PT2970424T - Polipéptidos de leptina canina modificados - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
"POLIPÉPTIDOS DE LEPTINA CANINA MODIFICADOS" REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório US No.61/779,337, arquivado em 13 de Março de 2013.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS O presente pedido contem uma listagem de Sequências que foi submetida electronicamente no formato ASCII e é aqui incorporada, por referência, na sua totalidade. A referida copia ASCII, criada em 7 de Março 2014 é denominada 204257-0016-WO-O0(509186)_SL.txt e tem 2597 bytes. A presente invenção relaciona-se com um polipép-tido de leptina canina modificado com polietilenoglicol e composições relacionadas e métodos úteis para tratar obesidade em animais domésticos e outros distúrbios relacionados com leptina.
Leptina é uma neuro-hormona que actua no hipotálamo para regular o falaço de energia e a ingestão alimentar. Muito já foi escrito sobre os problemas associados com leptina e o seu receptor para humanos (US2012/0149,636) mas os animais domésticos também sofrem de distúrbios relacionados com leptina. De notar particularmente são animais domésticos, tais como os caninos que experimentam distúrbios de leptina tais como obesidade. Sendo a administração de leptina exógena uma terapia conhecida em humanos, é comprometida por vários problemas não sendo o menor destes a incapacidade de providenciar efeitos duradouros. Assim estão em curso esforços para encontrar melhores alternativas e estes esforços incluem encontrar compostos mais seguros, mais duradouros e mais potentes para humanos e para animias domésticos. A presente invenção providencia um composto que compreende um polipéptido de SEQ ID N0:1 e um grupo polietilenoglicol (PEG) , em que o grupo PEG está covalentemente ligado a um grupo para-acetil-fenilalanina (pAF) do polipéptido de SEQ ID N0:1. A presente invenção também providencia um método para tratar obesidade em animais domésticos compreendendo administrar a um animal em necessidade disso, uma quantidade efectiva de um composto de acordo com a presente invenção. A presente invenção também providencia um método para evitar a obesidade em animais domésticos compreendendo administrar a um animal em necessidade disso, uma quantidade efectiva de um composto de acordo com a presente invenção. A presente invenção também providencia um composto, de acordo com a presente invenção para uso em terapia. A presente invenção também providencia um composto, de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de obesidade. A presente invenção também providencia um composto, de acordo com a presente invenção para uso na prevenção da obesidade. A presente invenção também providencia uma composição que compreende um composto, de acordo com a presente invenção e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes. A sequência de aminoácidos do polipéptido é: MVPXRKVQDD TKTLIKTIVA RINDISHTQS VSSKQRVAGL DFIPGLQPVL 50 SLSRMDQTLA IYQQILNSLH SRNVVQISMD LENLRDLLHL LASSKSCPLP 100 RARGLETFES LXaaGVLEASLY STEWALNRL QAALQDMLRR LDLSPGC 14 7
Em que Xaa é para-acetil-fenilalanina (pAF)(SEQ ID N0:1).
Um exemplo de uma molécula de DNA que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 é: atg gtt cca att cga aag gtt caa gat gat acg aag aca ctg ate aag act ate gtg gee? ege ate aac gat att: teg cat ace cag tea gtc teg teg aaa caa cgt gtg get ggc tta gat ttt att cca ggg ctg caa ccg gta ctg tet ctg age cgt. atg gac caa act ctg gee ate tac cag caa ate ett aac tet ctg cat tet ege aat gtg gtg caa ate teg aac gat ett gag aac ttg cgt gac ctg. tta cat ctg tta gee tea age aaa tea tgc ecg ctg ccg cgt gca cgt ggc ett gaa acg ttt gaa agt. ttg tag ggt gtc ttg gaa geg agt ett tat tee ace gaa gtc gtc gee ctg aac ege ctg cag gee gca ett caa gac atg ett ege cgt ctg gat etc agt ccg ggt tgc (SEQ ID N0:2).
Como resultado de processamento, a primeira metionina pode ser clivada e por isso não estar presente no polipéptido maduro, resultando numa mistura de SEQ ID NO. 1 com e sem a primeira metionina clivada. Preferivelmente a mistura final contem menos do que dez (10) porcento ou menos do que cinco (5) porcento da SEQ ID NO 1, em que a primeira metionina é clivada. Mais preferivelmente a mistura final contem 2 porcento ou menos de SEQ ID NO 1, em que a primeira metionina é clivada. São conhecidos na área aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Um aminoácido particular que não ocorre naturalmente é conhecido como para-acetil-fenilalanina (pAF). Os polipéptidos da invenção podem ser gerados in vivo usando sintetases de tRNA e e tRNa modificados para incorporar pAF em resposta a um codão stop "amber" no gene que codifica o polipéptido como descrito em US2012/0149, 636. Um plasmídeo de expressão ou vector que dirige a expressão do polipéptido de SEQ ID NO:l é transfectado numa estirpe de E.coli modificada K-12 W3110. A estirpe hospedeiro de E.coli K-12 é um derivado de W3110 que é modificada para conter o plasmideo que contem a sequência de DNA com um codão stop "amber" (TAG) no site em que o pAF é incorporado, Xaa na posição 112 da SEQ ID N0:1. 0 plasmideo também contem genes para urn par tirosil tRNA e aminoacil-tRNA sintetase (aa-RS) derivado de Methanococcus jannaschii DSM 2661 (MjTyrCUA tRNA e Tyr-RS). Este par é modificado e geneticamente seleccionado para incorporar pAF em resposta ao codão stop amber.
Os grupos PEG usados na presente invenção têm pesos moleculares médios entre 1 kDa e 100 kDa, ou entre 1 kDa e 50 kDa, ou entre 20 kDa e 50 kDa. Um grupo PEG preferido tem um peso molecular de cerca de 20 kDa. Outro grupo PEG preferido tem um peso molecular de cerca de 30 kDa. Ainda outro grupo PEG preferido tem um peso molecular de cerca de 40 kDa. PEG é usado para abranger tanto os polímeros lineares como os ramificados. A maioria dos PEGs estão disponíveis comercialmente. Preferivelmente o PEG é um PEG de 30 kDa (a-Metil-co-aminooxietilcarbamil, polioxietileno.
Animal refere-se a animais domésticos tais como cães e gatos.
Os compostos da invenção são úteis para tratar um animal doméstico que tenha um distúrbio modulado por leptina. Distúrbios deste tipo incluem obesidade e distúrbios induzidos por obesidade ou distúrbios relacionados com obesidade. Obesidade é uma condição na qual existe um excesso de tecido adiposo em proporção com o tecido magro. O tratamento da obesidade e dos distúrbios induzidos pela obesidade ou relacionados com a obesidade refere-se à administração do composto da presente invenção para reduzir a ingestão de alimentos, para reduzir preferencialmente a quantidade de tecido adiposo e reduzir o peso corporal de um animal doméstico obeso. Um efeito do tratamento pode ser reduzir o peso corporal de um animal doméstico obeso, em relação ao peso corporal do animal antes da administração dos compostos da presente invenção. 0 tratamento pode resultar adequadamente na redução da ingestão de alimentos ou calorias pelo animal, incluindo a redução da ingestão total de alimentos e em redução de peso em animais com necessidade disso. A prevenção da obesidade e distúrbios relacionados com a obesidade refere-se à administração de polipéptidos da presente invenção, para reduzir a ingestão de alimentos, para reduzir o peso corporal ou para manter o peso corporal de um animal em risco de obesidade. Outro resultado da prevenção pode ser evitar voltar a ganhar o peso corporal anteriormente perdido como resultado de dieta, exercício ou farmacoterapia. Outro resultado da prevenção pode ser evitar a ocorrência de obesidade, se o tratamento for administrado antes do início de obesidade num animal em risco de obesidade.
Os compostos da presente invenção podem ser combinados com, ou empregar um ou mais outros ingredientes activos em terapias para, e para tratar, um animal que tem um distúrbio modulado pela leptina canina.
Um composto da presente invenção pode ser incorporado numa composição adequada para administração a um animal. Estas composições são concebidas para ser adequadas para o modo de administração seleccionado e diluentes aceitáveis, veículos e/ou excipientes tais como agentes dispersantes, tampões, agentes tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidade, agentes estabilizantes e afins, são usados como apropriado. As referidas composições podem ser elaboradas de acordo com técnicas convencionais publicadas em por exemplo Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., PA 1995 que fornece um compêndio de técnicas de formulação que são geralmente conhecidas dos profissionais. Veículos adequados para composições incluem qualquer material que, quando combinado com um composto da invenção, retém a actividade do composto e é não-reactivo com o sistema imunitário do animal. Uma composição da presente invenção compreende um composto e um ou mais veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, diluentes ou excipientes.
Uma composição que compreende um composto da presente invenção pode ser administrada a um animal em risco de exibir doenças ou distúrbios como aqui descrito, usando técnicas standard de administração. Uma composição da invenção contem uma quantidade efectiva de um composto da invenção. Uma quantidade efectiva refere-se a uma quantidade (em doses o por períodos de tempo e por meios de administração) para obter o resultado terapêutico desejado.
Uma quantidade efectiva do composto pode variar de acordo com factores tais como estado de doença, idade, sexo e peso do animal e a capacidade do composto desencadear a resposta desejada no animal. Uma quantidade efectiva é também aquela em que qualquer efeito toxico ou prejudicial do composto é contrabalançado pelos efeitos terapêuticos benéficos. Uma quantidade efectiva pode ser aproximadamente 2% do peso corporal inicial do animal por semana, até o animal atingir o peso corporal desejado, tal como determinado pelo veterinário e cliente. Uma quantidade/dose efectiva pode ser entre cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso do animal por semana, administrado por exemplo por injecção subcutânea. Uma quantidade/dose efectiva pode ser 1 mg/kg administrada por injecção SC uma vez por semana.
Exemplo 1 O polipéptido da SEQ ID NO:l é obtido essencialmente como descrito em US2012/0149, 636. O polipéptido da SEQ ID NO:l é formulado para 4 mg/ml em Tris 20 mM, pH 4,0; ureia 2M; e metionina 50 mM. A este polipéptido formulado é adicionado 30 K de PEG (α-Metil-co-aminooxie-tilcarbamil-polioxietileno, Sunbright ME-300CA, NOF, Japão) para uma relação molar PEG para polipéptido 10:1. O polipéptido e o PEG são misturados com cuidado e deixados para ocorrer conjugação durante 48-72 horas a 28°C. O péptido PEGilado é então purificado por cromatografia de troca catiónica de rotina e ajustado a 1 mg/ml em PBS (solução salina tamponada) 7,4 com 4% de trealose. Este processo resulta numa mistura que contem entre 1-2% de SEQ ID N0:1, em que a primeira metionina é clivada.
Dados biológicos In vitro Células HEK 293 são transfectadas de forma estável tanto com o gene repórter de luciferase sob o controlo de um elemento de resposta STAT3 e o OB-Rb (receptor da leptina), que está expresso à superfície da célula. A leptina liga-se ao receptor da leptina e activa homodímeros de STAT3 e heterodímeros STAT3/STAT1 que interagem e se ligam ao elemento de resposta de sequência STAT3. Esta interacção conduz à expressão do gene de luciferase e estimula as células a produzir luminescência. A quantidade de luminescência é proporcional à actividade do composto. A actividade biológica é baseada no EC50 de uma curva sigmoidal 4-PL.
DIA UM
As células foram cultivadas numa pica de 96 poços a uma densidade de 20000 células/poço e colocadas numa incubadora a 37°C, 5% CO2 durante 24-30 horas.
DIA DOIS A concentração inicial para leptina canina tipo selvagem (wild type-WT) e o polipéptido PEGuilado do exemplo 1 é 1200 ng/ml. Desta, é tomado 400 μΐ de cada amostra e são feitas diluições em série através das linhas do bloco de diluição. Primeiro 300 μΐ/poço de meio de ensaio são adicionados a Col 2-11. Em seguida 100 μΐ são transferidos de Col 1 para Col 2, misturados cuidadosamente e devagar (sem fazer bolhas) 8-10 vezes e depois continuando a transferir 100 μΐ de Col 2 para Col 3 e repetindo até atingir Col 11. Deixar Col 12 como poço controlo, não estimulado. As células são então estimuladas com as diluições em série da leptina canina tipo selvagem (WT) e o polipéptido PEGilado do exemplo 1. As células são removidas da incubadora e o meio é cuidadosamente aspirado de cada poço. Em seguida 100 μΐ/poço do tipo selvagem diluído em série e polipéptido PEGilado é transferido do bloco de diluição de poços fundos para as células nas placas de ensaio de 96 poços. Amostras duplicadas são então formadas para tipo selvagem e polipéptido PEGilado testados horizontalmente através da próxima fila disponível. As placas são incubadas numa incubadora a 37°C, 5% C02 durante 16-18 horas. O formato da placa com concentrações finais em ng/ml mostra-se abaixo:
DIA TRÊS
Ao dia 3 é preparado um substracto e adicionado às células e estas são então medidas por um luminómetro. Aproximadamente 1-2 horas antes da placa ser lida é descongelado um conjunto de reagentes Steady-Glo (Promega) incluindo: um frasquinho de substracto de ensaio de luciferase Steady-Glo liofilizado e um frasquinho de tampão de ensaio de luciferase Steady-Glo por placa de ensaio à temperatura ambiente. Todo o conteúdo do tampão de ensaio de luciferase (aprox. 10,5 ml) é pipetado para o substracto de luciferase liofilizado. ΙΟΟμΙ/poço do substracto de luciferase reconstituído é adicionado a cada poço da placa de ensaio e a placa de ensaio é coberta com folha de alumínio e incubada à temperatura ambiente durante 45-60 minutos num agitador de placas a 450-600 rpm. A placa é então lida num leitor de placas Tecan GENiosPRO com um tempo de integração ajustado a 250 mseg. Os dados são são introduzidos em Excel e é realizada uma determinação de EC50 em aplicação SigmaPlot e a perda de actividade relativamente à Leptina WT e determinações de potência em percentagem relativa são também levadas a cabo. Perda de actividade relativamente à leptina canina tipo selvagem é determinada como [EC50 do exemplo] dividida pela [EC50 da leptina tipo selvagem]; a potência relativa em % de proteínas leptina para standard de referência é calculado dividindo o EC50 do standard de referência pelos valores EC50 das proteínas leptina e multiplicando por 100. Por exemplo a potência relativa em % é calculada como o [EC50 de standard de referência] dividido pelo [EC50 da amostra] x 100. A seguinte tabela mostra polipéptidos WT (tipo selvagem) e PEGuilados do exemplo 1, analisados usando estes métodos.
Tabela 1
Os resultados mostram que o polipéptido PEGuilado do Exemplo 1 é activo in vitro.
Dados Biológicos In vivo O objectivo deste estudo é avaliar o impacto do polipéptido PEGuilado do exemplo 1 no peso corporal, composição corporal e comportamento alimentar em cães obesos, machos e fêmeas. O polipéptido PEGuilado do exemplo 1, formulado a 5,1 mg/ml em tampão fosfato salino com um pH de 7,4 a 4%(peso/volume) de trealose. São usados dezoito (18) cães, todos com mais de um (1) ano: nove (9) beagles macho intactos e nove (9) beagles fêmea intactos. Estes cães são obesos, pesando aproxi-madamente 12 a 18 kg (26,4 a 39,6 libras) . Durante as primeiras quatro semanas do período de aclimatização, (ou até ser atingido o peso de início desejado), os cães são alimentados com comida seca de laboratório com alto teor em gordura (aprox. 45%) que preenche ou excede os requerimentos nutricionais para manutenção e saúde. Todos os cães são alimentados ad libitum durante esta porção do período de aclimatização para facilitar o aumento de peso. Durante as últimas duas semanas do período de aclimatização e no resto do estudo, todos os cães são alimentados com comida seca para cães, com o teor normal em gordura da comida comercial (aprox. 12%), para reduzir os níveis endógenos de leptina e restaurar a sensibilidade à leptina. Os cães nos grupos de tratamento 1 e 2 continuam a receber comida ad libitum durante o resto do estudo. Os animais no grupo de tratamento 3 são alimentados duas vezes por dia de acordo com as instruções do rótulo para a dieta. Os animais têm acesso ad libitum a água através de tijelas ou a um sistema automático para providenciar água contido em cada gaiola. Não são administrados outros medicamentos concomitantes durante o decurso do estudo.
Este estudo é conduzido como um design de blocos aleatório em cada sexo. Os cães são atribuídos aleatoriamente a compartimentos. Os animais são distribuídos por blocos de acordo com o peso corporal de base (dia-14) em cada sexo. Há três blocos com três machos e três fêmeas. 0 bloco um dos machos consiste em 3 machos com os pesos corporais mais baixos e o bloco um das fêmeas consistirá em 3 fêmeas com os pesos corporais mais baixos. Os segundos blocos em cada sexo consistem em 3 machos e três fêmeas com os seguintes pesos corporais mais baixos. 0 bloco final em cada sexo contem 3 machos e 3 fêmeas com os pesos corporais mais elevados. A tabela seguinte mostra os tratamentos, regimes de dose e números de animais utilizados.
Tabela 2
Os animais são divididos em dois grupos de sexo de nove animais. Em cada grupo de sexo os animais são ordenados do mais baixo para o mais alto baseado nos pesos corporais no dia -14. Os animais em cada grupo de sexo são divididos em blocos de três animais, com base em crescentes pesos corporais de base. Aos animais são atribuídas localizações em compartimentos usando uma tabela de aleatorização providenciada pelo promotor.
Aos grupos controlo e tratados são administrados via injecção subcutânea nos dias 0, 7, 14, 21, 28. As amostras de soro (aproximadamente 2-3 ml) são obtidas antes da inclusão no estudo no dia -14 antes de sujeitar os animais à ração de baixo teor em gordura, para habituar os cães ao procedimento e para estabelecer uma níveis de leptina endógenos de linha de base. A seguinte tabela fornece o nível de leptina circulante aos dias -14 e -1.
Tabela 3
Animais em todos os grupos de tratamento são submetidos a scan de DEXA (dual energy x-ray absorptiometry-absorciometria de raios X de dupla energia) nos dias -1, dia 21 e dia 42 (o dia final do estudo) para determinar as percentagens de tecido magro versus tecido adiposo.
Os consumos de ração diária são registados para animais incluídos nos grupos de tratamento 1 e 2 nos dias -7 a 42, aproximadamente ao mesmo tempo.
Os animais em todos os grupos de tratamento são filmados em video 24 horas por dia, começando ao dia -7 e continuando até ao fim do estudo, para observar o comportamento alimentar incluindo o número de refeições por dia e a duração média da alimentação por refeição. 0 resultado primário será a modificação nos pesos corporais dos indivíduos, por semana, durante o decorrer do estudo e estes serão sumarizados e comparados nos grupos de tratamento. Resultados secundários serão: 1)Composição corporal: resultados de DEXA de animais individuais, incluindo as percentagens de tecido magro e tecido adiposo serão sumarizados durante o decorrer do estudo e 2) Consumo alimentar/ comportamento alimentar: o consumo alimentar diário médio para animais individuais, nos tratamentos 1 e 2, será sumarizado para cada animal.
Serão observadas as gravações em vídeo do comportamento alimentar dos animais individuais para determinar o número de refeições e duração das refeições consumidas antes da iniciação do tratamento e a seguir à iniciação do tratamento.
Os resultados do impacto nos pesos corporais são providenciados na seguinte tabela.
Tabela 4
Ap=0,001; Bp=0,002.
Estes resultados indicam que os grupos tratados com o composto do exemplo 1 perderam mais peso comparados com o grupo controlo. O impacto na composição corporal está providenciado da seguinte tabela.
Tabela 5
Ap=0, 0 0 6; Bp=0, 049; cp=0,022; Dp=0, 038.
Estes resultados indicam que os grupos tratados com o composto do Exemplo 1 tiveram uma redução nos valores de condição corporal associado com uma diminuição preferencial da percentagem de tecido adiposo e não tiveram impacto significativo na percentagem de tecido, comparado com o grupo controlo. O impacto no consumo alimentar e comportamento está providenciado na seguinte tabela.
Tabela 6
Estes resultados indicam que os grupos tratados com o composto do exemplo, consumiram menos comida, comparado com o grupo controlo e a redução na ingestão de alimento estava associada com o tempo passado a comer, em oposição ao número de refeições consumidas por dia.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ELI LILLY AND COMPANY AMBRX, INC. <120> Polipéptidos de leptina canina modificados <130> 204257-0016-WO-00 (509186) <140> <141> <150> 61/779,337 <151> 2013-03-13 <160> 2 <170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 147 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> / Nota="Descrição de Sequência Artificial: polipéptido sintético" <22 0> <221> MOD_RES <222> (112)..(112) <223> Para-acetil-fenilalanina (pAF)
Met Val Pro lie Arg Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15
Thr lie Val Ala Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30
Ser Lys Gin Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu Gin Pro 35 40 45
Val Leu Ser Leu Ser Arg Met Asp Gin Thr Leu Ala lie Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Asn Ser Leu His Ser Arg Asn Val Val Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80
Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Ser Ser Lys Ser 85 90 95
Cys Pro Leu Pro Arg Ala Arg Gly Leu Glu Thr Phe Glu Ser Leu Xaa 100 105 110
Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Asn 115 120 125
Arg Leu Gin Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Arg Leu Asp Leu Ser 130 135 140
Pro Gly Cys 145
<210> 2 <211> 441 <212>ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: polipéptido sintético" <400> 2 atggttecaa ttcgaaaggt tcaagatgat aagaagacae tgatoaagac tategtggcg 60 cgcatcaacg atatttcgca tacccagtca gtctcgtcga aacaacgtgt ggctggctta 120 gattttattc cagggctgca accggtactg tctctgagcc gtatggacca aactctggce 180 atctaccagc aaatccttaa ctetctgcat tctegcaatg tggtgcaaat ctegaacgat 240 cttgagaact tgcgtgacct gttacatctg ttagcctcaa gcaaatcatg cccgctgacg 300 cgtgcacgtg gccttgaaac grtttgaaagt ttgtagggtg tcttggaagc gagtctttat 360 tccaccgaag tcgtcgccct gaaccgcctg caggccgcac ttcaagacat gcttcgcogt 420 ctggatctca gtccgggttg c 441
Lisboa, 18 de Agosto de 2017
Claims (8)
1. Um composto que compreende um polipéptido de SEQ ID NO: 1 e uma parte polietilenoglicol (PEG), em que a parte PEG está covalentemente ligada a um grupo para-acetil-fenilalanina (pAF) do polipéptido da SEQ ID N0:1.
2. 0 composto da reivindicação 1, em que a referida parte PEG tem um peso molecular de cerca de 30 kDa.
3. O composto da reivindicação 2 em que a referida parte PEG é a-metil-co-aminooxietilcarbamil ou polioxi-etileno.
4. um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para uso em terapia.
5. Um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para uso no tratamento de obesidade num animal doméstico.
6. Um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para uso na prevenção da obesidade num animal doméstico.
7. O composto para uso, de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que o animal doméstico é um cão.
8. Uma composição que compreende o composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes. Lisboa, 18 de Agosto de 2017 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Patentes citadas na Descrição * US 61779337 A * WO 61779337 A * US 20120149636 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Remington, The Science and Practice of Pharmacy. Mack Publishing Co, 1995
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