KR100289691B1 - 콜라게네이즈 인지부위를 가진 재조합 인간 성장 호르몬 - Google Patents
콜라게네이즈 인지부위를 가진 재조합 인간 성장 호르몬 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100289691B1 KR100289691B1 KR1019930030318A KR930030318A KR100289691B1 KR 100289691 B1 KR100289691 B1 KR 100289691B1 KR 1019930030318 A KR1019930030318 A KR 1019930030318A KR 930030318 A KR930030318 A KR 930030318A KR 100289691 B1 KR100289691 B1 KR 100289691B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- growth hormone
- human growth
- recognition site
- collagenase
- amino acid
- Prior art date
Links
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 9
- 239000005556 hormone Substances 0.000 abstract 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 9
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010039203 Road traffic accident Diseases 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- -1 dithio pentitol Chemical compound 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 콜라게네이즈 인지부위를 포함하는 재조합 인간 성장 호르몬 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하며, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이에 의해 형질 전환된 미생물을 제공한다. 상기 미생물을 배양하여 콜라게네이즈 인지부위를 포함하는 재조합 인간 성장 호르몬을 제조할 수 있으며, 이를 콜라게네이즈로 절단하여 인간 성장 호르몬만을 분리할 수 있다.
Description
제1도는 본 발명에 따른 발현벡터중 콜라게네이즈 인지부위(collagenase recognition site)와 연결된 재조합 인간 성장호르몬의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 재조합 DNA의 염기서열을 나타낸 것이고,
제2도는 상기 재조합 DNA의 효모 발현 벡터로의 클로닝 과정을 나타내며,
제3도는 콜라게네이즈 인지부위를 함유한 재조합 인간 성장 호르몬 발현정도를 15% SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
본 발명은 콜라게네이즈 인지부위를 가진 재조합 인간 성장 호르몬과 효모에서 콜라게네이즈 인지부위(collagenase recognition site)를 가진 재조합 인간 성장 호르몬(rHGH)을 발현시키는 것에 관한 것으로 더욱 상세하게는 유전공학적인 방법에 따라 효모를 발현체로 하여 콜라게네이즈 인지부위를 함유한 rHGH를 우선 발현시키고 차후 콜라게네이즈 처리로 인체의 인간 성장 호르몬과 동일한 형태의 인간 성장 호르몬을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있는 콜라게네이즈 인지부위를 가진 인간 성장 호르몬, 그의 유전자 및 그 발현벡터와 발현미생물에 관한 것이다.
인간 성장 호르몬은 191개의 아미노산 잔기로 구성되는 분자량 약 21,500 달톤(dalton)의 펩타이드 호르몬으로서 주로 왜소증을 치료하는데 사용되어 왔다(Robinson, M, S., J. Clin. Endocr. 18, 901(1958)). 종래에는 주로 교통사고나 질병으로 사망한 인간의 뇌하수체로 부터 인간 성장 호르몬을 추출하여 사용했으나, 그 양이 제한적이고 가격이 비싸기 때문에 사용에 많은 어려움이 있었다. 또한, 미국 식품의약품국(FDA)에서는 최근에 사망한 인간의 뇌하수체로 부터 추출정제한 인간 성장 호르몬의 사용을 금지시켰다(Science 234, 22(1986)).
한편, 인간 성장 호르몬의 다른 제조방법으로서, 화학적 합성이나 조직배양법 또는 기타 유전자 조합에 의한 미생물 배양법 등이 공지되어 있으나, 이들 방법 역시 수율이 낮고, 제조과정의 불합리로 가격이 상승되었을 뿐만 아니라, 또한 종래의 원핵세포로 부터 유전자 재조합 방법에 의한 인간 성장 호르몬의 제조시 N-말단에 유전자 발현과정에서 여분으로 생성되는 아미노산인 메티오닌을 그대로 가지고 있는 형태로 발현되어 장기간 인체에 투여되었을 때에 인간 성장 호르몬에 대한 항체가 생성되는 문제점을 가지고 있었다. 지금까지 유전공학적인 방법으로 합성된 인간 성장 호르몬 N-말단에 있는 메티오닌기를 제거하기 위하여 여러가지 방법들이 사용되고 있는데, 각 그 방법들을 살펴보면 다음과 같다. 첫째 아미노펩티다제를 이용하여 발현 후 정제과정에서 메티오닌기를 제거하는 방법(예를들면 본 출원인의 특허출원 제 92-25910호 경우)으로 이는 아미노펩티다제를 값싸게 얻지 못하는 단점이 있으며, 둘째 유비퀴틴이 인간 성장 호르몬의 N-말단에 붙어있는 형태로 발현시켜 세포안에서 자체적으로 유비퀴틴이 제거되면서 메티오닌이 제거된 인간 성장 호르몬을 얻게 하는 방법(예를들면 본 출원인의 특허공고 제92-1745호)인데 이것은 세포가 자체적으로 유비퀴틴을 제거하면서 인간 성장 호르몬의 첫번째 아미노산인 페닐알라닌까지 제거하여 두번째 아미노산인 프롤린 잔기부터 시작되는 인간 성장 호르몬 형태가 동시에 소량 존재하므로 정제등이 어렵고, 셋째 인간 성장 호르몬 벡터에 효모의 α-인자 신호 서열을 붙여 세포외로 분비되면서 메티오닌이 제거되도록 하는 방법(예를들면 본 출원인의 특허출원 제 92-10932호)등이 있는데 이는 발현된 인간 성장 호르몬이 세포외로 분비되면서 조건이 나쁜 세포밖의 배지에서 단백질의 아미노산간 공유결합이 끊어진 소량의 rHGH가 생겨 정제과정등이 어렵다.
이에 본 발명자들은 위에서 언급한 방법과는 다른 방법으로, 즉 유전공학적인 방법을 이용하여 인간 성장 호르몬 벡터에 콜라게네이즈 효소에 의해 인지되어 절단될 수 있는 부분을 인간 성장 호르몬 유전자 앞에 붙여 세포내에서 발현한 후에 값싼 콜라게네이즈에 의해 절단되게 하는 방법으로 결국은 N-말단에 메티오닌기가 제거된 인간 성장 호르몬을 대량생산하는데 유용하게 사용될 수 있는 인간 성장 호르몬 발현벡터를 발명하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 천연의 인간 성장 호르몬과 동일한 아미노산 서열을 갖는 (N-말단에 메티오닌이 없는) 인간 성장 호르몬을 대량생산하는데 사용될 수 있는 콜라게네이즈 인지부위를 가진 인간 성장 호르몬을 대량생산하는데 사용될 수 있는 콜라게네이즈 인지부위를 가진 인간 성장 호르몬, 그의 유전자, 및 그를 포함하는 발현벡터와 발현 미생물을 제공하는데 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 유비퀴틴 유전자(UB)와 인간 성장 호르몬 유전자(HGH)사이에 콜라게네이즈 인지부위(Josep Germino et al., P.N.A.S. 81, 4692-4696(1984))인 -Pro-X-Gly-Pro-Y-(X,Y는 아미노산이며 콜라게네이즈에 의해 절단되는 부위는 X 아미노산 뒤와 Y 아미노산 뒤이다) 뒤, 즉 Y 아미노산 뒤에 페닐알라닌으로 부터 시작하는 인간 성장 호르몬을 연결시켜줌으로서 효모에서 발현된 재조합 단백질을 값싼 콜라게네이즈로 처리하여 Y 아미노산 뒤가 절단되도록 하여 천연형 인간 성장 호르몬과 같이 첫 아미노산이 페닐알라닌으로 시작되는 인간 성장 호르몬을 얻을 수 있도록 한 것이다. 본 발명의 콜라제네이즈 인지부위를 코딩하는 DNA는 DNA 합성기로 합성한 것 등을 사용할 수 있으며, 인간 성장 호르몬 유전자는 예를들면 본 출원인의 선출원인 특허출원 제 89-20200호 (공고번호 92-1745)에 개시한 재조합 발현 벡터 pYLBC-A/G-UB-HGH로 부터 유래한 것을 사용할 수 있다.
본 발명은 A-Pro-X-Gly-Pro-Y-HGH(여기에서 A는 2개 이상의 아미노산 잔기, X 및 Y는 각각 1개의 아미노산 잔기를 나타내며, HGH는 천연 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열임)로 표시되는 콜라게네이즈 인지 부위를 함유한 재조합 인간 성장 호르몬을 제공하며, 또한 이를 코딩하는 유전자를 제공한다. 유전자의 제조 방법을 예시하면 다음과 같다.
먼저, 핵산합성기로 부터 콜라게네이즈 인지부위를 코딩하는 염기서열을 포함하는 프라이머 1을 합성한 다음 효모의 Gap 터미네이터의 3′ 말단의 염기서열의 윗가닥에 상보적인 DNA 염기서열을 포함하는 프라이머 2와 함께 pYLBC-A/G-UB-HGH를 주형으로하는 PCR에 의해 SacII와 SalI 부위를 갖는 콜라게네이즈 인지부위를 포함하는 인간 성장 호르몬 유전자 절편을 대량 증폭한다. 이렇게 얻어진 절편에 클레나우 효소(Klenow fragment)를 이용하여 평활말단을 가진 절편으로 만든다. 이 절편들을 박테리오 파아지인 M13 mp19을 SmaI으로 처리하여 얻어진 벡터에 연결시켜 M13mp19에 클로닝하고 염기서열을 결정한다. 이로부터 얻어낸 CRS-HGH의 염기서열을 제1도에 나타내었다.
본 발명의 재조합 유전자의 서열은 콜라게네이즈 인지부위 및 생물학적 활성을 갖는 인간 성장 호르몬을 코딩하는 유전자를 포함하는 범위내에서 제1도의 염기서열을 적절히 변형시킬 수 있으며, 상기 PCR을 이용한 방법이외에도 공지된 뉴클레오티드의 화학적 합성 방법에 의해 본 발명의 재조합 유전자를 제조할 수 있다.
상기 재조합 유전자는 적절한 효모용 발현 벡터 내에 발현가능하게 삽입하여 발현 벡터를 제조하는데, 유전자 및 벡터의 적절한 제한효소절단 부위를 이용하여 절단후 연결반응시킨다. 예를들면 상기 pYLBC-A/G-UB-HGH를 PstI 및 SalI으로 절단한 후, 이를 M13mp19에 클로닝 된 재조합 유전자 CRS-HGH를 SacII와 SalI으로 절단한 절편과 연결반응시킴으로서 유비퀴틴 유전자와 인간 성장 호르몬 유전자사이에 콜라제이즈 인지부위가 연결되어 있고, 작동유전자로서 A/G를 포함하는 재조합 인간 성장 호르몬 발현 벡터 pYLBC-Alg-UB-CRS-HGH를 얻을 수 있다. 이와 같이 완성된 벡터로 효모를 형질전환시켜서 적절한 선별배지, 예를들면 상기 벡터 pYLBC-Alg-UB-CRS-HGH로 형질전환된 효모의 경우 루이신 결핍(Leu-) 배지에서 선별할 수 있으며, 선별된 형질전환 효모는 YEPD(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 글루코즈) 배지등의 영양 배지에서 배양하여 상기 재조합 유전자를 발현시켜 원하는 재조합 단백질을 얻을 수 있다.
생성된 재조합 단백질을 공지의 방법으로 분리ㆍ정제할 수 있으며, 콜라게네이즈 인지부위와 연결된 인간 성장 호르몬은 예상과 같이 기존의 유전공학기법에 의해 발현된 인간 성장 호르몬보다 크기가 약 1,000 달톤 정도 더 크다. 발현정도는 기존의 인간성장호르몬과 비슷하면서 콜라제네이즈 인지부위를 붙여도 발현에 나쁜영향은 받지 않아 대량의 콜라제네이즈부위를 함유한 인간 성장 호르몬을 제조할 수 있다.
효모로부터 분리ㆍ정제된 재조합 단백질은 문헌(D. Randall Steinbrink et al., J. Biol. Chem. 260, 2771-2776(1985))에 기재된 방법에 따라 콜라게네이즈로 절단한 후 일반적인 크로마토그래피 방법으로 인간성장 호르몬 만을 분리해 낼 수 있다.
이와 같은 본 발명은 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명되나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[PCR에 의한 콜라게네이즈 인지부위를 포함하는 재조합 인간 성장 호르몬을 코딩하는 유전자의 증폭 및 박테리오 파아지에로의 클로닝]
PCR을 위한 프라이머를 만들기 위해 공지된 콜라게네이즈 인지부위를 포함하고 인간 성장 호르몬 유전자의 N-말단의 아랫가닥과 상보적인 염기 서열과 인간 성장 호르몬 유전자의 C-말단의 윗가닥과 상보적인 염기서열을 이용하였다. 제2도에서 나타낸 바와 같이 프라이머 1은 콜라제네이즈 인지부위-인간 성장 호르몬의 N-말단에 상보적인 DNA 염기서열을 가지고 있는 59-머(5′-GACTCCGCGGTATGGACCCAGGTCCAGTTGGTCCAGTTTTCCCAACTATTCCACTC-3′)로 핵산합성기(Applied Biosystem Inc., Model 380B, U.S.A.)를 사용하여 합성하였다. 또한 프라이머 2는 갭(Gap) 터미네이터의 3′-말단의 염기서열의 윗가닥에 상보적인 18-머(5′-TTTAAATGCAAGACTTTA)로 만들었다. 상기 생성물의 O.D·260nm값이 5가 되는 양을 취하여 건조시킨 다음, 300㎕ 증류수에 용해시켜 다음의 반응에 사용하였다.
각각 5㎕씩의 프라이머 1과 프라이머 2, 1㎕의 pYLBC-A/G-UB-HGH(10ng)에 10㎕의 10xTag 폴리머레이즈 완충용액(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1%(w/v) 젤라틴)과 10㎕의 dNTP 혼합용액(dGTP, dATP, TTP 및 dCTP가 각각 2mM), 69㎕의 증류수 및 0.5㎕의 앰플리(Ampli) Taq DNA 폴리머레이즈(5 Unit/㎕, Perkin-Elmer-Cetus, U.S.A.)를 첨가하여 잘 혼합하였다. 이때 용액의 증발을 막기위해 50㎕의 미네랄 오일을 반응용액 위에 첨가하였다. 증폭반응을 수행하는데 온도순환기(Thermal Reactor, Hybaid, England)를 사용하였으며, 온도순환 프로그램은 94℃에서 1분; 37℃에서 90초; 72℃에서 2분동안의 순환을 30회 반복시키고 마지막으로 72℃에서 10분 동일 추가 반응시켰다. 증폭된 콜라게네이즈 인지부위-인간 성장 호르몬 유전자 절편에 클레나우 효소(Klenow fragment of DNA polymerase I)를 처리하여 절편을 평활 말단으로 만든 다음 7% 폴리아크릴아마이드젤을 이용하는 전기영동법으로 분리정제하여 20㎕의 TE 완충용액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA)에 녹였다.
상기와 같이 정제한 콜라게네이즈 인지부위-인간 성장 호르몬 유전자 절편 5㎕와 SmaI로 절단한 박테리오 파아지 M13mp19 1㎕를 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결반응시킨 다음, 상기 재조합 박테리오 파아지 M13mp19 DNA로 대장균 JM103(ATCC 39403)를 형질전환시키고, X-gal을 포함하는 최소고체배지 플레이트에서 흰색 플라크를 형성하는 재조합 박테리오 파아지를 선별하여 그 파아지로부터 클로닝된 콜라게네이즈 인지부위-인간 성장호르몬 유전자를 포함하는 단일가닥 DNA를 추출한 후 염기서열을 결정하여 그 결과를 제1도에 나타내었다.
[실시예 2]
[효모발현 벡터로의 클로닝 및 효모의 형질전환]
상기의 실시예 1에서 얻은 재조합 박테리오 파아지로부터 두가닥 DNA를 추출한 후, 제한효소 SacII와 SalI으로 절단하여 630 염기쌍의 핵산 절편이 분리되는 것을 확인하였다. 한편, pYLBC-A/G-UB-HGH 벡터를 각각 PstI/SacII와 PstI/SalI으로 절단한 후, 이 두 벡터절편을 각각 상기의 콜라게네이즈 인지부위-인간 성장 호르몬 유전자의 SacII/SalI 절편과 연결반응을 시키고 대장균 HB101를 형질전환시켰다. 앰피실린을 포함하는 LB(LB-Amp) 아가 플레이트에서 자란 콜로니들을 이쑤시게로 찍은 다음 2㎖의 LB-Amp 배지에 넣어 37℃, 200rpm에서 6 내지 7시간 키운 후 1 내지 1.5㎖을 채취하여 원심분리해 형질전환체 침전물을 얻었다. 이를 알칼리 용해 방법(T. maniatis et al., Molecular cloning 2nd Ed. Vol 1, pp 1.38 내지 1.39)으로 완성된 pYLBC-Alg-UB-CRS-HGH를 대량추출하여 효모의 형질전환에 이용하였다.
효모를 재조합 플라스미드로 형질전환시키기 위하여 베그스(Beggs, Nature 275, 104(1987))와 힌넨 등(Hinnen et al., P.N.A.S. 75, 1929(1978))의 방법에 의거하여 수행하였다. 밤새도록 배양한 효모(S. cerevisiae DC04, Yeast Genetic Stock Center, Univ. of California, Berkeley, USA) 액 1㎖을 50㎖의 새 YEPD(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 2%) 배지에 접종하고 O.D. 650 값이 0.8 내지 1이 될 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 상기물을 5000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포침전물을 20㎖의 물에 진탕한 후 다시 원심분리하였다. 세포침전물을 다시 20㎖의 1M 소르비톨 용액으로 진탕한 후 다시 원심분리하였다. 침전된 세포를 5㎖의 SP 용액(1M 소르비톨, 50mM 인산 칼륨, pH7.5)와 5㎕의 1M 디티오 트레이톨(DTT)에 잘 용해시킨 후 50㎕의 자이몰레이즈 효소(50% 글리콜/50% SP 중에 10㎎/㎖ 함유)를 넣어 주고 30℃에서 완만한 진탕조건(150rpm)에서 30분 정도 배양하였다. 이때, 수시로 세포액을 추출하여 1/10 부피의 0.1% SDS를 처리하고 광학현미경 관찰하에 스페로플라스트(spheroplast)의 형성정도를 조사함으로써, 약 90% 이상의 효모세포가 스페로플라스트가 될 때까지 배양하였다(일반적으로 30분 정도). 그 다음 원심분리기로 1500rpm에서 3분 동안 원심분리하여 스페로플라스트 침전물을 얻은 후 5㎖의 1M 소르비톨 및 5㎖ STC 용액(1M 소르비톨, 10mM CaCl2, 10mM Tris-HCl, pH7.5)으로 각각 세척하고, 최종 1㎖ STC 용해에 용해시킨 후 이를 형질전환에 사용하였다.
12.5㎕의 5 내지 10㎍ 플라스미드 핵산과 12.5㎕의 2xSTC(STC의 2배 농축액)을 잘 혼합한 후 상기에서 만들어진 스페로플라스트를 50㎕ 첨가하고, 상온에서 10분 방치하였다. 500㎕의 PEG/TC 용액(40% PEG-4000, 10mM CaCl2, 10mM Tris-HCl, pH7.5)을 첨가한 후 10분 동안 더 방치시켰다. 원심분리기로 3분 동안 1500rpm에서 원심분리하여 스페로플라스트 침전을 얻고, 이를 200㎕의 1M 소르비톨에 잘 용해시켰다.
7㎖의 재생 아가(regeneration agar, 100㎖당 3g의 박토-아가, 50㎖의 2M 소르비톨 및 0.67g의 아미노산 결핍 효모 질소염기(Difco, U.S.A.), 0.1g의 루이신 결핍 아미노산 공급물, 0.4㎖의 50% 포도당 및 45㎖의 물 함유)와 잘 혼합한 다음, Leu 결핍 소르비톨 플레이트(182g의 소르비톨과 20g의 박토아가, 6.7g의 이미노산 결핍 효모질소기질, 0.25g의 Leu 결핍아미노산 공급물, 4㎖의 5% 트레오닌, 40㎖의 50% 포도당 및 820㎖의 물 함유)에 부어 30℃에서 3 내지 5일 동안 배양하여서, 재조합 플라스미드로 형질전환된 효모 콜로니를 얻었다.
[실시예 3]
[효모에서의 인간 성장 호르몬의 대량발현 및 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동에 의한 확인]
상기의 실시예 2에서 얻어진 발현벡터 pYLBC Alg-UB-CRS-HGH로 형질전환시킨 효모를 루이신 결핍배지(아미노산 결핍 효모질소기질) 6.7g과 루이신이 결핍된 아미노산 혼합물 0.25g 및 6% 포도당)에서 24시간 30℃에서 진탕배양한 후 YEPD 배지에 5% 종배양물이 되도록 접종하였다. 이를 30℃에서 72시간 동안 진탕 배양하였다. 이때 흡광도는 O.D. 650㎚에서 25 정도였으며, 여기서 O.D. 650㎚ 값이 10인 것에 해당되는 효모량을 원심분리시켜 침전물을 얻은 다음 200㎕ TE 완충용액(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA)에 용존시키고, 직경 0.4㎜의 유리 구슬을 같은 부피로 첨가하고 강하게 진탕시켜 세포벽을 파괴한 후 효모추출물을 얻었다. 10㎕의 효모추출물을 램리(Laemmli, Nature 277, 680(1970)) 방법에 따라 15% SDS 폴리 아크릴아마이드 젤에 전기영동 시킨 후, 코마시 브릴리언트 블루 R250(Commassie brilliant blue R250)로 염색한 결과를 제3도에 나타내었다.
제3도에서, 레인 1은 단백질의 표준 분자량(Bio-Rad 사, U.S.A)으로서 위로 부터 97400, 66200, 45000, 31000, 21500 및 14400 달톤이며, 레인 2는 정제된 콜라게네이즈 인지부위를 포함하지 않는 인간 성장 호르몬 표준시료를 나타낸다. 레인 3은 인간 성장 호르몬 유전자를 함유하지 않은 효모의 추출물이다. 레인 4부터 6까지는 콜라게네이즈-인간 성장 호르몬 발현벡터 pYLBC-Alg-UB-CRS-HGH를 함유하는 효모의 추출물로서 각각 24, 48, 72시간뒤에 채취한 시료들이며, 레인 7은 단백질의 표준 분자량(Bio-Rad사, U.S.A.)으로 위로 부터 45380, 29100, 18090, 14400, 5835 및 3035 달톤이다.
제4도에 나타낸 바와 같이, 레인 4에서 6까지의 콜라게네이즈 인지부위-인간 성장 호르몬 발현벡터 pYLBC-Alg-UB-CRS-HGH를 함유하는 효모의 추출물을 전기영동한 결과, 레인 3의 인간 성장 호르몬 유전자를 함유하지 않는 효모의 경우와는 달리, 인간 성장 호르몬 표준시료의 위치, 즉 분자량 22,000 달톤부근에 진한 밴드가 보이고 있고, 예상한대로 콜라게네이즈 인지부위를 포함하지 않는 인간 성장 호르몬 표준시료보다 약 1,000 달톤정도 더 큰 위치에 밴드가 보이고 있음을 알수 있다.
Claims (5)
- A-Pro-X-Gly-Pro-Y-HGH(여기에서 A는 2개 이상의 아미노산 잔기, X 및 Y는 각각 1개의 아미노산 잔기, 및 HGH는 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열임)로 표시되는, 콜라게네이즈 인지부위를 포함하는 재조합 인간 성장 호르몬.
- 제1항의 재조합 인간 성장 호르몬을 코딩하는 유전자.
- 제2항의 유전자를 포함하는 발현벡터 pYLBC-Alg-UB-HGH.
- 발현벡터 pYLBC-Alg-UB-HGH로 형질전환된 효모(KCTC 0097BP).
- 제4항의 미생물을 배양하여 콜라게네이즈 인지부위를 포함하는 재조합 인간 성장 호르몬을 분리한 후 콜라게네이즈로 절단함을 포함하는, 인간 성장 호르몬의 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019930030318A KR100289691B1 (ko) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 콜라게네이즈 인지부위를 가진 재조합 인간 성장 호르몬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019930030318A KR100289691B1 (ko) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 콜라게네이즈 인지부위를 가진 재조합 인간 성장 호르몬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR950018453A KR950018453A (ko) | 1995-07-22 |
| KR100289691B1 true KR100289691B1 (ko) | 2001-05-15 |
Family
ID=37517734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019930030318A KR100289691B1 (ko) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 콜라게네이즈 인지부위를 가진 재조합 인간 성장 호르몬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100289691B1 (ko) |
-
1993
- 1993-12-28 KR KR1019930030318A patent/KR100289691B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR950018453A (ko) | 1995-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR930001117B1 (ko) | Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법 | |
| FI109810B (fi) | Menetelmä rekombinanttiproteiinien entsymaattiseksi pilkkomiseksi käyttämällä IgA-proteaaseja | |
| US6229003B1 (en) | Production of bovine growth hormone by microorganisms | |
| AU614933B2 (en) | Functional DNA block and plasmid coding for hirudin, transformed yeast, method for preparing hirudin, hirudin obtained and its pharmaceutical use | |
| DE69637011T2 (de) | Herstellung enzymatisch aktiver, rekombinanter carboxypeptidase b | |
| JPH08507695A (ja) | Ｅｇ ▲ｉｉｉ▼セルラーゼの精製及び分子クローニング | |
| EP0438200B1 (en) | Method for the expression of heterologous genes in the yeast Pichia pastoris, expression vectors and transformed microorganisms | |
| DE19620649A1 (de) | Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus | |
| DE69115843T3 (de) | Protease aus Bacillus licheniformis | |
| EP1313848B1 (en) | Yeast transformant producing recombinant human parathyroid hormone and method for producing the hormone | |
| JPH05268972A (ja) | Ｄｎａおよびその用途 | |
| KR100289691B1 (ko) | 콜라게네이즈 인지부위를 가진 재조합 인간 성장 호르몬 | |
| US4935351A (en) | Process for preparing oligopeptide | |
| JP2657383B2 (ja) | 新規な加水分解酵素とその製造方法 | |
| DD274053A5 (de) | Verfahren zur Produktion eines menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators | |
| HU197351B (en) | Process for preparing polypeptide from genetically codeable aminoacids | |
| US5296366A (en) | Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant DNA and transformed microorgnaisms | |
| KR100274185B1 (ko) | 유비퀴틴에 융합된 인간 칼시토닌 | |
| KR920001745B1 (ko) | 인간성장호르몬 유전자 발현벡터[pYLBC-A/G-UB-HGH]와 그의 제조방법 | |
| CN1128222C (zh) | 新型分泌表达载体及其在重组水蛭素表达技术中的应用 | |
| KR100260633B1 (ko) | 인간 미드카인 유전자의 발현 벡터 및 효모에서의 그의 발현 | |
| JP2005503141A (ja) | アシル化ポリペプチドを作出するための方法 | |
| KR100284037B1 (ko) | 커큘린의 효모에서의 발현 | |
| KR100274184B1 (ko) | 단백질 감미료에 융합된 인간칼시토닌 | |
| JPH09275987A (ja) | コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のｄｎａ断片、及びこの酵素出現をコントロールするｄｎａ断片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20060105 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |