BRPI0914300B1

BRPI0914300B1 - Vacina para tratamento de obesidade

Info

Publication number: BRPI0914300B1
Application number: BRPI0914300-9A
Authority: BR
Inventors: Keith N. Haffer; James Larrick; Andrew R. Mendelsohn
Original assignee: Braasch Biotech Llc
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2021-03-23
Also published as: EP2291194A1; AU2009262243B2; IL209829A; US20110195080A1; BRPI0914300A2; BRPI0914300B8; WO2009158395A1; US8425914B2; CN102119033B; NZ590010A; CN102119033A; EP2291194B1; JP5627581B2; KR101627879B1; MX2010014078A; RU2011100105A; CO6321162A2; ZA201009127B; JP2011526285A; EP2291194A4

Abstract

composições e métodos para imunogenicidade intensificada de somatostatina. a presente invenção refere-se a composições e métodos que são providos para tratamento da deficiência do hormônio de crescimento e/ou fator de crescimento de insulina-símile 1 em um paciente em necessidade de tal tratamento. composições e métodos incluem vacinas novas que proveem imunogenicidade para somatostatina e resultam na liberação aumentada de hormônio de crescimento e/ou fator de crescimento de insulina-símile 1 endogenamente produzidos.

Description

VACINA PARA TRATAMENTO DE OBESIDADE

PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[0001] O pedido de patente se refere ao Pedido de Patente PCT Número PCT/US08/68195, intitulado Proteína de Fusão de Somatostatina Defeituosa em Cloranfenicol Acetil Transferase (CAT) e Usos da Mesma, depositado em 25 de junho de 2008 e incorporado aqui por referência para todos os propósitos.

CAMPO DA TÉCNICA

[0002] A presente invenção se refere aos tratamentos de pacientes tendo deficiência do hormônio de crescimento (GH) e/ou fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1). Mais particularmente, a invenção se refere aos tratamentos, e às composições e métodos envolvidos nos ditos tratamentos, para pacientes que apresentam deficiência de GH e/ou IGF-1 através de uso de vacinas de antígeno/adjuvante com base em somatostatina.

ANTECEDENTES

[0003] Prevenção de doença infecciosa usando vacinas tem sido na prática desde o final de 1700 (vacina antivariólica de 1798), incluindo uso de vacinas para prevenção de pólio, hepatite B, e influenza. Mais recentemente, as vacinas têm também sido identificadas para o uso em tratamento de câncer onde a vacina persuade o sistema imune do paciente em identificar e destruir células tumorais alvo, isto é, tratamento de câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pele, etc. Outros alvos novos e úteis para o tratamento de vacina estão sendo desenvolvidos devido à vantagem de usar o próprio sistema imune de um paciente para derrotar o agente invasor ou canceroso. Na maioria das circunstâncias, uma vacina combina um antígeno contra o qual a imunidade é buscada e um adjuvante para intensificar a resposta àquele antígeno pelo recipiente da vacina.

[0004] Hormônio de crescimento é um hormônio de polipeptídeo de 191 aminoácidos sintetizado e liberado da glândula pituitária anterior. Hormônio de crescimento é em geral considerado um hormônio anabólico, requerido para desenvolvimento/altura em crianças, aumento na retenção de cálcio (resistência óssea), promoção de lipólise, aumento na síntese proteica, promoção de gliconeogênese no fígado e outras funções similares. Pacientes que sofrem de deficiência do hormônio de crescimento endógeno frequentemente têm densidade óssea ruim, massa corporal magra diminuída, energia reduzida, e similares sintomas gerais similares.

[0005] Presentemente, pacientes que sofrem de deficiência do hormônio de crescimento são tratados com substituição de hormônio de crescimento, tipicamente usando um hormônio de crescimento recombinante expresso em bactérias geneticamente projetadas. Estes protocolos de tratamento são tipicamente extremamente caros (faixa de estimativas de $10.000 a $30.000 por ano) e contam com substituição exógena do hormônio (injeções diárias são típicas, frequentemente estendendo 18 meses ao tempo de vida do paciente). Como resultado, terapias novas, não exógenas, de ação longa, e menos caras são requeridas para pacientes que sofrem de deficiência do hormônio de crescimento.

[0006] Além disso, terapias são também necessárias para tratar pacientes em necessidade de níveis adicionais, acima da linha base, do hormônio de crescimento, por exemplo, estes pacientes frequentemente requerem hormônio de crescimento adicional para o tratamento de obesidade, cura de ferida, cura de queimadura, etc.

[0007] A presente invenção é direcionada para superar um ou mais dos problemas debatidos acima.

SUMÁRIO DAS MODALIDADES

[0008] Modalidades da presente invenção proveem composições e métodos para o tratamento de uma deficiência do hormônio de crescimento. Para o propósito da invenção, uma deficiência do hormônio de crescimento é qualquer diminuição nos níveis do hormônio de crescimento associada a um estado de doença ou insuficiência de crescimento devido à carência de secreções e/ou níveis adequados do hormônio de crescimento endógeno. Deficiência do hormônio de crescimento também inclui situações onde um nível endógeno normal (para aquele paciente) de hormônio de crescimento existe, mas acredita-se que hormônio de crescimento adicional seja vantajoso para o tratamento de uma doença ou condição, por exemplo, tratamento de obesidade, tratamento de feridas, e tratamento de queimaduras.

[0009] Modalidades da presente invenção também proveem composições e métodos para o tratamento de uma deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1. Para propósito da invenção, uma deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 é qualquer diminuição nos níveis do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 associada a um estado de doença ou condição devido à carência de secreções e/ou níveis adequados do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 endógeno. Deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 também inclui situações onde um nível endógeno normal do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 existe, mas acredita-se que o fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 adicional seja vantajoso para o tratamento de uma doença ou condição, por exemplo, insuficiência de crescimento, diabetes tipos 1 e 2, e reparo e/ou substituição de cartilagem.

[00010] Em uma modalidade, métodos são providos para tratamento de uma deficiência do hormônio de crescimento em um paciente em necessidade do mesmo. Métodos incluem administrar uma quantidade imunogênica de uma vacina de antígeno com base em somatostatina da invenção a um paciente e monitorar o progresso do paciente. Vacinações adicionais podem ser administradas para facilitar o tratamento da deficiência do hormônio de crescimento do paciente. Pacientes em necessidade de tal tratamento incluem: adulto e crianças que têm: uma carência do hormônio de crescimento endógeno que resulta em crescimento insuficiente, condições cardíacas congênitas ou outras doenças cardíacas como obesidade, pacientes em necessidade de reparo intensificado de queimadura, e pacientes em necessidade de cura intensificada de ferida.

[00011] Em outra modalidade, métodos são providos para o tratamento de uma deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 em um paciente em necessidade do mesmo. Métodos incluem administrar uma quantidade imunogênica de uma vacina de antígeno com base em somatostatina da invenção a um paciente e monitorar o progresso do paciente. Vacinações adicionais podem ser administradas para facilitar o tratamento da deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 do paciente. Pacientes em necessidade de tal tratamento incluem: lactentes que têm retinopatia da prematuridade (ROP), adultos e/ou crianças que são obesos, adultos e/ou crianças que têm diabetes tipo 1 ou 2, adultos e/ou crianças que têm síndrome de Rett, cachorros e/ou gatos que estão obesos, cavalos que requerem substituição e/ou reparo de cartilagem, e similares tratamentos similares.

[00012] A presente invenção também fornece polipeptídeos novos, e os polinucleotídeos que os codificam, tendo imunogenicidade intensificada de somatostatina para o uso no tratamento de um paciente tendo uma deficiência do hormônio de crescimento ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1. Os polipeptídeos da invenção incluem somatostatina-14 fundida em uma proteína de cloranfenicol acetil transferase inativada por meio de um ligante funcionalmente otimizado. Polipeptídeos da invenção são úteis em todas as espécies de vertebrados devido à natureza altamente conservada da somatostatina-14, estável para armazenamento a longo prazo, altamente imunogenética, e resistente à degradação no paciente. Como tal, os polipeptídeos quiméricos da invenção proveem materiais de custo altamente eficazes e baixos para o uso no tratamento de deficiência do hormônio de crescimento e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 em todos os vertebrados.

[00013] A presente invenção também provê adjuvantes novos para o uso no tratamento de um paciente em necessidade de uma resposta imunogênica, especialmente em relação a um paciente em necessidade de um tratamento de uma deficiência do hormônio de crescimento ou fator de crescimento insulina-símile. Adjuvantes novos aqui são altamente eficazes e seguros para o uso em vertebrados, incluindo seres humanos, cachorros, cavalos, gatos, e similares.

[00014] A presente invenção também provê vacinas novas para o uso no tratamento de um paciente tendo uma deficiência do hormônio de crescimento ou fator de crescimento insulina-símile. Vacinas são altamente eficazes e seguras para o uso em vertebrados, incluindo seres humanos, cachorros, cavalos, gatos e similares.

[00015] Estas e várias outras características e vantagens da invenção serão evidentes de uma leitura da descrição detalhada seguinte e uma revisão das reivindicações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00016] A Figura 1 é um gráfico esquemático ilustrativo de um plasmídeo pET30b CatSom de acordo com as modalidades da presente invenção. O plasmídeo inclui um marcador de resistência à canamicina, operador Lac, promotor T7, sequência de codificação de CAT, todos de acordo com as modalidades da invenção, uma região de ligante de acordo com a invenção aqui e uma região de codificação de somatostatina de acordo com a invenção, são também inclusos.

[00017] A Figura 2 é uma SDS-PAGE tingida ilustrativa que mostra uma banda de 28KD que corresponde ao tamanho prognosticado de um polipeptídeo de somatostatina defeituoso em CAT, de códon otimizado da invenção. Via 1 é LB + IPTG, reduzido, Via 2 é LB, reduzido, Via 3 é LB + IPTG e Via 4 é LB.

[00018] A Figura 3 é um gráfico de difração da porcentagem do peso de linha base versus vacinações contendo somatostatina em camundongos de cruzamento não parental.

[00019] A Figura 4 é um gráfico que mostra a admissão de alimento por grupo de camundongos em um curso de 7 dias.

[00020] A Figura 5 é um gráfico que mostra o peso do corpo médio dos grupos de tratamento de camundongos no curso de 39 dias, cada grupo testado é mostrado com uma barra de erro.

[00021] A Figura 6 é um gráfico que mostra a porcentagem do peso do corpo de linha base dos grupos de tratamento de camundongos no curso de 39 dias, cada grupo testado é mostrado com uma barra de erro.
IDENTIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS E IDENTIFICADORES DA SEQUÊNCIA
SEQ ID NO: 1 AGCKNFFWKTFTSC
SEQ ID NO: 15 GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACA TCCTGT
SEQ ID NO: 2 (His192->Gly, His193->Gly):
Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatauatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag
SEQ ID NO: 3: (His192->Gly, His193->Gly):
Mekkitgyttvdisqwhrkchfeafqsvaqctynqtvqlditanktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlnelqq
SEQ ID NO: 4 (His193->Gly):
Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttguacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatatlatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcuaatgaactgcagcag
SEQ ID NO: 5 (1 His193->Ala):
AtggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccalgggcaaataUalacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatgctgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag
SEQ ID NO: 6 (1 His+CAT WT):
Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttucatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatataucgcaagatgtggcgcgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagttlcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaactgcagcag
SEQ ID NO: 7 (um H->G):
Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypatihilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddtrqtlhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdliivanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhgavedgfhvgrmlnclqq
SEQ ID NO: 8: (H->A)
Mekkilgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqlvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmanikdgelviwdsvhpcytvftieqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienrnffvsanpwvsftsfdlnvanrndnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhaavcdgfhvgrmlnelqq
SEQ ID NO: 9:
tggsaactgcaccgttctgetccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcarg
SEQ ID NO: 10 welhrsgprprprprpefm
SEQ ID NO: 11 welhrsgp(rp)nefrn onde n>|
SEQ ID NO: 12
Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgiatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcagtgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatggccggctgcaagaacttcttttggaaaacctttacgagctgc
SEQ ID NO: 13
mekkitgyttvdisqwhrkehlealqsvaqctynqtvqlditanktvkknkhkfypafihilarlrnnahpefrrnarnkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlnelqqwelhrsgprprprprpefmagcknffwktftsc
SEQ ID NO: 14
mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmtfvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhhavcdgfhvgrmlnelqqwelhrsgprprprprpetmagcknffwktftsc

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00022] A presente invenção provê composições e métodos para o tratamento de deficiência do hormônio de crescimento em pacientes em necessidade de tal tratamento. Para propósitos aqui, e como previamente descrito, uma deficiência do hormônio de crescimento é qualquer diminuição nos níveis do hormônio de crescimento associada a um estado de doença ou condição devido à carência de secreções e/ou níveis adequados de hormônio de crescimento endógeno no paciente. Deficiência do hormônio de crescimento também inclui situações onde um nível endógeno normal de hormônio de crescimento existe, isto é, normal para o paciente, mas acredita-se que hormônio de crescimento adicional seja vantajoso para o paciente para o tratamento de uma doença ou condição-alvo, por exemplo, tratamento de obesidade, tratamento de feridas, tratamento de queimaduras, etc.

[00023] A presente invenção também provê composições e métodos para tratar deficiência do fator de crescimento semelhante a insulina tipo 1 em pacientes em necessidade de tal tratamento. Para propósitos aqui, uma deficiência do fator de crescimento semelhante a insulina tipo 1 é alguma deficiência nos níveis do fator de crescimento insulina-símile associada a um estado de doença devido à carência de secreções adequadas do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 endógeno. Deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 também inclui situações onde um nível normal de fator de crescimento insulina-símile existe, isto é, normal para o paciente, mas acredita-se que fator 1 adicional seja vantajoso para o paciente para o tratamento de uma doença ou condição, por exemplo, obesidade, diabetes tipo 1 e 2, e síndrome de Rett.

[00024] Em uma modalidade, polipeptídeos novos, e os polinucleotídeos que os codificam, são fornecidos incluindo polipeptídeos de somatostatina-14 fundida em uma proteína de cloranfenicol acetil transferase inativada por meio de um ligante funcionalmente otimizado. Os polipeptídeos quiméricos da invenção proveem materiais de custo altamente eficazes e baixos para o uso no tratamento de deficiência do hormônio de crescimento e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1.

[00025] Em outra modalidade, composições de adjuvante novas são providas para o uso no tratamento de pacientes tendo deficiência do hormônio de crescimento e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1. Em uma modalidade particular, antígeno com base em somatostatina pode ser combinado com adjuvantes novos e usado no tratamento de estados ou condições de doença relacionados à deficiência do hormônio de crescimento ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1, por exemplo, deficiência de crescimento em crianças, deficiência de crescimento em adultos, carência de secreções adequadas de hormônio de crescimento endógeno, cura de queimaduras, obesidade, doença cardíaca, etc. Adjuvantes aqui são projetados para ótimo uso em vertebrados, e em particular seres humanos. Adjuvantes aqui proveem imunogenicidade intensificada sobre os adjuvantes convencionais, assim permitindo as vacinas incluírem quantidades menores de antígeno. Modalidades de adjuvantes aqui são úteis com outras combinações de antígeno além daqueles úteis no tratamento de deficiência do hormônio de crescimento e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1. Novas modalidades de adjuvantes isoladas estão portanto dentro do escopo da presente invenção mas adjuvantes aqui predominantemente serão descritos de acordo com o antígeno com base em somatostatina.

[00026] Em ainda outra modalidade, vacinas são providas que resultam em imunogenicidade contra somatostatina que resulta em diminuição da somatostatina e assim remoção de uma proporção da inibição que a somatostatina exerce na liberação do hormônio de crescimento e assim liberação do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1. Modalidades de vacina aqui são otimizadas tanto para segurança como para função, tendo construções de somatostatina altamente imunogênicas em composições de adjuvante altamente seguras e eficazes. Vacinas da presente invenção requerem quantidades relativamente menores de antígeno (quando comparado às vacinas convencionais), têm vida de armazenamento intensificada, e são de custo inferior.

[00027] Embora a presente invenção seja focalizada em tratamento de deficiência do hormônio de crescimento e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 em seres humanos, o tratamento destas deficiências em outros vertebrados é contemplado estar dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, cachorros e gatos que mostram sinais de obesidade, e cavalos necessitando de reparo ou substituição de cartilagem podem ser tratados usando as composições e métodos descritos aqui.

[00028] As definições seguintes são fornecidas para facilitar o entendimento de certos termos usados frequentemente aqui e não são significadas para limitar o escopo da descrição presente.

DEFINIÇÕES:

[00029] "Aminoácido" se refere a qualquer um dos vinte aminoácidos de ocorrência natural como também quaisquer sequências de aminoácido modificadas. Modificações podem incluir processos naturais tais como processamento pós-translacional, ou podem incluir, mas não limitados a, fosforilação, ubiquitinação, acetilação, glicosilação, ligação covalente de flavina, ribosilação de PAD, reticulação, iodação, metilação, e similares.

[00030] "Anticorpo" se refere a uma molécula em forma de Y tendo um par de sítios de ligação de antígeno, uma região de dobradiça e uma região constante. Fragmentos de anticorpos, por exemplo, um fragmento de ligação de antígeno (Fab), anticorpos quiméricos, anticorpos que têm uma região constante humana acoplada a uma região de ligação de antígeno murino, e fragmentos dos mesmos, como também outros anticorpos recombinantes bem conhecidos que são incluídos na definição de anticorpo de acordo com a presente invenção.

[00031] "Isolamento" se refere a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que foi separado ou restabelecido de pelo menos um contaminante de seu ambiente natural. Em alguns casos o polinucleotídeo ou polipeptídeos foram separados ou restabelecidos de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos contaminantes de seu ambiente natural. Ordinariamente, polinucleotídeos ou polipeptídeos isolados são preparados usando pelo menos uma etapa de purificação. Nesta consideração, purificar ou purificação, se refere a um polipeptídeo-alvo livre de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% dos polipeptídeos contaminantes. Purificação de um polipeptídeo dos polipeptídeos contaminantes pode ser realizada através de qualquer de várias técnicas bem conhecidas, incluindo precipitação de sulfato de amônio ou de etanol, cromatografia de permuta de ânion ou de cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita, e cromatografia de lectina.

[00032] "Obesidade" se refere a um sujeito estando pelo menos 20% acima de um peso do corpo ideal. Para um ser humano, por exemplo, peso do corpo ideal é determinado pela altura do sujeito, idade, sexo e constituição física. Obesidade aqui inclui os termos: ligeiramente obeso (20-40% acima do peso ideal), moderadamente obeso (40-100% acima do peso ideal) e severamente obeso (100% acima do peso ideal).

[00033] "Paciente" se refere a um vertebrado, tipicamente um mamífero, em necessidade das composições e/ou métodos da presente invenção, por exemplo, um ser humano em necessidade de perda de peso (obeso, por exemplo) ou cavalo em necessidade de reparo de cartilagem.

[00034] "Porcentagem" de identidade de sequência de ácido nucleico ou de aminoácido descreve a porcentagem de sequência de ácido nucleico ou resíduos de aminoácido que são idênticos com um polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência. Em algumas circunstâncias, sequências são alinhadas e intervalos introduzidos para alcançar identidade de sequência máxima. Em algumas circunstâncias um programa de computação é empregado para calcular a porcentagem de identidade, por exemplo, programa GAP (pacote de Wisconsin Sequence Analysis, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), que usa um algoritmo de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math., 2:482-489 (cada um destes é incorporado por referência em sua totalidade aqui) ou programa de computação de comparação de sequência ALIGN-2 (vide WO 00/15796).

[00035] "Polinucleotídeo" se refere a uma sequência linear de nucleotídeos. Os nucleotídeos são sequência linear ou de polirribonucleotídeos ou polideoxirribonucleotídeos, ou uma mistura de ambos. Exemplos de polinucleotídeos no contexto da presente invenção incluem - DNA único e bifilamentar, RNA único e bifilamentar, e moléculas híbridas tendo ambas as misturas de DNA e RNA único e bifilamentares. Polinucleotídeos também incluem um ou mais nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos de peptídeo (PNA).

[00036] "Proteína", "peptídeo", e "polipeptídeo" são usados alternadamente para denotar um polímero de aminoácido ou um conjunto de dois ou mais polímeros de aminoácido interagindo ou ligados.

[00037] "Tratamento" ou "trato" referem-se à melhoria de um sujeito com relação a um sujeito sem tratar em uma situação relativamente idêntica. Tratamento ou trato em geral indicam que um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado foi alcançado usando as composições e métodos da presente invenção. Tratamento ou trato podem incluir tratamentos profilácticos.

[00038] "Vacina" se refere a qualquer composição que possa estimular o sistema imune do sujeito vacinado para produzir anticorpos para os propósitos descritos aqui.

HORMÔNIO DE CRESCIMENTO

[00039] Hormônio de crescimento é um peptídeo de 191 aminoácidos produzido e liberado de células somatotróficas na pituitária anterior. Os níveis de hormônio de crescimento no corpo são regulados pelo hormônio de liberação do hormônio de crescimento (GHRH) e somatostatina. GHRH resulta na síntese e liberação do hormônio de crescimento (estresse, exercício, etc. são também estimuladores conhecidos da liberação do hormônio de crescimento) enquanto somatostatina inibe a liberação do hormônio de crescimento.

[00040] Hormônio de crescimento (GH) está em geral envolvido em uma variedade de funções fisiológicas no corpo, incluindo: aumento da altura ao longo da infância, aumento da massa muscular através de hiperplasia de sarcômeros, promoção de lipólise, promoção de gliconeogênese no fígado, e envolvimento na homeóstase de combustível. Deficiências do hormônio de crescimento tipicamente manifestam por si próprias em várias doenças ou estados fisiológicos conhecidos, incluindo: insuficiência de estatura curta/desenvolvimento se a deficiência ocorrer durante a infância, déficits de resistência, perda de massa óssea, aumento nos riscos cardiovasculares, por exemplo, parada cardíaca crônica (Tien et al., Growth Hormone: A Promising Treatment for the Failing Heart, 2000, Pharmacotherapy 20(9): 1096-1106, incorporado aqui por referência em sua totalidade), e outros estados similares. Além disso, hormônio de crescimento suplementar para um sujeito é potencialmente útil no tratamento de feridas, queimaduras, obesidade, e similares. Vickers et al., 2002, Adult growth hormone treatment reduces hypertension and obesity induced by an adverse prenatal environment, J. Endocrinol, 175(3):615-623; Ramirez et al., 1998, Is there a role for growth hormone in the clinical management or burn injuries, Growth Hormone IGF Res. Suppl. B:99-105; e Lal et al., 2000, Growth hormone, burns and tissue healing, Growth Hormone IGF Res. 10 Suppl. B:539-543, cada um destes é aqui incorporado por referência para todos os propósitos.

[00041] Terapias convencionais para combater deficiência de hormônio de crescimento incluem suplementação ao indivíduo afligido com hormônio de crescimento humano recombinante (vide, por exemplo, Patentes U. S. 4.446.235 e 4.601.980). Terapias de suplementação de hormônio de crescimento tipicamente requerem injeção subcutânea de hormônio de crescimento recombinante em uma base ininterrupta, isto é, injeções diárias por pelo menos 18 meses são típicas, embora um número significativo de indivíduos requeira tratamento vitalício. Recentemente, terapias de suplementação de hormônio de crescimento foram usadas em tratamento de Esclerose Múltipla (MS), tratamento de fibromialgia, tratamento da doença de Crohn e/ou colite ulcerativa, tratamento para reverter efeitos de envelhecimento, tratamento de queimaduras, e tratamento para estatura curta idiopática. Porém, tratamento com terapia de hormônio de crescimento recombinante foi mostrado potencialmente aumentar o risco de diabetes, câncer de cólon, etc. Além disso, tratamento de um paciente com uma proteína recombinante é tipicamente desprovido de controles de realimentação internos que fornecem um ambiente de monitoramento constante e cuidado do paciente, com riscos de aumento associados quando o paciente tiver uma malignidade ativa. Também, hormônio de crescimento recombinante é extremamente caro para se obter, e custos de uso no curso de um ou mais anos podem ser proibitivos, como é o regimento de administrações diárias por meio de injeção. Como tal, as modalidades da presente invenção fornecem um benefício inesperado e substancial no tratamento destas doenças ou condições relacionadas à deficiência do hormônio de crescimento. FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA TIPO 1 (IGF-1)

[00042] IGF-1 é um hormônio de proteína de polipeptídeo similar em estrutura à insulina. IGF-1 é produzido no fígado e outros tecidos-alvo em resposta ao hormônio de crescimento e em geral tem efeitos anabólicos sob liberação. Tipicamente, IGF-1 atua através da via de sinalização de AKT (AKT representando uma família de proteína cinases específicas para serina/treonina). Em geral, os efeitos anabólicos de IGF-1 incluem crescimento e multiplicação das células como também uma inibição da apoptose nos sítios-alvo.

[00043] Vários fatores estão envolvidos na influência dos níveis de IGF-1 na circulação de um paciente, incluindo: nível de hormônio de crescimento, composição genética, tempo de dia, idade, sexo, estado de atividade física, estresse, índice de massa corporal, e estado de doença. Deficiência de IGF-1 pode ser caracterizada por retardamento ou insuficiência de crescimento, e são várias as condições associadas, incluindo: obesidade, diabetes tipos 1 e 2, doença cardiovascular, vários distúrbios de tensão, e similares.

[00044] IGF-1 recombinante foi usado no tratamento de várias destas enfermidades, com resultados misturados. Presentemente, Increlex® (um IGF-1 recombinante produzido por Tercica) está disponível nos Estados Unidos para tratamento de distúrbios-alvo, embora os resultados clínicos tenham variado.

SOMATOSTATINA

[00045] Somatostatina é um hormônio de peptídeo que inibe, entre outras coisas, a liberação do hormônio de crescimento da pituitária anterior. Somatostatina regula as várias funções endócrinas por meio de interação com receptores de somatostatina acoplados à proteína G em células endócrinas-alvo. Somatostatina é segregada dos sítios no hipotálamo, estômago, intestino e pâncreas. Controle dos níveis de somatostatina em um animal-alvo foi identificado recentemente como um ponto de interesse para produtividade crescente de animais de fazenda, isto é, controle dos níveis de somatostatina intensifica a produção de leite de vaca leiteira ou do tamanho de uns animais de fazenda, etc (vide Pedido de Patente Copendente S/N 12/198.579, intitulado Chloramphenicol Acetyl Transferase (CAT)-Defective Somatostatin Fusion Protein And Uses Thereof, que é aqui incorporado por referência para todos os propósitos).

[00046] Nestes estudos, produtividade de animais de fazenda foi otimizada através de uso de protocolos de vacinação com antígenos de somatostatina. Em geral, animais de fazenda imunizados com somatostatina tiveram um ganho de peso diário médio de 10-20%, um apetite reduzido em 9% e um aumento de 11% na eficiência de utilização alimentícia. Animais imunizados com somatostatina, e também sua descendência tem proporções corretas, e a distribuição do peso dos animais entre os músculos, ossos e gordura é como nos animais de controle (vide Reichlin, 1987). Porém, tratamentos de somatostatina alternativos, por exemplo, tratamento direto de animais-alvo com anticorpos antissomatostatina, provou-se ser demasiadamente caro e funcionalmente menos dramático, assim eliminando o tratamento de anticorpo direto como não prático. Muromtsev G. S., et al., 1990, Basics of agricultural biothecnology, Agropromizdat, Moscou, págs 102-106. Portanto, estes estudos indicam que induzindo imunogenicidade da somatostatina em um animal-alvo pode realizar resultados seguros e eficazes.

[00047] Os inventores aqui perceberam o resultado surpreendente e inesperado que a modificação destes protocolos de vacinação (incluindo métodos e composições) pode ser usada em tratamento de doença ou estados fisiológicos humanos, e em particular, tratamento de deficiência do hormônio de crescimento humano e/ou IGF-1.

[00048] Modalidades da presente invenção proveem tratamentos com base em somatostatina para deficiência do hormônio de crescimento em vertebrados, e, mais particularmente, em mamíferos. As modalidades típicas são direcionadas para tratamentos em seres humanos, cachorros, gatos e cavalos. Os seres humanos e similares mamíferos imunizados com somatostatina são tratados com vacinas da invenção (vide abaixo) para limitar ou inibir os efeitos que a somatostatina nativa tem na liberação de hormônio de crescimento. Por exemplo, onde hormônio de crescimento recombinante seria administrado a um paciente deficiente em hormônio de crescimento ou em necessidade de hormônio de crescimento de excesso, para tratamento de queimaduras, terapia cardíaca, diabetes, etc, as vacinas da invenção seriam fornecidas para resultar na liberação do hormônio de crescimento endógeno adicional. Antígenos de vacina e adjuvantes são otimizados para uso em vertebrados e em particular uso humano e tratamento de doença. Considerando que somatostatina é altamente conservada nos vertebrados, as modalidades da presente invenção são úteis para obter uma resposta imune em todos os vertebrados-alvo vacinados usando os métodos e composições aqui. Um benefício significativo da presente invenção é que os pacientes vacinados podem passar semanas a meses entre eventos de reforço, permitindo o sistema imune do paciente limitar ou eliminar a somatostatina do sistema.

[00049] Modalidades da presente invenção também proveem tratamentos com base em somatostatina para deficiência de IGF-1 em vertebrados, e em particular em mamíferos, por exemplo, humanos, cachorros, gatos, cavalos, e similares. Vertebrados imunizados com as vacinas da invenção limitam ou inibem os efeitos que a somatostatina tem nos níveis de IGF-1 naquele animal. As modalidades de tratamento podem ser usadas para tratar qualquer número de doenças e/ou condições associadas à deficiência de IGF-1 ou onde IGF-1 adicional é requerido para melhorar a saúde ou condição do animal tratado.

[00050] Como tal, os aspectos da presente invenção facilitam vacinas de imunização com base em somatostatina provendo materiais altamente imunogênicos para o uso na prevenção e tratamento de doença e/ou outras condições. Estes compostos de imunização com base em somatostatina foram otimizados para expressão e antigenicidade.

[00051] Em algumas modalidades, somatostatina-14 é expressa como um polipeptídeo quimérico de somatostatina deficiente de CAT, de códon otimizado. Estes materiais fornecem uma terapêutica inesperada para o uso no tratamento de hormônio de crescimento e doenças com base em deficiência de IGF-1 como também onde níveis adicionais de hormônio de crescimento ou IGF-1 seriam úteis em um regime de tratamento. Como descrito completamente abaixo, a presente invenção também provê adjuvantes otimizados para maximizar os efeitos dos polipeptídeos quiméricos de somatostatina deficientes em CAT, de códon otimizado. Antígenos com base em somatostatina da invenção são projetados para fornecer moléculas de tamanho maior (27.000+ Daltons versus 1.600 para somatostatina nativa), imunogenicidade e resistência à degradação. Desta maneira um antígeno com base em somatostatina da invenção está presente mais tempo (meia vida mais longa no paciente), com maior efeito (maior imunogenicidade), em um paciente tratado. Estes antígenos novos para o uso em vertebrados proveem ótima exposição para o sistema imune de um paciente responder.

NOVAS MODALIDADES DE VACINA PARA O USO NO TRATAMENTO DE DEFICIÊNCIA DO HORMÔNIO DE CRESCIMENTO

[00052] Somatostatina tem duas formas ativas que são produzidas por clivagem alternativa de um polipeptídeo. Costoff A. Seção 5, Capítulo 4: Structure, Synthesis, and Secretion of Somatostatin. Endocrinology: The Endrocrine Pâncreas. Medical College of Georgia, página 16, incorporado por referência em sua totalidade para todos os propósitos. Embora seja contemplado que qualquer forma de somatostatina possa ser usada em modalidades de antígeno com base em somatostatina aqui, somatostatina-14 será descrita em detalhes. Somatostatina-14 é um tetradecapeptídeo biologicamente ativo produzido no hipotálamo e trato gastrointestinal (estômago, intestino, e pâncreas). A sequência de aminoácido do tetradecapeptídeo é AGCKNFFWKTFTSC (SEQ ID NO: 1). A sequência de somatostatina-14 é altamente conservada entre vertebrados (Lin XW et al. Evolution of neuroendocrine peptide systems: gonadotropin-releasing hormone and somatostatin. Comp. Biochem. Physiol. C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1998 119(3):375-88). O tetradecapeptídeo é codificado por uma sequência de ácido nucleico:GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCT GT (SEQ ID NO: 15) (note que outras sequências de ácido nucleico podem ser usadas para codificar a SEQ ID NO: 1, porém, SEQ ID NO: 15 é fornecida para propósitos ilustrativos).

[00053] Somatostatina-14 é conhecida para ter efeito inibidor forte em um número grande de hormônios envolvidos no crescimento e utilização de alimento em animais. Como previamente descrito na Patente U. S. 6.316.004 e Pedido de Patente US 12/198.579 (cada um incorporado aqui por referência para todos os usos), somatostatina e versões quiméricas de somatostatina podem ser usadas na imunização de animais para aumento em peso diário e, onde apropriado, produção de leite. Estes procedimentos de imunização foram executados com adjuvantes convencionais. Imunização de somatostatina-14 não foi usada no tratamento de qualquer estado particular de deficiência do hormônio de crescimento.

[00054] Um aspecto da invenção fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam proteínas quiméricas que têm atividade imunogênica de somatostatina otimizada. Em particular, as modalidades da invenção incluem construções de ácido nucleico novas que codificam proteínas de fusão de CAT tendo atividade imunogênica para somatostatina. Estes polipeptídeos foram identificados para atividade funcional ótima em procedimentos de imunização e foram usados em tratamento de deficiências do hormônio de crescimento e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e em particular em tratamento de deficiências do hormônio de crescimento mamífero e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1.

[00055] Em uma modalidade, uma construção tendo um gráfico esquemático como mostrado na Figura 1 é fornecida para codificar os polipeptídeos quiméricos da invenção. Construções de ácido nucleico da invenção em geral codificam uma enzima de CAT inativa sem 10 aminoácidos C-terminais e incluem um ou dois aminoácidos substituídos de histidina. A enzima de CAT é inativada removendo o grupo imidazol de His 193 (His 195 na variante de CATIII canônica). Em outra modalidade a enzima de CAT é inativada removendo os grupos imidazol tanto de His 193 como perto de His 192 (respectivamente His195 e His194 para CATIII). Remoção do grupo imidazol essencial de His 193 (His 195 em CATIII) do sítio ativo de CAT e substituição com uma alanina, glicina ou outros aminoácidos similares resulta na inativação substancial da enzima de CAT (vide, por exemplo, Lewendon A et al. (1994) Replacement of catalytic histidine-195 of chloramphenicol acetyl transferase: evidence for a general base role for glutamate. Biochemistry. 33(7): 1944-50; White et al., (2000) Characterization of Chloramphenicol and Florfenicol Resistance in Escherichia coli associated with Bovine Diarrhea. J. Clin. Micro 38(12) págs. 4593 - 4598, cada um destes é aqui incorporado por referência para todos os propósitos). Por fim, as modalidades aqui podem também incluir inativação da enzima de CAT sozinha através da remoção do grupo imidiazol de His192 (His 194 para CATm). Como para His193, substituição pode ser com uma alanina, glicina ou outro aminoácido similar.

[00056] Em alguns aspectos, o um ou mais aminoácidos de histidina substituídos são codificados pelos ácidos nucleicos localizados nos números de posição 574-576 e 577-579 da SEQ ID NO: 2 (correspondendo aos números de aminoácido 192 e 193 na SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, as sequências de ácido nucleico da invenção incluem SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6. Proteínas quiméricas da invenção que incluem as construções de histidina substituídas aqui fornecem proteínas altamente imunogênicas com pouca ou nenhuma atividade de CAT, uma melhoria significativa na técnica existente. As modalidades de enzima de CAT inativada estão ligadas a um polipeptídeo de somatostatina da invenção. Esta ligação pode ser feita diretamente ou com um ligante (como descrito completamente abaixo).

[00057] Inativação de CAT, nos sítios de his192 e his193, pode ser realizada por meio de qualquer número de procedimentos conhecidos àqueles versados na técnica incluindo mutagênese local-dirigida e montagem de gene sintético. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica histidina 193 ou histidina 192 é modificada para codificar uma alanina, glicina ou outro aminoácido similar. Em outra modalidade, as sequências de ácido nucleico que codificam ambas histidinas 192 e 193 são modificadas para codificar alanina, glicina ou outros aminoácidos similares. Substituições típicas para o polipeptídeo quimérico de 192 e 193 incluem: alanina, alanina, alanina, glicina, glicina, alanina, glicina, glicina.

[00058] Modalidades da presente invenção também incluem as sequências de aminoácido para polipeptídeos deficientes em CAT da invenção, incluindo sequência de aminoácido tendo SEQ ID NO: 7, 8 e 3 (correspondendo a his->gly em 193, his->ala em 193, e his->gly em ambos 192 e 193).

[00059] A realização que a enzima de CAT poderia ser inativada e poderia ser usada como uma proteína de veículo para apresentação de somatostatina-14 no tratamento de doenças e/ou condições aqui, especialmente em mamíferos, foi uma descoberta inesperada dos inventores. CAT não inativada foi descrita como a enzima responsável pela resistência bacteriana mediada por plasmídeo por Cloranfenicol e Florfenicol (análogo fluorado) em múltiplos isolados bacterianos gram-negativos, mundiais. O uso do CAT não inativada, como descrito em US 6316004B1, antecede estas descobertas científicas. Como tal, de acordo com a corrente compreensão e padrões estabelecidos, o uso de CAT não inativada seria contraindicado devido a preocupações de segurança (isto é, criação de mais hospedeiros resistentes a antibióticos). Cloranfenicol foi descoberto cerca de 60 anos atrás e foi primariamente usado como um antibiótico. Várias preocupações de saúde surgiram deste uso incluindo os recipientes do fármaco desenvolvendo anemia aplástica. Além disso, onde o análogo fluorado antibiótico continuou sendo usado, por exemplo, na indústria de gado, um aumento em várias cepas de bactérias tornando-se resistentes a antibióticos, devido aos genes codificados de plasmídeo. Embora Cloranfenicol continue sendo usado em colírios para tratar conjuntivite bacteriana, não é usado nos Estados Unidos para tratar outra doença de bactérias. Como tal, a realização e desenvolvimento de usar uma enzima de CAT inativada em qualquer questão em mamífero, e em particular ser humano, é surpreendente, onde a utilização dos benefícios com base na proteína de veículo descritos ao longo deste relatório descritivo, ao mesmo tempo evitando as preocupações de saúde significativas de CAT ativa, fornece melhoria significativa para as vacinas descritas aqui.

[00060] Note que estas melhorias relacionadas ao "veículo" de CAT para o uso com moléculas pequenas são debatidas no Pedido de Patente U. S. copendente e relacionado S/N PCT/US08/68195 como também na Patente US 6.316.004 ambos são aqui incorporados por referência para todos os propósitos. Em particular, os inventores aqui inesperadamente descobriram que uma enzima de CAT inativada como uma proteína de veículo para somatostatina-14 poderia evitar os riscos de saúde significativos associados à enzima enquanto utilizando as proteínas quiméricas intensificou a capacidade para imunogenicidade, resistência à degradação da enzima, meia-vida aumentada e absorção intensificada pelos macrófagos do paciente.

[00061] Como mostrado na Figura 1, a enzima de CAT não ativa pode ser ligada à somatostatina-14 por meio de um ligante ou espaçador de comprimento variável. O espaçador é requerido para assegurar a apresentação da somatostatina codificada em uma superfície global. Modalidades de espaçador aqui proveem ótima resistência de protease e ótima exposição do epítopo e mostraram melhoria inesperada mais que as construções não tendo a(s) sequência(s) de ligante da presente invenção.

[00062] Portanto, as modalidades de espaçador foram otimizadas em comprimento e composição para assegurar expressão da somatostatina defeituosa em CAT em vários micro-organismos, e em particular em E. CoIi. Construções originais como descritas na Patente U. S. 6.316.004, incluem um espaçador tendo códons de E. coli raros e requeridos para a coexpressão de tRNAs raros de um segundo plasmídeo auxiliar. Modalidades de espaçador aqui removem estes códons de E. coli raros e assim removem a necessidade por um segundo plasmídeo auxiliar, uma melhoria a mais que a tecnologia anterior.

[00063] Em modalidades típicas, o espaçador tem uma sequência de ácido nucleico de tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg (SEQ ID NO: 9). Um exemplo de um espaçador da invenção tem uma sequência de aminoácido de welhrsgprprprprpefm (SEQ ID NO: 10). Uma sequência de aminoácido típica para um espaçador da invenção é welhrsgp(rp)nefm onde n>1 (SEQ ID NO: 11). Como observado acima, estas sequências de espaçador novas proveem resistência de protease intensificada (assim permitindo produção aumentada quando comparada às construções descritadescritas na Patente U. S. 6.316.004) e ótima exposição de somatostatina-14. Esta combinação de ligações de somatostatina a uma enzima de CAT inativada por um ligante otimamente conFigurado mostra melhoria inesperada quando usada para imunizar pacientes-alvo para tratamento da doença. Estas construções são usadas como antígenos no tratamento de doenças com base na deficiência do hormônio de crescimento e do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1.

[00064] Também, estas construções quiméricas mostram estabilidade de armazenamento intensificada quando comparada à somatostatina-14 sozinha. Além disso, os antígenos baseados em somatostatina da presente invenção fornecem meia-vida mais longa no paciente dada a resistência intensificada à degradação destes materiais. É observado que outros polipeptídeos de veículo podem substituir CAT inativada assim ligada à somatostatina. Por exemplo, somatostatina-14 pode ser combinada com KLH, toxoides de tétano ou CRM em vez da enzima de CAT inativada.

[00065] Modalidades da invenção também proveem composições de adjuvante novas para indução intensificada de imunidade humoral em um paciente-alvo. Estas composições de adjuvante proveem uma melhoria significativa sobre os materiais convencionais para a indução de uma resposta humoral e são seguras para o uso em alvos humanos. Composições de adjuvante aqui são usadas com antígenos com base em somatostatina para produzir vacinas da invenção. Vacinas da invenção são depois úteis no tratamento de doenças ou condições com base em deficiência de GH e/ou IGF-1.

[00066] Em modalidades aqui, todos os componentes das composições de adjuvante são de origem não animal, assim eliminando a contaminação secundária potencial dos seres humanos vacinados a partir de componentes adjuvantes potencialmente contaminados. Por exemplo, as modalidades aqui podem utilizar-se de Tween 80 livre de origem animal. Surpreendentemente, Tween 80 livre de origem animal mostra resultados significativamente melhores no uso das vacinas aqui quando comparado ao Tween 80 de origem animal, e elimina a possibilidade de contaminação com base em animal na vacina, por exemplo, Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE). Além disso, Tween 80 livre de origem animal mostra melhor capacidade para emulsificar quando comparado ao Tween 80 de origem animal, provendo um benefício inesperado adicional para seu uso de acordo com as modalidades aqui.

[00067] Modalidades de adjuvante aqui são também livres de benzeno e outros compostos carcinogênicos similares. Estas modalidades não fornecem um benefício de segurança disponível nos compostos adjuvantes mais convencionais. Por exemplo, as modalidades aqui utilizam-se de Carbopol 974P ou ácido policíclico livre de benzeno.

[00068] Em uma modalidade, o adjuvante imunológico compreende uma base de carbopol, uma base de esqualeno e uma solução de arabinogalactana. Em mais detalhe, a base de Carbopol é preparada usando Carbopol 974P em água ou solução salina. A base de esqualeno é preparada de uma combinação de esqualeno, Tween 80 de origem não animal e Span 85. Em algumas modalidades, a base de esqualeno é MF59 (Chiron Corp., Emeryville, CA). A arabinogalactana é dissolvida em PBS ou solução salina. Composições de adjuvante são combinadas com polipeptídeos quiméricos da invenção para produzir vacinas da invenção.

[00069] Em ainda outra modalidade, o adjuvante imunológico compreende uma base de Carbopol, uma base de esqualeno e uma solução de tragacantina. Em mais detalhe, a base de Carbopol é preparada usando Carbopol 974 P em água ou solução salina. A base de esqualeno é preparada de uma combinação de esqualeno, Tween 80 de origem não animal e Span 85. Tragacantina purificada é dissolvida em PBS ou solução salina. As composições de adjuvante são combinadas com polipeptídeos quiméricos da invenção para produzir as vacinas da invenção.

[00070] Combinação de adjuvante específico e concentrações são mostradas no Exemplo 3. Adjuvantes de acordo com a presente invenção são seguros e eficazes para o uso humano, evita produtos animais, evita hidrocarbonetos com base em petróleo, e evita compostos carcinogênicos.

VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[00071] A presente invenção também se refere aos vetores que compreendem as moléculas de polinucleotídeo da invenção, como também células hospedeiras transformadas com tais vetores. Quaisquer das moléculas de polinucleotídeo da invenção podem ser unidas a um vetor que em geral inclui um marcador selecionável e origem de replicação, para o hospedeiro de propagação de interesse. As células hospedeiras são geneticamente engenheiradas para incluir estes vetores e assim expressam os polipeptídeos da invenção. Em geral, vetores aqui incluem moléculas de polinucleotídeos da invenção operavelmente ligadas às sequências reguladoras transcricionais ou translacionais adequadas, tais como aquelas para células hospedeiras microbianas ou virais. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores transcricionais, operadores, ou intensificadores, sítios de ligação ribossômica de mRNA, e sequências apropriadas que controlam a transcrição e tradução. Sequências de nucleotídeo são operavelmente ligadas quando as sequências reguladoras aqui funcionalmente relacionarem ao polipeptídeo quimérico que codifica os polinucleotídeos da invenção.

[00072] Veículos típicos incluem plasmídeos, vetores ponte de levedura, baculovírus, adenovírus inativado, e similares. Em uma modalidade, o veículo é um plasmídeo pET30b CatSom modificado (vide Figura 1). Células hospedeiras-alvo para o uso aqui incluem o hospedeiro bacteriano, por exemplo, E. coli, levedura, células SF-9 de inseto, células mamíferas, plantas verdes, e outras.

[00073] Em uma modalidade, as sequências reguladoras incluem um promotor T71ac, CAT, Trp, ou T5 para expressão dos polipeptídeos quiméricos da invenção em E. coli ou outros micróbios similares. Estas sequências reguladoras são conhecidas na técnica e são usadas sob condições apropriadas e conhecidas.

[00074] Vários plasmídeos da invenção foram construídos para expressão dos polipeptídeos quiméricos da invenção através de utilização de sequências reguladoras-alvo. Plasmídeos ilustrativos podem incluir um promotor T71ac (vide Figura 1).

[00075] Células hospedeiras para expressão de polipeptídeos quiméricos-alvo incluem células procarióticas, de levedura e eucarióticas mais altas. Hospedeiros procarióticos ilustrativos incluem bactérias dos gêneros Escherichia, Bacillus, e Salmonella como também os gêneros Pseudomonas e Streptomyces. Em modalidades típicas, a célula hospedeira é dos gêneros Escherichia e pode ser Escherichia Coli (E. coli). Células hospedeiras (levedura ou bacterianas) podem também ser usadas para produzir polipeptídeos-alvo da invenção como partículas semelhantes a vírus (VLPs).

[00076] Como mostrado nos Exemplos abaixo, construções da invenção proveem ótima expressão de somatostatina deficiente de CAT sob uma variedade de condições. Estas construções são particularmente eficientes para expressão em hospedeiros procarióticos e em particular bactérias dos gêneros Escherichia.

PROTEÍNA DE FUSÃO LIVRE DE ENDOTOXINA PARA USO NAS VACINAS DA INVENÇÃO

[00077] Aspectos da presente invenção incluem o uso de somatostatina deficiente de CAT, livre de endotoxina, de códon otimizado. Em uma modalidade, a somatostatina imunogênica quimérica - compreendendo proteínas da invenção, são preparadas transformando as células-alvo com veículos contendo somatostatina apropriadas. Como observado acima, os veículos para uso aqui incluem plasmídeo conhecido e sistemas de vetor adequados para expressão em células-alvo selecionadas.

[00078] Em um aspecto da invenção, proteínas compreendendo somatostatina imunogênica quimérica são expressas nas células hospedeira alvo. Expressão da proteína quimérica é executada usando sequências reguladoras alvo. Em alguns aspectos os polipeptídeos quiméricos foram otimizados (especialmente com respeito às sequências de espaçador descritadescritas aqui) para expressão em E. coli.

[00079] Proteína quimérica pode ser depois purificada de acordo com as tecnologias de purificação de proteína conhecidas, incluindo, por exemplo, lise de lisozima, centrifugação diferencial dos corpos de inclusão, cromatografia de peneira e similares. Procedimentos de redobramento podem ser conduzidos em cloreto de guanidina e ureia em pH alcalino seguido por diálise e liofilização.

[00080] Em uma modalidade, células de E. coli são transformadas usando o plasmídeo contendo somatostatina deficiente de CAT, de códon otimizado - pET30b CatSom; o pET30b CatSom tendo as sequências reguladoras com base em E. coli apropriadas para expressão. Em alguns casos, fermentação de aproximadamente dez litros destas células fornece pelo menos 500 gramas e em alguns casos 600 gramas de biomassa total, rendendo cerca de 4 - 6 gramas de proteína total. É estimado de tingimento de prata e Coomassie blue que cerca da metade da proteína é a proteína quimérica alvo (vide Exemplo 2 e Figura 2).

[00081] Em algumas modalidades aqui, proteína quimérica da invenção é purificada de células hospedeira transformadas em um estado substancialmente livre de endotoxina. Purificação adicional removerá ou diminuirá a endotoxina para níveis aceitáveis para usos humanos de acordo com os padrões de Food and Drug Administration.

[00082] Como tal, algumas modalidades aqui são direcionadas para a produção de proteínas quiméricas substancialmente livres de endotoxina para o uso em vacinas. Em certas modalidades os níveis de endotoxina são em ou abaixo de 1 EU/mL e em outras modalidades os níveis de endotoxina são substancialmente eliminados, isto é, os polipeptídeos quiméricos da invenção são substancialmente livres de endotoxina.

[00083] Em uma modalidade, IB restabelecido de células hospedeiras lisadas foi lavado várias vezes usando um tampão de lavagem destituído de endotoxina. O pélete de IP restabelecido pode ser opcionalmente lavado até que os níveis de endotoxina estejam abaixo de cerca de 1 EU/mL (testes de endotoxina podem ser executados usando um ou mais ensaios conhecidos, incluindo kits de teste comercialmente disponíveis de MP Biochemicals, Charles River, etc.). Em algumas modalidades, o tampão de lavagem é livre de endotoxina e inclui um ou mais inibidor(es) de proteína proteolítica, por exemplo, fenilmetanossulfonilfluoreto (PMSF). Em algumas modalidades o tampão de lavagem é solução salina tamponada de fosfato (PBS) tendo uma quantidade eficaz de inibidor de PMSF e/ou Cloridrato de Fluoreto de Aminoetil-Benzenossulfonila (AEBSF).

[00084] Em alguns aspectos, péletes substancialmente livres de endotoxina podem ser tratados com uma solução de desdobramento de proteína em pH 12,5 contendo ureia e redobrada em uma solução de redobragem de proteína contendo uma molaridade reduzida de ureia com arginina, glicerol e/ou sacarose. Concentração da proteína quimérica purificada é modificada para ser entre 1 e 3 mg/mL e tipicamente cerca de 1,4 a 1,8 mg/mL. Em alguns casos, proteína quimérica livre substancialmente de endotoxina é fornecida em formulações de vacina em cerca de dose de 1,5 a 5 mg/2mL e mais tipicamente de dose de 2,0 a 3,5 mg/2 mL. Outros procedimentos de remoção de endotoxina podem também ser utilizados, por exemplo, colunas de remoção de endotoxina de permuta de íon comercialmente disponíveis, colunas hidrofóbicas, etc.

VACINAS

[00085] Vacinas da invenção são combinações de adjuvantes imunológicos como descritos aqui e antígenos-alvo úteis na prevenção ou tratamento de um estado de doença humana.

[00086] A dosagem farmacêutica para modalidade de vacina aqui inclui 1-5 mg de polipeptídeo quimérico. Em todas as modalidades aqui a vacina deve ser estéril, fluida e estável sob condições de fabricação e armazenamento. A prevenção da ação de microorganismos pode ser realizada por adição de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, ácido sórbico, timerosal e similares.

[00087] Vacinas aqui tipicamente incluem um antígeno em uma quantidade de proteína total de cerca de 1 mg/2 mL para 3 mg/2 mL de dose, em que cerca de 5% a 25% da dose são adjuvante e mais tipicamente de cerca de 10% a 20% da dose são adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante compõe cerca de 18% da dose.

[00088] Os adjuvantes da invenção são combinados com um polipeptídeo com base em somatostatina para fornecer uma vacina útil no tratamento de hormônio de crescimento humano para propósitos de ilustração, e/ou doenças e/ou condições com base em deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1. Note que os adjuvantes descritos aqui poderiam ser combinados com outros antígenos para produzir vacinas novas úteis no tratamento de outra doença humana alvo.

MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DOENÇA HUMANA

[00089] A invenção fornece vacinas do tipo farmacêutico contendo polipeptídeos quiméricos e adjuvantes da invenção. Tais vacinas podem ser administradas em pacientes tendo uma deficiência do hormônio de crescimento e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 para facilitar a liberação apropriada de fontes endógenas no paciente.

[00090] Vacinas da invenção são fornecidas aos pacientes tendo uma deficiência do hormônio de crescimento e/ou do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1. Em uma modalidade, as vacinas da invenção forneceram 1 a 2 vezes, com 3 a 5 reforços no curso de um tratamento. Uma quantidade de antígeno de vacina típica é de 1 a 5 mg/mL de polipeptídeo quimérico. Vacinas podem ser administradas através de técnicas conhecidas. Em uma modalidade a vacina é administrada por meio de injeção subcutânea. Em outra modalidade a vacina é administrada por injeção intradérmica, injeção intramuscular ou infusão.

[00091] Modalidades de vacina da invenção podem também incluir agentes dispersantes ou umectantes, agentes de suspensão, ou outros materiais similares. Por exemplo, as modalidades podem incluir óleos estéreis, mono ou diglicerídeos sintéticos, ácidos graxos ou ácidos oleicos.

[00092] Vacinas são tipicamente preparadas como soluções estéreis, aquosas. Estas soluções são estáveis sob condições de fabricação e armazenamento. Em alguns aspectos, agentes adicionais podem ser incluídos na vacina para impedir ação de microorganismos, por exemplo, agentes antibacterianos ou antifúngicos.

[00093] Soluções de vacina da invenção são preparadas incorporando os materiais nas quantidades requeridas (antígeno, adjuvante, outros ingredientes) e pode ser seguido por esterilização terminal, por exemplo, por meio de tratamento com luz UV ou com ozônio. Alternativamente, soluções de vacina da invenção podem ser preparadas usando componentes individualmente esterilizados antes da montagem final (em cujo caso nenhuma esterilização terminal é requerida).

[00094] Progresso do tratamento para pacientes que recebem as modalidades de vacina da invenção pode ser monitorado e administrações adicionais fornecidas. Aumento nos níveis de hormônio de crescimento, aumento nos níveis do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1, e benefícios funcionais (por exemplo, perda de peso aceitável em um paciente obeso) são todos alvos para monitoramento da efetividade do tratamento. Além disso, onde diabetes tipo 1 ou 2 ou obesidade estiver sendo tratada, glicose do sangue, níveis de IGF-1, perfis de lipídio, níveis de insulina, e níveis de A1C ligada à Hemoglobina (HbAIc) podem ser monitorados para determinar a efetividade do tratamento em um paciente. Com base no progresso de um paciente individual, injeções de vacina adicionais podem ser executadas usando mais ou menos antígenos de acordo com a presente invenção. Além disso, combinações de adjuvante alternativas podem ser usadas para modificar a resposta de um paciente particular à vacinação, como determinado pelo profissional de cuidado médico.

[00095] Modalidades aqui podem ser combinadas com outras terapias convencionais para o estado ou condição de doença de deficiência do hormônio de crescimento-alvo e/ou fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1. Por exemplo, vacinações da invenção podem ser combinadas com insulina de substituição no tratamento de diabetes tipo 1, ou as vacinações podem ser combinadas com cirurgia de perda de peso ou dietas hipocalóricas em um paciente sofrendo de obesidade severa.

[00096] Tendo em geral descrito a invenção, a mesma será mais facilmente entendida em referência aos exemplos seguintes que são fornecidos por via de ilustração e não são intencionados como limitação.

EXEMPLOS

[00097] Os exemplos seguintes são providos para propósitos ilustrativos apenas e não são intencionados a limitar o escopo da invenção.

EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE PROTEÍNA DE FUSÃO DE SOMATOSTATINA DEFEITUOSA DE CAT

[00098] O exemplo presente ilustra a produção de uma proteína de fusão de somatostatina defeituosa de CAT de acordo com as modalidades da presente invenção. Mutagênese local-direcionada foi executada no plasmídeo pET30b-CAT-Som para substituir His192 e His193 com resíduos de glicina (após modificação: Gly192 e Gly193). Inativação dos resíduos de His 193 (e His 192) elimina a capacidade da enzima de CAT para aceitar prótons, assim fornecendo inativação completa da CAT.

[00099] O espaçador no mesmo pET30b-CAT-Som (tendo a(s) substituição(ões)) foi otimizado no códon para expressão por E. coli na ausência das moléculas de tRNA coexpressas.

[000100] A construção de ácido nucleico de somatostatina defeituosa de CAT modificada é mostrada como SEQ ID NO: 12. A sequência da proteína de fusão de somatostatina defeituosa de CAT é descrita como SEQ ID NO: 13, sendo comparada a uma proteína de fusão de CAT-somatostatina inalterada (SEQ ID NO: 14).

EXEMPLO 2: PROTEÍNA DE FUSÃO DE SOMATOSTATINA DEFEITUOSA DE CAT PODE SER EXPRESSA EM NÍVEIS ALTOS

[000101] A construção de somatostatina defeituosa de CAT otimizada no códon como descrita no Exemplo 1 foi usada para expressar a proteína de fusão em células BL21(DE3). Células transformadas foram crescidas em LB e induzidas com 0,4 mM de IPTG durante aproximadamente três horas. Um mililitro de células de uma densidade de cultura de OD 0,7 foi peletizado, e aquecido para 70°C durante dez minutos em 100 μΙ de Tampão de amostra de SDS. Uma amostra de 40 μl de extrato de célula foi carregada por via para SDS PAGE.

[000102] Como mostrado na Figura 2, uma banda de 28 KD que corresponde ao tamanho prognosticado de um de códon otimizado, proteína de fusão de somatostatina defeituosa de CAT foi visível nas vias 1 (LB + IPTG, reduzido) e 3 (LB + IPTG) após indução com IPTG. Nenhuma expressão é vista nas vias de controle 2 (LB, reduzido) e 4 (LB). Como esperado, não houve nenhuma diferença em tamanho da proteína de fusão quando opera sob condições-padrão ou redutoras. EXEMPLO 3: VACINA CONTENDO SOMATOSTATINA DEFICIENTE DE CAT DE CÓDON OTIMIZADO, LIVRE DE ENDOTOXINA

[000103] Uma vacina JH17 ilustrativa de acordo com a presente invenção:

[000104] Solução de Reagente:
1. Base de Carbopol

a. Dissolver 0,5 gramas de Carbopol 974P em água ou solução salina.
b. Misturar e ferver para dissolver. Seguido por colocação em autoclave.
c. Armazenar a 4°C.

2. Base Esqualeno

a. Misturar 58,1 mL de esqualeno, 4,6 mL de Tween 80 de origem não animal e 5,2 mL de Span 85.
b. Mistura foi filtrada através de um filtro de 0,2 μ.
c. Armazenamento a 4°C.

3. Solução de tragacantina

a. Extrair goma de tragacanto com metanol.
b. Coletar fração insolúvel de metanol.
c. Secar em temperatura ambiente.
d. Armazenar em temperatura ambiente em um estado dessecado.
e. Adicionar 1 grama de Tragacantina secada em água ou solução salina.
f. Misturar e ferver para dissolver, seguido por colocação em autoclave.
g. Armazenar a 4°C.

[000105] Preparação da Vacina

1. Antígenos da vacina são preparados em solução salina ou PBS a 5 mg/mL ou menos.
2. Adicionar 6,79 mL de base de esqualeno à garrafa de mistura.
3. Adicionar 10 mL de base de Carbopol à base de Esqualeno (CS).
4. Misturar bem.
5. Adicionar 10 mL de solução de Tragacantina à solução de CS.
6. Misturar bem.
7. Antígenos de vacina, não diluídos ou diluídos para usar em solução salina ou PBS, são acrescentados a um volume final de 82 mL.
8. 1 mL de uma solução de 1% de Timerosal é adicionado e bem misturado.
9. Armazenar a vacina a 4°C até o uso.

[000106] Vacina JH18 ilustrativa alternativa de acordo com a presente invenção:

[000107] Soluções de Reagente:
1. Base de Carbopol:

a. Dissolver 0,5 gramas de Carbopol 974P em água ou solução salina;
a. Misturar e ferver para dissolver; e colocar em autoclave
b. Armazenar a 4°C.

2. Base de Esqualeno:

a. Misturar 58,1 mL de esqualeno, 4,6 mL de Tween 80 de origem não animal e 5,2 mL de Span 85; e filtrar através de filtro de 0,2 μ
b. Armazenar a 4°C.

3. Solução de Arabinogalactana:

a. Adicionar 1-10 gramas de arabinogalactana em PBS ou solução salina;
b. Misturar e ferver para dissolver; e colocar em autoclave
c. Armazenar a 4°C.

[000108] Preparação da vacina:

1. Antígenos da vacina são preparados em solução salina ou PBS a 5 mg/mL ou menos;
2. Adicionar 6,79 mL de base de esqualeno à garrafa de mistura;
3. Adicionar 10 mL de base de Carbopol à base de Esqualeno;
4. Misturar completamente e adicionar 10 mL de solução de arabinogalactana;
5. Antígenos da invenção, não diluídos ou diluídos, para usar em solução salina ou PBS, são acrescentados a um volume final de 82 mL.
6. 1 mL de uma solução a 1% de timerosal é adicionado e a vacina misturada; e
7. A vacina armazenada a 4°C até o uso.

EXEMPLO 4: TRATAMENTO DE DOENÇA CARDIOVASCULAR USANDO VACINA DO EXEMPLO 3

[000109] O Exemplo presente usa ratos com disfunção do ventrículo esquerdo como preparado no protocolo publicado em Genentech, 1995. Dois grupos de ratos são segregados (cada membro de cada grupo tendo uma artéria coronária esquerda ligada), um primeiro grupo de tratamento recebe as vacinações da invenção e um segundo grupo de controle (nenhuma vacinação, mas do contrário tratado o mesmo). Cada membro do grupo de tratamento recebe uma vacinação e então 21 dias depois uma segunda vacinação, administrada intramuscularmente (1 mL/dose). Níveis do IGF-1 no soro e anticorpos de antissomatostatina são medidos no dia 0, dia 21 e dia 42. No dia 42, os parâmetros hemodinâmicos são também medidos em ambos os grupos como também uma determinação de tamanho do infarto e índice cardíaco.

[000110] É antecipado que o grupo de rato que recebe as duas vacinações, como descrito no Exemplo 3, teria função cardíaca substancialmente melhorada (diminuiu o tamanho do infarto e melhorou o índice cardíaco) quando comparada ao grupo de controle.

EXEMPLO 5: TRATAMENTO DE OBESIDADE USANDO VACINA DO EXEMPLO 3

[000111] Um modelo de obesidade de rato como descrito em Vickers et al (2001) será usado para determinar o efeito que as vacinas da invenção tem na obesidade. Os ratos são alimentados com uma dieta hipercalórica durante 30 a 60 dias. Os ratos hipercalóricos serão pesados e separados em três grupos - um grupo de controle de solução salina e um grupo de vacinação continuaram em uma dieta hipercalórica, e um grupo de dieta calórica normal. Ratos que recebem a vacinação receberão 2x dose de 1 mL intramuscularmente no dia zero e no dia 21. Todos os ratos serão pesados semanalmente ao longo do período de estudo. No dia 42, todos os ratos serão pesados e soro colhido para análise de IGF-1, análise de ureia e níveis de anticorpo antissomatostatina.

[000112] É esperado que ratos que recebem as vacinações como descritas no Exemplo 3 terão controle de peso substancialmente melhorado sobre os grupos de controle de solução salina e mostram resultados de soro correspondentes que correlatam que controle de peso seja devido à modificação do hormônio de crescimento. O grupo vacinado substancialmente mostrará o mesmo controle de peso que o grupo de admissão calórica normal.

EXEMPLO 6: TRATAMENTO DE DEFICIÊNCIA DE CRESCIMENTO USANDO VACINA DO EXEMPLO 3

[000113] Ratos Cox de três semanas de idade (CD) serão vacinados mensalmente durante 3 meses usando uma dose de 1 mL. Cada vacinação ocorrerá intramuscular ou subcutaneamente. Ratos de controle receberão injeções de solução salina, usando o mesmo modo de administração e o mesmo volume de material para administração. Todos os ratos serão semanalmente pesados para determinar o crescimento e serão sangrados em 0, 4, 8, 12 e 16 semanas. Soro será colhido em um horário similar e será analisado para IGF-1, ureia e níveis de anticorpo de antissomatostatina.

[000114] É esperado que os ratos CD recebendo vacinações como descrito no Exemplo 3 tenham crescimento substancialmente melhorado quando comparado aos ratos CD de controle. Ratos tratados deveriam mostrar resultados de soro que confirmem os efeitos das vacinações em ratos tratados.

EXEMPLO 7: SOMATOSTATINA AUMENTADA LEVA A GANHO DE PESO EM CAMUNDONGOS

[000115] Estudos de obesidade de camundongo foram executados para ver se somatostatina exogeneamente administrada causariam ganho de peso nos camundongos. Um estudo de sete dias foi executado em camundongos de cruzamento não parental onde três adjuvantes inventivos diferentes foram combinados com somatostatina recombinante (adjuvantes são referidos como JH 14, JH 17 e JH 18). Cada adjuvante foi salpicado com 1 mg/mL de somatostatina recombinantemente produzida (produzida em 2009) e um adjuvante (JH14) foi também salpicado com somatostatina produzida em 2007 a uma concentração de 2,57 mg/mL. Um grupo de controle de camundongos recebeu uma injeção de solução salina estéril.

[000116] Cada camundongo foi pesado no começo do estudo para determinar um peso de linha base. Vacinações foram executadas em cada camundongo no dia 0 por injeção IP de 0,5 mL de vacina. Somatostatina em adjuvantes JH17 e 18 foi administrada a camundongos fêmeas e JH14 a camundongos machos. Os camundongos foram alimentados com uma dieta normal no curso dos 7 dias com cada camundongo sendo repesado no dia 7.

[000117] Como mostrado na Figura 3, os camundongos de cruzamento não parental que recebem somatostatina permaneceram saudáveis e mostraram pequenos efeitos adversos do estudo de uma semana. Camundongos fêmeas no grupo JH 17 tiveram um aumento em peso, enquanto os Camundongos fêmeas de JH 18 foram similares em ganho de peso aos camundongos de controle. Camundongos machos nos dois grupos de JH14 (2007 e 2009) ambos mostraram ganho de peso sobre o grupo de controle de camundongos machos. Em geral as descobertas na Figura 3 ilustram que os adjuvantes JH14, JH17 e JH18 são seguros para o uso em camundongos, altamente consistentes e capazes de armazenamento, e que somatostatina exogeneamente administrada em geral resulta em aumento de peso em um camundongo-alvo, fornecendo evidência que somatostatina está envolvida em ganho de peso. Todos os efeitos ocorreram dentro de vários dias de imunização IP. Isto é devido ao processamento de macrófago direto e antígeno e apresentação de linfócitos B a uma taxa acelerada, devido à via de administração, à natureza dos polipeptídeos quiméricos e ao efeito do adjuvante.

[000118] As pré-misturas de JH 14, 17 e 18 são como descritas neste e no Pedido de Patente US S/N PCT/US08/68195, intitulado Chloramphenicol Acetyl Transferase (CAT)-Defective Somatostatin Fusion Protein and Uses Thereof. A formulação final tinha 1 mg de antígeno de proteína por 1 mL de dose. Para este trabalho, as formulações foram as seguintes:
JH17
Proteína redobrada 12 mL (5,86 mg/mL)
PBS de Dulbecco 24,5 mL
Pré-mistura de JH 17 13,4 mL
1% de Timerosal 0,5 mL
37% de formaldeído 0,1 mL
JH18
Proteína redobrada 12 mL (5,86 mg/mL)
PBS de Dulbecco 24,5 mL
Pré-mistura de JH 18 13,4 mL
1% de Timerosal 0,5 mL
37% de formaldeído 0,1 mL
JH14
Proteína redobrada 12 mL (5,86 mg/mL)
PBS de Dulbecco 27,8 mL
Pré-mistura de JH 14 10 mL
1% de Timerosal 0,5 mL
37% de formaldeído 0,1 mL

[000119] Note que as formulações acima incluem timerosal e formaldeído para limitar a contaminação das vacinas. Estes materiais são apenas usados onde garrafas de reentrada de multidose para dispensar a vacina estão em uso, tipicamente os protocolos de tratamento humanos e animais serão empacotados em frascos de apenas um uso, assim eliminando a necessidade destes conservantes. Também note que um nível mais alto de antígeno foi usado no lote de JH14 2007 para compensar a degradação da proteína.

EXEMPLO 8: TRATAMENTO DE OBESIDADE EM CAMUNDONGOS

[000120] Estudos de obesidade de camundongo foram executados usando camundongos de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Vários camundongos endogâmicos da linhagem C57BL/6J foram obtidos de Jackson Laboratories, os camundongos eram: machos, mostravam obesidade severa induzida, tinha genéticas poligênicas, e exibiam obesidade de princípio maduro. Em testagem anterior, Jackson Laboratories tinha determinado que esta cepa particular de camundongos, quando alimentada em uma dieta hiperlipídica, desenvolve fenótipos de síndrome metabólica bem parecidos na natureza com aqueles relatados na população humana. Por exemplo, camundongos C57BL/6J alimentados com uma dieta hiperlipídica mostrarão adiposidade visceral, resistência à insulina, hiperinsulinemia, hiperleptinemia, resistência à leptina e hipertensão.

[000121] Estudos foram conduzidos para testar a efetividade das modalidades da vacina aqui para tratar obesidade, isto é, incluindo limitar o ganho de peso em alguns camundongos para causar perda de peso em camundongos C57BL/6J. Camundongos de seis semanas de idade foram alimentados com uma dieta gordurosa de 60% de kcal% durante 6 semanas. Camundongos de doze semanas de idade foram depois separados em um de quatro grupos: grupo 1 incluiu camundongos tratados com vacina contendo JH14; grupo 2 incluiu camundongos tratados com vacina contendo JH17, grupo 3 incluiu camundongos tratados com vacina contendo JH 18, e grupo 4 incluiu camundongos de controle que foram tratados com PBS ao invés de qualquer tipo de antígeno de tipo antissomatostatina. Os camundongos em cada grupo foram vacinados usando uma vacina especificada de 0,5 mL ou PBS por meio de uma via IP. Após vinte e dois dias, os camundongos foram tratados novamente com uma segunda dose IP usando 0,1 mL de vacina.

[000122] Ao longo do curso do estudo (6 semanas) cada camundongo foi pesado duas vezes por semana e admissão de alimento monitorada, isto é, para assegurar que as alterações de peso não foram devido à perda ou aumento na admissão alimentícia (vide Figura 4 exibindo admissão alimentícia cumulativa dentro de cada um dos 4 grupos). Uma sangria terminal foi executada em cada camundongo na conclusão do estudo e os níveis de IGF-1 determinados (níveis de IGF-1 do plasma foram determinados usando Diagnostic Systems Laboratories Inc. Active Mouse/Rat IGF-1 ELISA (DSL-10-29200).

[000123] Como mostrado nas Figuras 5 e 6 e Tabela 1, camundongos trataram com JH 14, 17 e 18 todos mostraram uma diferença altamente significativa (p < 0,0001) por análises estatísticas paramétricas ou não paramétricas) na porcentagem do Peso do Corpo Final versus Peso de Linha Base. Perda de peso significativa foi observada em cada grupo vacinado dentro dos primeiros 7 dias enquanto o grupo de controle mostrou ganho de peso suave no mesmo período de tempo. Uma perda de peso pequena foi também observada após a segunda dose de vacina (1/5° da dose fornecida no dia 1) ter sido administrada aos grupos JH14, JH17 e JH18 no dia 22.

[000124] Dados do estudo de obesidade de camundongo forneceram as conclusões seguintes: (1) embora não haja uma diferença estatisticamente significativa entre JH 18 e os controles, em termos de ng/mL de IGF-1, há uma diferença altamente significativa entre estes grupos (P < 0,0001) por análise estatística paramétrica ou não paramétrica na porcentagem do Peso do Corpo Final versus Peso de Linha Base; (2) Na Porcentagem do Peso do Corpo Final versus Peso de Linha Base, JH17 versus os controles produziu uma estatisticamente diferença significativa por ambos os testes estatísticos; (3) JH 18 (que teve um nível médio de IGF-1 de 135,8 ng/mL a mais que JH17), demonstrou uma diferença estatisticamente significativa versus JH 17 na porcentagem do peso de linha base (apenas pelo teste não paramétrico); (4) antígeno quimérico de somatostatina da invenção nos adjuvantes JH17 e JH18 induziu uma diferença estatisticamente significativa na porcentagem do peso do corpo final versus Peso de Linha Base; (5) JH18 foi estatisticamente significativo quando comparado com JH17 por análise não paramétrica em termos de porcentagem do Peso do Corpo Final versus Peso de Linha Base; (6) níveis de IGF-1 podem ser correlacionados com uma maior perda de peso ao término do estudo versus controles e vacina de JH17 (vide Tabela 2); (7) uma vez que todos os vacinados tinham as mesmas quantidades de dose do antígeno quimérico-somatostatina da invenção, um efeito do adjuvante foi observado dentro do estudo; (8) camundongos C57BL/6J machos endogâmicos alimentados com 60% de kcal de dieta gordurosa demonstraram uma perda de peso significativa dentro da primeira semana pós-vacinação de IP; e (9) a perda de peso mostrada aqui persistiu até mesmo enquanto os camundongos comeram uma dieta gordurosa de 60% de kcal para a duração do estudo.
Tabela 1: Peso do Corpo Final versus Peso de Linha Base

Tabela 2: Análise Estatística de IGF-1

[000125] Os seguintes parágrafos numerados contêm outros aspectos aqui revelados:

1. Método para tratar uma deficiência de hormônio do crescimento em um paciente, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

[000126] administrar uma quantidade imunogênica de uma vacina ao paciente, a vacina compreendendo um antígeno à base de somatostatina e um adjuvante, em que a vacina administrada resulta em um aumento nos níveis de hormônio do crescimento no paciente com deficiência de hormônio do crescimento.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende um polipeptídeo quimérico de somatostatina-14 funcionalmente ligado a uma enzima CAT substancialmente inativada.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o adjuvante compreende uma quantidade eficaz de carbopol 974p.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o adjuvante compreende ainda esqualeno e Tween 80 de origem não animal.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente é um adulto com deficiência de crescimento.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente é uma criança com deficiência de crescimento.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente em tratamento para deficiência de hormônio do crescimento tem uma doença da mucosa.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente em tratamento para deficiência de hormônio do crescimento tem uma doença cardíaca.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente em tratamento para uma deficiência de hormônio do crescimento é obeso.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente é um cão obeso.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente é um gato obeso.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente é um cavalo com necessidade de reparo da cartilagem.
13. Método para tratar uma deficiência de fator de crescimento semelhante à insulina 1 em um paciente, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

[000127] administrar uma quantidade imunogênica de uma vacina ao paciente, a vacina compreendendo um antígeno à base de somatostatina e um adjuvante, em que a vacina administrada resulta em um aumento nos níveis de fator de crescimento semelhante à insulina 1 no paciente com deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina 1.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o paciente em tratamento para deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina 1 tem diabetes tipo 1 ou tipo 2.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o paciente em tratamento para deficiência de fator de crescimento semelhante à insulina 1 tem um distúrbio de estresse.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o paciente em tratamento para deficiência do fator de crescimento semelhante à insulina 1 tem doença cardíaca.
17. Um adjuvante para uso em uma vacina para o tratamento de um vertebrado, o adjuvante compreendendo:

[000128] uma base de carbopol 974p;

[000129] uma base de esqualeno; e

[000130] uma solução de arabinogalactano;

[000131] em que o adjuvante atua como um veículo para um antígeno à base de somatostatina para o tratamento de hormônio de crescimento humano ou deficiência de fator de crescimento semelhante à insulina 1 no vertebrado.
18. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a base de esqualeno é uma combinação de esqualeno, Tween 80 de origem não animal e Span 85.
19. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antígeno à base de somatostatina é a somatostatina-14 ligada a uma enzima CAT substancialmente inativada.
20. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a enzima CAT inativada tem um ou mais resíduos de histidina de tipo selvagem substituídos por alanina, glicina ou outro aminoácido semelhante.
21. Vacina para o tratamento de um paciente com deficiência de hormônio do crescimento e/ou fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1, a vacina caracterizada pelo fato de que compreende:

[000132] uma quantidade imunogênica de antígeno à base de somatostatina; e

[000133] um adjuvante compreendendo pelo menos Carbopol 974p, esqualeno e arabinogalactana.
22. Vacina, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o antígeno à base de somatostatina é a somatostatina-14 ligada a uma enzima CAT inativada.
23. Vacina, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a enzima CAT inativada tem um ou mais resíduos de histidina de tipo selvagem substituídos por alanina, glicina ou outro aminoácido semelhante.
24. Método para o tratamento da obesidade em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende:

[000134] administrar uma quantidade imunogênica de uma vacina ao paciente obeso, em que a vacina compreende um antígeno à base de somatostatina e um adjuvante; e

[000135] monitorar o progresso do tratamento no paciente.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o paciente é um humano, cachorro, gato ou cavalo.

Claims

Vacina para tratamento de obesidade em um paciente, caracterizada pelo fato de que compreende:
uma quantidade imunogênica de antígeno com base em somatostatina, em que o antígeno baseado em somatostatina é somatostatina-14 ligada a uma enzima de CAT inativada apresentando um ou mais resíduos de histidina do tipo selvagem substituídos com alanina, glicina ou outro aminoácido similar; e
um adjuvante compreendendo pelo menos Carbopol 974P, esqualeno e arabinogalactana.
Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende ainda esqualeno e Tween 80 de origem não animal.
Vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o paciente é um adulto obeso ou uma criança obesa.
Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o paciente em tratamento para obesidade apresenta uma doença cardíaca.
Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o paciente a ser tratado para obesidade tem diabetes tipo 1 ou tipo 2.
Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o paciente em tratamento para obesidade apresenta um distúrbio de estresse.
Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda monitorar o progresso do tratamento no paciente.
Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o paciente é um humano obeso, um cão obeso, um gato obeso ou um cavalo obeso.
Vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende ainda Span 85.