CN115135338A - 包含具有二硫桥重排的人vegf-a突变体的多肽以及包含其的组合物 - Google Patents

Abstract

包含以二硫桥的非天然重排进行折叠的人血管内皮生长因子A(VEGF‑A)的同种型的功能突变体的多肽，其中所述突变体的多肽链的第二个和第四个半胱氨酸仅形成分子内桥，并且所述突变体的第七个和第八个半胱氨酸仅形成分子间桥。本发明还包括包含这些多肽中的至少一种的抗原制备物，以及包含所述抗原制备物和疫苗佐剂的药学组合物。本发明的抗原制备物在制备药物中使用，所述药物用于治疗其进展与血管发生、炎症和免疫抑制的增加相关的疾病，以及用于恢复免疫系统。

Description

包含具有二硫桥重排的人VEGF-A突变体的多肽以及包含其的 组合物

技术领域

本发明涉及生物技术，和涉及人类健康领域。本发明提供了多肽，其包含以二硫桥的非天然重排进行折叠的人血管内皮生长因子A(VEGF-A)的功能突变体。本发明提供了对于生成包含这些多肽的疫苗组合物的基础，所述疫苗组合物用于预防和治疗随着血管发生、炎症和免疫抑制的增加而出现的病理学状况。

发明背景

VEGF-A及其受体的系统构成分子复合物，其相互作用特异性地调节内皮细胞的生长、通透性、可塑性和能动性，其中对于病理性新生血管发生具有正效应。VEGF-A及其受体的表达的失调在肿瘤细胞中和在间质中发生，在那里它们特别地表达并且调节内皮细胞的功能。在过去20年中在根本上描述了肿瘤VEGF-A对于围绕肿瘤的组织的内皮细胞的旁分泌效应，以及该生长因子对于表达其受体的肿瘤细胞和间质的自分泌效应(Carmeliet,NatMed,2003,9:653-60；Mashreghi等人,J Cell Physiol,2018,233:2949-65)。

VEGF-A在内皮细胞中诱导增殖、能动性和组织化的增加，这导致新血管的形成，它们的排列和成熟依赖于VEGF-A及其同种型的梯度以及其他促血管发生因子及其受体的存在(Carmeliet,Nat Med,2003,9:653-60)。除了该主要功能，在骨髓来源的细胞中其1和2型受体和其共同受体的表达的证据指出该因子是炎症和免疫抑制过程的中心介体。已知，例如，在树突细胞中VEGF-A与1型受体相互作用，并且通过其对于转录因子NFκB的效应来降低其成熟(Gabrilovich等人,Nat Med,1996,2:1096-103；Gabrilovich等人,Blood,1998,92:4150-66)。此外，该生长因子与VEGF-A的2型受体(VEGFR2)(其在效应T细胞中诱导)相互作用，作为用于负向地调节γ-干扰素(IFN-γ)的分泌应答的机制(Ziogas等人,Int JCancer,2012,130:857-64)。VEGF-A还是炎症过程的必不可少的介体，并且在与尤其是赘生和关节炎现象相关联的损伤的微环境中诱导巨噬细胞和嗜中性粒细胞的表型变化(Voron等人,Front Oncol,2014:4:70)。

在该情景下，VEGF-A蛋白家族及其受体构成了在其病程与已描述的过程相关联的疾病中主动和被动免疫疗法所指向的靶标。VEGF-A及其受体作为靶标的用途从接受包括用阿瓦斯丁、索拉非尼和舒尼替尼的被动免疫疗法作为多种肿瘤实体以及与年龄相关的黄斑变性的一线治疗开始而得到验证(Wentink等人,Biochim Biophys Acta,2015,1855:155-71)。用该生长因子的主动类型的免疫疗法(其牵连自身免疫应答的诱导)经历了较缓慢的发展。直至2002年，仅报道了很少的用VEGF-VEGFR系统作为靶标的研究。大部分这些努力致力于分析异种变体(Wei等人,Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98:11545-50)或者与VEGF-A具有高度的结构和功能同源性的变体(国际专利申请号WO 99/45018和WO 00/53219)的免疫原性、抗血管发生效应和抗肿瘤效应。异种变体的使用在不存在细胞应答的情况下诱导高滴度的中和性和特异性的抗体，而同源分子的使用诱导边缘免疫应答，但没有抗肿瘤或抗转移效应的证据。这些策略中没有任何一个转化为临床实践。

在2002年，揭示了在针对所述生长因子的主动免疫接种中使用VEGF-A的功能突变体，以裸脱氧核糖核酸(DNA)以及与作为佐剂使用的免疫刺激序列相融合的重组蛋白质的形式(专利申请号PCT/CU03/00004)。

施用VEGF-A的突变体(Arg82,Lys84,His86→Ala82,Ala84,Ala86；或者Arg82,Lys84,His86→Glu82,Glu84,Glu86)导致T特异性抗肿瘤免疫应答的诱导，当采用用裸DNA(Bequet-Romero等人,Angiogenesis,2007,10:23-34)或者在佐剂存在下用蛋白质(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93)进行的疫苗接种时。此外，用蛋白质制剂取得了中和VEGF-A与其1和2型受体的结合的抗体的诱导(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93；Morera等人,Vaccine,2012,30:368-77)。尽管引入至VEGF-A的突变消除了与VEGFR2结合的可能性，但是生成了阻碍VEGF-A与所述受体相互作用的抗体。该疫苗策略的使用在黑素瘤(MB16F10)、肺癌(3LLD122和TC1)、乳腺癌(F3II)和结肠直肠癌(CT26)的鼠类模型中导致相关的抗肿瘤和抗转移效应。对于所述变体，证明诱导了对于同系肿瘤细胞的直接细胞应答，伴随有对于与VEGF-A的温育来说特异性的IFN-γ的表达(Bequet-Romero等人,Vaccine,2012,30:1790-9)。与其余策略不同，该策略采用了代表了VEGF-A的同种型121的在细菌中产生的重组抗原，其中没有消除在天然VEGF-A结构中的促进二聚体形成的半胱氨酸。该疫苗策略的使用证明，关于对于免疫接种的应答，在所研究的物种中存在优异的潜在应答储备(Sanchez Ramirez等人,BMC Immunol,2017,18:39)。

通过采用诸如佐剂及其浓度的变化以及增加待施用的抗原的质量的策略，在临床前模型中和在临床中取得了增加的免疫应答和益处(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93；Gavilondo等人,Vaccine,2014,32:2241-50；Perez Sanchez等人,Hum VaccinImmunother,2015,11:2030-7；Sanchez Ramirez等人,BMC Immunol,2017,18:39)。在所有情况下，这些增加发生，而不损害所研究的物种的生理学参数，并且保持所述应答的自我调节特征。在处于研究中的受试者的免疫接种过程期间所获得的抗体水平显著更低，如果与在“推注”施用治疗性抗体后存在的抗体水平相比较。前面提及的要素表明，关于改善对于所述疫苗的应答，以取得治疗优势，而没有生成不利效应的危险，还存在空间。

因此，对于获得具有增加的抗血管发生、抗肿瘤、抗转移、抗炎和免疫恢复效应的人VEGF-A变体仍然存在兴趣，所述变体允许在用包含所述变体的抗原制备物进行免疫接种的个体中所实现的免疫应答的改善。

发明描述

本发明通过提供这样的多肽而解决了前面所提出的问题，所述多肽包含以二硫桥的非天然重排进行折叠的人VEGF-A的同种型的功能突变体，其中所述突变体的第二个和第四个半胱氨酸仅形成分子内桥，并且所述突变体的第七个和第八个半胱氨酸仅形成分子间桥。出于本发明的目的，考虑了VEGF-A的功能突变体为这样的分子，其氨基酸序列相对于天然变体而言保留95％的同一性，但是与之不同之处在于它不与VEGFR2结合，并且不诱导与通过其的信号转导相关联的效应。

本发明的多肽以前未曾描述过，其与人VEGF-A家族的蛋白质有关，特别地与VEGF-A即其同种型有关。它们最初从向由SEQ ID NO:2所定义的多肽的纯化过程中引入变化开始来生成(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93)。它们的分析表明了相对于原始抗原制备物PVM而言在稳定性、免疫原性和抗肿瘤效应方面的增益(实施例1、2、3、4和5)。

为了获得本发明的多肽(其包含人VEGF-A的同种型的功能突变体)，在VEGF-A与VEGFR2的结合中所牵涉的氨基酸之中进行突变。在本发明的一个实施方案中，所述多肽的特征在于，所述人VEGF-A的同种型选自由下列各项组成的组：VEGF-A¹²¹、VEGF-A¹⁴⁵、VEGF-A¹⁶⁵、VEGF-A¹⁸⁹和VEGF-A²⁰⁶。增加免疫原性的在本发明中所发现的半胱氨酸重新排列扩展至共享对于VEGF-A 121所描述的半胱氨酸的规范结构(图1)并且具有相同的治疗效应的那些VEGF-A的同种型。因此，使用相同的克隆和表达系统来插入相应于VEGF-A¹⁴⁵、VEGF-A¹⁶⁵、VEGF-A¹⁸⁹和VEGF-A²⁰⁶的序列。在保留了“半胱氨酸结”的产物与未保留其的产物之间的比较评价表明，在该规范结构不存在下，复制了对于抗原PVM和PVM-I所描述的免疫原性的增加(实施例2)。

在本发明的一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第五个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸、两条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第五个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸、两条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸、两条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第五个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸和两条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸和两条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸和两条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在另一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

在本发明的一个实施方案中，包含人VEGF-A的同种型的功能突变体的多肽另外还包含增加其在细菌中的表达的氨基末端区段和使其纯化容易的羧基末端区段。

不构成对于本发明的范围的限制，在本发明的一个实施方案中，研究了包含脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)P64K蛋白的氨基末端的46个氨基酸(SEQ ID NO:24)的重组嵌合蛋白的异构体混合物。在所述嵌合蛋白中，所示的氨基末端区段和经突变的人VEGF-A的同种型121的氨基末端被作为这两个区段之间的桥梁起作用的13个氨基酸分隔开。此外，所述蛋白质在羧基末端具有六个组氨酸的区段，该区段为了生产目的而使用。由于在所述融合多肽中保留了Cys 110和119，其等价于天然VEGF-A的Cys 51和60(图1)；因而更可能获得其中分子的二级结构受到影响的结构异构体。只有Bequet-Romero等人和Morera等人的以前工作使用了包括这些半胱氨酸的VEGF-A变体。但是，在它们的任一个中均未观察到在所述多肽序列的半胱氨酸2和4之间的链内二硫键的形成。在所述抗原中这两个氨基酸的存在以及获得这一点所经由的过程(其中半胱氨酸2和4仅形成链内键)构成了用于获得具有疫苗目的的蛋白质的新方法。总之，该策略导致有助于增加的免疫应答的位点的暴露。这可以归因于被中和VEGF-A与其2型受体的结合的抗体所识别，或者归因于推动了通过蛋白体的消化和通过抗原呈递细胞的新肽的暴露。

本发明的一个特别的实施方案为这样的多肽，其具有在序列表中标示为SEQ IDNO:18至SEQ ID NO:23的氨基酸序列。这些多肽具有相对于保留了对于人VEGF-A的同种型121所描述的三级结构的多肽而言增加的免疫原性特性。在所述多肽中具有所述抗原的三级结构的修饰，其取得了所希望的优异效应。该优异的免疫原性是令人惊讶的，因为它们在二级结构中具有变化，这些变化迄今为止被描述为对于获得特异于人VEGF-A的有效免疫应答来说不是最佳的(Wentink等人,Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113:12532-7)。

在为了标示为SEQ ID NO:2的多肽而建立的纯化方法中，获得了具有与对于天然蛋白质所描述的那些相似的半胱氨酸结结构的VEGF-A的结构异构体，如在实施例1中所显示的。出人意料地，在所述多肽的纯化中的变化导致具有牵涉Cys 110和119(相应于VEGF-A的Cys 51和60，其天然地形成分子间桥)的链内二硫键的异构体家族的富集。在本文中称为PVM-I的抗原制备物之中，还观察到牵涉Cys 161、163和175的链间桥的形成，这导致通过二硫桥的寡聚体结构的形成。现有技术中不存在有关于在本文中所描述的折叠的形成、稳定化和排列的信息。这是由于实际上没有任何一项VEGF-A研究保留了等价于天然VEGF-A的Cys 51和60的Cys。当保留这些半胱氨酸时，施行了受控的复性过程，其目标是重构天然的二硫桥(Pizarro等人,Protein Expression and Purification,2010,72:184-93)。因此，新的键(而不是规范的键)的检测以及其与制备物PVM-I的优异的稳定化和生物学活性的关系是本发明的一个出人意料的和令人惊讶的发现。

本发明并不局限于用于获得在抗原制备物PVM-I中存在的结构异构体的特定形式。如在实施例7中所证明的，这些异构体可以通过其他程序来获得和分开。同样地，在该实施例中，验证了在免疫原性的增加方面，不同的结构异构体的贡献的同等性。在表现出较小的对于胰蛋白酶消化的抗性的蛋白质级分之中，共存有在诱导特异性免疫应答的增加方面具有相似的能力的结构异构体。

制备物PVM-I由异构体的混合物组成，或者由通过反相色谱法(其有效地分开12种异构体变体)分离出的特定异构体组成。异构体混合物中的任何一种都是有效的，因为分开地施用所述异构体模拟了包含其的制备物的在免疫学水平上的效应(实施例7)。这可以涉及，在所有情况下，推动了通过内切蛋白酶例如胰蛋白酶(其是负责生成待在MHC环境中向免疫系统呈递的肽的蛋白体系统的必需组分)的作用来生成肽(Pamer等人,Annu RevImmunology 1998,323-358)。

本发明的目标还为包含至少一种多肽的抗原制备物，所述多肽包含以二硫桥的非天然重排进行折叠的人VEGF-A的同种型的功能突变体，其中其多肽链的第二个和第四个半胱氨酸仅形成分子内桥，并且其多肽链的第七个和第八个半胱氨酸仅形成分子间桥。所述抗原制备物包含至少一种在药学上可接受的赋形剂或稀释剂。所述免疫原的剂量可以在既不是有毒的也不具有治疗效应的对于制药用途来说可接受的载料中进行施用。这些载料包括离子交换剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质、缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、植物来源的饱和脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质以及聚乙二醇。在本发明中，优选地使用tris-HCl缓冲液作为所述疫苗制备物的载料。

本发明并不局限于通过给出的获得方法所获得的抗原制备物，因为本发明的目标是具有与在自然界中存在的人VEGF-A的同种型不同的二级/三级结构的多肽。由包含人VEGF-A的同种型的突变体的多肽所构成的异构体家族可以通过其他策略均质地获得，所述其他策略尤其包括通过反相色谱法(RP-HPLC；反相-高压液相色谱法)或者从受控复性的设计开始(在存在变性试剂不平衡的情况下)的结构异构体的纯化。如在实施例7中所显示的，结构同种型可以通过RP-HPLC来分开，并且其以独立方式和以相同浓度的使用导致在免疫原性以及抗肿瘤和抗转移效应方面与用已经描述的混合物(PVM-I)所获得的相似的效应。

根据在使用弗氏佐剂的临床前研究中所初步证明的，制备物PVM-I是具有较高免疫原性和稳定性的抗原变体(实施例1)。后来，将所述研究扩展至与在非人哺乳动物中(实施例2-5和9-13)和在人中(实施例14和15)的治疗场景相关的佐剂和规划。具有较高稳定性的抗原变体的使用在生产和商业情景下是重要的，但增加的免疫原性特性提供了优异的治疗解决方案(实施例2-5、9-15)。

本发明还公开了包含抗原制备物的药学组合物，所述抗原制备物包含至少一种多肽，所述多肽包含以二硫桥的非天然重排进行折叠的人VEGF-A的同种型的功能突变体，其中其多肽链的第二个和第四个半胱氨酸仅形成分子内桥，并且其多肽链的第七个和第八个半胱氨酸仅形成分子间桥。

本发明的组合物包含至少一种在药学上可接受的疫苗佐剂。为了有利于免疫应答的发展，可以将本发明的结构异构体与已经描述的免疫增强剂相组合。在这之中包括无机盐，免疫刺激剂例如细胞因子、分子佐剂(CD40、CD154、I型MHC的不变链、LFA3)、皂苷类、胞壁酰二肽衍生物、寡核苷酸CpG、脂多糖、单磷酰脂质A和聚磷腈，脂质颗粒例如乳状液(例如，弗氏佐剂、MF59、Montanide)、脂质体、纳米颗粒、病毒体、ISCOMS、螺旋状体(cochleates)、微颗粒佐剂、泊洛沙姆、病毒和细菌抗原。还考虑粘膜佐剂。在一个特别的实施方案中，所述佐剂选自由下列各项组成的组：油性佐剂、铝盐、脂蛋白体和与神经节苷脂相缀合的脂蛋白体。

该抗原与在药学上可接受的佐剂的组合可以有贡献于降低或避免转移的出现，减少或消除原发性肿瘤，作为一线或二线疗法，与或不与其他抗肿瘤试剂相联合地(实施例2-5、9-12和14)。该类型的主动免疫疗法在单一或联合治疗中对于治疗尤其是急性和慢性炎症过程(哮喘、呼吸窘迫、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化、组织水肿)、感染性疾病(肝炎、卡波西肉瘤)、自身免疫性疾病(糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎)、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、新生血管性青光眼、血管瘤和血管纤维瘤来说也是有效的(实施例12、13和15)。

特别地，本发明涉及与一套分组在名称NAcGM3-VSSP之下的佐剂一起以每周一次的规划施用所述疫苗抗原。该佐剂可以从下述步骤开始来获得：按照所描述的(专利US6149921；国际申请WO201986056A1；Regalado等人,Organic Process Research&Development 2013,17:53-60)，将天然的或通过合成途径获得的神经节苷脂N-乙酰基GM3与脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜囊泡相缀合。在此之后，将以VSSP(非常小尺寸脂蛋白体(VerySmall Size Proteoliposome))而为人所知的该佐剂的变体称为NAcGM3-VSSP。掺入了合成的N-乙酰基GM3的那些根据被掺入到神经节苷脂中的脂肪酸的长度而有所不同。通常，用其中掺入了硬脂酸(sNAcGM3-VSSP)和油酸(oNAcGM3-VSSP)的变体，获得与用掺入了天然神经节苷脂的变体所获得的相似的结果，在免疫原性以及抗肿瘤和抗转移效应方面。当采用PVM-I作为抗原时，在所有这些配佐条件下都获得优异的抗肿瘤、抗转移、抗炎和免疫恢复效应(实施例4-12)。

组织病理学分析在所有情况下均显示了在原发性肿瘤中的功能血管数目的减少、其细胞密度的降低以及向着有丝分裂/凋亡平衡降低的显著趋势，这与肿瘤生长负相关。考虑到大部分由癌症引起的死亡与转移事件相关，还在自发和实验肺转移的侵袭性模型中评价了所述抗原制备物。在所有情况下，制备物PVM-I都显示出更好的抗转移活性特性谱，其显著地优于用疫苗抗原PVM所获得的那些。

转移病灶的分析显示出与经治疗的原发性肿瘤相似的特征，具有血管系统的减少以及有丝分裂/凋亡平衡的降低，同时坏死病灶增加，其与所发现的转移数目相关。令人感兴趣的是，除了减少转移病灶的数目外，疫苗接种还降低了其大小和增殖能力，这表明在转移过程的至少两个阶段(病灶的植入以及其生长)中存在对于疫苗的免疫应答效应(实施例9)。

特别地，对于磷酸铝，还以每两周一次的规划施用本发明的抗原制备物。当采用PVM-I作为抗原时，用该佐剂获得了优异的抗肿瘤、抗转移、抗炎和免疫恢复效应。

以相似的浓度并且在所有所研究的佐剂中，制备物PVM-I都显著地优于PVM，在特异性抗体应答和血清中和能力方面。这对于所检定的两个小鼠品系都发生了，这表明了所述疗法在不同的单元型中诱导应答的广泛潜力。类似地，对于用NAcGM3-VSSP进行的配佐，显示PVM-I在诱导细胞应答(对于每种情况，其直接消除同系肿瘤细胞)方面也是优异的。该新的抗原制备物在VEGF-A的序列的同源性方面更接近的物种之中也具有优异的效应，如非人灵长类的情况。

对于治疗性应用，通过本技术领域专业人员已知的途径以在药学上可接受的剂量向哺乳动物(优选地，人)施用本发明的疫苗制备物。本发明的抗原制备物的施用可以以与其他治疗伴行地或顺次地进行。

新的抗原制备物PVM-I的施用显著地降低了各种来源的瘤形成的肿瘤生长，包括黑素瘤、肺癌、乳腺癌和结肠癌。这些结果是在与将其他抗肿瘤治疗的结果转化为临床实践相关的模型中获得的，这表明该疫苗策略可应用于癌症治疗的临床场景。待用于每种应用的抗原的剂量取决于所希望的效应，因为随着剂量增加，观察到与免疫应答相关联的生物学效应的增加。

本发明还首次揭示了包含至少一种多肽的抗原制备物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗其进展与血管发生、炎症和免疫抑制的增加相关的疾病，所述多肽包含以二硫桥的非天然重排进行折叠的人VEGF-A的同种型的功能突变体。在本发明的一个特别的实施方案中，用所述抗原制备物进行治疗的疾病选自由下列各项组成的组：癌症、黄斑变性、糖尿病、类风湿性关节炎和水肿。

新的抗原制备物PVM-I在人中的癌症的主动免疫疗法中是有用的。作为治疗赘生性疾病的基础，它的使用再现了在临床前阶段中所描述的免疫效应。在经免疫接种的患者中，已检测到特异于VEGF-A的抗体(其中和VEGF-A与其受体的结合)，以及响应于疫苗抗原而分泌IFN-γ的T淋巴细胞克隆。该免疫应答的存在与患者存活的显著增加相关联，并且在其中报告了完全应答的治疗组中发现了长期应答者。这在用于癌症的疫苗的情景下是一个不寻常的事件。此外，令人感兴趣的是，该疗法的成功并不是随着VEGF-A的血浆浓度的完全消融而出现。这个因素支持在临床和临床前场景中不存在不利效应，例如用采用VEGF/VEGFR2系统作为靶标的其他治疗备选方案所产生的那些。类似地，通过实现循环VEGF-A的减少以及VEGF-A结合VEGFR2的能力的全身中和，在药学上可接受的佐剂中施用的所述新的抗原制备物可以用于治疗另一组与过度血管发生相关的病理学状况。

本发明不限制将在本文中所公开的抗原制备物用于特定疾病，并且阐明了所述疗法如何在这些情景下也是有效的。因此，在磷酸铝或sNAcGM3-VSSP存在下施用本发明的抗原制备物导致免疫恢复效应(实施例11)。本发明还证明，抗原制备物PVM-I具有相对于在本文中称为PVM的抗原制备物而言增加的抗炎效应，在DBA/I小鼠中的由胶原诱导的关节炎模型的情景下(实施例12)。同样地，抗原制备物PVM-I在角膜损伤的动物模型之中和在人中的与年龄相关的黄斑变性之中具有更大的抗血管发生效应(实施例13和15)。这阐明了该策略在治疗非赘生性疾病中的潜在效用。在角膜中血管化的减少(其产生自在该区室中施用VEGF-A)表明该策略用于治疗与年龄相关的黄斑变性和糖尿病性视网膜病的潜在性，所述疾病是随着VEGF-A的局部水平的增加而出现的，并且可以从用包含本发明的多肽的制备物进行的主动免疫接种所诱导的免疫应答开始来控制的疾病。

另一方面，本发明揭示了包含具有至少一种多肽的抗原制备物的药学组合物在恢复免疫系统中的用途，所述多肽包含以二硫桥的非天然重排进行折叠的人VEGF-A的同种型的功能突变体。除了具有更好的免疫原性特性外，所述新的抗原制备物还导致优异的免疫恢复效应。在用本发明的抗原制备物进行治疗的动物的原发性和转移性损伤中，分析了调节T细胞和抑制髓样T细胞。该分析表明，当以不同的佐剂和规划施用疫苗制备物时，这些抑制性细胞的数目减少。抑制性细胞的功能性以及其在全身水平上的数目也受到影响(实施例10)。

在本发明中所公开的抗原制备物的佐剂效应在表达卵清蛋白(OVA)这种抗原的实验模型中得到证明。在具有OVA的佐剂中施用疫苗抗原PVM-I(无论是顺次地，还是相组合地)都导致特异于OVA的体液和细胞免疫应答的显著增加。此外，在I类呈递分子的情景下，观察到用PVM-I的疫苗接种对于VEGF-A和OVA的交叉呈递的效应(实施例11)。

附图简述

图1.A：以其同种型121、145、165、206和189的天然VEGF-A的氨基酸序列与在抗原制备物PVM中存在的蛋白质的氨基酸序列的比对。用深色的字母C代表的半胱氨酸指明了形成了链内桥的那些，而用深色且加有下划线的字母C代表的半胱氨酸形成链间桥。B：在天然VEGF-A的变体中存在的二硫桥排列的示意图示。

图2.在抗原制备物PVM-I中存在的多肽之中检测到的二硫键的示意图示。

图3.通过在天然条件下(在二硫苏糖醇或β-巯基乙醇不存在下)的聚丙烯酰胺凝胶电泳来评价VEGF-A的特征性的半胱氨酸“结”的规范结构的存在。A：在用胰蛋白酶进行消化后，蛋白质PVM、CHO-VEGF-A和VM的分析。B：在用胰蛋白酶进行消化后，在两个批次的制备物PVM-I(泳道2-5)和PVM(作为对照)(泳道6-7)中存在的蛋白质的分析。在标记为PM1和PM2的泳道中，分开分子量标准参照物。

图4.在用在佐剂NAcGM3-VSSP中(I)或在磷酸铝中(II)施用的抗原制备物PVM-I进行免疫接种的晚期癌症患者中体液和细胞免疫应答的评价。A：在经免疫接种的患者中对于人VEGF-A来说特异性的IgG的滴度。B：经免疫接种的患者的血清阻断VEGF-VEGFR2相互作用的能力的研究。C：通过IFN-γ的ELISPOT所测量的的特异性细胞免疫应答的评价。在所有情况下，所述值相应于相对于在免疫接种开始时的样品而言所发现的差异。在标记为PM1的泳道中，分开分子量标准参照物。

图5.用抗原制备物VM-I进行免疫接种的患者的免疫应答及其对于存活的影响的分析。显示了患者的存活时间，作为对于用在佐剂NAcGM3-VSSP中(I)或在磷酸铝中(II)施用的抗原进行免疫接种的组所检测到的阳性免疫应答的数目的函数。

实施方式的详细描述/实施例

实施例1.抗原制备物PVM和PVM-I的获得和表征

将编码其中氨基酸82、84和86突变为谷氨酸的人VEGF-A的同种型121的DNA克隆到载体PM238中(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93)。DNA序列以100％得到验证并且被命名为SEQ ID NO:1。在该遗传构建中，氨苄青霉素抗性基因被相应于卡那霉素抗性的基因打断，而无表达水平的变化。将质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21中，并且在化学成分确知的培养基中选择具有最高表达水平的转化体。设计该培养基以使得在动物来源的组分不存在下重组蛋白质的表达达到最大。按照由Morera等人(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93)所描述的来纯化该蛋白质。简而言之，将蛋白质在4℃下在缓冲液50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,6M尿素,pH 7.8中提取16小时，并且按照制造商(QIAGEN)的说明书通过镍亲和色谱法来进行纯化。在基质G25(GE Healthcare)上的分子排阻色谱法中，将缓冲液改变为pH 7.4的10mM Tris。

通过质谱法来评价所得的蛋白质制备物，以验证其氨基酸序列。在具有电喷雾离子化源Z-spray(nanoESI)的正交混合构型光谱仪QTOF-2(Micromass,USA)中获得质谱ESI-MS和ESI-MS/MS(“电喷雾离子化质谱法”和“电喷雾离子化串联质谱法”)。减小的蛋白质制备物的分子质量(21 569.13Da)相应于关于下述蛋白质的理论估计：人VEGF-A的同种型121，其在氨基末端处与细菌蛋白质P64K的片段相融合并且与之被13个氨基酸(其作为这些多肽之间的桥梁起作用)分隔开，还在羧基末端处掺入组氨酸尾。核实了引入到人VEGF-A的序列中的突变，并且在位置141、143和145处分别检测到代替相应于天然VEGF-A的序列的氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)的谷氨酸。

在样品中氨基末端的完整性的核实从获得自用内切蛋白酶Glu-C进行的消化的肽混合物开始来进行。在ESI-MS谱中观察到相应于肽¹VDKRMALVE⁹的信号(双电荷，理论m/z530.78)。该肽通过ESI-MS/MS来进行测序，并且序列与对于该蛋白质的氨基末端所预期的相同。

通过提高在质谱仪的输入锥孔处的电压(其引起在源中的碎片化)，在减小的完整蛋白质的ESI-MS谱中检测到相应于C-末端的信号。在通过ESI-MS/MS的其测序后，结果的分析与肽¹⁷⁷KPRRGSRAHHHHHH¹⁹⁰(双电荷，m/z 875.46)相一致，这确证了羧基末端的序列。总之，测序的结果使得能够验证在该抗原制备物中存在的多肽的一级结构(SEQ ID NO:2)。在此之后，将由SEQ ID NO:2所定义的蛋白质制备物命名为PVM。

发酵和纯化条件的研究指明了优于以前所描述的方法(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93)的回收，通过更改在发酵期间的生长条件，缩短提取时间，更改在镍亲和色谱法中特定蛋白质的电荷，和在洗涤步骤中掺入去污剂。简而言之，在发酵过程期间，将生长期的发酵温度更改至28℃，并且仅通过改变至37℃来诱导表达，而无需使用诱导剂。还将在6M尿素中从生物质开始的该蛋白质的提取时间从16小时减少至2小时，并且在镍亲和色谱法中引入用0.1％的Triton X114的洗涤步骤。另外，在甘露糖醇(40mg/mL)、蔗糖(10mg/mL)和10mM Tris/HCl pH 7.4中配制得自分子排阻色谱法的制备物。将该最终的蛋白质制备物命名为PVM-I，并且在此之后将其与在最初方法中所获得的制备物即制备物PVM进行比较。

在这两种制备物中都以双波长(620和450nm)通过Microcoomassie方法来评价总蛋白质浓度；并且在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上评价纯度百分比。免疫鉴定通过用识别在所述蛋白质抗原中存在的不同区段的单克隆抗体的免疫印迹来进行。在这些研究中，制备物PVM和PVM-I是相同的。

这些冻干的蛋白质制备物的构象和稳定性的分析在Superdex 200XK 10/300柱(GE-Healthcare)上通过分析级的分子排阻色谱法来进行。采用缓冲液10mM TRIS/HCl,150mM NaCl,pH 7.4作为流动相；流速为0.5mL/分钟。将冻干的蛋白质制备物悬浮在一毫升水中，并且比较数据表明在重构之时，PVM和PVM-I在该类型的色谱法中具有相同的保留特性曲线。按照所采用的分子量标准参照物，在这两种情况下都形成分子量高于670kDa的的可溶性聚集体。但是，从PVM-I重构的溶液在聚集组合物的随时间的稳定性方面显示出有差异的特征，这指示了在其结构组成中的变化。在重构后，制备物PVM-I在4℃下保持在分子排阻色谱法中的其保留时间特性曲线30天，而制备物PVM在72小时之时开始显著地失去稳定性(表1)。在24小时之时超过14％的蛋白质质量的构象变化在30天时变得更加显著，当原始构象以超过45％的蛋白质质量丢失时，如从在色谱记录中的曲线下面积开始进行的质量分析所显示的。

表1.蛋白质制备物PVM和PVM-I的随时间的构象稳定性的分析

注：显示了关于5次实验重复的平均值±标准偏差

为了评价蛋白质制备物PVM和PVM-I的免疫原性，在对于第一剂在完全弗氏佐剂(SIGMA)中进行施用和对于第二剂(在一周后施加)在不完全弗氏佐剂(SIGMA)中进行施用后，分析在小鼠中产生的体液免疫应答。使用两个小鼠品系(C57Bl/6和BALB/c)的10只动物/组，并且以250μL的总体积施用100μg蛋白质制备物(蛋白质/佐剂比：1:1v/v)。在第二次免疫接种后一周采集动物的血清。按照以前所描述的(Bequet-Romero等人,Vaccine,2012,30:1790-9)，通过ELISA来评价在血清中存在的对于人VEGF-A来说特异性的抗体的滴度，以及所述抗体中和VEGF-A与其2型受体的相互作用的能力。将滴度结果表示为在其之下检测到特异于VEGF-A的抗体的存在的最大稀释度。将中和能力表示为在血清中存在的抗体所消除的最大VEGF-A/VEGFR2结合的百分比。

在比较免疫原性时，证明了相对于以前的抗原制备物(PVM)而言在用新的抗原制备物(PVM-I)进行免疫接种时所取得的血清转化水平的显著增加，即使当施用等量的这些抗原制备物时，这显示在表2中。

表2.制备物PVM和PVM-I的免疫原性的评价

注：IgG的滴度表示为1:稀释度。显示了相应于所评价的每个小鼠品系的平均值、平均值的标准偏差和“p”值。进行Student’s t检验。

考虑到(a)这些蛋白质制备物的单体具有相同的一级序列(SEQ ID NO:2)，(b)其具有9个半胱氨酸残基，和(c)人VEGF-A(其构成了在PVM和PVM-I中存在的多肽序列的63％)的免疫原性、热稳定性和构象稳定性与半胱氨酸的规范结构(这对于天然蛋白质及其蛋白质家族来说是广泛特征性的)的形成相关联，在这两种制备物中都进行了二硫桥的分析。

在所述蛋白质制备物之内的二硫桥的排列通过用胰蛋白酶的蛋白水解研究初步进行了评价，并且通过在非变性条件下的电泳和通过分子排阻色谱法(在Superose 12XK10/300柱上，用200mM Tris/HCl,pH 8.0作为流动相，以0.5mL/分钟的流速)进行了分析。

已知在天然VEGF-A中的半胱氨酸的特征性的排列使得其对于胰蛋白酶消化具有抗性(Keck等人,Arch Biochem Biophys,1997,344:103-13)，因此进行用该酶消化PVM和PVM-I的比较。为此，将最后的纯化缓冲液改变为200mM Tris,pH 8.0，并且将蛋白质在37℃在胰蛋白酶存在或不存在下以50:1(蛋白质:胰蛋白酶)的比例进行温育。在16小时的消化后，取样品以用于通过非变性天然电泳来评价胰蛋白酶消化的效率(图3)。使用下列作为在VEGF-A分子中的桥的正确构象的对照：1)VM：从大肠杆菌的周质产生的具有R80、K82和H84被E置换这些突变的人VEGF-A的同种型121(Gavilondo等人,Vaccine,2014,32:2241-50)，和2)CHO-VEGF：从CHO(中国仓鼠卵巢)真核细胞系的转染开始而获得的人VEGF-A的同种型121(Sánchez Ramírez等人,J Immunoassay Immunochem,2016,37:636-58)。这些VEGF-A变体通过在还原剂不存在下的非变性过程来获得。在图3中显示了从周质获得的制剂如何抵抗用胰蛋白酶的消化，其中在以低于未消化的蛋白质的分子量进行迁移的级分中回收了其的90％，并且与对于在具有或没有P64K区段的突变体的二聚体形式中半胱氨酸的规范结构(也称为“半胱氨酸结”)的存在所估计的分子量相一致(19.902kDa)(图3A)。

制备物PVM的分析证明了相似的现象，其对于制备物PVM-I未观察到，其中未出现相应于半胱氨酸结的肽(图3B)。考虑到这一点，按照对于PVM所描述的但不使样品经历还原过程，通过质谱法来分析由于用胰蛋白酶或GluC消化制备物PVM-I而产生的肽。检测到二硫键的存在，这显示于表3中。

表3.在PVM-I的消化期间生成的肽的单种同位素分子量的汇总

在总共8个完成的批次中分析在这些二硫桥重排的形成方面的一致性，并且结果在它们之间是相同的。所描述的键出现在就活性药学成分进行分析的样品中以及在其最终制剂中。这些结构异构体所采取的特定排列显著地不同于对于其天然变体和以天然状态的其他VEGF-A同种型所描述的那些，或者在通过在各种原核和真核表达系统中通过重组DNA途径获得这些蛋白质期间所描述的那些(Keck等人,Arch Biochem Biophys,1997,344:103-13)。在相应于关于半胱氨酸110和119(其相应于天然VEGF-A的第二个和第四个半胱氨酸)的分子间桥的所有信号谱中进行详尽搜索。即使当在天然分子中这些半胱氨酸形成分子内键时，在任何实验条件下都无法在制备物PVM-I内检测到对相应于它们的肽。

根据现有技术，关于VEGF-A的最稳定的结构相应于保留了“半胱氨酸结”的那些。但是，用蛋白质制备物PVM和PVM-I进行的研究表明，在获得它们所处的条件下，离VEGF-A蛋白质的天然构象越远的变体越稳定。同样地，尽管有Timmerman等人所报道的数据(专利申请US2012/0231000)，但是在弗氏佐剂中的免疫原性的初步比较分析表明，包含由图2显示的键所定义的结构异构体混合物的制备物PVM-I比制备物PVM更具免疫原性。

该研究表明，在制备物PVM-I中发生了相对于PVM而言的二硫桥布局的改变，这是更稳定的和可复现的，根据该抗原制备物的新的获得方式。图2显示了在产生蛋白质制备物PVM-I的多肽中检测到的9个半胱氨酸之间稳定地建立的12个桥变体。

实施例2.与NAcGM3-VSSP一起施用的抗原制备物PVM和PVM-I的免疫原性的比较

使用在其对于抗原攻击生成体液和/或细胞应答的能力方面十分不同的小鼠品系C57/Bl6和BALB/c。在这两种情况下，都施用100μg的抗原制备物/剂，在下列之中：a)100μg的掺入了天然神经节苷脂的NAcGM3-VSSP，b)100μg的掺入了具有硬脂酸的神经节苷脂的sNAcGM3-VSSP，或者c)100μg的掺入了具有油酸的神经节苷脂的oNAcGM3-VSSP。在8周期间以每周一次的频率免疫接种10只动物/组。在第三次后并且直至第八次和最后一次，在每次免疫接种后一周采集动物血清。按照所描述的(Bequet-Romero等人,Vaccine,2012,30:1790-9)，通过ELISA来评价对于人VEGF-A来说特异性的抗体的滴度以及其中和VEGF-A与其2型受体的相互作用的能力。

特异性IgG的滴度随着免疫接种次数的增加而增长，并且在第八次免疫接种后一周达到最大。在表4中显示了相应于该实验点的结果。如可以看到的，在所述两个品系中，在第八次免疫接种后，对于抗原制备物PVM-I都获得了显著更优的结果，无论在特异性滴度方面，还是在VEGF-A与其受体的结合的抑制方面。在佐剂NAcGM3-VSSP的三种变体中的比较分析表明，所述疫苗制备物是同样地具有免疫原性的。

表4.对于抗原制备物PVM和PVM-I的免疫原性的评价结果

显示了相应于用Student-t检验进行的统计学比较的值。

实施例3.与磷酸铝一起施用的抗原制备物PVM和PVM-I的免疫原性的比较

使用小鼠品系C57/Bl6和BALB/c。施用100μg的抗原制备物/剂；在0.7mg当量的Al³⁺(磷酸铝)中。以两周一次的频率免疫接种10只动物/组，总共4次免疫。在第二次和第四次免疫后一周采集动物血清。按照所描述的(Bequet-Romero等人,Vaccine,2012,30:1790-9)，通过ELISA来评价对于人VEGF-A来说特异性的抗体的滴度以及其中和VEGF-A与其2型受体的相互作用的能力。

对于所述两种抗原和在所述两个小鼠品系中，观察到随着所施用的剂数增加的滴度增长。在表5中揭示了关于在第四次免疫接种后获得的血清样品的结果。如可以看到的，在所述两个品系中，在第四次免疫接种后，对于抗原制备物PVM-I都获得了显著更优的结果，无论在特异性抗体的滴度方面，还是在VEGF-A与其受体的结合的抑制方面。

表5.对于PVM和PVM-I的免疫原性结果的分析

显示了相应于用Student-t检验进行的统计学比较的值。

实施例4.由用在NAcGM3-VSSP中进行施用的抗原制备物PVM或PVM-I进行免疫接种所诱导的细胞应答的评价

按照由Bequet-Romero等人所描述的来分析细胞应答(Bequet-Romero等人,Angiogenesis,2007,10:23-34；Morera等人,Vaccine,2012,30:368-77)。在这种情况下，仅评价在用NAcGM3-VSSP进行配佐的情景下的应答。动物(n＝10，每组)以在实施例2中对于该佐剂所描述的规划来进行免疫接种，在最后一次免疫后一周处死动物，并且将从其脾脏中分离出的细胞与用荧光团CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记的同系肿瘤细胞一起以100:1(效应细胞:经标记的肿瘤细胞)比例进行共温育。

对于该研究，选择与品系C57/BL6同系的黑素瘤细胞系B16F10、淋巴瘤细胞系EL4和肺癌细胞系3LL-D122，以及与品系BALB/c同系的结肠癌细胞系CT26、乳腺癌细胞系F3II和肾癌细胞系RENCA。在共温育后活细胞的通过流式细胞术(Space ML-PARTEC)的分析证明，在所述两个小鼠品系中，制备物PVM-I的施用都导致更大强度的直接细胞应答，即使当施用相似剂量的所述两种抗原制备物时。表6显示了相应于当面对经免疫接种的动物的淋巴细胞时死亡的肿瘤细胞的百分比的结果，其中将相应于用赋形剂进行的治疗的细胞的平均值取作100％的生存力。在所述两个小鼠品系(C57Bl/6和BALB/c)中都观察到，抗原制备物PVM-I的施用(在相应于组IV的所有情况下)优于制备物PVM的使用，在诱导有效的细胞应答方面。

表6.在小鼠品系BALB/c和C57Bl/6中响应于用在NAcGM3-VSSP中的PVM和PVM-I进行免疫接种的细胞介导的细胞毒性的评价

通过Dunnet检验的统计学比较：以平均值递增的次序，对于显著的统计学差异(p<0.05)分配不同的字母。

实施例5.在小鼠中的实体肿瘤治疗之中用PVM和PVM-I进行免疫接种的功效

在所有情况下都免疫接种具有12只小鼠的组。对于所述两个肿瘤模型，描述了用sNAcGM3-VSSP和用磷酸铝进行免疫接种的结果。在用sNAcGM3-VSSP进行配佐的情况下，通过皮下途径免疫接种动物8周，按照通过皮下途径的总共200μL的周剂量，其包含100μg的相应抗原和100μg的佐剂。对于磷酸铝，免疫接种动物4次，以双周规划。每次施用在200μL的总体积中的100μg的抗原，所述总体积包含以磷酸铝形式的0.7mg当量的Al³⁺。

在小鼠品系C57Bl6中，评价了黑素瘤模型B16F10。在第四次免疫接种(在sNAcGM3-VSSP存在下)或第二次免疫接种(在磷酸铝存在下)后三天，通过皮下途径用在100μL的DMEM培养基中的总共20000个细胞对小鼠进行接种。表7显示了在肿瘤攻击后25天通过外科手术从经历安乐死的动物中取出的原发性肿瘤的重量。

表7.在皮下黑素瘤模型B16F10中，施用在sNAcGM3-VSSP和磷酸铝中的抗原制备物PVM和PVM-I的比较评价

通过Dunnet检验的统计学比较：以平均值递增的次序，分配不同的字母以便指出在统计学上显著的差异(p<0.05)。

如在表7中所观察到的，用在所述两种佐剂中的抗原制备物对动物进行治疗显著地降低了肿瘤的生长，直至在肿瘤攻击后的第25天，但是新的抗原制备物(PVM-I)的使用表现出更显著的抑制。该抗肿瘤应答与特异于VEGF-A的免疫应答(无论是体液的，还是细胞的)的存在相关(p<0.05；皮尔逊检验)。

类似地，使用相同的免疫接种规划，在小鼠品系BALB/c中评价了抗肿瘤效应。在第四次免疫接种(在NAcGM3-VSSP存在下)或第二次免疫接种(在磷酸铝存在下)后三天，用25000个与该品系同系的结肠癌细胞CT26，同样地产生肿瘤攻击。在攻击后30天的肿瘤生长的比较分析表明了由于用抗原制备物PVM-I进行免疫接种而产生的更优的抗肿瘤效应，相对于使用制备物PVM而言(表8)。

表8.在结肠癌模型CT26中在NAcGM3-VSSP和磷酸铝中施用抗原制备物PVM和PVM-I的比较评价

通过Dunnet检验的统计学比较：以平均值递增的次序，对于在统计学上显著的差异(p<0.05)分配不同的字母。

与前面的研究相似地，该结果与特异于VEGF-A的免疫应答(无论是体液的，还是细胞的)的存在相关，其在使用抗原制备物PVM-I的情况下更优(p<0.05；皮尔逊检验)。在所述两个研究中，取出的肿瘤的连续切片的组织学分析证明了在使用抗原制备物PVM-I时疫苗接种的显著地更有利的抗血管发生、促凋亡和抗增殖效应(p<0.05，Dunnet，在所有分析中)。

实施例6.基于VEGF-A的同种型145、165、189和206的多肽变体的获得和表征

如图1的比对所显示的，所有这些VEGF-A的同种型共享在同种型121中存在的半胱氨酸残基，因此用于增加免疫原性的策略对于整个蛋白质家族是确凿有效的。为了确证该假设，从HeLa肿瘤细胞的mRNA(信使核糖核酸)开始克隆了同种型145、165、189和206。自动测序验证了序列，按照在数据库CCDS中所报道的那些(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ CCDS/CcdsBrowse.cgi，Release 22)，根据其2018年6月的更新(查询23/12/2019)。

简而言之，使用在实施例1中所描述的策略，因为所有这些VEGF-A的同种型都可以在单个扩增反应中获得，并且由于其不同的大小而是完全可分开的。在所有情况下，都引入了在实施例1中所描述的突变，以排除VEGFR2的激活的诱导，从施用抗原制备物开始。将相应于生成蛋白质变体PVM145、PVM165、PVM189、PVM206的蛋白质的氨基酸序列分别命名为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在按照所描述的将所述蛋白质变体克隆到载体pM238中后，通过两种策略来获得蛋白质：a)按照由Morera等人所描述的过程(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93)，和b)按照在实施例1中所描述的过程。对于每种同种型，比较所述两种纯化变体对于胰蛋白酶消化的抗性。消化的分析通过分子排阻色谱法来进行。结果表明，与对于PVM-I所描述的一样，当按照第二种纯化策略来获得VEGF-A的同种型的变体(PVM145-I、PVM165-I、PVM189-I、PVM206-I)时，在低于5％的总质量的蛋白质级分中观察到对于胰蛋白酶消化的抗性。该抗性反映在相应于“半胱氨酸结”的二聚体的信号的存在之中，所述信号仅在当按照在自然界中存在的排列建立二硫桥时才获得(在23和25分钟之间的信号)(表9)。因此，当按照在实施例1中所描述的过程来获得蛋白质制备物时，它们以多于95％通过与胰蛋白酶的温育而被消化，相比于用由Morera等人所描述的最初过程所产生的对应物而言，如在表9中所观察到的。对于用胰蛋白酶消化抗原制备物PVM145-I、PVM165-I、PVM189-I、PVM206-I，通过ESI-MS/MS确认了在表3(实施例1)中详细描述的并且确认规范的半胱氨酸结不存在的肽，而在制备物PVM145、PVM165、PVM189、PVM206中无法检测到。

在弗氏佐剂中这些变体的免疫原性的比较分析如在实施例1中所描述的那样进行。该研究证明了用具有较低的对于胰蛋白酶消化的抗性的变体(PVM145-I、PVM165-I、PVM189-I、PVM206-I)进行治疗的动物的血清对于VEGF-A与VEGFR2的结合的更优的中和，当与其变体PVM145、PVM165、PVM189、PVM206相比较时，这可在表9中观察到。

表9.在抗原变体的胰蛋白酶消化后在24.8分钟的保留时间处回收的蛋白质的百分比的评价，和用这些变体进行免疫接种的动物的血清对于VEGFR2结合的中和的分析

在通过皮下途径用10000个CT26细胞攻击的BALB/c动物中以与在实施例5所描述的相似的免疫接种和剂量规划使用这些蛋白质。结果表明，在肿瘤接种后28天，与佐剂sNAcGM3-VSSP一起使用抗原变体在变体PVM145-I、PVM165-I、PVM189-I、PVM206-I的情况下诱导更优的抗肿瘤效应，相对于制备物PVM145、PVM165、PVM189、PVM206而言(表10)。

表10.在使用基于VEGF-A的同种型145、165、189和206的多肽变体后观察到的抗肿瘤效应的比较分析

治疗组	肿瘤生长的抑制(％)
		安慰剂	1±10.8<sup>b</sup>
PVM145	31±7.6<sup>b</sup>
		PVM165	36±11.3<sup>b</sup>
PVM189	41±12.1<sup>b</sup>
		PVM206	40±12.8<sup>b</sup>
PVM145-I	60.1±13.7<sup>a</sup>
		PVM165-I	72.5±15.4<sup>a</sup>
PVM189-I	65.3±16.1<sup>a</sup>
		PVM206-I	68±15.3<sup>a</sup>

显示了ANOVA多重比较检验以及随后的Dunnet检验的结果(不同的字母指明了显著差异，p<0.05)。

观察到，独立于所使用的VEGF-A的同种型，对胰蛋白酶消化不具有抗性的变体为具有最大免疫原性和抗肿瘤效应的那些。

实施例7.通过用胰蛋白酶可消化的变体的氧化和选择来获得制备物PVM-I

由于多个二硫桥的形成，数种构象共存于蛋白质制备物PVM-I中。这些可以通过不同于在实施例1中已经描述的那种的过程来获得和分开，其包括在氧化剂存在下的受控的变性和复性的步骤。对于在大肠杆菌中表达的尺寸较小的VEGF-A的同种型(SEQ ID NO:2)，将内含体溶解在6M氯化胍中，并且在该变性剂存在下按照制造商(QIAGEN)的建议通过对镍的亲和力来纯化蛋白质。然后，将洗脱的结果在制备型柱C18上通过在下述缓冲液之间的线性梯度在反相色谱法(RP)中进行分开：(A)在水中的三氟乙酸(TFA)(0.088％v/v)；和(B)在水中的0.084％TFA,90％乙腈(v/v)。在其中洗脱出目的蛋白质的级分中，如所预期的，未观察到对于胰蛋白酶消化的抗性，这与蛋白质制备物的变性和还原状态相一致。然后，使所述蛋白质在22℃下在氯化胍和β-巯基乙醇(0.2mM)存在或不存在下在TrisHCl pH 8.6中经历氧化复性过程20小时。在将缓冲液改变为10mM TrisHCl pH 7.4后，通过在Sepharose G25上的分子排阻色谱法，评价了二硫桥的形成。“半胱氨酸结”的形成通过下述方式来进行分析：按照在实施例1中所描述的，在缓冲液200mM TrisHCl,pH 8.0中和以50:1的比例(蛋白质:胰蛋白酶)，用胰蛋白酶消化16小时。如所预期的，在氯化胍不存在下复性的蛋白质展现出90％的对于消化的抗性(PVM-IA)，而在变性剂存在下的复性导致不同百分比的对于消化的抗性，其随着氯化胍的体积摩尔浓度的增加而减小。

通过使用6M氯化胍，获得了最大数目的对于胰蛋白酶消化不具抗性的级分，并且将其整体命名为PVM-IO。将这些级分在制备型柱C18上通过RP-HPLC色谱法进行分开。总共分开了15个级分，将其按照在RP色谱中的洗脱次序进行编号(F1至F15，表11)。

在将缓冲液改变为10mM Tris pH 7.4后，将制备物PVM-IA、PVM-IO和后者的级分与PVM和PVM-I在BALB/c小鼠中的研究之中进行比较。在其中，评价以间隔一周的8次施用的常规规划的蛋白质施用，按照在100μg的sNAcGM3-VSSP中的200μg的蛋白质制备物。表11显示了下列方面的比较分析的结果：对于鼠类VEGF-A来说特异性的IgG的滴度，其与VEGFR2的结合的中和，在淋巴结中以及在脾脏中的细胞毒性细胞应答的诱导，和免疫接种对于皮下肿瘤CT26的生长的效应。

表11.在PVM-I的氧化复性后获得的级分的比较分析

显示了ANOVA多重比较检验以及随后的Dunnet检验的结果(不同的字母指明了显著差异，p<0.05)。

在表11中，观察到相对于制备物PVM而言制备物PVM-I的更优的效应，这证实了在实施例1中所显示的在弗氏佐剂中的结果。该研究显示了已经描述的对于免疫性的效应，以及与有效的体液和细胞应答的诱导直接相关的抗肿瘤效应。在还原剂不存在下复性的蛋白质制备物(PVM-IA)的分析结果表明，它的免疫原性比PVM-I，和甚至比PVM低7至10倍，并且导致更低的抗肿瘤效应。但是，通过使用在6M氯化胍存在下复性的制备物(PVM-IO)，获得了并不显著不同于对于PVM-I所描述的那些的结果。另外，制备物PVM-IO的级分的评价表明，这些级分中的至少12个级分(F4-F15)在诱导特异性体液和细胞免疫应答方面，以及在生成抗肿瘤应答方面是等效的。

通过胰蛋白酶消化和质谱法(按照在实施例1中所描述的而发展的)以及伴随的Edman降解(Marti,T.,Rosselet,S.J.,Titani,K.和Walsh,K.A.(1987)Biochemistry 26,8099-8109)对这些级分进行的分析使得能够验证，在级分F4至F15中，半胱氨酸结的规范结构的半胱氨酸2和4形成分子内桥，而在级分F1至F3的情况下，在分子间连接C2-C2、C4-C4、C2-C4、C2-C9和C4-C9中检测到它们。

在级分F4至F15中其中牵涉所述半胱氨酸的键的排列相应于在序列表中标示为SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:23的多肽，如下面详细描述的：

-F4相应于SEQ ID NO:18，其中两条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)、两条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)和两条多肽链的最后一个半胱氨酸(位置175)相连接从而形成分子间二硫桥；

-F5相应于SEQ ID NO:18，其中一条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)与另一条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥；

-F6相应于SEQ ID NO:19，其中两条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)、两条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)和两条多肽链的最后一个半胱氨酸(位置175)相连接从而形成分子间二硫桥；

-F7相应于SEQ ID NO:19，其中一条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)与另一条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥；

-F8相应于SEQ ID NO:20，其中两条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)、两条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)和两条多肽链的最后一个半胱氨酸(位置175)相连接从而形成分子间二硫桥；

-F9相应于SEQ ID NO:20，其中一条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)与另一条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥；

-F10相应于SEQ ID NO:21，其中两条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)和两条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)相连接从而形成分子间二硫桥；

-F11相应于SEQ ID NO:21，其中一条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)与另一条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)相连接从而形成分子间二硫桥；

-F12相应于SEQ ID NO:22，其中两条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)和两条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)相连接从而形成分子间二硫桥；

-F13相应于SEQ ID NO:22，其中一条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)与另一条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)相连接从而形成分子间二硫桥；

-F14相应于SEQ ID NO:23，其中两条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)和两条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)相连接从而形成分子间二硫桥；

-F15相应于SEQ ID NO:23，其中一条多肽链的第七个半胱氨酸(位置161)与另一条多肽链的第八个半胱氨酸(位置163)相连接从而形成分子间二硫桥。

实施例8.在免疫原性结构的生成中半胱氨酸2和4的重要性的分析

在实施例1、9和10中所描述的结果表明，PVM-I的最具免疫原性的结构的共同特征为在VEGF-A中的分子内键牵涉一级序列的半胱氨酸2和4(在PVM-I中的Cys 110和Cys 119)这一事实。这些残基在所回顾的用于获得VEGF-A的研究中出现以高频率发生突变，因为以此避免了该蛋白质的二聚体聚集(Jiang等人,Biochemistry,2010,49:6550-6；Wentink等人,Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113:12532-7)。在天然构象中，这些是形成链间桥以生成VEGF-A的二聚体的氨基酸。只有Bequet-Romero等人和Morera等人的以前的工作使用了包括这些半胱氨酸的VEGF-A的一级序列的变体，但是在它们的任一个中均没有观察到在该序列的半胱氨酸2和4之间形成链内二硫键。在用于生成该抗原的序列中这些氨基酸的存在以及获得它们以便所提及的半胱氨酸形成仅链内键所经由的过程，构成了用于获得具有疫苗目的的蛋白质的新方法。为了更好地表征这些残基对于抗原制备物的免疫原性的关联性，着手获得(通过定向诱变)变体，其在一级序列中包括下列的半胱氨酸向丙氨酸的改变：

a)PVM-I^Ala110：Cys110变为Ala110

b)PVM-I^Ala119：Cys119变为Ala119

c)PVM-I^Ala110,119：Cys110变为Ala110并且Cys119变为Ala119。

为此目的，使用在表12中所指出的寡核苷酸对，以按照所描述的(Bequet-Romero等人,Angiogenesis,2007,10:23-34)通过嵌套式聚合酶链反应(PCR)来引入突变。简而言之，进行PCR 1和2，其中取包含编码SEQ ID NO:2的序列的质粒作为模板。使用用于PCR的混合物MasterMix(Qiagen)和在表12中所示的寡核苷酸。在将其在琼脂糖凝胶上从反应模板分开后，纯化在每个反应中扩增的DNA。对于在表12中所描述的每个分子，使用所得的DNA的两条链作为在PCR3中的模板。进行25个循环的PCR，并且在琼脂糖凝胶上分开后，将所得的DNA按照制造商的说明书用酶NheI和BamHI(Promega)进行消化。按照所描述的(Morera等人,Angiogenesis,2008,11:381-93)，将经消化的DNA克隆到载体pM238中。所得的DNA的自动测序验证了所引入的突变。将编码这些经突变的蛋白质的DNA转化到菌株BL21(DE3)中，并且按照在实施例1中对于PVM-I所描述的过程来产生多肽。相应于序列SEQ ID NO:15、SEQID NO:16和SEO ID NO:17的多肽产生制备物PVM-I^Ala110、PVM-I^Ala119和PVM-I^Ala110,119。

表12.在用于获得PVM-I的突变体的PCR反应中所使用的寡核苷酸

将包含具有在半胱氨酸110和119处的突变的蛋白质的制备物与PVM和PVM-I在BALB/c小鼠中的研究之中进行比较，其中评价以间隔一周时间的8次施用的规划的其施用，按照在100μg的佐剂sNAcGM3-VSSP中的200μg的抗原制备物。所述比较研究在皮下结肠癌模型CT26中进行，以10只动物/组。在表13中观察到制备物PVM-I相对于PVM而言的更优的免疫原性，这证实了在实施例1中所显示的结果。在半胱氨酸110和119处的突变体的蛋白质制备物的分析结果表明，它的免疫原性比PVM-I，和甚至比PVM低大约2倍，并且导致更低的抗肿瘤效应。

表13.抗原制备物PVM、PVM-I、PVM-I^Ala110、PVM-I^Ala119和PVM-I^Ala110,119的比较分析

显示了ANOVA多重比较检验以及随后的Dunnet检验的结果(不同的字母指明了统计学显著差异，p<0.05)。

实施例9.在小鼠中的肺转移治疗之中抗原制备物PVM和PVM-I的临床前使用的功效的比较评价

转移是由任何来源的癌症引起的死亡的根本原因。在这之中，肺转移是最常导致患者死亡的转移，这是由于它们所引起的呼吸并发症，无论是肺组织被肿瘤组织取代，还是胸膜液的积累。肺转移构成了对于抗血管发生干预最具抗性的情形之一，所述抗血管发生干预基于仅施用消除配体的试剂或者VEGF-A受体所转导的信号的抑制剂。在这种情景下，将免疫应答的细胞分支纳入对于用所述疫苗进行免疫接种的应答的武器库可以具有决定性的作用。

为了评价所研究的疫苗制备物用于在小鼠中治疗肺转移的功效，在所有情况下，用这些制备物免疫接种具有12只小鼠的组，并且根据每种模型的要求用肿瘤细胞进行肿瘤攻击。下面描述了对于三种转移模型，用sNAcGM3-VSSP作为佐剂进行免疫接种的结果。通过皮下途径，按照200μL总体积的周剂量(其包含100μg的相应的抗原和100μg的佐剂)，免疫接种动物8周。

对于在小鼠品系C57Bl/6中的研究，在第四次免疫接种后3天，在足垫中接种250000个转移性肺癌细胞3LL，克隆D122。在植入20天时，通过外科手术去除原发性肿瘤，并且在15天后处死动物以计数和表征肺转移。转移负荷的分析通过评价肺的重量和大转移灶(macrometastasis)的数目来进行。有丝分裂指数的研究通过测量每只动物每个视野(以每个切片10个视野)的有丝分裂数目来进行。同样地，对每个视野的凋亡图像进行定量，并且计算有丝分裂/凋亡比。

表14显示了经历了治疗的动物的肺重量的比较。在所述两种抗原之间观察到不同的效应，其有利于富含完全缺乏在天然VEGF-A中存在的二硫键的结构异构体家族的抗原制备物PVM-I。通过苏木精-伊红染色来进行的转移损伤的组织病理学表征以及连续切片分析证明，特异于VEGF-A的免疫应答还转化为在转移病灶中所观察到的有丝分裂/凋亡平衡的显著下降。

表14.在皮下肿瘤3LL-D122的自发肺转移模型中施用抗原制备物PVM和PVM-I的效应

显示了通过Dunnet检验的统计学比较，其中以平均值递增的次序，对于在统计学上显著的差异(p<0.05)分配不同的字母。

在小鼠品系BALB/c中，评价了在20000个CT26癌细胞的静脉内接种后实验性肺转移的建立。在第四次免疫接种后三天，通过眶后丛进行攻击。在肿瘤攻击后30天处死动物，并且评价在肺中的肿瘤负荷，以及形态学、细胞密度、血管发生和有丝分裂/凋亡平衡，从肺组织连续切片的组织病理学分析开始。如在表15中所观察到的，无论是转移灶的数目，还是在所分析的切片(10个/动物)中它们所占据的面积，用PVM进行的免疫接种都下降。在用制备物PVM-I进行免疫接种时观察到最显著的效应(p<0.05；Dunnet后验检验)。令人感兴趣的是，对于由该模型所引起的肺转移损伤来说非常高的有丝分裂指数(有丝分裂数目/视野)在施用疫苗制备物时降低大约4倍。与在前面的分析中一样，在用抗原变体PVM-I进行治疗的组中观察到最好的效应。

表15.在结肠癌CT26的静脉内施用后，在实验性肺转移模型中施用抗原制备物PVM和PVM-I的效应

治疗	大转移灶的数目	有丝分裂/凋亡比
			无治疗	16.22±8.913<sup>c</sup>	5.567±1.197<sup>a</sup>
在sNAcGM3-VSSP中的PVM	7.778±6.797<sup>b</sup>	3.244±1.638<sup>b</sup>
			在sNAcGM3-VSSP中的PVM-1	1.889±2.977<sup>a</sup>	1.8±0.6325<sup>c</sup>
在sNAcGM3-VSSP中的赋形剂	22.22±10.4<sup>c</sup>	6.422±2.524<sup>a</sup>

显示了通过Dunnet检验的统计学比较，其中以平均值递增的次序，对于显著的统计学差异(p<0.05)分配不同的字母。

在小鼠品系BALB/c中，还评价了自发转移至肺的转移性乳腺癌模型F3II。在这种情况下，包括了使用双周规划，其中在磷酸铝中进行配佐作为另外一组。第四次免疫接种(在sNAcGM3-VSSP存在下)或第二次免疫接种(在磷酸铝存在下)后三天，通过皮下途径接种在100μL的DMEM培养基中的总共200000个细胞。

表16显示了在肿瘤植入后28天原发性肿瘤重量的分析。用所述两种抗原变体并且以所述两种佐剂和施用规划对动物进行的治疗显著地降低了肿瘤生长，但是抗原制备物PVM-I是显现出最显著抑制的那个(p<0.05，Dunnet检验)。同一表格显示了肺大转移灶的计数结果。如所看到的，肿瘤生长的降低转化为所植入的转移灶的数目的显著减少。此外，在这些研究中观察到有丝分裂/凋亡平衡的下降，和与所检测的转移损伤相关联的坏死病灶数目的增加。所有这些效应在用抗原制备物PVM-I进行治疗的组中更显著地被检测到。

表16.在转移性乳腺癌模型F3II中施用在两种佐剂中的抗原制备物PVM和PVM-I的效应

	肿瘤生长	转移灶的数目
			治疗	n＝10	n＝12
无治疗	3.375±0.3701<sup>a</sup>	18±3.643<sup>a</sup>
			在sNAcGM3-VSSP中的PVM	2.231±0.5614<sup>b</sup>	7.25±3.306<sup>b</sup>
在sNAcGM3-VSSP中的PVM-1	1.579±0.4538<sup>c</sup>	2.417±1.621<sup>c</sup>
			在sNAcGM3-VSSP中的赋形剂	3.502±0.4347<sup>a</sup>	21.08±4.907<sup>a</sup>
在磷酸铝中的PVM	2.387±0.5571<sup>b</sup>	9.167±3.614<sup>b</sup>
			在磷酸铝中的PVM-1	1.691±0.3536<sup>c</sup>	3.25±2.094<sup>c</sup>
在磷酸铝中的赋形剂	3.508±0.5316<sup>a</sup>	21.50±4.075<sup>a</sup>

多重比较以及随后的Bonferroni检验的统计学分析(不同的字母指明了统计学显著性)。

总之，结果表明，抗原制备物PVM-I在降低原发性肿瘤的转移潜力和转移性细胞植入肺中的能力方面是更有效的。此外，观察到在转移表型改变方面用抗原制备物PVM-I进行的疫苗接种的优异的效应，其中观察到具有降低的有丝分裂/凋亡平衡、更高的坏死发生率和血管发生的显著减少的细胞病灶。

实施例10.用抗原制备物PVM和PVM-I进行免疫接种对于由肿瘤诱导的免疫抑制的效应

使用具有15只BALB/c品系的动物的组，其通过皮下途径用下列变体进行免疫接种：

1.在sNAcGM3-VSSP中的PVM(8次免疫接种，每周一次的频率)，

2.在sNAcGM3-VSSP中的PVM-I(8次免疫接种，每周一次的频率)，

3.sNAcGM3-VSSP(8次免疫接种，每周一次的频率)，

4.在磷酸铝中的PVM(4次免疫接种，两周一次的频率)，

5.在磷酸铝中的PVM-I(4次免疫接种，两周一次的频率)，

6.磷酸铝(4次免疫接种，两周一次的频率)。

在所有情况下，免疫接种都通过皮下途径用200μL的总体积来进行。在最后一次免疫接种后三天，随机选择5只动物/组，并且使其经历安乐死，以分析其免疫学状态和实验对照(组3和6)的免疫学状态。该评价对于全血样品、脾细胞、淋巴结和骨髓通过流式细胞术来进行。

对于每个组的其余动物，通过皮下途径在右胁用20000个结肠癌细胞CT26施行肿瘤攻击。在注射肿瘤细胞后14和21天时，使五只小鼠/组经历安乐死，并且类似地进行评价，其中在这种情况下增添离解的肿瘤组织的分析。

在肉眼可见水平上在任何动物中均未证明毒性事件的出现，并且在最后一次免疫接种后7天，组织病理学分析在任何所分析的器官中均未揭示出损伤的存在。免疫学评价在于：(1)鼠类VEGF-A的血清浓度的分析；(2)在全血、对原发性肿瘤进行引流的淋巴结和肿瘤本身中T淋巴细胞浓度的评价；(3)在面对经突变的VEGF-A的代表性抗原时由肿瘤内淋巴细胞进行的IFN-γ分泌的研究。

在未治疗的动物的血清中鼠类VEGF-A水平的分析(R&D)表明，当增加暴露于肿瘤的时间时，在血清中VEGF-A水平增加，这与随时间的肿瘤大小的增加相一致。在用抗原变体进行免疫接种的组中，观察到VEGF-A水平的显著下降(p<0.001ANOVA，Dunnet后验检验)，其甚至延长至肿瘤攻击后30天，这可在表17中看到。对于肿瘤区室观察到相似的现象。

表17.在经免疫接种的动物的血清和肿瘤裂解物中鼠类VEGF-A浓度的分析

多重比较以及随后的Bonferroni检验的统计学分析(不同的字母指明了统计学显著性)。

在每个时刻处死的动物的免疫系统状态通过在淋巴结和肿瘤本身中存在的细胞群体的比例的研究来进行分析，按照由Gabrilovich D等人所报道的(Gabrilovich D等人,Blood 1998,92:4150)。对于这些研究，采用针对CD3、CD4、CD8的单克隆抗体，其用允许通过流式细胞仪(Sysmex Partec)使细胞群体可视化的异硫氰酸荧光素、藻红蛋白和藻红蛋白-Cy7进行标记。所获得的结果反映在表18中。

表18.目的细胞群体的分析结果的汇总

注：全血(WB)，引流淋巴结(NLD)，和皮下肿瘤(T)。

在肿瘤攻击后14天在动物中的淋巴样细胞群体的分析显示了在三个所分析的区室中CD3、CD4和CD8阳性的细胞级分的增加，其与疫苗制备物的施用直接相关。用抗原变体PVM-I，达到了显著更高的免疫系统的这些细胞的浓度(p<0.05，Bonferroni后验检验)。另外，浸润到皮下肿瘤中的CD8 T淋巴细胞中的标志物PD1的研究表明，在用所述抗原进行治疗的那些动物中它们的增加与阴性PD1表型相关联，在接受抗原PVM-I的动物的情况下以更高的百分比(表18)。CD4和CD8细胞浸润物的增加与肿瘤团块的减小显著地正相关(r＝0.7147，p<0.002)。

在柱子上，通过使用包被有特异于CD45的抗体的磁珠(Miltenyi)，通过正选择过程来分离来自肿瘤的白细胞，并且通过ELISPOT型系统(MABTECH)来评价在培养基中响应于添加经突变的VEGF-A的IFN-γ分泌。仅在用所述抗原进行疫苗接种的动物的情况下观察到该细胞因子的分泌的增加，并且对于所述两种佐剂，其在接受抗原PVM-I的组中都是更高的(p<0.05，Bonferroni后验检验)(表19)。这证明，不仅细胞浸润增加，而且这些浸润性白细胞具有与疫苗制备物的施用相关联的更高的活性。

表19.通过IFN-γ的ELISPOT的肿瘤的CD45+浸润物的分析

实施例11.用PVM-I进行的免疫接种对于针对另一抗原攻击而生成的免疫原性的辅佐效应的评价

鉴于其免疫恢复潜力，探究了用PVM-I进行的免疫接种是否能够诱导辅佐效应，其中具有不仅对于VEGF-A而且对于不相关的抗原来说特异性的体液和细胞应答的增加。该潜在的效应通过评价对于在肿瘤中存在的抗原和对于与疫苗共施用的抗原的特异性免疫性的程度来进行检查。

使用卵巢肿瘤模型ID8-OVA来用于C57Bl/6动物的肿瘤攻击，并且在体外裂解研究中使用亲本系ID8。动物(n＝10/组)通过腹膜内途径接受250万个细胞的肿瘤攻击，并且在三天后开始免疫接种规划，如在下面所描述的：

a)PVM-I(200μg)，sNAcGM3-VSSP(100μg)：每周皮下施用，8周；

b)OVA(1mg)，sNAcGM3-VSSP(100μg)：每周皮下施用，2周；sNAcGM3-VSSP(100μg)：每周皮下施用，其余的6周；

c)PVM-I(200μg)，sNAcGM3-VSSP(100μg)，OVA(1mg)：每周皮下施用，2周；和PVM-I(200μg)，sNAcGM3-VSSP(100μg)：每周皮下施用，其余的6周；

d)sNAcGM3-VSSP(100μg)：每周皮下施用，8周；

e)OVA(1mg)：每周皮下施用，2周；sNAcGM3-VSSP(100μg)：每周皮下施用，其余的6周。

在第八次免疫接种后一周，和在肿瘤植入的第60天时，进行动物的安乐死。在该肿瘤模型中，动物的体重与肿瘤的生长相关。表20显示了所观察到的抗肿瘤效应，其通过在sNAcGM3-VSSP中的PVM-I存在下施用OVA而以协作方式增加。

对于VEGF-A和OVA的体液应答的分析在所收集的血液上通过ELISA型系统来进行，按照在实施例1、2和3中所描述的。特异性细胞应答通过肿瘤细胞的特异性裂解研究来进行分析，其中通过脾脏细胞与肿瘤细胞系ID8和ID8-OVA的体外共培养(按照在实施例4中所描述的)。此外，还检查了响应于添加特异性刺激物(肽OVA₂₅₇-264或VEGF_KDR-)72小时的在从经免疫接种的动物开始分离出的脾脏细胞的上清液中IFN-γ的分泌。在这后一种情况下，使用ELISA型测定法来检测IFN-γ，按照制造商(Biolegend)的说明书。结果汇总在表20和21中。

表20.在结束研究时动物的体重以及特异于抗原VEGF-A和OVA的IgG的滴度

显示了ANOVA多重比较检验以及随后的Dunnet检验的结果(不同的字母指明了显著差异，p<0.05)。

表21.细胞应答研究的结果的比较分析

％指明了在该研究的终点时ID8或ID8-OVA细胞裂解的百分比。显示了ANOVA多重比较检验以及随后的Dunnet检验的结果(不同的字母指明了显著差异，p<0.05)。

当在sNAcGM3-VSSP的情景下进行施用时，对于所述两种抗原，都诱导了体液应答(表20)和细胞应答(表21)。OVA与包括PVM-I的免疫疗法的共施用有助于对于OVA的特异性应答的显著增加，不仅在接受OVA作为免疫原的动物中，而且还在只接受PVM-I的动物中。这个事实表明了用该抗原制备物的疫苗策略在诱导对于未包括在所述疫苗制备物内但是被肿瘤表达的抗原的应答放大中的潜力。在用所述两种抗原进行治疗的组中，体液应答以及IFN-γ分泌和ID8-OVA细胞裂解表明，该组合不仅具有累加效应，而且具有诱导更优效应的协作。该要素指出了在增加对于其他肿瘤相关抗原的免疫应答中使用该策略的可能性。

实施例12.在由胶原诱导的关节炎模型中的体内保护实验，通过用在所述两种佐剂中的PVM或PVM-I进行免疫接种

免疫接种具有20只DBA/1小鼠(H-2q单倍型)的组，其对于由胶原诱导的关节炎易感。所述动物接受在磷酸铝或sNAcGM3-VSSP中配佐的所调查的抗原制备物(PVM或PVM-I)。对于sNAcGM3-VSSP，采用以周间隔时间的8个剂量的100μg抗原和100μg佐剂的规划；和在磷酸铝的情况下，以双周间隔时间施用4个剂量的在0.7mg当量的Al³⁺中的100μg抗原。治疗组如下定义：

I.在sNAcGM3-VSSP中的PVM，

II.在sNAcGM3-VSSP中的PVM-I，

III.sNAcGM3-VSSP，

IV.在磷酸铝中的PVM，

V.在磷酸铝中的PVM-I，

VI.磷酸铝。

在用NAcGM3-VSSP进行第四次免疫接种或用磷酸铝进行第二次免疫接种后三天，开始按照以前所描述的模型(Campbell IK等人,Eur.J.Immunol.30:1568,2000)，通过用鸡的II型胶原(Sigma)进行免疫接种来诱导自身免疫性关节炎。在第26天时重复该免疫接种，以完成自身免疫性应答的诱导。按照关节炎指数每日对小鼠的四条腿进行评价，所述关节炎指数通过在征候检查中红斑(1)、炎症(2)或关节僵直(3)的存在来对每条腿建立0至3的得分，最大值为12。小鼠在关节炎诱导的23天时开始表现出关节炎发展的临床症状，其中在50天时达到最大发病率。在表22中可看到在不同实验组的动物中关节炎发病率的分析。在40和55天时，观察到在经疫苗接种的组(I、II、IV和V)中关节炎发病率的显著下降，相比于接受在相应的佐剂中的安慰剂的对照组III和VI而言。

表22.在所述两个评价时刻的关节炎发病率

组	在第40天时的发病率	在第55天时的发病率
			I	20/7(35％)	20/9(45％)
II	20/4(20％)	20/6(30％)
			III	20/12(60％)	20/16(80％)
IV	20/8(40％)	20/12(60％)
			V	20/6(30％)	20/8(40％)
VI	20/13(65％)	20/15(75％)

实施例13.在非人灵长类中PVM和PVM-I的免疫原性的评价以及免疫接种对于由激光诱导的实验性脉络膜新血管形成的效应的分析

在非人灵长类(西非绿猴(Chlorocebus aethiops sabaeus))中评价抗原制备物PVM和PVM-I在更自体的情景下诱导相关免疫应答的能力。使用4只动物/组。在200μg的NAcGM3-VSSP中或在以磷酸铝形式的0.7mg当量的Al³⁺中，施用400μg的抗原制备物PVM或PVM-I。施用规划在NAcGM3-VSSP的情况下为8个周剂量，和对于磷酸铝为4个双周剂量。在第8次免疫接种(NAcGM3-VSSP)或第4次免疫接种(磷酸铝)后一周评价特异于VEGF-A的IgG类型抗体的滴度以及VEGF-A与其2型受体的结合的中和。结果显示在表23中。如所观察到的，所述两种抗原制备物都导致诱导了特异于VEGF-A的滴度，在所述两种佐剂中用PVM-I诱导的滴度都是更高的。这些滴度则与血清的中和能力的增长相关。

表23.在灵长类中体液应答的分析

显示了通过使用在所述两种佐剂中的所述两种疫苗制备物而获得的特异于人VEGF-A的滴度

为了评价在何种程度上与体液应答的诱导相平行地取得了细胞应答的激活，按照所描述的(Morera等人,Vaccine,2010,28:3453-61)来进行常规的迟发型超敏反应(DTH；Delayed Type Hypersensitivity)测试。在48小时之时，用数字游标卡尺进行硬结的两次垂直测量。计算损伤面积，并且报告其几何平均值。红斑或炎症不被认为是该反应的一部分。0.5mm的直径被认为是可检测的反应的界限。结果按照下述评定来呈现：(++)>5mm²；(+)＝在0.5和4.99mm²之间；(-)不可检测的反应。在表24中显示了这样的评定的结果。此外，在致敏点处打6mm²的孔(6个/动物)，其通过苏木精/伊红染色研究来进行分析。每个活组织检查分析至少两个切片，以在单核细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞的存在方面确定浸润物的性质。

抗原的真皮内注射被很好地耐受，没有不利事件例如水疱或溃疡。所有以其与佐剂的不同组合用疫苗制备物进行治疗的组的猴子都针对人VEGF-A作出反应。在其中注射盐水溶液(作为对照)的位点处，在任何经免疫接种的组中均未报告任何反应。组织病理学评价证实了对于VEGF-A接种的强烈的DTH型反应的存在。从用人VEGF-A的注射位点获得的活组织检查与DTH场景相一致，其中具有丰富的巨噬细胞和淋巴细胞浸润物。

表24.在两种佐剂存在下用PVM或PVM-I进行免疫接种的非人灵长类中DTH反应的评定

分析了6个位点/动物。-，不可检测的反应

按照先前所报道的，通过Ficoll梯度来从经免疫接种的动物中分离出外周血单核细胞(PBMC)，并且分析事先与抗原VM一起进行温育并且用CFSE进行标记的同系细胞的特异性细胞溶解。表25显示相应于通过流式细胞术对“经负载的”并且用CFSE进行标记的细胞的存活进行分析的结果。每只动物至少三次重复的分析表明，在相应于诱导期的最后一次免疫接种后的那一周中，疫苗制备物诱导了具有细胞毒性能力的特异于所述抗原的细胞免疫。如所观察到的，在所述两种佐剂中，在使用抗原PVM-I时，该疫苗的效应都是显著地更优的(P<0.05；Dunnet)。

表25.从用在两种佐剂中的PVM或PVM-I进行免疫接种的猴子中分离出的负载有VEGF-A的自体PBMC的直接细胞溶解

细胞毒性通过流式细胞术来进行评价，并且表示为相比于未负载的自体PBMC而言用CFSE进行标记的群体的减少百分比。

在这些动物中还评价了在非人灵长类中由激光诱导的实验性脉络膜新血管形成的防止。作为模型，采用由Krzystolik等人所报道的(Krzystolik M.G.等人,2006.ActaOphthalmol,120:338-346)。使用4只猴子/实验组。对于所有程序都用盐酸氯胺酮、马来酸乙酰丙嗪和硫酸阿托品的肌内注射来麻醉动物。也采用盐酸丙美卡因的局部麻醉。在最后一次免疫接种后一周，通过用氩激光烧灼在黄斑中诱导脉络膜新血管形成(CNV；choroidalneovascularization)的形成。为了检测和测量程度，以及评价损伤的特征，使用摄影术和荧光血管造影术。在用激光处理之前和之后，以及在其之后第15、20和29天，评价CNV损伤的发展。由在实验设计之外的专家来分析损伤，其中采用下述量表：等级1，无高荧光；等级2，高荧光，但无溢出；等级3，早期或中间过渡高荧光，和晚期泄漏；和等级4，非常亮的早期或中间过渡高荧光，具有延伸超过激光点边缘的晚期泄漏。进行动物的每日观察，以评价其临床状态，包括任何的眼睛异常。

在分配给激光处理的四个等级中，等级4在临床上相应于显著泄漏的状态。认为损伤反映了新的脉络膜血管的存在，其要么已生长超过激光处理区域，要么如此强烈地泄漏以致于荧光素已引人注目地扩散到血管之外。在安慰剂组中等级4的损伤的平均数在激光处理面积的45.4％至50.2％之间变动。在对照组中等级4的损伤平均百分比与由已采用该CNV动物模型的其他作者所报道的相似。相反地，所有用疫苗制备物进行治疗的组都显示出等级4的损伤的明显减少或完全不存在，无论采用何种佐剂。表26显示了对于治疗组在第29天时所有损伤等级的百分比分布。令人感兴趣的是，通过使用疫苗制备物PVM-I，获得了较高分级的损伤的明显更大的减少(ANOVA，Bonferroni后验检验，p<0.05)。

表26.脉络膜血管形成的等级的分析

实施例14.通过施用由抗原制备物PVM-I和佐剂组成的疫苗来在人中治疗实体肿瘤

该研究的目标是在人中的肿瘤病理学状态情景下评价新的抗原制备物诱导相关的特异性免疫应答的潜力。选择具有晚期实体肿瘤、没有其他治疗选项、在施用开始之前具有至少4周的无其他治疗时期的患者。以800μg的剂量施用抗原制备物PVM-I：(a)在sNAcGM3-VSSP存在下，以每周一次接种规划，持续8周，随后为一月一次施用；或者(b)在磷酸铝中，以具有两周一次的频率的4剂规划，随后也为每月一次施用。

在免疫接种规划开始之前和在最后一次免疫接种后一周，在两种情况下，在血清中和在所收集的PBMC中评价体液和细胞免疫应答。在血清中评价两个基本参数：特异于VEGF-A的抗体的滴度，以及所述抗体中和VEGF-A与其受体VEGFR2的结合的能力。该参数通过两个ELISA型系统来进行测定(Morera等人,Vaccine,2012,30:368-77；Sanchez Ramirez等人,J Immunoassay Immunochem,2016,37:636-58)。大于1:500的滴度和大于10％的中和百分比被定义为阳性结果。

按照已描述的(Gavilondo等人,Vaccine,2014,32:2241-50)，通过IFN-γ的ELISPOT来在PBMC样品中评价细胞应答。低应答者被认为是具有29至39个对于IFN-γ分泌来说阳性的克隆数目/百万个CD3阳性细胞的患者；作为中间应答者，为具有40至79的信号数目的患者；和作为高应答者，为具有大于80个信号的患者。

施用在所述两种佐剂中的PVM-I都导致特异于VEGF-A的免疫应答的建立，在特异性抗体(图4A)以及其中和该生长因子与VEGFR2的相互作用的能力(图4B)方面。在70％的用所采用的佐剂中的任一种进行治疗的患者中观察到该应答。类似地，在用人VEGF-A的变体(VM)进行刺激时观察到PBMC的应答能力的显著增加(图4C)。这些结果表明，在人中使用新的抗原变体PVM-I诱导了针对人VEGF-A的特异性免疫应答。

图5以总结方式显示了总患者数目，以及他们中有多少在对于每一种所述佐剂的测试中的任一个之中表现出阳性应答。对结果进行分层分级，其中考虑了在使用其免疫前的值作为对照时具有显著更优的结果的测试的数目。在该图中，还为每位患者分配了在疫苗制备物施用开始后存活的月数(在24个月时的分析)。这使得能够讲述在另一种癌特异性治疗不存在下，所述特异性免疫应答在何种程度上对于存活的增加做出贡献。观察到，在具有较高阳性应答数目的患者中，存活显著地增加(p<0.05；Kaplan Meyer)。

实施例15.抗原制备物PVM-I在人中治疗与年龄相关的黄斑变性之中的临床用途

该研究的目标是评价抗原制备物PVM-I在人中的与年龄相关的黄斑变性(AMD；Age-related Macular Degeneration)的情景下诱导相关的特异性免疫应答的潜力。患者按照在50μL中125μg，通过玻璃体内途径，每月一次，连续三个月接受贝伐珠单抗的施用。在诊断后头三个月施用该药物或其他抗血管发生药物例如阿柏西普(Aflibercept)、雷珠单抗或雷莫芦单抗(Ramucirumab)是已作为用于该疾病的初始控制的常规疗法而建立的那种。在这些施用后，患者系统地参加视敏度和视网膜结构中的表型变化的检查，并且取决于在这些方面的改变，指示或不指示抗血管发生药物的新的玻璃体内注射。治疗的成功在很大程度上取决于玻璃体内施用的需求的减少。

将该疗法与以400μg的剂量的抗原制备物PVM-I伴随地或不伴随地进行施用：(组2)，在sNAcGM3-VSSP存在下，以每周一次的规划，持续8周，和接着进行每月一次的再施用；或(组3)，在磷酸铝中，以具有两周一次的频率的4剂规划，随后也为每月一次施用。组1仅接受常规疗法，其组成为每月一个剂量的施用，连续3个月。在贝伐珠单抗的头三次施用后，患者仅在当与先前的眼科学分析相比较时损伤加重的情况下再次接受它们。该加重被定义为视敏度的丧失、视网膜厚度的增加、视网膜内液的存在或视网膜下积液的增加(高于200μm或在先前就诊中所观察到的值)。

以所示的佐剂和规划施用抗原制备物导致对于维持或改善患者视力质量和黄斑完整性所需要的贝伐珠单抗玻璃体内注射次数的显著减少。表27以总结方式显示了在贝伐珠单抗的第三次施用后需要应用的贝伐珠单抗注射次数/患者，以及所述免疫接种所诱导的特异于VEGF-A的抗体的滴度。用抗原制备物PVM-I的免疫疗法的使用显著地(p<0.05，在所述两种情况下，Dunnet检验)降低待向患者应用的贝伐珠单抗玻璃体内注射次数，相对于常规规划(组1)而言。在所述两种情况下，都观察到在玻璃体内施用次数的减少与在患者血清中特异于人VEGF-A的抗体的水平之间的显著的相关性，其中对于组2在第四次免疫接种后一周(皮尔逊r＝-0.8788，p＝0.0008)，和对于组3在第八次免疫接种后一周(皮尔逊r＝-0.7894，p＝0.0066)。

表27.在所述研究中的患者的评价

A：需要施用的玻璃体内注射次数，和B：通过施用抗原制备物而生成的特异于人VEGF-A的抗体的滴度，组1：常规疗法，组2：在磷酸铝中的400μg PVM-I，组3：在sNAcGM3-VSSP中的400μg PVM-I。

大约30％的在该研究中所包括的患者具有活动性中央凹外息肉。这是对于响应于玻璃体内施用的常规疗法的患者的演化来说的一个不良预后因素。这归因于息肉状损伤起源于视网膜的更深层。令人感兴趣的是，具有脉络膜息肉状新血管系统的患者的分析表明了在开始疗法后一年活动性损伤数目的显著减少，这是在向其施行常规疗法的组中仅对于20％的患者(5名中1名)所描述的效果(表28)。

表28.在所述研究的患者中中央凹外息肉状损伤的评价

序列表

<110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA

<120> 包含具有二硫桥重排的人VEGF-A突变体的多肽以及包含其的组合物

<130> VEGFII

<140> CU 2019-0111

<141> 24.12.2019

<160> 24

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：编码多肽变体的核酸

<400> 1

atggtagata aaagaatggc tttagttgaa ttgaaagtgc ccgacattgg cggacacgaa 60

aatgtagata ttatcgcggt tgaagtaaac gtgggcgaca ctattgctgt ggacgatacc 120

ctgattactt tggatctaga tcacgatgac gatgacgata aagcttcaga tctgctagcc 180

gcacccatgg caaaaggagg agggcagaat catcacgaag tggtgaagtt catggatgtc 240

tatcagcgcm gtkactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca ggagtaccct 300

gatgagatcg agtacatctt caagccatcc tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc 360

tgcaatgacg agggcctgga gtgtgtgccc actgaggagt ccaacatcac catgcagatt 420

atggagatcg aacctgagca aggccagcac ataggagaga tgagcttcct acagcacaac 480

aaatgtgaat gcagaccaaa gaaagataga gccagacaag aaaaatgtga caagccgagg 540

cggggatccc gggcacacca tcaccatcac cat 573

<210> 2

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体

<400> 2

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体同种型145

<400> 3

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser

165 170 175

Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg

180 185 190

Tyr Lys Ser Trp Ser Val Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala

195 200 205

His His His His His His

210

<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体同种型165

<400> 4

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys

165 170 175

Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln

180 185 190

Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg

195 200 205

Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

210 215 220

Gly Ser Arg Ala His His His His His His

225 230

<210> 5

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体同种型189

<400> 5

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser

165 170 175

Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg

180 185 190

Tyr Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys

195 200 205

His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn

210 215 220

Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr

225 230 235 240

Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His

245 250 255

His His

<210> 6

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体同种型206

<400> 6

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser

165 170 175

Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg

180 185 190

Tyr Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro

195 200 205

Trp Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg

210 215 220

Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys

225 230 235 240

Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg

245 250 255

Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His

260 265 270

His His His

275

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：寡核苷酸

<400> 7

attgcatgcg cccccgcatc gcatcagggg cactgcgga 39

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：寡核苷酸

<400> 8

tccgcagtgc ccctgatgcg atgcgggggc gcatgcaat 39

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：寡核苷酸

<400> 9

attgcatgcg cccccgcatc gcatcagggg cacacagga 39

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：寡核苷酸

<400> 10

tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc gcatgcaat 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：寡核苷酸

<400> 11

attgcagcag cccccgcatc gcatcagggg cactcggga 39

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：寡核苷酸

<400> 12

tccgcagtgc ccctgatgcg atgcgggggc tgctgcaat 39

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：寡核苷酸

<400> 13

ctgctagccg cacccatggc agaa 24

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：寡核苷酸

<400> 14

ccgggatccc cgcctcggct t 21

<210> 15

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 Cys 110变为Ala

<400> 15

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Ala Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 16

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 Cys 119变为Ala

<400> 16

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Ala Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 17

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 Cys 110和119变为Ala

<400> 17

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Ala Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Ala Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 18

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 重排1

<220>

<221> DISULFID

<222> (85)..(110)

<220>

<221> DISULFID

<222> (116)..(119)

<220>

<221> DISULFID

<222> (120)..(127)

<220>

<223> Cys 161、Cys 163和Cys 175牵涉分子间二硫桥

<400> 18

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 19

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 重排2

<220>

<221> DISULFID

<222> (85)..(110)

<220>

<221> DISULFID

<222> (116)..(120)

<220>

<221> DISULFID

<222> (119)..(127)

<220>

<223> Cys 161、Cys 163和Cys 175牵涉分子间二硫桥

<400> 19

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 20

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 重排3

<220>

<221> DISULFID

<222> (85)..(110)

<220>

<221> DISULFID

<222> (116)..(127)

<220>

<221> DISULFID

<222> (119)..(120)

<220>

<223> Cys 161、Cys 163和Cys 175牵涉分子间二硫桥

<400> 20

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 21

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 重排4

<220>

<221> DISULFID

<222> (85)..(175)

<220>

<221> DISULFID

<222> (110)..(116)

<220>

<221> DISULFID

<222> (119)..(120)

<220>

<223> Cys 161和Cys 163牵涉分子间二硫桥

<400> 21

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 22

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 重排5

<220>

<221> DISULFID

<222> (85)..(175)

<220>

<221> DISULFID

<222> (110)..(119)

<220>

<221> DISULFID

<222> (116)..(120)

<220>

<223> Cys 161和Cys 163牵涉分子间二硫桥

<400> 22

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 23

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：多肽变体 重排6

<220>

<221> DISULFID

<222> (85)..(175)

<220>

<221> DISULFID

<222> (110)..(120)

<220>

<221> DISULFID

<222> (116)..(119)

<220>

<223> Cys 161和Cys 163牵涉分子间二硫桥

<400> 23

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Ala Pro Met Ala Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr

65 70 75 80

Gln Arg Ser Asn Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln

85 90 95

Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro

100 105 110

Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val

115 120 125

Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Glu Ile Glu Pro

130 135 140

Glu Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys

145 150 155 160

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp

165 170 175

Lys Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ala His His His His His His

180 185 190

<210> 24

<211> 46

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）

<400> 24

Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly

1 5 10 15

Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp

20 25 30

Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp

35 40 45

Claims (24)

1.多肽，其特征在于，所述多肽包含以二硫桥的非天然重排进行折叠的人血管内皮生长因子A(VEGF-A)的同种型的功能突变体，其中所述突变体的多肽链的第二个和第四个半胱氨酸仅形成分子内桥，并且所述突变体的第七个和第八个半胱氨酸仅形成分子间桥。

2.权利要求1的多肽，其特征在于，所述功能突变体从在与其2型受体(VEGFR2)的结合中所牵涉的VEGF-A的氨基酸的突变开始来获得。

3.权利要求2的多肽，其特征在于，所述人VEGF-A的同种型选自由下列各项组成的组：VEGF-A¹²¹、VEGF-A¹⁴⁵、VEGF-A¹⁶⁵、VEGF-A¹⁸⁹和VEGF-A²⁰⁶。

4.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第五个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸、两条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

5.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第五个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

6.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸、两条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

7.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

8.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸、两条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

9.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第五个半胱氨酸与第六个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸和两条多肽链的最后一个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

10.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸和两条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

11.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸相连接，第四个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

12.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸和两条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

13.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

14.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接；并且其中两条多肽链的第七个半胱氨酸和两条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

15.权利要求3的多肽，其特征在于，所述多肽包含分子内二硫桥的重排，其中第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸相连接，第二个半胱氨酸与第五个半胱氨酸相连接，第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸相连接；并且其中一条多肽链的第七个半胱氨酸与另一条多肽链的第八个半胱氨酸相连接从而形成分子间二硫桥。

16.权利要求4-15中任一项的多肽，其包含用于增加其在细菌中的表达的氨基末端区段和用于使其纯化容易的羧基末端区段。

17.权利要求16的多肽，其中所述用于增加其在细菌中的表达的氨基末端区段具有由SEQ ID NO:24组成的氨基酸序列。

18.权利要求17的多肽，其特征在于，其氨基酸序列选自由下列各项组成的组：SEQ IDNO:18至SEQ ID NO:23的序列。

19.抗原制备物，其包含至少一种权利要求4-18中任一项的多肽和在药学上可接受的赋形剂或稀释剂。

20.药学组合物，其包含权利要求19的抗原制备物和在药学上可接受的疫苗佐剂。

21.权利要求20的药学组合物，其中所述疫苗佐剂选自由下列各项组成的组：油性佐剂、铝盐、脂蛋白体和与神经节苷脂相缀合的脂蛋白体。

22.包含至少一种权利要求4-18中任一项的多肽的抗原制备物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗其进展与血管发生、炎症和免疫抑制的增加相关的疾病。

23.权利要求22的用途，其中所述其进展与血管发生、炎症和免疫抑制的增加相关的疾病选自由下列各项组成的组：癌症、黄斑变性、糖尿病、类风湿性关节炎和水肿。

24.包含至少一种权利要求4-18中任一项的多肽的抗原制备物在制备药物中的用途，所述药物用于恢复免疫系统。

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