JP6434071B2 - 修飾されたイヌレプチンポリペプチド - Google Patents

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された、米国仮出願第６１／７７９，３３７号の利益を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出している配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。２０１４年３月７日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０４２５７−００１６−ＷＯ−００（５０９１８６）＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、２，５９７バイトのサイズである。

本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により修飾されたイヌレプチンポリペプチドならびにペットの肥満および他のレプチン関連障害を治療するのに有用な関連組成物および方法に関する。

レプチンは、エネルギーバランスおよび食物摂取を調節するために視床下部において作用する神経ホルモンである。ヒトについてのレプチンおよびその受容体に関連する問題について非常に多く記載されているが（特許文献１）、ペットもレプチン関連障害に苦しんでいる。特に注目すべきことは、イヌなどのペットが肥満などのレプチン障害を受けていることである。ヒトにおいて療法として外因性レプチンを投与することは知られているが、それはいくつかの問題により妨げられており、その中でも無視できないのが、長続きする効果を提供できないことである。したがって、より良い代替案を見つける努力が継続中であり、それらの努力は、ヒトおよびペットに対して、より安全で、より長続きし、より有効な化合物を見つけることを含む。

米国特許出願公開第２０１２／０１４９，６３６号

本発明は、配列番号１のポリペプチドおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む化合物であって、ＰＥＧ部分は配列番号１のポリペプチドのパラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）残基に共有結合している、化合物を提供する。

本発明はまた、有効量の本発明に係る化合物を、それを必要とする動物に投与することを含む、ペットにおいて肥満を治療する方法を提供する。

本発明はまた、有効量の本発明に係る化合物を、それを必要とする動物に投与することを含む、ペットにおいて肥満を予防する方法を提供する。

本発明はまた、療法に使用するための本発明に係る化合物を提供する。

本発明はまた、肥満の治療に使用するための本発明に係る化合物を提供する。

本発明はまた、肥満の予防に使用するための本発明に係る化合物を提供する。

本発明はまた、本発明に係る化合物および１種以上の担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。

ポリペプチドのアミノ酸配列は以下である：
ＭＶＰＩＲＫＶＱＤＤ ＴＫＴＬＩＫＴＩＶＡ ＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳ ＶＳＳＫＱＲＶＡＧＬ ＤＦＩＰＧＬＱＰＶＬ ５０
ＳＬＳＲＭＤＱＴＬＡ ＩＹＱＱＩＬＮＳＬＨ ＳＲＮＶＶＱＩＳＮＤ ＬＥＮＬＲＤＬＬＨＬ ＬＡＳＳＫＳＣＰＬＰ １００
ＲＡＲＧＬＥＴＦＥＳ ＬＸａａＧＶＬＥＡＳＬＹ ＳＴＥＶＶＡＬＮＲＬ ＱＡＡＬＱＤＭＬＲＲ ＬＤＬＳＰＧＣ １４７
ここで、Ｘａａはパラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）（配列番号１）である。

配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子の例は以下である：
ａｔｇ ｇｔｔ ｃｃａ ａｔｔ ｃｇａ ａａｇ ｇｔｔ ｃａａ ｇａｔ ｇａｔ ａｃｇ ａａｇ ａｃａ ｃｔｇ ａｔｃ ａａｇ ａｃｔ ａｔｃ ｇｔｇ ｇｃｇ ｃｇｃ ａｔｃ ａａｃ ｇａｔ ａｔｔ ｔｃｇ ｃａｔ ａｃｃ ｃａｇ ｔｃａ ｇｔｃ ｔｃｇ ｔｃｇ ａａａ ｃａａ ｃｇｔ ｇｔｇ ｇｃｔ ｇｇｃ ｔｔａ ｇａｔ ｔｔｔ ａｔｔ ｃｃａ ｇｇｇ ｃｔｇ ｃａａ ｃｃｇ ｇｔａ ｃｔｇ ｔｃｔ ｃｔｇ ａｇｃ ｃｇｔ ａｔｇ ｇａｃ ｃａａ ａｃｔ ｃｔｇ ｇｃｃ ａｔｃ ｔａｃ ｃａｇ ｃａａ ａｔｃ ｃｔｔ ａａｃ ｔｃｔ ｃｔｇ ｃａｔ ｔｃｔ ｃｇｃ ａａｔ ｇｔｇ ｇｔｇ ｃａａ ａｔｃ ｔｃｇ ａａｃ ｇａｔ ｃｔｔ ｇａｇ ａａｃ ｔｔｇ ｃｇｔ ｇａｃ ｃｔｇ ｔｔａ ｃａｔ ｃｔｇ ｔｔａ ｇｃｃ ｔｃａ ａｇｃ ａａａ ｔｃａ ｔｇｃ ｃｃｇ ｃｔｇ ｃｃｇ ｃｇｔ ｇｃａ ｃｇｔ ｇｇｃ ｃｔｔ ｇａａ ａｃｇ ｔｔｔ ｇａａ ａｇｔ ｔｔｇ ｔａｇ ｇｇｔ ｇｔｃ ｔｔｇ ｇａａ ｇｃｇ ａｇｔ ｃｔｔ ｔａｔ ｔｃｃ ａｃｃ ｇａａ ｇｔｃ ｇｔｃ ｇｃｃ ｃｔｇ ａａｃ ｃｇｃ ｃｔｇ ｃａｇ ｇｃｃ ｇｃａ ｃｔｔ ｃａａ ｇａｃ ａｔｇ ｃｔｔ ｃｇｃ ｃｇｔ ｃｔｇ ｇａｔ ｃｔｃ ａｇｔ ｃｃｇ ｇｇｔ ｔｇｃ （配列番号２）。

プロセシングの結果として、最初のメチオニンは切断され得るので、成熟ポリペプチドに存在せず、その結果、切断した最初のメチオニンを有するおよび有さない配列番号１の混合物を生じる。好ましくは、最後の混合物は十（１０）パーセント未満または五（５）パーセント未満の配列番号１を含有し、最初のメチオニンは切断されている。最も好ましくは、最後の混合物は２パーセント未満の配列番号１を含有し、最初のメチオニンは切断されている。

天然に存在しないアミノ酸は当該分野において知られている。１つの特定の天然に存在しないアミノ酸は、パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）として知られている。本発明のポリペプチドは、米国特許出願公開第２０１２／０１４９，６３６号に記載されているポリペプチドをコードする遺伝子においてａｍｂｅｒ終止コドンに応答するｐＡＦを組み込むために修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを使用してインビボで生成され得る。配列番号１のポリペプチドの発現を誘導する発現プラスミドまたはベクターは、修飾された大腸菌Ｋ−１２ Ｗ３１１０株内にトランスフェクトされる。大腸菌Ｋ−１２宿主株は、ｐＡＦが組み込まれる部位、配列番号１の１１２位におけるＸａａにａｍｂｅｒ終止コドン（ＴＡＧ）を有するＤＮＡ配列を含有するプラスミドを含有するように修飾されるＷ３１１０誘導体である。プラスミドはまた、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＤＳＭ ２６６１に由来する修飾されたチロシルｔＲＮＡおよびアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａ−ＲＳ）対（ＭｊＴｙｒＣＵＡ ｔＲＮＡおよびＴｙｒ−ＲＳ）についての遺伝子を含有する。この対は修飾され、ａｍｂｅｒ終止コドンに応答するｐＡＦを組み込むために遺伝的に選択される。

本発明に使用されるＰＥＧ部分は、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、または１ｋＤａ〜５０ｋＤａ、または２０ｋＤａ〜５０ｋＤａの平均分子量を有する。好ましいＰＥＧ部分は約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の好ましいＰＥＧ部分は約３０ｋＤａの分子量を有する。さらに別の好ましいＰＥＧ部分は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＰＥＧは直鎖状および分枝状の両方のポリマーを包含するために使用される。多くのＰＥＧは市販されている。好ましくは、ＰＥＧは３０ｋＤａのＰＥＧ（α−メチル−ω−アミノオキシエチルカルバミル（ａｍｉｍｏｏｘｙｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｙｌ）、ポリオキシエチレンである。

動物とは、イヌおよびネコなどのペットを指す。

本発明の化合物は、レプチンによって調節される障害を有するペットを治療するのに有用である。このような障害は、肥満および肥満により誘導されるまたは肥満に関連する障害を含む。肥満は除脂肪組織に比例して過剰の脂肪組織が存在する状態である。肥満および肥満により誘導されるまたは肥満に関連する障害の治療とは、食物摂取を減少させるため、優先的には脂肪組織の量を減少させるため、および肥満のペットの体重を減少させるための本発明の化合物の投与を指す。治療の１つの結果は、本発明の化合物の投与前の動物の体重に比べて肥満のペットの体重を減少させることができる。治療は、好適には、総食物摂取量の減少を含む、動物による食物またはカロリー摂取量の減少、およびその治療を必要とする動物の体重減少を生じる。肥満および肥満に関連する障害の予防とは、肥満の危険性のある動物の食物摂取量を減少させるため、体重を減少させるため、または体重を維持するための本発明のポリペプチドの投与を指す。予防の別の結果は、ダイエット、エクセサイズ、または薬物療法の結果として、以前に失った体重の再増加を予防できる。予防の別の結果は、治療が肥満の危険性のある動物における肥満の発症前に投与される場合、肥満が生じることを予防できる。

本発明の化合物は、イヌレプチンによって調節される障害を有する動物のための療法において、およびその動物を治療するために１種以上の他の有効成分と組み合わせてもよく、またはそれらを利用してもよい。

本発明の化合物は動物への投与に適した組成物内に組み込まれ得る。そのような組成物は、選択される投与様式に適するように設計され、分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などの許容可能な希釈剤、担体、および／または賦形剤が必要に応じて使用される。前記組成物は、例えば、実務者に一般的に知られている製剤技術の概要を提供する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ １９９５に開示される従来技術に従って設計され得る。組成物のための好適な担体は、本発明の化合物と組み合わされる場合、化合物の活性を保持し、動物の免疫系と反応しない任意の物質を含む。本発明の組成物は、化合物および１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む。

本発明の化合物を含む組成物は、標準的な投与技術を使用して本明細書に記載される疾患または障害の危険性のある、またはそれらを示す動物に投与され得る。本発明の組成物は有効量の本発明の化合物を含有する。有効量とは、（投薬量ならびに投与期間および投与手段にて）所望の治療効果を達成する量を指す。化合物の有効量は、疾患状態、動物の年齢、性別および体重、ならびに動物において所望の反応を引き起こす化合物の能力などの要因に応じて変わり得る。有効量はまた、治療的に有益な効果が、化合物の任意の毒性または有害作用を上回るものである。有効量は、動物が獣医およびクライアントによって決定される所望の体重を達成するまで、１週間当たり動物の初期の体重のおよそ２％であり得る。有効量／用量は、例えば皮下注射によって投与する場合、１週間当たり約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ動物の体重であってもよい。有効量／用量は、１週間に１回、ＳＣ注射によって投与される場合、１ｍｇ／ｋｇであってもよい。

実施例１
配列番号１のポリペプチドは、実質的に米国特許出願公開第２０１２／０１４９，６３６に記載されているように得られる。配列番号１のポリペプチドは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ４．０；２Ｍ尿素；および５０ｍＭメチオニン中に４ｍｇ／ｍＬで製剤化される。この製剤化したポリペプチドに、３０Ｋ ＰＥＧ（α−メチル−ω−アミノオキシエチルカルバミル、ポリオキシエチレン、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−３００ＣＡ、ＮＯＦ、日本）を１０：１のＰＥＧ対ポリペプチドのモル比で加える。ポリペプチドおよびＰＥＧを穏やかに混合し、コンジュゲーションを２８℃にて４８〜７２時間進行させる。次いでＰＥＧ化ポリペプチドを通常のカチオン交換クロマトグラフィーにより精製し、４％トレハロースを有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）７．４中で１ｍｇ／ＭＬに製剤化する。このプロセスは、１〜２％の配列番号１（最初のメチオニンは切断されている）を含有する混合物を生じる。

インビトロ生物学的データ
ＨＥＫ２９３細胞を、ＳＴＡＴ３反応エレメントの制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子および細胞表面上で発現するＯＢ−Ｒｂ（レプチン受容体）の両方で安定にトランスフェクトする。レプチンはレプチン受容体に結合し、ＳＴＡＴ３配列反応エレメントと相互作用し、結合する、ＳＴＡＴ３ホモ二量体およびＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ１ヘテロ二量体を活性化する。この相互作用はルシフェラーゼ遺伝子の発現を誘導し、発光を生じるように細胞を刺激する。発光の量は化合物の活性に比例する。生物活性は４−ＰＬのＳ字状曲線のＥＣ５０に基づく。

１日目
細胞を２０，０００細胞／ウェルにて９６ウェルプレートに播種し、２４〜３０時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内に入れる。

２日目
野生型（ＷＴ）イヌレプチンおよび実施例１のＰＥＧ化ポリペプチドについての開始濃度は１２００ｎｇ／ｍＬである。そこから、４００μＬ体積を各試料から得、４×連続希釈を希釈ブロックの列にわたって作製する。最初に、３００μＬ／ウェルのアッセイ培地をＣｏｌ２〜１１に加える。次いで、１００μＬをＣｏｌ１からＣｏｌ２に移し、注意深くおよびゆっくり（泡立てずに）８〜１０回混合し、次いで１００μＬをＣｏｌ２からＣｏｌ３に移し続け、Ｃｏｌ１１に到達するまで繰り返す。Ｃｏｌ１２を刺激されていない対照ウェルのままにしておく。次いで細胞を、野生型（ＷＴ）イヌレプチンおよび実施例１のＰＥＧ化ポリペプチドの連続希釈で刺激する。細胞をインキュベータから取り出し、培地を各ウェルから注意深く吸引する。次いで１００μＬ／ウェルの連続希釈したＷＴおよびＰＥＧ化ポリペプチドを、ディープウェル希釈ブロックから９６ウェルアッセイプレート中の細胞に移す。次いで二連の試料を、次の利用可能な列にわたって水平に試験したＷＴおよびＰＥＧ化ポリペプチドについて作製する。プレートを、１６〜１８時間、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータにおいてインキュベートする。ｎｇ／ｍＬで最終濃度を有するプレート形式を以下に示す。

３日目
３日目に、基質を調製し、細胞に加え、次いでそれらを照度計によって測定する。プレートを読み取る前に約１〜２時間、室温にてアッセイプレート当たり、１つのバイアルのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ凍結乾燥したルシフェラーゼ基質および１つのバイアルのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ緩衝液を含む、１セットのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を解凍する。ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（約１０．５ｍＬ）の全内容物をピペット操作により、凍結したルシフェラーゼ基質に入れる。１００μＬ／ウェルの再構成したルシフェラーゼ基質を、アッセイプレートの各ウェルに加え、アッセイプレートをアルミニウム箔で覆い、４５０〜６００ｒｐｍに設定したプレートシェーカー上で室温にて４５〜６０分間インキュベートする。次いでプレートを、２５０ｍｓｅｃに設定した積分時間でＴｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓＰＲＯプレートリーダーにより読み取る。次いでデータをＥｘｃｅｌに入力し、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎでＥＣ５０測定を実施し、ＷＴレプチンに対する損失活性（倍）および相対的効力（パーセント）測定も実施する。野生型イヌレプチンに対する損失活性（倍）は、［試料のＥＣ５０］を［野生型レプチンのＥＣ５０］で割って測定し；参照基準に対するレプチンタンパク質の相対的効力％は、参照基準のＥＣ５０をレプチンタンパク質のＥＣ５０値で割り、１００を掛けることによって算出する。例えば、相対的効力％は、［試料のＥＣ５０］で割った［参照基準のＥＣ５０］×１００として算出する。以下の表は、これらの方法を使用して分析した実施例１のＷＴおよびＰＥＧ化ポリペプチドを示す。

インビボ生物学的データ
この研究の目的は、肥満の雄および雌のイヌにおける体重、身体組成、および摂食行動に対する実施例１のＰＥＧ化ポリペプチドの影響を評価することである。実施例１のＰＥＧ化ポリペプチドを、７．４のｐＨで、および４％（ｗ／ｖ）トレハロースを有するリン酸緩衝生理食塩水中で５．１ｍｇ／ｍｌにて製剤化した。

全て一（１）歳以上の十八（１８）匹のイヌを使用する：九（９）匹の去勢されていない雄および九（９）匹の避妊手術を受けていないビーグル犬。イヌは肥満であり、約１２〜１８ｋｇ（２６．４〜３９．６ｌｂｓ）の体重である。最初の４週間の順応期間の間（または所望の開始体重が達成されるまで）、イヌに実験用の高脂肪（約４５％）乾燥食品（維持および健康についての栄養要求を満たすまたは超えている）を与える。全てのイヌは、体重増加を促進するためにこの順応期間の間、自由に餌を取ることができる。順応期間の最後の２週間および研究の残りの期間の間、内因性レプチンレベルを減少させ、レプチン感受性を回復させるために、全てのイヌに市販の通常の脂肪（約１２％）乾燥ドッグフードを与える。処置群１および２におけるイヌは、研究の残りの間にわたって自由に餌を取らせ続ける。処置群３における動物はラベルの指示に従ってダイエットのために１日に２回餌を与える。動物はボウルまたは各ケージに含まれる自動水供給システムで水を自由に取ることができる。研究の過程の間、他の併用薬は投与されない。

この研究は、各々の性においてランダム化したブロック設計として行われる。イヌをランダムに囲いに割り当てる。動物を各々の性においてベースライン（−１４日）体重によってブロックする。３匹の雄を有する３つのブロックが存在し、３匹の雌を有する３つのブロックが存在する。雄のブロックの１つは最も低い体重を有する３匹の雄からなり、雌のブロックの１つは最も低い体重を有する３匹の雌からなる。各々の性において第２のブロックは、次に最も低い体重を有する３匹の雄および３匹の雌からなる。各々の性において最後のブロックは、最も重い体重を有する３匹の雄および３匹の雌からなる。

以下の表は、利用した動物の処置、投薬レジメン、および数を示す。

動物を９匹の動物の２つの性の群に分ける。各々の性の群において、動物を−１４日の体重に基づいて最低から最高にランク付けする。各々の性の群における動物を、増加しているベースライン体重に基づいて３匹の動物のブロックに分ける。動物を、スポンサーによって提供されるランダム化表を使用して囲いの位置にランダムに割り当てる。

対照および処置群を、０、７、１４、２１、２８日に皮下注射により投与する。出血処置に対してイヌを順応させ、ベースライン内因性レプチンレベルを確立するために、動物を低脂肪の餌に切り替える前に−１４日に研究に登録する前に血清試料（約２〜３ｍｌ）を得る。以下の表は−１４日および−１日における循環レプチンレベルを提供する。

全ての３つの処置群における動物を、脂肪組織に対する除脂肪のパーセンテージを決定するために、−１日、２１日および４２日（最後の研究の日）にＤＥＸＡ（二重エネルギーＸ線吸収法）走査に供する。

毎日の食餌消費量を、各々ほぼ同じ時間で、−７日から４２日の間、処置群１および２に登録した動物について記録する。

全ての処置群における動物を、−７日に開始して１日につき２４時間録画し、１日当たりの食餌の数および食餌当たりの平均摂取時間を含む、摂食行動を観察するために研究の終わりまで継続する。

主要評価項目は、研究の過程にわたる毎週の個々の動物の体重の変化であり、それらをまとめ、処置群と比較する。副次的評価項目は以下の通りである：
１）身体組成：除脂肪および脂肪組織のパーセンテージを含む、個々の動物のＤＥＸＡ走査の結果を研究の過程にわたってまとめ、
２）食餌消費量／摂食行動：処置１および２における個々の動物についての毎日の食餌消費量を各々の動物についてまとめる。

個々の動物の摂食行動を記録したビデオテープを、処置の開始前および処置の開始後、食餌の数および各動物が費やす食餌の時間を測定するために観察する。

体重に対する影響の結果を以下の表に提供する。

これらの結果は、実施例１の化合物で処置した群は、対照群と比較して多くの体重を損失したことを示す。

身体組成に対する影響を以下の表に提供する。

これらの結果は、実施例１の化合物で処置した群が、脂肪組織のパーセンテージの優先的な低下に関連する身体状態のスコアを減少し、対照群と比較して組織のパーセンテージに対して有意な影響がないことを示す。

食餌消費および摂食行動に対する影響を以下の表に提供する。

これらの結果は、実施例の化合物で処置した群が対照群と比較して食餌の消費が少なくなり、食餌摂取の減少が、１日当たりに消費される食餌の数と対照的に摂食に費やす時間の減少に関連していることを示す。

Claims (8)

1. 配列番号１のポリペプチドおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む化合物であって、前記ＰＥＧ部分は、前記配列番号１のポリペプチドの１１２位のパラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）残基に共有結合している、化合物。
2. 前記ＰＥＧ部分が３０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の化合物。
3. 前記ＰＥＧ部分が、α−メチル−ω−アミノオキシエチルカルバミル、ポリオキシエチレンである、請求項２に記載の化合物。
4. 配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターであって、前記ＤＮＡ配列が、配列番号１のポリペプチドの１１２位にパラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）をコードするａｍｂｅｒ終止コドンを含有する、ベクター。
5. 配列番号２のＤＮＡ配列を含有する、請求項４に記載の発現ベクター。
6. メタノコックス・ヤンナスキイＤＳＭ ２６６１に由来する、修飾されたチロシルｔＲＮＡおよびアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａ−ＲＳ）対をコードするＤＮＡ配列をさらに含有する、請求項４又は５に記載の発現ベクター。
7. 配列番号１のポリペプチドを発現させるために請求項４〜６のいずれかに記載の発現ベクターを使用する方法。
8. 請求項４〜６のいずれかに記載の発現ベクターを修飾された大腸菌Ｋ−１２ Ｗ３１１０株内にトランスフェクトして配列番号１のポリペプチドを得る工程、および得られたポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾する工程を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物の製造方法。