KR101627879B1

KR101627879B1 - 강화된 소마토스타틴 면역성을 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101627879B1
Application number: KR1020107029178A
Authority: KR
Inventors: 케이트 엔. 하퍼; 제임스 래릭; 앤드류 알. 멘델슨
Original assignee: 브라아쉬 바이오테크 엘엘씨
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2016-06-07
Also published as: EP2291194A1; AU2009262243B2; IL209829A; US20110195080A1; BRPI0914300A2; BRPI0914300B1; BRPI0914300B8; WO2009158395A1; US8425914B2; CN102119033B; NZ590010A; CN102119033A; EP2291194B1; JP5627581B2; MX2010014078A; RU2011100105A; CO6321162A2; ZA201009127B; JP2011526285A; EP2291194A4

Abstract

본 발명의 조성물 및 방법은 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍과 같은 치료를 필요로 하는 환자의 치료를 가능하게 한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 소마토스타틴에 대한 면역성을 제공하고, 내인성으로 생성된 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1의 분비를 증가시키는 신규한 백신을 포함한다.

Description

강화된 소마토스타틴 면역성을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED SOMATOSTATIN IMMUNOGENICITY}

본 발명은 2008년 6월 25일에 출원되고 사실상 참조로서 본원에 통합되어 있는, 클로람페니콜 아세틸 트렌스퍼라아제(CAT)-결손성 소마토스타틴 융합 단백질 및 그것의 용도라는 제목의 PCT 특허 출원 일련 번호 PCT/US08/68195와 관계가 있다.

본 발명은 성장 호르몬(growth hormone; GH) 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1(insulin-like growth factor 1; IGF-1) 결핍을 가지는 환자의 치료에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 소마토스타틴에 기초한 항원/보조제 백신의 사용을 통한 GH 및/또는 IGF-1 결핍을 가지는 환자를 위한 치료 및 상기 치료에 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.

소아마비(polio), B형 간염(hepatitis B) 및 인플루엔자(influenza)의 예방을 위한 백신의 사용을 포함하는, 백신을 이용한 감염성 질환의 예방은 지난 1700년대부터 수행되어 왔다. 가장 최근에는, 암의 치료 즉, 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 피부암(skin cancer) 등의 치료에 있어서 백신이 환자의 면역 시스템을 이용하여 표적 종양 세포를 확인하고 파괴하도록 하는 백신의 용도에 대하여 확인하였다. 백신 치료를 위한 다른 새롭고 유용한 표적은 침입 또는 발암 물질을 물리치는데 환자 자신의 면역 시스템을 사용하는 이점 때문에 개발되고 있다. 대개의 경우, 백신은 그 백신의 접종자에 의하여 면역성을 얻기 위한 항원 및 그 항원에 대한 반응을 강화시키기 위한 보조제와 결합한다.

성장 호르몬은 뇌하수체 전엽(anterior pituitary gland)으로부터 합성되고 분비되는 191개의 아미노산 폴리펩티드 호르몬이다. 성장 호르몬은 일반적으로 어린이들에서 성장/신장에 요구되는, 칼슘 정체(calcium retention)의 증가(뼈의 강도), 지방분해(lipolysis) 촉진, 단백질 합성의 증가, 간에서의 포도당 신생 합성(gluconeogenesis) 및 다른 기능을 촉진하는 동화 호르몬(anabolic hormone)으로 여겨진다. 내인성 성장 호르몬 결핍으로 고통받는 환자들은 종종 불충분한 골밀도(bone density), 감소된 제지방량(lean body mass), 감소된 에너지 및 다른 일반적인 증상들을 가진다.

현재, 성장 호르몬 결핍으로 고통받고 있는 환자들은 전형적으로 유전자 조작된 박테리아로부터 발현된 재조합 성장 호르몬을 사용하는 성장 호르몬 대체요법(growth hormone replacement)으로 치료한다. 이러한 치료 방법은 전형적으로 상당한 비용이 들며(년간 $10,000 내지 $30,000으로 추정됨), 외인성 호르몬의 대체에 의존한다(일일 1회 주사가 일반적이며, 종종 18달 내지 환자의 일생에 이른다). 그 결과, 성장 호르몬 결핍으로 고통받는 환자들을 위한 신규하고 비외인성이며 장기간 작용하는 적은 비용의 치료가 요구된다.

게다가, 치료들은 또한 부가적인 기저 수준(baseline levels) 이상의 성장 호르몬을 필요로 하는 환자들을 치료할 필요가 있으며, 예를 들어 이 환자들은 종종 비만, 상처 치유, 화상 치유 등의 치료를 위한 부가적인 성장 호르몬을 필요로 한다.

본 발명은 하나 또는 그 이상의 상기에 언급된 문제들을 극복하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 구현은 성장 호르몬 결핍의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 목적을 위하여, 성장 호르몬 결핍은 충분한 내인성 성장 호르몬 분비 및/또는 레벨의 부족에 의한 질병 상태 또는 성장 부전(growth failure)이 수반되는 성장 호르몬 레벨의 임의의 감소이다. 성장 호르몬 결핍은 또한 (환자에 대한) 정상적인 내인성 수준(endogenous level)의 성장 호르몬이 존재하지만, 부가적인 성장 호르몬이 질병 또는 질환의 치료, 예를 들어 비만의 치료, 상처의 치료 및 화상의 치료에 유리하다고 고려되는 경우의 상황을 포함한다.

본 발명의 구현은 또한 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 목적을 위하여, 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍은 충분한 내인성 인슐린-유사 성장 인자 1 분비 및/또는 레벨의 부족에 의한 질병 상태 또는 이상이 수반되는 인슐린-유사 성장 인자 1 레벨의 임의의 감소이다. 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍은 또한 정상적인 내인성 수준의 인슐린-유사 성장 인자 1이 존재하지만, 부가적인 인슐린-유사 성장 인자 1이 질병 또는 질환의 치료, 예를 들어 성장 부진, 타입 1 및 2 당뇨병 및 연골 재생 및/또는 대체의 치료에 유리하다고 고려되는 경우의 상황을 포함한다.

하나의 구현에서, 방법은 그것을 필요로 하는 환자에게 성장 호르몬 결핍의 치료를 가능하게 한다. 방법은 본 발명의 면역학적 양(immunogenic amount)의 소마토스타틴에 기초한 항원 백신을 환자에게 투여하고 환자의 경과를 관찰하는 것을 포함한다. 환자의 성장 호르몬 결핍 치료를 용이하게 하기 위하여 부가적인 예방접종이 투여될 수 있다. 이와 같은 치료를 필요로 하는 환자는 내인성 성장 호르몬 부족으로 인하여 불충분한 성장, 선천성 심장 질환 또는 다른 심장병, 비만을 가지는 성인 및 어린이, 강화된 화상 회복이 필요한 환자 및 강화된 상처 치유가 필요한 환자를 포함한다.

다른 구현에서, 방법은 그것을 필요로 하는 환자에게 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료를 가능하게 한다. 방법은 본 발명의 면역학적 양의 소마토스타틴에 기초한 항원 백신을 투여하고 환자의 경과를 관찰하는 것을 포함한다. 환자의 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍 치료를 용이하게 하기 위하여 부가적인 예방접종이 투여될 수 있다. 이와 같은 치료를 필요로 하는 환자는 미숙아망막증(retinopathy of prematurity; ROP)을 가진 유아, 비만인 성인 및/또는 어린이, 타입 1 또는 2 당뇨병을 가진 성인 및/또는 어린이, 레트 증후군(Rett's syndrome)을 가지는 성인 및/또는 어린이, 비만을 가진 개 및/또는 소, 연골의 대체 및/또는 재생 및 다른 치료가 필요한 말을 포함한다.

본 발명은 또한 성장 호르몬 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍을 가지는 환자의 치료에 사용하기 위한 소마토스타틴의 강화된 면역성을 가지는, 신규한 폴리펩티드 및 그것들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 기능적으로 최적화된 링커를 통하여 불활성화된 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제 단백질과 융합된 소마토스타틴-14를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 소마토스타틴-14의 매우 보존적인 특성 때문에 모든 척추동물 종에 유용하고, 장기간 저장에 안정하며, 면역성이 높고, 환자 내에서 분해에 대한 저항성이 있다. 그와 같이, 본 발명의 키메릭 폴리펩티드(chimeric polypeptide)는 모든 척추동물에서 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료에 사용하기 위한 매우 효과적이고 값싼 물질을 제공한다.

본 발명은 또한 면역반응을 필요로 하는 환자, 특히 성장 호르몬 또는 인슐린-유사 성장 인자 결핍 중 하나의 치료를 필요로 하는 환자에 관련된 치료에 사용하기 위한 신규한 보조제를 제공한다. 본원의 신규한 보조제는 인간, 개, 말, 고양이 등을 포함하는 척추동물에서 사용하기에 매우 효과적이고 안전하다.

본 발명은 또한 성장 호르몬 또는 인슐린-유사 성장 인자 결핍 중 하나를 가지는 환자의 치료에 사용하기 위한 신규한 백신을 제공한다. 백신은 인간, 개, 말, 고양이 등을 포함하는 척추동물에서 사용하기에 매우 효과적이고 안전하다.

본 발명의 이러한 다양한 다른 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명을 읽고 첨부된 청구항을 검토함으로써 명백해질 것이다.

본 발명은 소마토스타틴-14의 매우 보존적인 특성 때문에 모든 척추동물 종에 유용하고, 장기간 저장에 안정하며, 면역성이 높고, 환자 내에서 분해에 대한 저항성이 있는 폴리펩티드를 제공한다. 그와 같이, 본 발명의 키메릭 폴리펩티드는 모든 척추동물에서 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료에 사용하기 위한 매우 효과적이고 값싼 물질을 제공한다.

도 1은 본 발명의 구현에 따른 pET30b CatSom 플라스미드의 대략도를 나타내는 것이다. 상기 플라스미드는 카나마이신 저항성 마커, Lac 오퍼레이터, T7 프로모터, 본 발명의 구현에 따른 모든 CAT 코딩 서열, 본원의 발명에 따른 링커 부위를 포함하며, 본 발명에 따른 소마토스타틴 암호화 부위 또한 포함된다.
도 2는 본 발명의 코돈-최적화된 CAT-결손성 소마토스타틴 폴리펩티드의 예측된 크기에 대응하는 28KD 밴드를 나타내는 염색된 SDS-PAGE를 나타내는 것이다. 레인(Lane) 1은 LB + IPTG(환원됨(reduced)), 레인 2는 LB(환원됨), 레인 3은 LB + IPTG 및 레인 4는 LB이다.
도 3은 비근교계 마우스(outbred mice)에서 기초 체중 대 예방접종을 포함하는 소마토스타틴의 비율에 대한 분산 그래프이다.
도 4는 7일의 기간에 걸친 마우스 그룹 당 사료 섭취를 나타낸 그래프이다.
도 5는 39일의 기간에 걸친 마우스 치료군의 평균 체중을 나타낸 그래프이며, 각각 테스트 된 그룹은 에러 바와 함께 나타내었다.
도 6은 39일의 기간에 걸친 마우스 치료군의 기초 체중의 비율을 나타낸 그래프이며, 각각 테스트 된 그룹은 에러 바와 함께 나타내었다.

서열의 확인 및 서열 동일성

SEQ ID NO: 1

AGCKNFFWKTFTSC

SEQ ID NO: 15

GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT

SEQ ID NO: 2 (Hisl92->Gly, Hisl93->Gly):

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SEQ ID NO: 3: (Hisl92->Gly, Hisl93->Gly):

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SEQ ID NO: 4 (Hisl93->Gly)

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SEQ ID NO: 5 (1 Hisl93->Ala)

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SEQ ID NO: 6 (1 His+CAT wt)

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SEQ ID NO: 7 (one H->G):

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SEQ ID NO: 8: (H->A)

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SEQ ID NO: 9

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SEQ ID NO: 10

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SEQ ID NO: 11

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SEQ ID NO: 12

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SEQ ID NO: 13

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SEQ ID NO: 14

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본 발명은 성장 호르몬 결핍의 치료를 필요로 하는 환자에서의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 목적을 위하여, 이미 기재된 바와 같이, 성장 호르몬 결핍은 환자 내에서의 충분한 내인성 성장 호르몬 분비 및/또는 레벨의 부족에 의한 질병 상태 또는 이상이 수반되는 성장 호르몬 레벨의 임의의 감소이다. 성장 호르몬 결핍은 또한 정상적인 내인성 수준(endogenous level)의 성장 호르몬이 존재하지만, 즉 환자에게는 정상적이지만, 부가적인 성장 호르몬이 질병 또는 질환의 치료, 예를 들어 비만의 치료, 상처의 치료 및 화상 등의 치료에 유리하다고 고려되는 경우의 상황을 포함한다.

본 발명은 또한 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료를 필요로 하는 환자의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 목적을 위하여, 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍은 충분한 내인성 인슐린-유사 성장 인자 1 분비 부족에 의한 질병 상태가 수반되는 인슐린-유사 성장 인자 1 레벨의 임의의 감소이다. 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍은 또한 정상적인 내인성 수준의 인슐린-유사 성장 인자가 존재하지만, 즉 환자에게는 정상적이지만, 부가적인 인슐린-유사 성장 인자 1이 질병 또는 질환의 치료, 예를 들어 비만, 타입 1 및 2 당뇨병 및 레트 증후군의 치료를 위한 환자에 유리하다고 고려되는 경우의 상황을 포함한다.

하나의 구현에서, 기능적으로 최적화된 링커를 통하여 불활성화된 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제 단백질과 융합된 소마토스타틴-14의 폴리펩티드를 포함하는 신규한 폴리펩티드 및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명의 키메릭 폴리펩티드는 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료에 사용하기에 매우 효과적이고 값싼 물질을 제공한다.

다른 구현에서, 신규한 보조제 조성물은 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍을 가지는 환자의 치료에 사용할 수 있다. 다른 특정 구현에서, 소마토스타틴에 기초한 항원은 신규한 보조제와 결합될 수 있으며, 성장 호르몬 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍에 관련된 질병 상태 또는 이상, 예를 들어 어린이에서의 성장 장애, 성인에서의 성장 장애, 충분한 내인성 성장 호르몬 분비 부족, 화상의 치유, 비만, 심장병 등의 치료에 사용된다. 본 발명의 보조제는 척추동물, 특히 인간에서의 최적의 사용을 위하여 설계된다. 본 발명의 보조제는 기존의 보조제에 비해 강화된 면역성을 제공하며, 그것에 의하여 백신이 더욱 적은 양의 항원을 포함할 수 있도록 한다. 본 발명의 보조제 구현은 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료에 유용한 것들 그 이상으로 다른 항원 조합과 함께 유용하다. 신규한 독립된(stand-alone) 보조제의 구현은 따라서 본 발명의 범위 내에 있으나, 본 발명의 보조제는 소마토스타틴에 기초한 항원에 부합되게 주로 기재될 것이다.

또 다른 구현에서, 백신은 소마토스타틴의 감소로 나타난 소마토스타틴에 대한 면역성을 제공하며, 그것에 의하여 소마토스타틴이 성장 호르몬 분비 및 인슐린-유사 성장 인자 1 분비에 미치는 저해 비율을 제거한다. 본 발명의 백신의 구현은 안전성과 기능 모두에 대하여 최적화되며, 안전하고 매우 효과적인 보조제 조성물에서 고면역성 소마토스타틴 구조물을 가지고 있다. 본 발명의 백신은 (기존의 백신과 비교하여) 상대적으로 적은 양의 항원을 필요로 하며, 강화된 저장 수명을 가지며, 저가이다.

비록 본 발명은 인간에서의 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료를 목표로 하지만, 다른 척추동물에서의 이런 결핍의 치료도 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. 예를 들면, 비만의 징후를 보이는 개나 고양이 및 연골의 재생 또는 대체를 필요로 하는 말은 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있다.

하기의 정의들은 본 발명에서 빈번하게 사용되는 어떤 용어들의 이해를 용이하게 하기 위하여 제공되며, 본 발명의 기술의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

정의

"아미노산(amino acid)"은 임의의 20개의 자연적으로 생성된 아미노산뿐만 아니라 임의의 변경된 아미노산 서열을 말한다. 변경은 번역 후 과정(posttranslational processing)과 같은 자연적인 과정을 포함할 수 있거나, 인산화(phosphorylation), 유비퀴틴화(ubiquitination), 아세틸화(acetylation), 글리코실화(glycosylation), 플라빈(flavin)의 공유 부착(covalent attachment), ADP-리보실화(ADP-ribosylation), 가교결합(cross-linking), 요오드화(iodination), 메틸화(methylation) 등을 포함할 수 있으나 이로 제한되지는 않는다.

"항체(antibody)"는 한 쌍의 항원 결합 부위(antigen binding sites), 힌지 영역(hinge region) 및 불변영역(constant region)을 가지는 Y자 형태의 분자를 말한다. 항체의 단편, 예를 들어 항원 결합 부위(antigen binding fragment; Fab), 키메릭 항체(chimeric antibodies), 쥐의 항원 결합 부위에 결합된 인간 불변 영역을 가지는 항체 및 그것들의 단편뿐만 아니라 다른 잘 알려져 있는 재조합 항체들도 본 발명에 따른 항체의 정의에 포함된다.

"분리(isolation)"는 그것의 천연 환경의 적어도 하나의 오염물질로부터 분리되거나 회수되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 어떤 경우에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 그것의 천연 환경의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로부터 분리되거나 회수된다. 보통, 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계를 사용하여 제조된다. 이와 관련하여, 정제하다(purify) 또는 정제(purification)는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 오염된 폴리펩티드를 포함하지 않는 표적 폴리펩티드를 말한다. 오염된 폴리펩티드로부터의 폴리펩티드의 정제는 암모늄 술페이트(ammonium sulfate) 또는 에탄올(ethanol) 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스(phosphocellulose) 크로마토그래피, 소수성 상호작용(hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 친화성(affinity) 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피 및 렉틴(lectin) 크로마토그래피를 포함하는 다수의 공지된 기술을 통하여 달성될 수 있다.

"비만(obesity)"은 이상적인 체중을 적어도 20% 넘긴 환자를 말한다. 예를 들어, 인간의 이상적인 체중은 환자의 신장, 나이, 성별 및 체격에 의해 결정된다. 본원의 비만은 경도비만(mildly obese)(이상적인 체중을 20-40% 넘김), 중등도비만(moderately obese)(이상적인 체중을 40-100% 넘김) 및 고도비만(severely obese)(이상적인 체중의 100%를 넘김)을 포함한다.

"환자(patient)"는 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 필요로 하는 척추동물, 전형적으로는 포유동물, 예를 들어, 체중 감량(예를 들어, 비만)을 필요로 하는 인간 또는 연골의 재생을 필요로 하는 말을 말한다.

핵산 또는 아미노산 서열 동일성(identity)의 "비율(percent)"은 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 동일한 핵산 서열 또는 아미노산 잔기의 비율을 말한다. 어떤 경우에 있어서, 서열들은 최대의 서열 동일성을 얻기 위하여 정렬되고 간격이 도입된다. 어떤 경우에 있어서, 동일성 비율을 계산하기 위하여 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 스미스 및 워터맨 등(Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math., 2:482-489)의 알고리듬을 사용한 갭 프로그램(Gap program)(Wisconsin Sequence Analysis package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin)(각각 본원에 그 전체가 참조로서 통합되어 있다) 또는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램(WO 00/15796을 참조)이 사용된다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)는 뉴클레오티드의 선형(linear) 서열을 말한다. 상기 뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드(polyribonucleotides) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotides) 또는 둘의 혼합물의 선형 서열 중 하나이다. 본 발명의 문맥에서 폴리뉴클레오티드의 예는 단일 및 이중나선 DNA, 단일 또는 이중 나선 RNA 및 단일 및 이중 나선 DNA와 RNA 양쪽 모두의 혼합물을 가지는 하이브리드(hybrid) 분자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 또는 그 이상의 변경된 뉴클레오티드 및 펩티드 핵산(peptide nucleic acid; PNA)을 포함한다.

"단백질(protein)", "펩티드(peptide)" 및 "폴리펩티드(polypeptide)"는 아미노산 폴리머 또는 두 개 또는 그 이상 상호작용하거나 결합된 아미노산 폴리머의 세트를 나타내는데 상호교환적으로 사용된다.

"치료(treatment)" 또는 "치료하는 것(treating)"은 상대적으로 동일한 환경에서 치료하지 않은 환자에 대한 환자의 개선을 말한다. 치료 또는 치료하는 것은 일반적으로 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 달성되는 이상적인 약제학적 및/또는 생리학적 효과를 나타낸다. 치료 또는 치료하는 것은 예방 치료를 포함할 수 있다.

"백신(vaccine)"은 본원에 기재된 목적을 위한 항체를 생산하기 위하여 예방접종된 환자의 면역 시스템을 자극할 수 있는 임의의 조성물을 말한다.

성장 호르몬

성장 호르몬은 뇌하수체 전엽(anterior pituitary)에서 성장자극 세포(somatotroph cell)로부터 생산되고 분비되는 191개의 아미노산 펩티드이다. 신체에서의 성장 호르몬 레벨은 성장 호르몬 분비 호르몬(growth hormone releasing hormone; GHRH) 및 소마토스타틴(somatostatin)에 의해 조절된다. GHRH는 성장 호르몬의 합성 및 방출을 야기하는 반면(스트레스, 운동 등도 성장 호르몬 분비의 자극원으로 알려져 있다), 소마토스타틴은 성장 호르몬의 분비를 저해한다.

성장 호르몬(GH)은 일반적으로 신체에서 유년 시절에 걸친 신장의 증가, 근절 증식(sarcomere hyperplasia)을 통한 근질량(muscle mass)의 증가, 지방분해 촉진, 간에서의 포도당 신생합성 촉진 및 에너지 항상성(fuel homeostasis)에의 관련을 포함하는 다양한 생리학적 기능에 관련된다. 성장 호르몬 결핍은 전형적으로 결핍이 유년기 동안에 발생한다면, 저신장(short stature)/성장부진(growth failure), 힘의 부족(strength deficit), 골질량의 손실, 심혈관 위험, 예를 들어 만성 심부전(chronic heart failure)(Tien et al., Growth Hormone: A Promising Treatment for the Failing Heart, 2000, Pharmacotherapy 20(9):1096-1106, 그것의 전체가 참조로서 본원에 통합되어 있음) 및 다른 상태를 포함하는 다수의 공지된 질병 또는 생리학적 상태에서 명백하게 나타난다. 게다가, 환자에게 성장 호르몬을 보충하는 것은 상처, 화상, 비만 등의 치료에 잠재적으로 유용하다(Vickers et al., 2002, Adult growth hormone treatment reduces hypertension and obesity induced by an adverse prenatal environment, J. Endocrinol, 175(3):615-623; Ramirez et al., 1998, Is there a role for growth hormone in the clinical management or burn injuries, Growth Hormone IGF Res. Suppl. B:99-105; and Lal et al., 2000, Growth hormone, burns and tissue healing, Growth Hormone IGF Res. 10 Suppl. B:539-543, 각각 사실상 본원에 참조로서 통합되어 있다).

성장 호르몬 결핍을 없애기 위한 기존의 치료들은 고통받는 개개인에 대한 재조합 성장 호르몬의 보충을 포함한다(예를 들어, U.S. Patent No. 4,446,235 및 4,601,980을 참조하라). 성장 호르몬 보충 치료는 비록 다수의 개개인들이 평생의 치료를 필요로 하지만, 전형적으로는 지속적(continual basis)으로 재조합 성장 호르몬의 피하 주사를 필요로 하며, 즉, 적어도 18개월에 1일 1회 주사가 전형적이다. 최근, 성장 호르몬 보충 치료는 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS)의 치료, 섬유근육통(fibromyalgia)의 치료, 크론병(Crohn's disease) 및/또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)의 치료, 노화의 역효과(reverse effect)에 대한 치료, 화상의 치료 및 특발성 저신장증(idiopathic short stature)에 대한 치료에 사용된다. 그러나, 재조합 성장 호르몬을 사용한 치료는 당뇨병, 결장암 등의 위험을 잠재적으로 증가시키는 것으로 나타났다. 게다가, 재조합 단백질을 사용한 환자의 치료는 전형적으로 환자가 활성 악성종양(active malignancy)을 가지는 경우, 관련된 위험의 증가에 따른 지속적인 관찰과 환자의 간호 환경을 제공하는 휴지기 반응의 제어(interval feedback control)를 필요로 한다. 또한, 재조합 호르몬은 입수하는데 높은 비용이 들며, 주사를 통한 일일 투여 요법과 같은 1년 또는 그 이상의 기간에 걸친 사용에 대한 비용은 엄청나게 비싸다. 그와 같이, 본 발명의 구현은 성장 호르몬 결핍에 관련된 질병 또는 질환의 치료에 예기치 못한 실질적인 이익을 제공한다.

인슐린-유사 성장 인자 1( IGF -1)

IGF-1은 인슐린과 구조적으로 유사한 폴리펩티드 단백질 호르몬이다. IGF-1은 간 및 성장 호르몬에 반응하는 다른 표적 조직에서 생산되며, 일반적으로 분비에 대한 동화 효과(anabolic effect)를 가진다. 전형적으로, IGF-1은 AKT(AKT는 세린/쓰레오닌-특이적 단백질 키나아제의 패밀리를 나타낸다) 신호전달 경로를 통하여 작용한다. 일반적으로, IGF-1 동화 효과는 세포 성장과 증식뿐만 아니라 표적 부위에서의 아폽토시스(apoptosis)의 저해를 포함한다.

성장 호르몬의 레벨, 유전적 구성(genetic make-up), 하루 중의 한 시기(time of day), 연령, 성별, 운동 상태, 스트레스, 체질량 인덱스(body mass index) 및 질병 상태를 포함하는 다수의 인자들이 환자의 순환기에서 IGF-1 레벨에 영향을 주는데 관여한다. IGF-1 결핍은 성장 지연(retardation) 또는 부진(failure)을 특징으로 할 수 있고, 비만, 타입 1 및 2 당뇨병, 심혈관 질환, 다양한 스트레스성 질환 등을 포함하는 여러가지 상황과 관련된다.

재조합 IGF-1은 각양 각색의 결과들을 가지는 이러한 여러가지 병들의 치료에 사용되고 있다. 현재, 비록 임상 결과가 여러가지 일지라도, 인크레렉스(Increlex®)(터시카(Tercica)에 의해 제조된 재조합 IGF-1)가 표적 질환의 치료를 위하여 미국에서 이용할 수 있다.

소마토스타틴

소마토스타틴은 뇌하수체 전엽으로부터의 다른 호르몬들 중에서 성장 호르몬의 분비를 저해하는 펩티드 호르몬이다. 소마토스타틴은 표적 내분비 세포(endocrine cells)상에서 G-단백질-결합 소마토스타틴 수용체(G-protein-coupled somatostatin receptors)와의 상호작용을 통하여 다양한 내분비 기능을 조절한다. 소마토스타틴은 시상하부(hypothalamus), 위(stomach), 창자(intestine) 및 췌장(pancreas)에 있는 부위로부터 분비된다. 표적 동물에서 소마토스타틴 레벨의 조절은 가축의 생산성을 증가시키기 위한 관심의 차원으로서 가장 최근에 확인되었으며, 즉 소마토스타틴 레벨은 젖소의 우유 생산 또는 가축의 크기 등을 강화시킨다(사실상 참조로서 본원에 통합되어 있는, "Chloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)-Defective Somatostatin Fusion Protein And Uses Thereof"라는 제목의 동시 계류중인 출원 S/N 12/198,579를 참조하라).

이 연구들에서, 가축의 생산성은 소마토스타틴 항원을 사용한 예방접종 프로토콜의 사용을 통하여 최적화되었다. 일반적으로, 소마토스타틴으로 면역화된 가축들은 10-20%의 평균 일일 체중 증가량을 가지고, 식욕이 9%로 감소되었으며, 사료 이용의 효율이 11% 증가하였다. 소마토스타틴으로 면역화된 동물 및 그것들의 새끼는 정확한 비례를 가지며, 동물의 체중과 근육, 뼈 및 지방 사이의 분포는 대조군 동물에서와 같이 동일하였다(Reichlin, 1987을 참조). 그러나, 대안적인 소마토스타틴 치료, 예를 들어 항-소마토스타틴 항체를 사용한 표적 동물의 직접적인 치료는 지나치게 비용이 들고, 기능적으로 덜 뛰어난 것으로 나타났으므로, 비실용적으로서 직접 항체 치료는 고려하지 않는다(Muromtsev G.S., et al., 1990, Basics of agricultural biotechnology, Agropromizdat, Moscow, pp 102-106). 이 연구들은 따라서 표적 동물에서 소마토스타틴의 면역성을 유도하는 것은 안전하고 효과적인 결과를 달성할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명의 발명자들은 (본 발명의 방법 및 조성물을 포함하는) 이러한 예방접종 프로토콜의 변경이 인간의 질병 또는 생리학적 상태, 특히 인간 성장 호르몬 및/또는 IGF-1 결핍의 치료에 사용될 수 있다는 놀랍고 예기치 못한 결과를 깨달았다.

본 발명의 구현은 척추동물, 더욱 상세하게는 포유동물에서 성장 호르몬 결핍에 대한 소마토스타틴에 기초한 치료를 제공한다. 전형적인 구현은 인간, 개, 고양이 및 말에서의 치료를 목표로 한다. 소마토스타틴으로 면역화된 인간 및 다른 포유동물들은 천연 소마토스타틴이 성장 호르몬 분비에 미치는 효과를 제한하거나 저해하기 위한 본 발명의 백신(하기를 참조)을 사용하여 치료된다. 예를 들면, 재조합 성장 호르몬이 성장 호르몬이 결핍되거나 화상, 심장병 치료, 당뇨병 등의 치료를 위하여 과도한 성장 호르몬이 필요한 환자에게 투여될 경우, 본 발명의 백신은 부가적인 내인성 성장 호르몬이 분비되도록 제공될 수 있다. 백신 항원과 보조제는 척추동물의 사용, 특히 인간의 사용 및 질병 치료에 최적화된다. 소마토스타틴은 척추동물에서 매우 보존적이기 때문에, 본 발명의 구현은 본원의 방법 및 조성물을 이용하여 예방 접종된 모든 표적 척추동물에서 면역반응을 일으키는데 유용하다. 본 발명의 현저한 이익은 예방 접종된 환자들이 2차 투여(booster event) 사이에 1주 내지 1달의 시간이 주어지므로, 환자의 면역반응이 시스템으로부터 소마토스타틴을 제한하거나 제거할 수 있게 한다.

본 발명의 구현은 또한 척추동물, 특히 예를 들어 인간, 개, 고양이, 말 등의 포유동물에서 IGF-1 결핍에 대한 소마토스타틴에 기초한 치료를 제공한다. 본 발명의 백신을 사용하여 면역화된 척추동물은 그 동물에서의 IGF-1 레벨 상에 소마토스타틴 효과를 제한하거나 저해한다. 치료의 구현은 IGF-1 결핍과 관련된 다수의 질병 및/또는 질환을 치료하거나 치료된 동물의 건강 또는 상태를 향상시키기 위하여 부가적인 IGF-1이 필요한 경우에 사용될 수 있다.

그와 같이, 본 발명의 양상은 질병 및/또는 다른 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위한 고면역성 물질을 제공함으로써 소마토스타틴에 기초한 면역 백신을 용이하게 한다. 이러한 소마토스타틴에 기초한 면역 화합물은 발현 및 항원성에 대하여 최적화되었다.

어떤 구현에 있어서, 소마토스타틴-14는 코돈 최적화된, CAT-결손성 소마토스타틴 키메릭 폴리펩티드로서 발현된다. 이러한 물질들은 성장 호르몬 및 IGF-1 결핍에 기반한 질병들의 치료뿐만 아니라, 부가적인 레벨의 성장 호르몬 또는 IGF-1 중 하나가 치료 요법에 유용할 경우에 예기치 못한 치료학적 용도를 제공한다. 하기에 더욱 충분히 기재되는 바와 같이, 본 발명은 또한 코돈 최적화된, CAT-결손성 소마토스타틴 키메릭 폴리펩티드의 효과를 최대화시키기 위한 최적화된 보조제를 제공한다. 본 발명의 소마토스타틴에 기초한 항원은 대형 분자(천연 소마토스타틴에 대하여 27,000+ 달톤 vs. 1,600), 면역성 및 분해에 대한 내성을 제공한다. 이런 식으로, 본 발명의 소마토스타틴에 기초한 항원은 치료된 환자에서 더 우수한 효과(큰 면역성)를 가지고 더욱 길게(환자에서 더욱 긴 1/2 수명) 존재한다. 척추동물에서 사용하기 위한 이 신규한 항원은 환자의 면역 시스템이 반응하기 위한 최적의 노출을 제공한다.

성장 호르몬 결핍의 치료에 사용하기 위한 신규한 백신의 구현

소마토스타틴은 폴리펩티드의 대체적 절단(alternative cleavage)에 의해 생성된 두 개의 활성형(active form)을 가진다(stoff A. Section 5, Chapter 4 : Structure, Synthesis, and Secretion of Somatostatin. Endocrinology : The Endocrine Pancreas. Medical College of Georgia, page 16, 사실상 그것의 전체가 참조로서 본원에 통합되어 있다). 어느 한쪽의 소마토스타틴 형태도 본원의 소마토스타틴에 기초한 항원의 구현에 사용될 수 있으나, 소마토스타틴-14가 상세하게 기재될 것이다. 소마토스타틴-14는 시상하부 및 위장관(위, 창자 및 췌장)에서 생성된 생리활성 테트라데카펩티드(biologically active tetradecapeptide)이다. 상기 테트라데카펩티드의 아미노산 서열은 AGCKNFFWKTFTSC(SEQ ID NO:1)이다. 소마토스타틴-14의 서열은 척추동물들 사이에서 매우 보존적이다(Lin XW et al., Evolution of neuroendocrine peptide systems: gonadotropin-releasing hormone and somatostatin. Comp. Biochem. Physiol. C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1998 119(3):375-88). 상기 테트라데카펩티드는 핵산서열 : GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT(SEQ ID NO:15)에 의해 암호화된다(다른 핵산 서열 또한 SEQ ID NO:1을 코딩하는데 사용될 수 있다, 그러나 SEQ ID NO:15는 예시의 목적으로 제공됨에 유의하라).

소마토스타틴-14는 동물에서 성장 및 음식의 이용에 관련된 다수의 호르몬에 강력한 저해 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 미국 특허등록번호 제6,316,004호 및 미국 특허출원번호 제12/198,579호(각각 사실상 참조로서 본원에 통합되어 있다)에 이미 기재되어 있는 바와 같이, 소마토스타틴 및 소마토스타틴의 키메릭 형태도 일일 체중 증가 및 필요하다면, 우유 생산을 위한 동물의 면역화에 사용될 수 있다. 이 면역화 방법은 기존의 보조제를 사용하여 수행된다. 소마토스타틴-14 면역화는 어떤 특정 성장 호르몬 결핍 상태의 치료에도 사용된 적이 없다.

본 발명의 하나의 양상은 최적화된 소마토스타틴 면역 활성을 가지는 키메릭 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 특히, 본 발명의 구현은 소마토스타틴에 대한 면역 활성을 가지는 CAT 융합 단백질을 암호화하는 신규한 핵산 구조물을 포함한다. 이 폴리펩티드는 면역화 방법에서 최적의 기능적 활성에 대하여 확인되었으며, 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍, 특히 포유동물의 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍의 치료에 사용한다.

하나의 구현에서, 도 1에 나타낸 것과 같은 개략도를 가지는 구조물은 본 발명의 키메릭 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 본 발명의 핵산 구조물은 일반적으로 10개의 C-말단 아미노산을 가지지 않은 불활성 CAT 효소를 암호화하며, 아미노산으로 치환된 하나 또는 두 개의 히스티딘을 포함한다. 상기 CAT 효소는 His 193(카노니칼(canonical) CAT_III 변이체에서 His 195)의 이미다졸기를 제거함으로써 불활성화된다. 다른 구현에서, CAT 효소는 His 193 및 주변의 His 192(각각 CAT_III에 대하여 His 195 및 His 194) 양쪽의 이미다졸기를 제거함으로써 불활성화된다. CAT의 활성 부위로부터 필수 His 193(CAT_III에서의 His 195) 이미다졸기의 제거 및 알라닌, 글리신 또는 다른 아미노산으로의 치환은 CAT 효소의 실질적인 불활성화를 야기한다(예를 들어, Lewendon A et al. (1994) Replacement of catalytic histidine-195 of chloramphenicol acetyl transferase : evidence for a general base role for glutamate. Biochemistry. 33(7):1994-50; White et al., (2000) Characterization of Chloramphenicol and Florfenicol Resistance in Escherichia coli associated with Bovine Diarrhea. J. Clin. Micro 38(12) p4593-4598, 각각 사실상 본원에 참조로서 통합되어 있다). 마지막으로, 본원의 구현은 또한 His 192 단독(CAT_III에서의 His 194)의 이미다졸기의 제거를 통한 CAT 효소 불활성화를 포함할 수 있다. His 193에 대하여 말하자면, 치환은 알라닌, 글리신 또는 다른 아미노산으로 할 수 있다.

어떤 양상에 있어서, 하나 또는 그 이상의 치환된 히스티딘 아미노산은 SEQ ID NO:2의 위치 번호 574-576 및 577-579(SEQ ID NO:3에서 아미노산 번호 192 및 193에 해당함)에 위치하는 핵산에 의해 암호화된다. 어떤 구현에 있어서, 본 발명의 핵산 서열은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6을 포함한다. 본원의 히스티딘이 치환된 구조물을 포함하는 본 발명의 키메릭 단백질은 CAT 활성이 거의 없고, 종래에 존재하는 것들에 비하여 현저한 향상을 가지는 고면역성 단백질을 제공한다. 상기 불활성화된 CAT 효소의 구현은 본 발명의 소마토스타틴 폴리펩티드에 부착된다. 이 부착은 (하기에 더욱 충분히 기재되는 바와 같이) 직접적으로 또는 링커를 사용하여 이루어질 수 있다.

His 192 및 His 193 부위에서의 CAT 불활성화는 부위-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 및 합성 유전자 어셈블리(synthetic gene assembly)를 포함하는 당업자에게 공지된 다수의 방법들을 통하여 달성될 수 있다. 하나의 구현에서, 히스티딘 193 또는 히스티딘 192를 암호화하는 핵산 서열은 알라닌, 글리신 또는 다른 아미노산을 암호화하도록 변경된다. 다른 구현에서, 히스티딘 192 및 193 모두를 암호화하는 핵산 서열은 알라닌, 글리신 또는 다른 아미노산을 암호화하도록 변경된다. 상기 192 및 193 키메릭 폴리펩티드에 대한 전형적인 치환은 알라닌, 알라닌; 알라닌, 글리신; 글리신, 알라닌; 글리신, 글리신을 포함한다.

본 발명의 구현은 또한 SEQ ID NO:7, 8 및 3을 가지는 아미노산 서열(193에서 his → gly, 193에서 his → ala, 192 및 193 모두에서 his → gly에 해당함) 을 포함하는 본 발명의 CAT 결손성 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열을 포함한다.

CAT 효소가 불활성화될 수 있고, 특히 포유동물에 있어서 본원의 질병 및/또는 질환의 치료에 소마토스타틴-14의 제공을 위한 운반 단백질로서 사용될 수 있음을 깨달았으며, 이는 발명자들의 예기치 못한 발견이었다. 불활성화되지 않은 CAT는 다중(multiple)의, 세계적인(worldwide), 그람-음성 세균 분리집단에서 클로람페니콜 및 플로르페니콜 양쪽 모두에 대하여 플라스미드 매개의 세균 저항성과 관련된 효소로서 기재되어 있다. 미국 특허등록번호 제6,316,004B1호에 기재된 것과 같은 불활성화되지 않은 CAT의 사용은 이러한 과학적 발견보다 앞선다. 그와 같이, 현재의 지식 및 확립된 표준에 따라서, 불활성화되지 않은 CAT의 사용은 안전성의 염려(즉, 숙주의 더 많은 항생제 내성의 생성) 때문에 사용하기에 적합하지 않을 것이다(counterindicated). 클로람페니콜은 약 60년 전에 발견되었으며, 항생제로서 처음으로 사용되었다. 이것의 사용에 기인하는 여러 가지 건강상의 문제들은 재생불량성 빈혈(aplastic anemia)을 발병시키는 약물의 수용자를 포함한다. 게다가, 예를 들어 축산업계에서 플루오르화된 항생제 유사체들이 지속적으로 사용되는 경우, 플라스미드에 암호화된 유전자(plasmid-encoded gene) 때문에 항생제에 대한 저항성을 가지는 몇몇 세균의 균주들이 증가한다. 비록 클로람페니콜이 세균성 결막염(bacterial conjunctivitis)을 치료하기 위한 안약에 지속적으로 사용될지라도, 다른 세균 매개 질병(bacterial borne disease)을 치료하는데 미국에서 사용되지는 않는다. 그와 같이, 이 명세서에 걸쳐 기재된 이점에 기반한 운반 단백질을 사용하는 한, 포유동물 특히 사람에 있어서 무엇이든지 불활성화된 CAT 효소 사용의 실현 및 개발은 놀라운 것임과 동시에, 활성 CAT의 현저한 건강상의 문제들을 피하는 것은 본원에 기재된 백신에 대한 현저한 향상을 제공한다.

소분자들과 함께 사용하는데 대한 CAT의 이러한 "운반(carrier)"에 관련된 향상은 양쪽 모두 사실상 본원에 참조로서 통합되어 있는 동시 계류중인 관련 미국 특허출원번호 S/N PCT/US08/68195호뿐만 아니라 미국 등록특허번호 제6,316,004호에 논의되어 있다. 특히, 본 발명의 발명자들은 소마토스타틴-14를 위한 운반 단백질로서 불활성화된 CAT 효소가 효소에 관련된 현저한 건강상의 위험들을 피할 수 있다는 것을 예치기 못하게 발견하였으며, 동시에 키메릭 단백질을 사용하는 것은 면역성에 대한 능력, 효소 분해에 대한 저항성을 강화시키고, 반감기를 증가시키고, 환자의 대식세포에 의한 흡수를 강화시킨다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 활성이 없는 CAT 효소는 가변길이(variable length) 링커 또는 스페이서를 통하여 소마토스타틴-14와 연결될 수 있다. 상기 스페이서는 넓은 표면상에서 암호화된 소마토스타틴의 표시를 보장하는데 필요하다. 본원의 스페이서의 구현은 최적의 프로테아제 저항성 및 최적의 에피토프 노출을 가능하게 하며, 본 발명의 링커 서열을 가지지 않는 구조물에 비하여 예기치 않은 향상을 나타낸다.

따라서, 스페이서의 구현은 다양한 미생물, 특히 E. coli에서 CAT-결손성 소마토스타틴 발현을 확실하게 하기 위한 길이 및 구조에 최적화된다. 미국 등록특허번호 제6,316,004호에 기재된 것과 같은 본래의 구조물에는 희귀한 E. coli 코돈을 가지는 스페이서가 포함되며, 2차 또는 보조 플라스미드로부터의 희귀 tRNA의 공통발현을 필요로 한다. 본원의 스페이서의 구현은 이러한 희귀 E. coli 코돈을 제거함으로서 2차 보조 플라스미드의 필요성을 없애고 종래 기술에 비해 향상되었다.

전형적인 구현에서, 상기 스페이서는 tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg(SEQ ID NO:9)의 핵산 서열을 가진다. 본 발명의 스페이서 중 하나의 예는 welhrsgprprprprpefm(SEQ ID NO:10)의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 스페이서의 전형적인 아미노산 서열은 welhrsgp(rp)_nefm(SEQ ID NO:11)이고, 여기에서 n>1이다. 상기에 언급한 바와 같이, 이 신규한 스페이서 서열은 프로테아제 저항성을 강화시킬 수 있고(그것에 의하여 U.S. Patent No. 6,316,004에 기재된 구조물과 비교하여 생산을 증가시킬 수 있다), 최적의 소마토스타틴-14 노출을 가능하게 한다. 이러한 소마토스타틴의 조합은 질병 치료를 위한 표적 환자의 면역화에 사용될 때 예기치 않은 향상을 나타내는 최적으로 구성된 링커에 의해 불활성화된 CAT 효소에 부착된다. 이 구조물들은 성장 호르몬 및 인슐린-유사 성장 호르몬 1 결핍에 기반한 질병들의 치료에 항원으로서 사용된다.

또한, 이 키메릭 구조물들은 소마토스타틴-14 단독에 비하여 강화된 저장 안정성을 나타낸다. 게다가, 본 발명의 소마토스타틴에 기초한 항원은 이 물질들에 대한 분해에 강화된 저항성이 주어진 환자에서 더 긴 반감기를 가진다. 다른 운반 폴리펩티드도 소마토스타틴에 부착됨으로써 불활성화된 CAT를 대체할 수 있다. 예를 들면, 소마토스타틴-14는 불활성화된 CAT 효소 대신에 KLH, 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 CRM과 결합될 수 있다.

본 발명의 구현은 또한 표적 환자에서 체액성 면역반응(humoral immunity)의 강화된 유도를 위한 신규한 보조제 조성물을 제공한다. 이 보조제 조성물은 체액성 반응의 유도를 위한 기존의 물질들에 비해 현저한 향상을 제공하며, 인간 표적에서 사용하는데 안전하다. 본원의 보조제 조성물은 본 발명의 백신을 제조하기 위하여 소마토스타틴에 기초한 항원과 함께 사용된다. 본 발명의 백신은 게다가 GH 및/또는 IGF-1 결핍에 기반한 질병 또는 질환의 치료에 유용하다.

본원의 구현에서, 보조제 조성물이 모든 성분들은 비동물성 기원(non-animal origin)이며, 그것에 의하여 부분적으로 오염된 보조제 성분들로부터 예방 접종된 인간의 잠재적인 교차 감염을 제거하였다. 예를 들면, 본원의 구현들은 동물성 기원을 포함하지 않는 트윈 80(Tween 80)을 사용할 수 있다. 놀랍게도, 동물성 기원을 포함하지 않는 트윈 80은 동물성 기원의 트윈 80에 비하여 본원의 백신의 사용에 있어서 더욱 현저한 결과를 나타내었으며, 백신 내로 동물로부터 유래된 오염, 예를 들어 광우병(bovine spongiform encephalopathy)의 가능성을 제거한다. 게다가, 동물성 기원을 포함하지 않는 트윈 80은 본원의 구현에 따른 그것의 사용에 부가적인 예기치 못한 이점을 제공하는 동물성 기원의 트윈 80에 비하여 더 나은 유화 능력을 나타내었다.

본원의 보조제의 구현은 또한 벤젠 및 다른 발암성 화합물을 포함하지 않는다. 이 구현들은 대부분의 기존의 보조제 화합물에서 가능하지 않은 안정성의 이점을 제공한다. 예를 들면, 본원의 구현들은 카보폴 974P(Carbopol 974P) 또는 벤젠을 포함하지 않는 폴리시클릭산(polycyclic acid)을 사용한다.

하나의 구현에서, 면역 보조제는 카보폴 성분(carbopol base), 스쿠알렌 성분(squalene base) 및 아라비노갈락탄 용액(arabinogalactan solution)을 포함한다. 보다 상세하게는, 상기 카보폴 성분은 물 또는 식염수에 용해시킨 카보폴 974P를 사용하여 제조된다. 상기 스쿠알렌 성분은 스쿠알렌, 비동물성 기원의 트윈 80 및 스팬 85(span 85)의 조합으로부터 제조된다. 상기 아라비노갈락탄은 PBS 또는 식염수에 용해시킨다. 보조제 조성물은 본 발명의 백신을 생산하기 위하여 본 발명의 키메릭 폴리펩티드와 함께 결합된다.

또 다른 구현에 있어서, 면역 보조제는 카보폴 성분, 스쿠알렌 성분 및 트래거캔틴(tragacanthin) 용액을 포함한다. 더욱 상세하게는, 상기 카보폴 성분은 물 또는 식염수에 용해시킨 카보폴 974P를 사용하여 제조된다. 상기 스쿠알렌 성분은 스쿠알렌, 비동물성 기원의 트윈 80 및 스팬 85의 조합으로부터 제조된다. 정제된 트래거캔틴은 PBS 또는 식염수에 용해시킨다. 보조제 조성물은 본 발명의 백신을 생산하기 위하여 본 발명의 키메릭 폴리펩티드와 함께 결합된다.

특정 보조제 조합 및 농도를 실시예 3에 나타내었다. 본 발명에 따른 보조제는 인간에 사용하기에 안전하고 효과적이며, 동물 부산물(animal product)을 예방하고, 석유-기재의 탄화수소을 예방하며 발암성 화합물을 예방한다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 이와 같은 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드 분자들은 관심있는 숙주의 증식을 위하여 선택 마커(selectable marker) 및 복제 원점(origin of replication)을 일반적으로 포함하는 벡터에 결합될 수 있다. 숙주 세포는 이러한 벡터를 포함하기 위하여 유전적으로 조작되며, 그것에 의하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현하게 된다. 일반적으로, 본원의 벡터는 미생물 또는 바이러스 숙주 세포의 것과 같은 적절한 전사 또는 번역 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 조절 서열의 예는 전사 프로모터(transcriptional promoter), 오퍼레이터(operator) 또는 인핸서(enhancers), mRNA 리보솜 결합 부위(mRNA ribosomal binding sites) 및 전사 및 번역을 조절하는 적절한 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 본원의 조절 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 키메릭 폴리펩티드와 기능적으로 관련된 경우 작동가능하게 연결된다.

전형적인 비히클(vehicle)은 플라스미드(plasmids), 효모 셔틀 벡터(yeast shuttle vectors), 바큘로바이러스(baculovirus), 불활성화된 아데노바이러스(inactivated adenovirus) 등을 포함한다. 하나의 구현에서, 상기 비히클은 변경된 pET30b CatSom 플라스미드(도 1을 참조)이다. 본원에서 사용하기 위한 표적 숙주 세포는 박테리아 숙주, 예를 들어 E. coli, 효모, SF-9 곤충 세포, 포유동물의 세포, 녹색 식물 등을 포함한다.

하나의 구현에서, 조절 서열은 E. coli 또는 다른 미생물에서 본 발명의 키메릭 폴리펩티드의 발현을 위한 T7lac, CAT, Trp 또는 T5 프로모터를 포함한다. 이 조절 서열들은 당업계에 공지되어 있으며, 적절하고 공지된 환경하에서 사용된다.

본 발명의 다양한 플라스미드는 표적 조절 서열의 사용을 통하여 본 발명의 키메릭 폴리펩티드의 발현을 위하여 제작된다. 실례가 되는 플라스미드는 T7lac 프로모터(도 1을 참조)를 포함할 수 있다.

표적 키메릭 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포는 원핵생물(prokaryotes), 효모 및 고등 진핵생물의 세포를 포함한다. 실례가 되는 원핵생물 숙주는 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus) 및 살모넬라(Samonella)속 뿐만 아니라, 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)속의 박테리아도 포함한다. 전형적인 구현에서, 숙주 세포는 에스케리키아 속 중 하나이며, 에스케리키아 콜라이(Escherichia Coli; E.coli)일 수 있다. 숙주 세포(효모 또는 박테리아)도 또한 바이러스-유사 입자(virus-like particles; VLPs)와 같은 본 발명의 표적 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다.

하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 구조물은 다양한 조건하에서 최적의 CAT 결손성 소마토스타틴 발현을 가능하게 한다. 이 구조물들은 원핵생물 숙주, 특히 에스케리키아 속 박테리아에서의 발현에 특히 효과적이다.

본 발명의 백신에 사용하기 위한 내독소를 포함하지 않는 융합 단백질

본 발명의 양상은 내독소를 포함하지 않고, 코돈에 최적화된, CAT-결손성 소마토스타틴의 용도를 포함한다. 하나의 구현에서, 본 발명의 키메릭 면역성 소마토스타틴-포함 단백질은 적절한 소마토스타틴-함유 비히클을 사용하여 표적 세포를 형질전환시킴으로써 제조된다. 상기에 언급한 바와 같이, 본원에서 사용하기 위한 비히클은 공지의 플라스미드 및 선택된 표적 세포에서 발현하기에 적합한 벡터 시스템을 포함한다.

본 발명의 양상에서, 키메릭 면역성 소마토스타틴-포함 단백질은 표적 숙주 세포에서 발현된다. 키메릭 단백질 발현은 표적 조절 서열을 사용하여 수행된다. 어떤 양상에서, 상기 키메릭 폴리펩티드는 E. coli에서의 발현을 위하여 (특히 본원에 기재된 스페이서 서열에 관하여) 최적화되었다.

키메릭 단백질은 그 후 예를 들어, 라이소자임 용해(lysozyme lysis), 봉입체(inclusion bodies)의 편차 원심분리(differential centrifugation), 분자체 크로마토그래피(sieve chromatography) 등을 포함하는 공지의 단백질 정제 기술에 따라 정제될 수 있다. 리폴딩(refolding) 방법은 염기성 pH에서 구아니딘 클로라이드(guanidine chloride) 및 우레아에서 수행된 후, 투석 및 동결건조될 수 있다.

하나의 구현에서, E. coli 세포는 코돈 최적화된, CAT-결손성 소마토스타틴 함유 플라스미드 - pET30b CatSom을 사용하여 형질전환되며; 상기 pET30b CatSom은 발현을 위한 적절한 E. coli 염기 조절 서열을 가진다. 어떤 경우에 있어서, 대략 10리터의 이 세포들의 발효는 총 바이오매스의 적어도 500 그램, 어떤 경우에는 600 그램을 제공하며, 총 단백질의 약 4-6 그램을 산출한다. 실버 및 쿠마시 블루 염색으로부터 단백질의 약 절반이 표적 키메릭 단백질인 것으로 추측하였다(실시예 2 및 도 2를 참조).

본원의 어떤 구현에서, 본 발명의 키메릭 단백질은 형질전환된 숙주 세포로부터 실질적으로 내독소를 포함하지 않는 상태로 정제된다. 추가적인 정제는 식품 및 약물 투여 표준에 따른 인간에서의 사용에 허용가능한 레벨로 내독소를 제거하거나 낮출 것이다.

그와 같이, 본원의 어떤 구현은 백신에서 사용하기 위한 실질적으로 내독소를 포함하지 않는 키메릭 단백질의 생산을 목표로 한다. 어떤 구현에서 상기 내독소의 레벨은 1 EU/ml이거나 그 이하이고, 다른 구현에서 상기 내독소의 레벨은 실질적으로 제거된다. 즉, 본 발명의 키메릭 폴리펩티드는 실질적으로 내독소를 포함하지 않는다.

하나의 구현에서, 용해된 숙주 세포로부터 회수된 IB는 내독소가 전혀 없는 세척 버퍼를 사용하여 여러 번 세척된다. 상기 회수된 IB 펠릿은 내독소의 레벨이 대략 1 EU/ml 이하가 될 때까지 선택적으로 세척될 수 있다(내독소 테스트는 MP Biochemicals, Charles River 등으로부터의 상용 테스트 키트를 포함하는 하나 또는 그 이상의 공지의 검정법을 사용하여 수행될 수 있다). 어떤 구현에서, 상기 세척 버퍼는 내독소를 포함하지 않으며, 하나 또는 그 이상의 단백질 가수분해성 단백질 억제제(proteolytic protein inhibitor), 예를 들어 페닐메탄술포닐플루오라이드(phenylmethanesulphonylfluoride; PMSF)를 포함한다. 어떤 구현에서, 상기 세척 버퍼는 저해 효과를 나타내는 양의 PMSF 및/또는 아미노에틸-벤젠술포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(Aminoethyl-Benzenesulfonyl Flouride Hydrochloride; AEBSF)를 포함하는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline; PBS)이다.

어떤 양상에서, 실질적으로 내독소를 포함하지 않는 펠릿은 pH 12.5에서 우레아를 함유하는 단백질 언폴딩(unfolding) 용액을 사용하여 처리될 수 있고, 아르기닌, 글리세롤 및/또는 수크로오스와 함께 감소된 몰농도의 우레아를 함유하는 단백질 리폴딩(refolding) 용액에서 리폴딩된다. 정제된 키메릭 단백질 농도는 1 및 3mg/ml 사이, 전형적으로는 약 1.4 내지 1.8mg/ml 사이가 되도록 변경된다. 어떤 경우에 있어서, 실질적으로 내독소를 포함하지 않는 키메릭 단백질은 약 1.5 내지 5mg/2ml의 투약량 및 더욱 전형적으로는 2.0 내지 3.5mg/2ml의 투약량의 백신 제형으로 제공된다. 다른 내독소 제거 방법, 예를 들어 상용의 이온교환 내독소 제거 컬럼, 소수성 컬럼 등도 사용될 수 있다.

백신

본 발명의 백신은 본원에 기재된 것과 같은 면역 보조제 및 인간 질병 상태의 예방 또는 치료에 유용한 표적 항원의 조합이다.

본원의 백신의 구현을 위한 약제학적 투약량(dosage)은 1-5mg의 키메릭 폴리펩티드를 포함한다. 본원의 모든 구현에서, 백신은 멸균되어야만 하며, 제조 및 저장 조건 하에서 유동성이며 안정하여야 한다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤(parabens), 클로로부탄올(chlorobutanol), 소르브산(sorbic acid), 티메로살(thimerosal) 등의 첨가에 의해 달성될 수 있다.

본원의 백신은 전형적으로 총 단백질 양에서 약 1mg/2ml 내지 3mg/2ml 투약량으로 항원을 포함하며, 여기에서 대략 투약량의 5% 내지 25%, 더욱 전형적으로는 투약량의 약 10% 내지 20%가 보조제이다. 어떤 구현에서, 상기 보조제는 투약량의 약 18%를 이루고 있다.

설명을 위하여, 본 발명의 보조제는 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍에 기반한 질병 및/또는 질환의 치료에 유용한 백신을 생산하기 위하여 소마토스타틴에 기초한 폴리펩티드와 결합된다. 본원에 기재된 보조제는 다른 표적 인간의 질병의 치료에 유용한 신규한 백신을 생산하기 위하여 다른 항원과 결합될 수 있음에 유의하라.

인간 질병의 치료를 위한 방법

본 발명은 본 발명의 키메릭 폴리펩티드 및 보조제를 포함하는 약제학적 등급의 백신을 제공한다. 이와 같은 백신은 환자에서 내인성 공급원(endogenous source)으로부터 적절한 분비를 용이하게 하기 위하여 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍을 가지는 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 백신은 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍을 가지는 환자에게 제공된다. 하나의 구현에서, 본 발명의 백신은 치료 기간에 걸쳐 3 내지 5번의 2차 투여(booster)와 함께 1 내지 2번 제공된다. 전형적인 백신 항원 양은 1 내지 5mg/ml 키메릭 폴리펩티드이다. 백신은 공지의 기술에 의해 투여될 수 있다. 하나의 구현에서, 상기 백신은 피하 주사를 통하여 투여된다. 다른 구현에서, 상기 백신은 피내(intradermal) 주사, 근육내(intramuscular) 주사 또는 주입(infusion)에 의해 투여된다.

본 발명의 백신의 구현은 또한 분산제(dispersing agent) 또는 습윤제(wetting agent), 현탁제(suspension agents) 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 구현은 멸균된 오일, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드, 지방산 또는 올레산을 포함할 수 있다.

백신은 전형적으로 멸균된 수용액으로서 제조된다. 이 용액은 제조 및 저장 조건하에서 안정하다. 어떤 양상에서, 미생물의 작용을 예방하기 위하여 백신 내에 첨가제(additional agent), 예를 들어 항세균제 또는 항진균제가 포함될 수 있다.

본 발명의 백신 용액은 요구되는 양으로 물질(항원, 보조제, 다른 성분들)을 포함함으로써 제조되며, 그 후 최종 멸균, 예를 들어 자외선(UV light) 또는 오존(ozone) 처리될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 백신 용액은 (최종 멸균이 요구되는 경우에 한하여) 최종 어셈블리 전에 개별적으로 멸균된 성분들을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 백신의 구현을 수용하는 환자에 대한 치료 과정은 관찰될 수 있으며, 부가적인 투여가 제공된다. 성장 호르몬 레벨의 증가, 인슐린-유사 성장 인자 1 레벨의 증가 및 기능적 이점들(예를 들어, 비만 환자에서의 만족스러운 체중 감량)이 치료 효과의 관찰에 대한 모든 표적이다. 게다가, 타입 1 또는 2 당뇨병 또는 비만이 치료될 경우, 환자에서 치료 효과를 판단할 수 있도록 혈액, 글루코오스, IGF-1 레벨, 지질 프로파일, 인슐린 레벨 및 헤모글로빈 결합성 A1c(hemoglobin bound A1c; HbAlc) 레벨이 관찰될 수 있다. 환자 개개인의 경과에 기초하여, 다소의 본 발명에 따른 항원을 사용하여 추가 백신 투여가 수행될 수 있다. 게다가, 건강 관리 전문가에 의한 판단으로서 예방접종에 대한 특정 환자의 반응을 변경하기 위하여 대안적인 보조제 조합이 사용될 수 있다.

본원의 구현은 성장 호르몬 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 1 결핍성 질병 상태 또는 질환을 목표로 하는 다른 기존의 치료와 함께 조합될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 예방접종은 타입 1 당뇨병의 치료에서 대체 인슐린과 함께 조합될 수 있거나, 예방접종은 고도비만으로 고통받는 환자에서의 위절제술(weight loss surgery) 또는 저칼로리 다이어트와 함께 조합될 수 있다.

본 발명에 일반적으로 기재된 것들은 실례를 통하여 제공되는 하기의 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해될 수 있을 것이며, 이는 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

하기의 실시예들은 단지 설명의 목적을 위하여 제공될 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1 : CAT - 결손성 소마토스타틴 융합 단백질의 제작

본 실시예는 본 발명의 구현에 따른 CAT-결손성 소마토스타틴 융합 단백질의 생산을 설명한다. His 192 및 His 193을 글리신 잔기로 치환하기 위하여, 부위-지정 돌연변이를 플라스미드 pET30b-Cat-Som 상에서 수행하였다(변경 후 : Gly 192 및 Gly 193). His 193(및 His 192) 잔기의 불활성화는 프로톤을 받아들이기 위한 CAT 효소의 능력을 제거하여, CAT의 완전한 불활성화를 제공한다.

(His 치환을 가지는) 동일한 pET30b-Cat-Som에서 스페이서는 공통발현된 tRNA 분자들의 부재하에서 E. coli에 의한 발현을 위하여 코돈 최적화되었다.

변경된 CAT-결손성 소마토스타틴 핵산 구조물을 SEQ ID NO:12로 나타내었다. CAT-결손성 소마토스타틴 융합 단백질 서열을 SEQ ID NO:13로 기재하였으며, 변경되지 않은 CAT-소마토스타틴 융합 단백질(SEQ ID NO:14)과 비교하였다.

실시예 2 : 높은 수준으로 발현될 수 있는 CAT - 결손성 소마토스타틴 융합 단백질

BL21(DE3) 세포에서 융합 단백질을 발현시키기 위하여, 실시예 1에 기재된 것과 같은 코돈 최적화된 CAT-결손성 소마토스타틴 구조물을 사용하였다. 형질전환된 세포를 LB에서 키우고, 대략 3시간 동안 0.4mM IPTG로 유도하였다. OD 0.7 밀도의 배양액으로부터 1ml의 세포를 펠릿화시키고, 100μl SDS 샘플 버퍼에서 10분간 70℃에서 가열하였다. 40μl의 세포 추출물의 샘플을 SDS PAGE의 레인 마다 로딩하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 코돈 최적화된 CAT-결손성 소마토스타틴 융합 단백질의 예측된 크기에 대응하는 28KD 밴드를 IPTG로 유도한 후 레인 1(LB + IPTG, 환원됨) 및 3(LG + IPTG)에서 확인하였다. 대조 레인 2(LB, 환원됨) 및 4(LB)에서는 어떠한 발현도 보이지 않았다. 예측한 바와 같이, 표준 또는 환원 조건하에서 수행하였을 때의 융합 단백질 크기에는 차이가 없었다.

실시예 3 : 내독소를 포함하지 않는 코돈 최적화된 CAT - 결손성 소마토스타틴을 함유하는 백신

본 발명에 따른 예시적 백신:

시약 용액:

1. 카보폴 성분

a. 물 또는 식염수에 0.5g의 카보폴 974P를 용해시킨다.

b. 용해시키기 위하여 혼합하고 끓인 후 살균(autoclaving)한다.

c. 4℃에 저장한다.

2. 스쿠알렌 성분

a. 58.1ml의 스쿠알렌, 4.6ml의 비동물성 기원의 트윈 80 및 5.2ml의 스팬 85를 혼합한다.

b. 혼합물을 0.2μ 필터를 통하여 여과한다.

c. 4℃에 저장한다.

3. 트래거캔틴 용액

a. 메탄올로 트래거캔스 검을 추출한다.

b. 메탄올 불용성 단편을 회수한다.

c. 상온에서 건조시킨다.

d. 건조된 상태로 상온에서 저장한다.

e. 물 또는 식염수에 1g의 건조된 트래거캔틴을 첨가한다.

f. 용해시키기 위하여 혼합하고 끓인 후 살균한다.

g. 4℃에 저장한다.

백신 제조

1. 백신 항원을 5mg/ml 또는 그 이하로 식염수 또는 PBS에 제조한다.

2. 혼합 용기에 6.79ml의 스쿠알렌 성분을 첨가한다.

3. 스쿠알렌 성분에 10ml의 카보폴 성분을 첨가한다(CS).

4. 잘 혼합한다.

5. CS 용액에 10ml의 트래거캔틴 용액을 첨가한다.

6. 잘 혼합한다.

7. 식염수 또는 PBS에 사용하기 위하여 희석되지 않거나 희석된 백신 항원을 최종 부피가 82ml이 되도록 첨가하였다.

8. 1ml의 1% 티메로살 용액을 첨가하고 잘 혼합한다.

9. 사용할 때까지 백신을 4℃에 저장한다.

본 발명에 따른 대안적인 예시 백신:

시약 용액

1. 카보폴 성분

a. 물 또는 식염수에 0.5g의 카보폴 974P를 용해시킨다.

b. 용해시키기 위하여 혼합하고 끓이고, 살균(autoclaving)한다.

c. 4℃에 저장한다.

2. 스쿠알렌 성분

a. 58.1ml의 스쿠알렌, 4.6ml의 비동물성 기원의 트윈 80 및 5.2ml의 스팬 85를 혼합하고, 0.2μ 필터를 통하여 여과한다.

b. 4℃에 저장한다.

3. 아라비노갈락틴 용액:

a. PBS 또는 식염수 내로 1-10g의 아라비노갈락틴을 첨가한다.

b. 용해시키기 위하여 혼합하고 끓이고, 살균한다.

c. 4℃에 저장한다.

백신 제조

2. 혼합 용기에 6.79ml의 스쿠알렌 성분을 첨가한다.

3. 스쿠알렌 성분에 10ml의 카보폴 성분을 첨가한다(CS).

4. 완전히 혼합하고, 10ml의 아라비노갈락틴 용액을 첨가한다

5. 식염수 또는 PBS에 사용하기 위하여 희석되지 않거나 희석된 본 발명의 항원을 최종 부피가 82ml이 되도록 첨가하였다.

6. 1ml의 1% 티메로살 용액을 첨가하고, 백신을 혼합하였다.

7. 사용할 때까지 백신을 4℃에 저장한다.

실시예 4 : 실시예 3의 백신을 사용하는 심혈관 질환의 치료

본 실시예는 제네테크(Genetech, 1995)에 공개된 프로토콜에서 제조된 것과 같은 좌심실 부전(left ventricle dysfunction)을 가진 백서를 사용하였다. 본 발명의 예방접종을 한 첫번째 치료군, 두번째 대조군(예방접종하지 않았으나, 다른 것들은 동일하게 처리함)의 두 그룹의 백서(각 그룹의 각 구성원은 결찰된 좌관상동맥(left coronary artery)를 가짐)로 분리하였다. 치료군의 각 구성원들에게 근육내로(1ml/dose) 예방접종을 한 후, 21일 후에 두번째 예방접종을 투여하였다. 혈청 IGF-1 레벨 및 항-소마토스타틴 항체를 0일, 21일 및 42일째에 측정하였다. 42일째에, 혈역학적 지표(hemodynamic parameter)를 두 그룹 모두에서 측정하였을 뿐만 아니라, 손상 크기(infarct size) 및 심장지수(cardiac index)도 측정하였다.

실시예 3에 기재된 바와 같은 두 번의 예방접종을 한 백서 그룹은 대조군에 비하여 실질적으로 향상된 심장 기능(손상 크기의 감소 및 향상된 심장 지수)을 가질 것으로 예상되었다.

실시예 5 : 실시예 3의 백신을 사용한 비만의 치료

비만에 본 발명의 백신이 끼치는 효과를 측정하기 위하여, 빅커 등(Vickers et al., 2001)에 기재된 것과 같은 비만 백서 모델을 사용하였다. 백서들에게 30 내지 60일간 고열량 식이(hypercaloric diet)를 주었다. 고열량을 가지는 백서들의 체중을 재고, 세 그룹 - 식염수 대조군 및 고열량 식이를 계속하는 예방 접종군 및 정상적인 열량 식이군으로 분리하였다. 예방접종한 백서들에 0일 및 21일째에 근육내로 2 x 1ml 투약하였다. 연구 기간에 걸쳐 모든 백서들의 체중을 주마다 재었다. 42일째에 모든 백서들의 체중을 재고, IGF-1 분석, 우레아 분석 및 항-소마토스타틴 항체 레벨을 위하여 혈청을 수집하였다.

실시예 3에 기재된 것과 같이 예방 접종된 백서들은 식염수 대조군에 비하여 실질적으로 향상된 체중 조절을 가질 것으로 기대되었으며, 체중 조절과 상호관계가 있는 대응하는 혈청 결과는 성장 호르몬 변경 때문이다. 예방 접종된 군은 정상적인 열량 섭취군과 같이 실질적으로 동일한 체중 조절을 나타내었다.

실시예 6 : 실시예 3의 백신을 사용하는 성장부진의 치료

3주령의 Cox(CD) 백서에 1ml 투약량을 사용하여 매달 3개월간 예방접종을 하였다. 각 예방접종은 근육내 또는 피하내로 투여되었다. 대조군 백서에는 투여에 대하여 동일한 투여방법 및 동일한 부피의 물질을 사용하여 식염수를 주사하였다. 주단위의 성장을 측정하기 위하여 모든 백서들의 체중을 재고, 0, 4, 8, 12 및 16주에 채혈하였다. 유사한 예정으로 혈청을 수집하고, IGF-1, 우레아 및 항-소마토스타틴 항체 레벨에 대하여 분석하였다.

실시예 3에 기재된 것과 같이 예방 접종된 CD 백서들은 대조 CD 백서들에 비하여 실질적으로 향상된 성장을 보일 것이라고 기대되었다. 치료된 백서들은 치료된 백서들에서의 예방접종 효과를 확인하는 혈청 효과를 나타내야만 한다.

실시예 7 : 마우스에서 체중 증가를 야기하는 증가된 소마토스타틴

외생적으로 투여된 소마토스타틴이 마우스에서 체중 증가를 야기하는지를 알아보기 위하여 마우스 비만 연구를 수행하였다. 3가지의 서로 다른 본 발명의 보조제가 재조합 소마토스타틴과 조합되었을 경우, 7일간 연구를 비근교계 마우스에서 수행하였다(보조제는 JH14, JH17 및 JH18로 칭한다). 각각의 보조제를 재조합적으로 생산(2009년에 생산)된 소마토스타틴 1mg/ml에 첨가하고, 하나의 보조제(JH14) 또한 2.57mg/ml의 농도로 2007년에 생산된 소마토스타틴에 첨가하였다. 대조군 마우스는 멸균된 식염수를 주사하였다.

기초 체중을 측정하기 위하여 연구 시작시에 각각의 마우스의 체중을 재었다. 각 마우스에 대한 예방접종은 0.5ml의 백신을 IP 주사에 의해 0일째에 수행하였다. JH17 및 18 보조제에 들은 소마토스타틴을 암컷 마우스에 투여하였고, JH14를 수컷 마우스에 투여하였다. 마우스에 7일간의 기간에 걸쳐 정상 식이를 주고, 각 마우스들의 체중을 7일째에 재었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 소마토스타틴이 투여된 비근교계 마우스들은 건강을 유지하였고, 1주간의 연구에서 거의 부작용을 나타내지 않았다. JH17 군에서 암컷 마우스들은 체중이 증가한 반면, 암컷 JH18 마우스들은 대조군 마우스들과 유사한 체중을 보였다. 두 개의 JH14 그룹(2008 및 2009) 모두에서 수컷 마우스들은 대조군 수컷 마우스들에 비하여 체중 증가를 보였다. 도 3에서의 총체적인 발견은 JH14, JH17 및 JH18 보조제들이 마우스에서 사용하기에 안전하고, 매우 일관되며 저장 가능하고, 외생적으로 투여된 소마토스타틴은 일반적으로 소마토스타틴이 체중 증가에 관여한다는 증거를 제공하는 표적 마우스에서의 체중 증가를 야기한다. 이 모든 효과들은 IP 예방접종 몇일 내에 일어난 것이다. 이것은 투여 방법, 천연 키메릭 폴리펩티드 및 보조제 효과에 기인하는 빠른 속도로 대식세포 과정(macrophage processing) 및 항원 및 B 림프구 제시(presentation)를 유도하기 때문이다.

JH14, 17 및 18 프리블렌드(Preblend)는 여기 및 미국 특허 S/N PCT/US08/68195("Chloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)-Defective Somatostatin Fusion Protein and Uses Thereof)에 기재된 것과 같다. 최종 제형은 1ml 투약량 당 1mg의 단백질 항원을 가진다.

이 작업에 대한 제형들은 하기와 같다:

JH17

리폴딩된 단백질 12ml(5.86mg/ml)

둘베코 PBS(Dulbecco's PBS) 24.5ml

JH17 프리블렌드 13.4ml

1% 티메로살 0.5ml

37% 포름알데히드 0.1ml

JH18

리폴딩된 단백질 12ml(5.86mg/ml)

둘베코 PBS 24.5ml

JH18 프리블렌드 13.4ml

1% 티메로살 0.5ml

37% 포름알데히드 0.1ml

JH14

리폴딩된 단백질 12ml(5.86mg/ml)

둘베코 PBS 27.8ml

JH14 프리블렌드 10ml

1% 티메로살 0.5ml

37% 포름알데히드 0.1ml

상기 제형들은 백신의 오염을 제한하기 위하여 티메로살 및 포름알데히드를 포함한다는 것에 유의하라. 이 물질들은 백신을 현탁하기 위한 다회용 재출입 용기((multi-dose re-entry bottles)가 사용되고 있는 경우에만 사용되며, 전형적으로 인간 및 동물 치료 프로토콜은 일회용(single-use) 바이알에 패키지될 것이며, 그것에 의하여 이러한 보존의 필요성이 없어진다. 또한, 더 높은 레벨의 항원들이 단백질 분해를 만회하기 위하여 2007 JH14에 사용된다.

실시예 8 : 마우스에서의 비만 치료

잭슨 실험실(Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine)로부터의 마우스를 사용하여 마우스 비만 연구를 수행하였다. C57BL/67 혈통의 다수의 비근교계 마우스들을 잭슨 실험실로부터 얻었으며, 상기 마우스들은 유도된 고도비만을 보이고, 다유전자성 유전적 특징(polygenic genetics)을 가지고, 성인비만(mature onset obesity)을 나타낸다. 이전의 테스트에서, 잭슨 실험실은 이 특정 혈통의 마우스가 고지방 식이를 섭취한 경우 인간 집단에서 보고된 것과 사실상 매우 유사한 대사 증후군(metabolic syndrome) 표현형을 발병시킨다는 것을 측정하였다. 예를 들면, 고지방 식이를 섭취한 C57BL/6J 마우스는 내장지방 축적증(visceral adiposity), 인슐린 저항성(insulin resistance), 고인슐린증(hyperinsulinemia), 렙틴 저항성(leptin resistance) 및 고혈압(hypertension)을 나타낼 것이다.

C57BL/6J 마우스에서 체중 감량을 야기하는데 대하여 몇몇의 마우스에서 제충 증가를 제한하는 것을 포함하는 비만의 치료를 위한 본원의 백신의 구현의 유효성을 테스트하기 위하여 연구를 수행하였다. 6주령의 마우스를 6주 동안 60% Kal% 지방 식이를 먹였다. 12주령 마우스들을 그 후 4개의 그룹으로 나누었다: 그룹 1은 백신을 포함하는 JH14로 치료된 마우스들을 포함하고; 그룹 2는 백신을 포함하는 JH17로 치료된 마우스들을 포함하며, 그룹 3은 백신을 포함하는 JH18로 치료된 마우스들을 포함하며, 그룹 4는 임의의 형태의 항-소마토스타틴 형태의 항원보다는 PBS로 치료된 대조군 마우스들을 포함한다. 각 그룹에서의 마우스들에 IP 방법을 통하여 0.5ml의 특이적 백신 또는 PBS를 사용하여 예방접종하였다. 22일 후, 마우스들에 0.1ml의 백신을 사용하여 2차 IP 투약량으로 다시 치료하였다.

연구 기간(6주)에 걸쳐서 각각의 마우스들의 체중을 1주에 2번 재고, 체중 변화가 음식 섭취의 감소 또는 증가 때문이 아님을 확인하기 위하여 음식 섭취를 관찰하였다(각 4 그룹 내에서의 누적 음식 섭취를 나타내는 도 4를 참조). 연구 기간에 최종 채혈을 각 마우스에서 수행하였고, IGF-1 레벨을 측정하였다(IGF-1 혈장 레벨은 진단 시스템 연구소의 Active Mouse/Rat IGF-1 ELISA(DSL-10-29200)을 사용하여 측정하였다).

도 5 및 6 및 표 1에 나타낸 바와 같이, JH14, 17 및 18로 치료된 마우스들은 모두 최종 체중 대 기초 체중 비율에 있어서 매개변수적 또는 비매개변수적 통계분석에 의해 매우 현저한 차이(p<0.0001)를 보였다. 처음 7일 내에 각 예방접종된 군에서 현저한 체중 감소가 관찰된 반면, 대조군은 동일한 기간에 비하여 약간의 체중 증가를 보였다. 22일째에 제2 투약량의 백신(1일에 제공된 투약량의 1/5th)을 JH14, JH17 및 JH18 그룹에 투여한 후, 적은 체중 감소 또한 관찰되었다.

마우스 비만 연구로부터의 데이터는 하기의 결론을 제공한다: (1) IGF-1 ng/ml의 관점에서, 비록 JH18 및 대조군 사이에 통계학적으로 현저한 차이는 없으나, 최종 체중 대 기초 체중의 비율에 있어서 매개변수적 또는 비매개변수적 통계 분석에 의하면 이 그룹들 사이에는 매우 현저한 차이(p<0.0001)가 있고, (2) 최종 체중 대 기초 체중의 비율에서, JH17 대 대조군은 두 가지 통계 테스트에 의해 통계학적으로 현저한 차이점을 제공하고, (3) (JH17보다 135.8ng/ml의 평균 IGF-1 레벨을 가지는) JH18은 기초 체중 비율에서 JH17과 비교하여 (단지 비매개변수적 테스트에 의해) 통계학적으로 현저한 차이를 나타내었고, (4) JH17 및 JH18 보조제 모두에서 본 발명의 키메릭-소마토스타틴 항원은 최종 체중 대 기초 체중의 비율에서 통계학적으로 현저한 차이가 유도되며, (5) JH18은 최종 체중 대 기초 체중 비율의 관점에서 비매개변수적 분석에 의해 JH17과 비교하였을 때 통계학적으로 현저하고, (6) IGF-1 레벨은 대조군 및 JH17 예방접종 모두와 비교하여 연구의 마지막에서 더욱 큰 체중 감소와 상호연관이 있을 수 있고(표 2를 참조), (7) 모든 예방접종이 동일한 투약량의 본 발명의 키메릭-소마토스타틴 항원을 가지기 때문에, 보조제의 효과는 연구 내에서 관찰되며, (8) 50% kcal 지방 식이를 먹인 비근교계 C57BL/6J 수컷 마우스는 IP 예방접종 후 1주 내에 현저한 체중 감소를 나타내었고, (9) 본원에서 나타난 체중 감소는 심지어 연구기간 동안 마우스가 60 kcal% 지방 식이를 먹는 동안에도 유지되었다.

최종 체중 대 기초 체중

그룹	#	% 기초	표준 편차	맨 위트니 (양측검정)	독립표본 t-검정 (양측검정)
대조군	10	115.5	6.3	수행하지 않음	수행하지 않음
JH17	10	107.1	4.7	P=0.0021	P=033
JH18	10	104	3.0	PM0.0001	P<0.0001
JH17 대JH18	---	---	---	P=0.0355	P=0.11015

IGF-1 통계학적 분석

그룹	#	평균 IGF-1 (ng/ml)	표준 편차	맨 위트니 (일측검정)
대조군	10	365.6	88.7	수행하지 않음
JH17	10	304.2	99.2	P=0.0827
JH18	10	440.4	103.7	P=0.105

이 명세의 목적을 위하여 다양한 변화 및 변경이 본 발명에서 일어날 수 있고, 그것이 본 발명의 범위 내에 있을 것이라는 것으로 이해되어 진다. 다양한 다른 변화들이 당업자 자신에게 쉽게 연상되고 본원에 기재된 발명의 범위 내에 포함되며 첨부된 청구항에 정의된 것과 같이 이루어질 수 있다. 상기 명세서는 다양한 특허 및 문헌에 대한 인용들을 포함하고 있다. 각각은 모든 목적을 위하여 참조에 의해 본원에 통합되어 있다.

<110> BRAASCH BIOTECH LLC <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED SOMATOSTATIN IMMUNOGENISITY <130> PI10-0131 <150> US 61/075,656 <151> 2008-06-25 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480 gccaatatgg acaacttctt 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Asp Asn Phe Phe Ala Pro Val Phe Thr Met Gly Lys Tyr 165 170 175 Tyr Thr Gln Gly Asp Lys Val Leu Met Pro Leu Ala Ile Gln Val Gly 180 185 190 Gly Ala Val Cys Asp Gly Phe His Val Gly Arg Met Leu Asn Glu Leu 195 200 205 Gln Gln 210 <210> 4 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540 gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatggtg ccgtttgtga 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Claims

실질적으로 불활성화된 CAT 효소에 기능적으로 부착된 소마토스타틴-14의 키메릭 폴리펩티드(chimeric polypeptide), 및 유효량의 카보폴974P(Carbopol974P)를 포함하는 보조제를 포함하는 비만을 치료하기 위한 백신.
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제1항에 있어서,
상기 보조제는 스쿠알렌(squalene) 및 비동물성 기원의 트윈 80(Tween 80)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
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제1항에 있어서,
치료를 받을 대상은 비만 성인 또는 비만 어린이인 것을 특징으로 하는 백신.
제1항에 있어서,
치료를 받을 대상은 인간, 개, 고양이 또는 말인 것을 특징으로 하는 백신.
제9항에 있어서,
상기 대상은 비만 개인 것을 특징으로 하는 백신.
제9항에 있어서,
상기 대상은 비만 고양이인 것을 특징으로 하는 백신.
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제1항에 있어서,
비만 치료를 받을 대상은 타입 1 및 타입 2 당뇨병을 가지는 것을 특징으로 하는 백신.
제1항에 있어서,
비만 치료를 받을 대상은 스트레스성 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 백신.
제1항에 있어서,
비만 치료를 받을 대상은 심장질환을 가지는 것을 특징으로 하는 백신.
제1항에 있어서,
상기 보조제는
카보폴 974P 성분(Carbopol 974P base);
스쿠알렌 성분(squalene base); 및
아라비노갈락탄 용액(arabinogalactan solution)
을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제17항에 있어서,
상기 스쿠알렌 성분은 스쿠알렌(squalene), 비동물성 기원(non-animal origin)의 트윈 80(Tween 80) 및 스팬 85(Span 85)의 조합인 것을 특징으로 하는 백신.
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제1항에 있어서,
상기 불활성화된 CAT 효소는 알라닌, 글리신 또는 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 야생형(wild type) 히스티딘 잔기를 가지는 것을 특징으로 하는 백신.
면역학적 양(immunogenic amount)의 불활성화된 CAT 효소에 부착된 소마토스타틴-14, 여기에서 상기 불활성화된 CAT 효소는 알라닌, 글리신 또는 다른 아미노산으로 치환된 적어도 하나 또는 그 이상의 야생형 히스티딘 잔기를 가지고; 그리고
적어도 카보폴 974P(Carbopol 974P), 스쿠알렌(squalene) 및 아라비노갈락탄(arabinogalactan)을 포함하는 보조제;
를 포함하는, 비만 치료를 위한 백신.
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