JPH05130873A - 改変型転写アクチベーターを用いた植物における遺伝子転写の不活性化 - Google Patents

改変型転写アクチベーターを用いた植物における遺伝子転写の不活性化

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JPH05130873A
JPH05130873A JP3232060A JP23206091A JPH05130873A JP H05130873 A JPH05130873 A JP H05130873A JP 3232060 A JP3232060 A JP 3232060A JP 23206091 A JP23206091 A JP 23206091A JP H05130873 A JPH05130873 A JP H05130873A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 転写アクチベータータンパクによって転写が
活性化される植物中の遺伝子の発現を阻害する。 【構成】 目的とする遺伝子の転写アクチベータータン
パクをコードするＤＮＡ配列の一部を改変し、改変型の
タンパクをコードするようにする。改変転写アクチベー
ターは、遺伝子の転写を活性化せずに、遺伝子または細
胞の転写機構のその他の成分に結合し得る。これらの改
変された調節複合体成分をコードする合成ＤＮＡ配列
は、植物細胞中に導入され得、１個またはそれ以上の標
的遺伝子の発現を競合的に阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は人為的に改変した転写ア
クチベーターを用い、植物における遺伝子転写を不活性
化することに関する。
【０００２】
【従来の技術】植物全体の構造および／または機能を改
変するための植物細胞の形質転換においては、遺伝子の
発現を妨げることが、時折望まれる。例えば、発現が花
粉または葯の形成にとって必要であるような遺伝子を妨
げると、雄性不稔が起こる。別の例として、糖からデン
プンへの転化を触媒する酵素をコードする遺伝子の妨害
は、高水準の甘味を有するだけでなく、収穫後も長期に
わたってその甘味を保持するようなスイートコーンを産
するために用いられ得る。さらに別の例として、ジグリ
セロールアシル転移酵素をコードする遺伝子の妨害は、
主として、モノグリセリドおよびジグリセリドからなる
貯蔵脂質を有する植物を産するために用いられ得る。さ
らに別の例では、脂肪酸の延長および／または不飽和化
に起因する酵素をコードする遺伝子を妨げることで、パ
ルミチン酸あるいは飽和脂肪酸に富んだ貯蔵脂質を有す
る植物が生産される。
【０００３】遺伝子が多段階経路によって発現するとい
うことはよく知られており、その１つの段階は、二本鎖
ＤＮＡ配列から相当する一本鎖メッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）配列への転写である。転写の間、遺伝子の
センス鎖は、対となっているアンチセンスから離れてい
る。次いで、酵素が、アンチセンスＤＮＡ鎖の配列に相
補的な、ＲＮＡ分子を組み立てる。このメッセンジャー
ＲＮＡは、最終的に、コードされた情報を読み、そし
て、適切なアミノ酸を続けて配列することにより、コー
ドされたタンパクを形成する、リボソームと呼ばれる細
胞組織に移動する。ＤＮＡ転写を妨害することで、この
プロセスの起点が妨害され、その結果、遺伝子の発現が
効果的に妨害される。このように、例えば、特殊な生化
学的な経路が妨げられているような植物を作ることを望
む場合、このような植物を作る１つの方法としては、こ
の経路における必須の酵素の形成を妨げることが挙げら
れる。酵素は遺伝子の発現の結果として形成されるタン
パク分子であるので、酵素をコードする遺伝子の転写を
妨害すること、あるいはＲＮＡ転写物の翻訳を妨害する
ことによって、全経路を妨害することが可能である。
【０００４】従来、遺伝子の発現はアンチセンス技術の
使用によって妨害され得ることが知られている。アンチ
センスシステムにおいては、アンチセンスＲＮＡ、また
はセンスＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡが作られ、そし
て、それがセンスＲＮＡとハイブリダイズし、そのこと
によって、その通常の機能が不能となる。例えば、いく
つかのプラスミドを複製するにはＲＮＡプライマーが必
要である。二本鎖の状態において、ＲＮＡプライマーは
ＤＮＡ複製を開始し得ない。なぜなら、プライマーはそ
のプラスミドの複製起点と対になり得ないからである。
アンチセンスＲＮＡの効用は、ＤＮＡ複製の調節だけで
はない。その効用はまた転写および翻訳の調節にまで及
ぶ。転写の間に、遺伝子産物をコードするメッセンジャ
ーＲＮＡは、構造遺伝子から生ずる。この細胞が遺伝子
のセンスＤＮＡ鎖からアンチセンスＲＮＡを転写すると
きもまた、アンチセンスＲＮＡはセンスメッセンジャー
ＲＮＡと特異的に結合し得、そして、リボソームがコー
ドされた情報をタンパクに翻訳することを防ぎ得る。こ
の技術の使用の例は、１９９０年７月２４日に発行さ
れ、そしてＣａｌｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．に譲渡された、Ｈ
ｏｕｃｋらの米国特許第４，９４３，６７４号において
見いだされ得る。しかし、アンチセンスの効力には限界
がある。なぜなら、それは、細胞中における翻訳に有効
である特定のＲＮＡ配列の量を単に減じるのみでその作
用を全く妨害するわけではないからである。それゆえ
に、遺伝子の発現をより効果的に妨害する新しい方法が
必要とされ続けている。
【０００５】互いに整合的な調節された遺伝子の完全な
セットの発現を妨害することもまた、いくつかの例にお
いて望ましい。このような例においては、アンチセンス
技術の使用は、極端に複雑になる。なぜなら、アンチセ
ンス分子は、非常に特異的である。すなわち、それは１
個の相補的なＲＮＡ配列にのみ結合し、従って、１つの
遺伝子の発現にのみ影響を及ぼす。互いに整合的な調節
された遺伝子のセットの発現を完全に妨害するために、
このセット中の各遺伝子、あるいはこのセットの調節タ
ンパクのためのアンチセンス分子を生ずることが必要で
ある。このような場合、１つの遺伝子の改変で、発現を
ブロックすることが望ましい。
【０００６】真核性の遺伝子の転写は、種々の調節要素
によって影響を受け、そして、その調節要素は、配列特
異的にＤＮＡと結合する転写調節タンパクを包含する。
これらのタンパクの多くが同定された。これらのタンパ
クの配列特異的な結合が満たされる手法は、いくつかの
カテゴリーに分類され得る。最近の総説記事として記載
された、当業者には公知の、ＪｏｈｎｓｏｎらのＡｎｎ
ｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：７９９−８
３９（１９８９）に開示されたように、このカテゴリー
は以下を包含している： −２本のαヘリックス分節が、比較的シャープなβター
ンによって分離される、ヘリックス・ターン・ヘリック
ス構造の認識および結合； −タンパク中の反復配列が亜鉛イオンを封鎖して、ＤＮ
Ａと相互に作用するループを形成する、亜鉛フィンガー
の認識および結合； −７個のロイシン残基の配列が二量体化のためのからみ
合うらせん構造を提供する、ロイシンジッパーの認識お
よび結合。この二量体化によって、塩基性の領域は特定
のＤＮＡ配列との相互作用のために「ジッパー」から二
量体のＮ−末端方向へ向けられる； −塩基性領域がロイシンジッパー機構と同様に配向され
るが、二量体化はループによって分離された２本のαら
せん構造の相互作用によって起こる、ヘリックス・ルー
プ・ヘリックスの認識および結合；および −分類されていない結合システム。
【０００７】同様に、活性化ドメインは酸性残基、グル
タミン残基、またはプロリン残基が豊富にあるものとし
て分類され得る。このことはＭｉｔｃｈｅｌｌらによる
Ｓｃｉｅｎｃｅ，４５：３７１−３７８（１９８９）に
詳細に論ぜられている。
【０００８】優性トランス作用インヒビターは酵母およ
び哺乳類の細胞において転写アクチベーターをコードす
る遺伝子によって確認された。このインヒビターの作用
は瞬間的アッセイにおいて異種レポーター遺伝子を用い
て証明された。
【０００９】植物においては、トウモロコシの天然の変
異対立遺伝子（Ｃ−Ｉ）が、転写アクチベーターへの効
果を経て作用するアントシアニン生合成のインヒビター
をコードすることが仮定されている。合成Ｃ−Ｉ構築物
は、Ｇｏｆｆら、（Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎ
ｅｗｓｌｅｔｔｅｒ， ６４， ６）によって報告さ
れ、異種のレポーターとして外因性のプラスミドに由来
するルシフェラーゼを用いるトランスアクチベーション
アッセイにおいて、Ｂｚｌ：：ルシフェラーゼの活性を
阻害するとされている。インビトロで構築された優性ト
ランス作用インヒビター遺伝子を用いた植物染色体の遺
伝子の阻害については、現在まで報告されていない。
【００１０】
【発明の構成】本発明の方法は、転写が転写アクチベー
タータンパクによって活性化される植物のゲノムにおけ
る遺伝子の発現を阻害する方法であって、実質的に該遺
伝子の転写アクチベーターのアミノ酸配列を有するが、
少なくとも１個のアミノ酸が該遺伝子の転写アクチベー
ターのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタ
ンパクを該遺伝子の環境中に導入し、そのことにより、
該タンパクが該遺伝子の転写を活性化し得なくなる工程
を包含する。
【００１１】好適な実施態様においては、この方法にお
いて、上記タンパクは、認識ドメインおよび活性化ドメ
インを有し、この認識ドメインは、実質的に上記遺伝子
の転写アクチベーターの認識ドメインのアミノ酸配列を
有し、そして、この活性化ドメインは、少なくとも１個
のアミノ酸がこの遺伝子の転写アクチベーターの活性化
ドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有す
る。
【００１２】好適な実施態様においては、この方法にお
いて、上記タンパクは、認識ドメインおよび活性化ドメ
インを有し、この活性化ドメインは、実質的に上記遺伝
子の転写アクチベーターの活性化ドメインのアミノ酸配
列を有し、そして、この認識ドメインは、少なくとも１
個のアミノ酸がこの遺伝子の転写アクチベーターの認識
ドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有す
る。
【００１３】本発明のＤＮＡ配列は、植物ゲノムにおけ
る遺伝子の転写アクチベーターのアミノ酸配列を実質的
に有するタンパクを実質的に単独でコードするＤＮＡ配
列であって、しかしこの転写アクチベーターをコードす
る配列とは少なくとも１個の塩基対が異なるコード配列
を有し、その結果、該タンパクが遺伝子の転写アクチベ
ーターのアミノ酸配列とは少なくとも１個のアミノ酸が
異なるアミノ酸配列を有する。
【００１４】好適な実施態様においては、このＤＮＡ配
列において、上記コード配列は、１つの塩基対の付加ま
たは欠損によって転写アクチベーターをコードする配列
とは異なり、その結果、この付加または欠損の位置より
下流に、コード配列のフレームシフトが存在する。
【００１５】好適な実施態様においては、このＤＮＡ配
列は、（ａ）植物遺伝子の転写アクチベーターの認識ド
メイン；および（ｂ）少なくとも１個のアミノ酸が植物
遺伝子転写アクチベーターの活性化ドメインとは異なる
活性化ドメイン；で実質的になるタンパクを実質的に単
独でコードする。
【００１６】さらに好適な実施態様においては、このＤ
ＮＡ配列は、上記活性化ドメインをコードする前記配列
は、１個またはそれ以上のコドンの欠損、付加、または
置換により、天然の活性化ドメインの天然の配列とは異
なり、そのことにより前記タンパクの活性化ドメイン
は、１個またはそれ以上のアミノ酸の欠損、付加、また
は置換によって天然の活性化ドメインとは異なる。
【００１７】本発明のＤＮＡ配列はまた、植物遺伝子転
写アクチベータータンパクの認識ドメインを唯一の遺伝
子生産物として有する。
【００１８】本発明のタンパクは、植物遺伝子転写アク
チベータータンパクの認識ドメインで実質的になる。
【００１９】本発明の発現カセットは、植物細胞におけ
る前記ＤＮＡ配列の発現を引き起こす植物調節配列に作
動可能に連結した、上記のＤＮＡ配列を有する。
【００２０】本発明の細菌の形質転換用ベクターは、細
菌細胞中で前記発現カセットの複製を引き起こす細菌発
現調節配列に作動可能に連結した、上記の発現カセット
を有する。
【００２１】本発明の細菌細胞は、上記の細菌の形質転
換用ベクターの少なくとも１個のコピーを外来プラスミ
ドとして含有している。
【００２２】本発明の形質転換植物細胞は、上記の発現
カセットのＤＮＡ配列の少なくとも１個のコピーを外来
ＤＮＡとして含有している。
【００２３】本発明のトウモロコシの細胞または組織培
養物は、上記の形質転換植物細胞を包含する。
【００２４】本発明の形質転換されたトウモロコシ植物
体は、上記の発現カセットのＤＮＡ配列の少なくとも１
個のコピーを外来ＤＮＡとして含有している。
【００２５】遺伝子の発現は、ＤＮＡ上の特定の部位に
結合する調節タンパクによって制御され得る。これらの
タンパクは転写を増加するかまたは減少するかによっ
て、アクチベーターまたはリプレッサーと呼ばれる。あ
る種のタンパクは両方の機能を果たし得る。理論によっ
て制限するわけではないが、アクチベーターは、ＤＮＡ
配列上の特定の認識部位に結合することによって機能し
ているようである。この１つあるいは複数の部位は、配
列の点から遺伝子に接近しているか、あるいはＤＮＡの
ループによって配列の離れた領域が互いに物理的に接近
できるので、ゲノムからかなりの距離であり得る。１種
またはそれ以上の転写アクチベーター因子の結合が、Ｒ
ＮＡポリメラーゼとそれに結合するタンパクを含む活性
型転写複合体の形成を可能にする。この複合体が形成す
ると、転写が開始される。
【００２６】転写アクチベーターをコードする遺伝子
が、インビトロにおいて改変または変異導入され得、そ
の結果、この遺伝子は以下のようなタンパクをコードす
ることも発見されている。これらのタンパクは、植物中
で１あるいは複数の標的遺伝子の発現を競合的に阻害す
るように転写複合体の１種またはそれ以上の成分とさら
に結合している。この阻害活性は、選択された転写アク
チベーターによる整合的な調節に供する遺伝子の完全な
セットにまで及ぶ。植物におけるこれらのインヒビター
の活性は、トウモロコシの内因性アントシアニン生合成
遺伝子を用いて、最近確立された。これらの結果に基づ
いて、本発明は、トウモロコシ、サトウモロコシ、コム
ギ、ライコムギ、オオムギ、オートムギ、イネ、ダイ
ズ、アルファルファ、タバコ、カノラ、ヒマワリおよび
トマトを包含し、これらに限定されず、すべての単子葉
植物種または双子葉植物種においても満足され得ること
が認められている。
【００２７】したがって、本発明は植物のゲノムにおけ
る１またはそれ以上の遺伝子の発現を阻害する方法を提
供する。この方法は、実質的に遺伝子の転写アクチベー
ターのアミノ酸配列を有するが、遺伝子の転写アクチベ
ーターのアミノ酸配列とは少なくとも１個のアミノ酸で
異なるアミノ酸配列を有するタンパクを植物遺伝子の環
境中に導入する工程を含む。そのことにより、このタン
パクが遺伝子の転写を活性化し得なくなる。好ましい実
施態様において、このタンパクは、このタンパクをコー
ドするＤＮＡ配列を植物細胞中に導入することによって
植物遺伝子の環境に導入される。
【００２８】本発明の遺伝子不活性化システムは、メン
デル優性のさらなる利点を提供する。そして、これは雑
種作物の開発および生産において有用となる。
【００２９】（転写アクチベーターの改変）多くの転写
アクチベーターは、２つの異なるドメイン；すなわち、
それによって、アクチベーターがＤＮＡを認識してＤＮ
Ａと結合する、認識ドメイン；およびＲＮＡポリメラー
ゼのような、転写機構１またはそれ以上の成分の結合ま
たは活性を多少なりとも増強する、活性化ドメイン、と
を有する。
【００３０】上記で述べられているように、ＤＮＡまた
は転写複合体の１またはそれ以上の成分に結合するが転
写を活性化しないリプレッサータンパクを産生する、あ
る種の天然の突然変異体が同定された。いくつかの例の
これらのタンパクの分析によって、この分子の活性化ド
メインの中または近くで、負の電荷の量を減少するある
種のアミノ酸置換が見られた。したがって、活性化ドメ
インは、例えば、酵母におけるＧＡＬ４融合のようなト
ランス−アクチベーションアッセイを用いて、機能的に
同定され得る。タンパクのこのような情報および／また
はアミノ酸配列によって、活性化ドメインにおける改変
の結果として生じる特定の改変を、設計し得る。これら
の構造的な改変および対応する遺伝子配列の変化によっ
て、遺伝子は、それが細胞中に導入されたとき、改変転
写アクチベータータンパクを産生するように合成され得
る。いくつかの例において、転写アクチベーターの構造
の情報または構造上関連した転写アクチベーターが知ら
れており、そして、その情報に基づいて改変が行われ
る。このように、本発明は以下の（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）および（ｄ）の工程を包含する方法によって実施
される：（ａ）遺伝子の転写アクチベータータンパク、
すなわち、認識ドメインおよび活性化ドメインを有する
タンパクを単離し、構造または配列を特徴づける工程；
（ｂ）タンパクのアミノ酸配列を改変して、遺伝子の転
写を活性化する能力を減少させる工程；（ｃ）改変型タ
ンパクをコードするＤＮＡ配列を提供する工程；および
（ｄ）植物細胞中にＤＮＡ配列を導入し、そのことによ
り、改変型タンパクが発現して、遺伝子の転写を妨害す
る工程。
【００３１】理論によって制限するわけではないが、改
変型転写アクチベーターが転写を妨害するよう作用し得
る、多くのメカニズムがある。転写を活性化することな
くＤＮＡと結合することによって、通常の認識ドメイン
を有する改変型タンパクは、本来の転写アクチベーター
と競合し、そして、その標的の結合部位を占領する。本
発明のインヒビターが作用し得る第２のメカニズムは、
天然の転写アクチベーターと結合して、不活性な二量体
またはヘテロ二量体を形成することである。これらの目
的のための好ましいタンパクは、天然の転写アクチベー
ターの活性化ドメインを単に欠損させることにより構築
され得、そして、本質的に認識ドメインおよび活性化ド
メインの両方を有する植物遺伝子転写アクチベータータ
ンパク由来の認識ドメインからなる。
【００３２】第３の方法はＤＮＡ分子の隣接部位に結合
することによるものであり、その結果、本来の転写アク
チベーターとのタンパク同士の相互作用が、このアクチ
ベーターが転写複合体と結合するのを防ぐ。第４のメカ
ニズムは、転写のスタート部位、またはその近くで、遺
伝子と結合することにより、転写複合体と遺伝子との相
互作用を妨害することである。これらの後の２つのメカ
ニズムには、天然の転写アクチベーターとは異なる認識
ドメインを有するタンパクが必要である。このことは天
然の転写アクチベーターをコードする遺伝子の、１個ま
たはそれ以上のコドンの付加、欠損、または置換によっ
て成し遂げられ得る。それによって、天然の転写アクチ
ベーターと比べて、その配列中に少なくとも１個の付加
されているか、欠損しているか、または異なっているア
ミノ酸を有する遺伝子産物が産生される。
【００３３】本発明の方法は、上記で述べられているよ
うな、認識および結合の方法にかかわらず、調節タンパ
クに適用し得る。第５のメカニズムには、酸性の活性化
ドメインの過剰発現が必要であり、これによって転写ア
クチベーターの標的を中和してしまう。この現象は酵母
および哺乳類の細胞において観察され、「スケルチング
（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）」と呼ばれている。例えば、
Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ， ３３５：６８３−６
８９ （１９８８）；およびＰｔａｓｈｎｅら，Ｎａｔ
ｕｒｅ， ３４６：３２９−３３１ （１９９０）を参
照のこと。このメカニズムは、以下の実施例３５−３７
に示されているように、現在、植物細胞で実行されてい
る。
【００３４】
【実施例】以下の実施例は本発明を例示することを意図
するものであり、それらを限定するものではない。
【００３５】（実施例１）ｐＰＨＩ２８９ プラスミドｐＰＨＩ２８９は、単子葉植物において用い
られる空の発現カセットであって、ｐＵＣ１８プラスミ
ド由来であり、以下を含んでいる。すなわち、カリフラ
ワーモザイクウイルスの−４２１位から＋２位のヌクレ
オチドであり、その内、−４２１位から−９０位の領域
は２つ縦列につながっている増強された３５Ｓプロモー
ター；Ｇａｌｌｉｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：３２５７（１９８７）に記載
のタバコモザイクウイルスの５’リーダー配列でｐＪＩ
Ｉ１０１由来の７９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｌ１断
片；Ｄｅｎｎｉｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，１２：３９８３（１９８４）に記載の
トウモロコシＡｄｈ１−Ｓ由来の第１のイントロンの５
７９ｂｐの断片；および、Ａｎら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ
ｌ，１：１１５−１２２（１９８９）に記載のポテトプ
ロテアーゼインヒビターＩＩ遺伝子由来のポリアデニル
化部位の断片である。本発明の改変型タンパクをコード
する遺伝子は、細菌中または植物中で、発現させるため
にこのベクター中に挿入され得る。
【００３６】（実施例２）ｐＰＨＩ４１４ プラスミドｐＰＨＩ４１４は、単子葉植物において用い
られる空の発現カセットであって、ｐＵＣ１８プラスミ
ド由来であり以下を含んでいる。すなわち、カリフラワ
ーモザイクウイルスの−４２１位から＋２位のヌクレオ
チドであり、その内、−４２１位から−９０位の領域は
２つ縦列につながっている増強された３５Ｓプロモータ
ー；タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列である
ｐＪＩＩ１０１由来の７９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａ
ｌ１断片；トウモロコシＡｄｈ１−Ｓ由来の第１のイン
トロンである５７９ｂｐの断片；およびＢｅｖａｎら，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
１：３６９（１９８３）に記載のノパリンシンターゼ遺
伝子由来のポリアデニル化部位の２８１ｂｐの断片であ
る。本発明の改変型タンパクをコードする遺伝子は、細
菌または植物のいずれかにおいて、発現するためにこの
ベクター中に挿入され得る。
【００３７】（実施例３）ｐＰＨＩ４４３ プラスミドｐＰＨＩ４４３は、ｐＵＣ１８プラスミドで
あり以下を含んでいる。すなわち、カリフラワーモザイ
クウイルスの−４２１位から＋２位のヌクレオチドであ
り、その内、−４２１位から−９０位の領域は２つ縦列
につながっている増強された３５Ｓプロモーター；タバ
コモザイクウイルスの５’リーダー配列であるｐＪＩＩ
１０１由来の７９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｌ１断
片；トウモロコシＡｄｈ１−Ｓ由来の第１のイントロン
である５７９ｂｐの断片；Ｒ ｃＤＮＡである２４１５
ｂｐのＸｂａ１断片；およびｐＴｉＴ３７におけるノパ
リンシンターゼ遺伝子由来のポリアデニル化部位の２８
１ｂｐの断片である。この構築物は、Ｌｕｄｗｉｇら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：４４９−４５０（１９９０）
において用いられた。
【００３８】（実施例４）ｐＰＨＩ４６６ ｐＰＨＩ４４３のＲ ｃＤＮＡを、ＰＣＲの鋳型として
用いた。使用されたオリゴヌクレオチドは、Ｒ遺伝子の
５’末端にＮｃｏＩ部位を導入した。得られた配列を、
その末端を修復して、そして、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩ
Ｉ部位に挿入した。
【００３９】（実施例５）ｐＰＨＩ４６７ このベクターは、Ｒ遺伝子を反対向にクローン化した以
外は、ｐＰＨＩ４６６と同様に調製された。
【００４０】（実施例６）ｐＰＨＩ４７０ ＤＰ４６６由来のＲ遺伝子の２７０ｂｐのＮｃｏＩ／Ｓ
ｍａＩ断片を、ＤＰ４１４のＮｃｏＩ／ＨｐａＩ部位に
クローン化した。
【００４１】（実施例７）ｐＰＨＩ４７１ ＮｃｏＩ断片に含有されるＤＰ４６６由来のＲ遺伝子の
１．５ｋｂの５’領域を、ＤＰ４７０のＮｃｏＩ部位に
クローン化した。Ｒ遺伝子の再構築において得られた構
築物（センス型）を、単離し、そして、実施例２８−３
７の実験において用いた。
【００４２】（実施例８）ｐＰＨＩ４７２ このベクターは、１．５ｋｂ断片をアンチセンス方向で
クローン化した以外は、ｐＰＨＩ４７１と同様に調製さ
れた。
【００４３】（実施例９）ＤＰ５４２ プラスミドｐＰＨＩ５４２は、単子葉植物において用い
られる空の発現カセットである。これは、ＮｏｔＩ制限
部位が植物転写ユニットの下流に付加された以外は、ｐ
ＰＨＩ２８９と同一である。本発明の改変型タンパクを
コードする遺伝子は、このベクターに挿入され得、バク
テリアまたは植物のいずれかにおいて、発現する。
【００４４】（実施例１０）ＤＰ６３０ ベクターＤＰ４７１を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消
化し、完全なＲ遺伝子を含有する１．８ｋｂ断片を得
た。これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位にクローン
化した。得られたベクターを、単離し、そして、ＤＰ６
３０と名付けた。
【００４５】（実施例１１）ＤＰ６６３ ＤＰ６３０を、部位特異的変異導入に供し、Ｒ遺伝子の
１０６６位のＧ残基をＡに改変した。この改変によっ
て、ＢｓｐＨＩ部位が導入され、そして遺伝子産物のア
ミノ酸３５６位でのアラニンからスレオニンへの改変を
導いた。
【００４６】（実施例１２）ＤＰ６６４ ｐｃＬＣ２８．２を、ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化
し、そして、完全なＣ１遺伝子を含有する得られた１．
０ｋｂの断片を、ベクターｐＩＣ２０Ｈ中にクローン化
することにより［Ｍａｒｓｈら，Ｇｅｎｅ，３２：４８
１−４８５（１９８４）］、ＤＰ６６４を作成した。
【００４７】（実施例１３）ＤＰ６６５ ＤＰ６６４をＢａｍＨＩで消化し、１．０２９ｋｂのＣ
１断片を得、それを、ＢａｍＨＩ消化したＤＰ５４２に
クローン化した。このＣ１はプロモーターおよびターミ
ネーション配列に関してセンス方向で存在させた。この
構築物を実施例２８−３７の実験において用いた。
【００４８】（実施例１４）ＤＰ６６９ このベクターは、１．０２９ｋｂＣ１断片をアンチセン
ス方向でクローン化した以外はＤＰ６６５と同様に調製
した。この構築物を実施例３２の実験において用いた。
【００４９】（実施例１５）ＤＰ６８０ ＤＰ６６４をＸｈｏＩで消化し、そして、その末端を、
ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて修復した。
次いで、得られた混合物をＢａｍＨＩで消化し、そし
て、得られたＣ１遺伝子の８０１ｂｐの断片を、Ｂａｍ
ＨＩおよびＢａｌＩで消化したＤＰ５４２中にクローン
化した。得られた改変型Ｃ１遺伝子産物は、アミノ酸２
５８位で終結した。
【００５０】（実施例１６）ＤＰ６９２ 次の実施例のＤＰ６９３をＢｓｐＨＩおよびＨｉｎｃＩ
Ｉで分解し、Ｒ遺伝子の３’領域を含む７７９ｂｐ断片
（Ｒ−Ｉ）を作成した。これをＤＰ５４２のＮｃｏＩ／
ＨｐａＩ部位にクローン化し、ＤＰ６９２を製造した。
この構築物を実施例２９の実験において用いた。
【００５１】（実施例１７）ＤＰ６９３ ＤＰ６６３をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した。得
られた１．８ｋｂのＲ遺伝子断片をｐＵＣ１８のＢａｍ
ＨＩ／ＸｂａＩ部位にクローン化した。
【００５２】（実施例１８）ＤＰ７４８ ８００ｂｐのＧＡＬ４／ＴＦＥ３融合遺伝子を含むＧＡ
Ｌ４Λ３−Δ２プラスミド（Ｂｅｃｋｍａｎｎら，Ｇｅ
ｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：１６７
−１７９（１９９０））をＢｇｌＩＩ／ＳｍａＩ消化し
た。得られた断片をＤＰ２８９のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ
部位にクローン化し、ＤＰ７４８を作成した。この構築
物を実施例３７の実験に用いた。
【００５３】（実施例１９）ＤＰ７５２ ＤＰ６８０をＸｍａＩＩＩで消化し、そして、その末端
をＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて修復し
た。次いで、得られた混合物をＢａｍＨＩで分解し、そ
して、得られた断片をＤＰ５４２のＢａｍＨＩ／Ｂａｌ
Ｉにクローン化して、ＤＰ７５２を作成した。得られた
Ｃ１遺伝子産物は、アミノ酸１４０位で終結した。この
構築物を実施例３１の実験において用いた。
【００５４】（実施例２０）ＤＰ７９１ Ｍｕｒｒｅら，Ｃｅｌｌ，５８：５３７−５４４（１９
８９）に記載されたＥ１２ＲプラスミドＤＮＡをＮｃｏ
ＩおよびＥｃｏＲＩで分解し、そして、その末端をＤＮ
Ａポリメラーゼのクレノー断片を用いて修復した。得ら
れた１．３ｋｂ断片をＤＰ５４２のＮｃｏＩ／ＨｐａＩ
部位にクローン化して、ＤＰ７９１を作成した。実施例
３３の実験においてこの遺伝子を用い、その結果を、図
に例示した。
【００５５】（実施例２１）ＤＰ７９２ Ｍｕｒｒｅら，Ｃｅｌｌ，５８：５３７−５４４（１９
８９）に記載されたＥ４７ＳプラスミドＤＮＡをＮｃｏ
ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして、その終端をＤＮ
Ａポリメラーゼのクレノー断片を用いて修復した。得ら
れた４００ｂｐの断片をＤＰ５４２のＮｃｏＩ／Ｈｐａ
Ｉ部位にクローン化して、ＤＰ７９２を作成した。実施
例３４の実験においてこの遺伝子を用い、その結果を図
に例示した。
【００５６】（実施例２２）ＤＰ１２０２ ＤＰ６３０を部位特異的変異導入し、Ｒ遺伝子の１２６
４位と１２７０位との間の配列を、ＣＧＡＡＡＧＣから
ＧＧＴＡＣＣＧへと改変した。この改変によりＫｐｎＩ
部位が導入され、そして、アミノ酸配列は天然のＲ遺伝
子の塩基性のＤＮＡ結合領域の中のＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇが、改変された遺伝子産物ではＧｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｙに改変される。
【００５７】（実施例２３）ＤＰ１２０６ ＤＰ６３０を部位特異的変異導入し、Ｒ遺伝子の１２６
５位と１２７２位との間の配列を、ＧＡＡＡＧＣＧＡか
らＡＧＡＡＡＣＴＧへと改変した。この改変により、Ａ
ｌｗＮＩ部位が導入され、そして、アミノ酸配列は、天
然のＲ遺伝子の塩基性のＤＮＡ結合領域におけるＡｒｇ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇから、改変された遺伝子産物ではＧｌ
ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕに改変される。
【００５８】（実施例２４）ＤＰ１２０９ Ｓａｄｏｗｓｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：５６３−
５６４（１９８８）に記載の１ｋｂのＧＡＬ４／ＶＰ１
６融合遺伝子を含むプラスミドをＢａｍＨＩで消化し
た。得られた断片をＤＰ２８９のＢａｍＨＩ部位にクロ
ーン化して、ＤＰ１２０９を作成した。この構築物を実
施例３６の実験において用いた。
【００５９】（実施例２５）ＤＰ１２１１ １ｋｂのＧＡＬ４／Ｃ１融合遺伝子を含むプラスミドを
ＢａｍＨＩで消化した。得られた断片をＤＰ２８９のＢ
ａｍＨＩ部位にクローン化して、ＤＰ１２１１を作成し
た。この構築物を実施例３５の実験において用いた。
【００６０】（実施例２６）ＤＰ１２１６ ＤＰ１２０２をＭｌｕＩおよびＢｃｌＩで消化した。得
られた８５８ｂｐの断片を、ＤＰ４７１のＭｌｕＩ／Ｂ
ｃｌＩ部位にクローン化して、塩基性領域が変異してい
るＲ遺伝子を再構築した。得られたベクターは、ＤＰ１
２１６と命名した。
【００６１】（実施例２７）ＤＰ１２１７ ＤＰ１２０６をＭｌｕＩおよびＢｃｌＩで消化した。得
られた８５８ｂｐの断片を、ＤＰ４７１のＭｌｕＩ／Ｂ
ｃｌＩ部位にクローン化して、塩基性領域が変異してい
るＲ遺伝子を再構築した。得られたベクターは、ＤＰ１
２１７と命名した。
【００６２】（実施例２８）遺伝子発現の阻害 ［試料の調製］プラスミドＤＮＡはアルカリ溶菌および
ＰＥＧ沈澱によって大腸菌から精製した。Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社製のタングステン粒子（平均直
径１．２ミクロン）をエタノール中で４回から５回洗浄
し、そして、４．３７５ｍｇずつをマイクロヒュージ
（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）チューブ中で、蒸発させた。１
０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中１０μｇの全ＤＮＡを
含有し、上記実施例の実験構築物を含む、ＤＮＡ調製物
をこの粒子に加えた。各ＤＮＡ調製物はＤＰ６６５（下
記以外の０．５μｇ）およびＤＰ４７１を含有してい
た。すべての調製物は３５Ｓプロモーター／エンハンサ
ー配列の同数のコピーを含有し、３５Ｓ構築物に結合す
る転写因子の滴定に差が生じるのを避けた。さらに３５
Ｓ配列が必要な場合、ＰｉｏｎｅｅｒＨｉ−Ｂｒｅｄ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．によって開発さ
れ、Ｌｕｄｗｉｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：４４９
−４５０（１９９０）に記載されている「ブランク」３
５Ｓ：：ＧＵＳのｐＰＨＩ４５９構築物によって供給し
た。全てのプラスミドは、ほぼ同じサイズであった。Ｄ
ＮＡをこの粒子に加えた後、この粒子を短音波処理によ
り再懸濁し、次いで、２５μＬの２．５ＭＣａＣｌ2お
よび１０μＬの０．１Ｍスペルミンをこの調製物に加
え、さらに短音波処理を施した。この粒子を沈澱させた
後、３０μＬの上澄み液を除去した。
【００６３】［組織の調製］フィールドコーンを代表す
るトウモロコシハイブリッド（遺伝子型ｃ ｒ−ｒＢ−
ｂ ｐｌ）由来のトウモロコシ胚形成懸濁細胞３−４４
−６Ｅ１をＭＳ塩およびビタミン類、０．１ｇ／Ｌのミ
オイノシトール、２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、および３０
ｇ／Ｌのスクロースを含有する培地中で増殖させた。サ
ンプリング前に、この懸濁液をフィルターを通して選別
し、重量を測り、同様の培地に３％のＰＥＧ（ｗ／ｖ）
を加えた培地中で、２５ｍｇ／ｍＬの密度で再懸濁し
た。細胞をその培地中で一晩、標準的な成育条件下でイ
ンキュベートした。次の日、６×２ｃｍペトリ皿に１ｍ
Ｌの変法ＭＳ培地であらかじめ湿らせておいた２枚のワ
ットマン６１７ろ紙上に、この細胞を１ｍＬずつ置い
た。
【００６４】各試料細胞に、この実験混合物を含有する
粒子の１μＬを１回砲撃し、３個の試料細胞に、各ＤＮ
Ａ調製物を別々に砲撃し、１回の処理に付き３種類を提
供した。
【００６５】砲撃後、１ｍＬの変法ＭＳ培地を各試料に
加え、そして、この試料を暗所で３℃で２−３日インキ
ュベートした。４−６時間以内で全ての試料について、
赤い細胞を数えた。その結果は１個の調製物に対する３
個の試料の全てを合計し、砲撃による誤差を最小にし
た。
【００６６】（実施例２９）前述の一般の実験方法を用
いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．０２μｇ
から５μｇで変化させ、かつ、ＤＰ６９２含有量を０か
ら５μｇで変化させた。その結果を図２８（Ａ）のグラ
フに示す。
【００６７】（実施例３０）前述の一般的な実験方法を
用いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．０２μ
ｇから５μｇで変化させ、かつ、ＤＰ４７２含有量を０
から５μｇで変化させた。その結果を図２８（Ｂ）のグ
ラフに示す。
【００６８】これらの２つの実施例の結果より、アンチ
センスのＲを発現するＤＰ４７２が、改変型Ｒ（Ｒ−
Ｉ）を発現するＤＰ６９２より、５倍から２０倍効果が
低いことを示す。改変型Ｒ転写アクチベーター（Ｒ−
Ｉ）の場合、遺伝子発現の１００％阻害が得られたが、
アンチセンスＲによっては１００％阻害は得られえなか
った。このことはまた、図２９（Ａ）のグラフにおい
て、図示されている。
【００６９】（実施例３１）前述の一般的な実験方法を
用いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．５μｇ
に固定し、かつ、ＤＰ７５２含有量を０から５μｇに変
化させた。
【００７０】（実施例３２）ＤＮＡ調製物のＤＰ６６５
含有量が０．３μｇである以外は前述の一般的な実験方
法を用いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．５
μｇに調整した。ＤＰ６６９含有量を０から５μｇで変
化させた。この実施例およびその前の実施例の結果を、
図２９（Ｂ）のグラフに示す。このＣ−Ｉ構築物（ＤＰ
７５２）は、アンチセンス構築物（ＤＰ６６９）より、
少なくとも１０倍効果的であった。
【００７１】（実施例３３）前述の一般的な実験方法を
用いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．５μｇ
に固定し、かつ、ＤＰ７９１含有量を０から９μｇで変
化させた。
【００７２】（実施例３４）前述の一般的な実験方法を
用いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．５μｇ
に固定し、かつ、ＤＰ７９２含有量を０から９μｇで変
化させた。この実施例およびその前の実施例の結果を図
３０に示す。これらの結果から、ヘリックス・ループ・
ヘリックスドメインおよびヒトＥ４７Ｓタンパクの隣接
塩基性領域を発現する構築物（ＤＰ７９２）がＲ−Ｉを
発現する構築物である。ＤＰ６９２とほぼ同様に効果的
にアントシアニン生合成を阻害することが示される。Ｅ
１２Ｒを発現する構築物（ＤＰ７９１）は、インヒビタ
ーとしては効果的ではない。
【００７３】（実施例３５）前述の一般的な実験方法を
用いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．５μｇ
に固定し、かつ、ＤＰ１２１１含有量を０から９μｇで
変化させた。
【００７４】（実施例３６）前述の一般的な実験方法を
用いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．５μｇ
に固定し、かつ、ＤＰ１２０９含有量を０から９μｇで
変化させた。
【００７５】（実施例３７）前述の一般的な実験方法を
用いた。ＤＮＡ調製物のＤＰ４７１含有量を０．５μｇ
に固定し、かつ、ＤＰ７４８含有量を０から９μｇで変
化させた。この実施例およびその前の２つの実施例の結
果を図３１に示す。これらの結果から、強酸性の活性化
ドメインを発現する構築物の存在下では、アントシアニ
ン生合成もまた阻害されるということが示される。この
ことは、酵母および哺乳類細胞において起こると仮定さ
れ、そして、“スケルチング”と呼ばれている阻害のメ
カニズムを植物において、例示している。
【００７６】前述の発明は明白さおよび理解のために例
示および実施例によって詳細に記載したが、ある種の変
化および改変が、添付された請求項の範囲内で当業者に
よって実施され得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
図において、以下に示す記号が用いられる： Ｂ ＢａｍＨＩ Ｂｃ ＢｃｌＩ Ｂｇ ＢｇｌＩＩ Ｅ ＥｃｏＲＩ Ｈ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｘ ＸｂａＩ
【図１】ｐＰＨＩ２８９のプラスミド地図を表す。
【図２】ｐＰＨＩ４１４のプラスミド地図を表す。
【図３】ｐＰＨＩ４４３のプラスミド地図を表す。
【図４】ｐＰＨＩ４６６のプラスミド地図を表す。
【図５】ｐＰＨＩ４６７のプラスミド地図を表す。
【図６】ｐＰＨＩ４７０のプラスミド地図を表す。
【図７】ｐＰＨＩ４７１のプラスミド地図を表す。
【図８】ｐＰＨＩ４７２のプラスミド地図を表す。
【図９】ＤＰ５４２のプラスミド地図を表す。
【図１０】ＤＰ６３０のプラスミド地図を表す。
【図１１】ＤＰ６６３のプラスミド地図を表す。
【図１２】ＤＰ６６４のプラスミド地図を表す。
【図１３】ＤＰ６６５のプラスミド地図を表す。
【図１４】ＤＰ６６９のプラスミド地図を表す。
【図１５】ＤＰ６８０のプラスミド地図を表す。
【図１６】ＤＰ６９２のプラスミド地図を表す。
【図１７】ＤＰ６９３のプラスミド地図を表す。
【図１８】ＤＰ７４８のプラスミド地図を表す。
【図１９】ＤＰ７５２のプラスミド地図を表す。
【図２０】ＤＰ７９１のプラスミド地図を表す。
【図２１】ＤＰ７９２のプラスミド地図を表す。
【図２２】ＤＰ１２０２のプラスミド地図を表す。
【図２３】ＤＰ１２０６のプラスミド地図を表す。
【図２４】ＤＰ１２０９のプラスミド地図を表す。
【図２５】ＤＰ１２１１のプラスミド地図を表す。
【図２６】ＤＰ１２１６のプラスミド地図を表す。
【図２７】ＤＰ１２１７のプラスミド地図を表す。
【図２８】実施例２９および３０の結果を例示する２つ
のグラフを表す。
【図２９】実施例２９−３２の結果を例示する２つのグ
ラフを表す。
【図３０】実施例３３および３４の結果を例示する１つ
のグラフを表す。
【図３１】実施例３５−３７の結果を例示する１つの棒
グラフを表す。 ここで用いられたように、プラスミドの名称の頭に付く
「ｐＰＨＩ」および「ＤＰ」は、相互置換えである。す
なわち、ｐＰＨＩ４４３はまたＤＰ４４３とも呼ばれ
得、そしてＤＰ１２１１はまたｐＰＨＩ１２１１とも呼
ばれ得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 15/63 15/70 15/82 (72)発明者 ベン エー． ボーウエン アメリカ合衆国 アイオワ 50310，ポー ク カウンテイ，デモイン，36テイーエイ チ ストリート 3008 (72)発明者 ブラツドレイ エー． ロス アメリカ合衆国 アイオワ 50111，ポー ク カウンテイ，グリムズ，エヌ．ダブリ ユー． サード プレイス 210

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 転写が転写アクチベータータンパクによ
    って活性化される、植物のゲノムの遺伝子の発現を阻害
    する方法であって、実質的に該遺伝子の転写アクチベー
    ターのアミノ酸配列を有するが、少なくとも１個のアミ
    ノ酸が該遺伝子の転写アクチベーターのアミノ酸配列と
    は異なるアミノ酸配列を有するタンパクを該遺伝子の環
    境中に導入し、そのことにより、該タンパクが該遺伝子
    の転写を活性化し得なくなる工程を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記タ
    ンパクが、認識ドメインおよび活性化ドメインを有し、
    該認識ドメインが、実質的に前記遺伝子の転写アクチベ
    ーターの認識ドメインのアミノ酸配列を有し、そして、
    該活性化ドメインが、少なくとも１個のアミノ酸が該遺
    伝子の転写アクチベーターの活性化ドメインのアミノ酸
    配列とは異なるアミノ酸配列を有する、方法。
  3. 【請求項３】 前記タンパクをコードするＤＮＡ配列を
    細胞中に導入する工程をさらに包含する、請求項２に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、前記タ
    ンパクが、認識ドメインおよび活性化ドメインを有し、
    該活性化ドメインが、実質的に前記遺伝子の転写アクチ
    ベーターの活性化ドメインのアミノ酸配列を有し、そし
    て、該認識ドメインは、少なくとも１個のアミノ酸が該
    遺伝子の転写アクチベーターの認識ドメインのアミノ酸
    配列とは異なるアミノ酸配列を有する、方法。
  5. 【請求項５】 前記タンパクをコードするＤＮＡ配列を
    細胞中に導入する工程をさらに包含する、請求項４に記
    載の方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、 （ａ）前記遺伝子の転写アクチベータータンパクの構造
    または配列を特徴づける工程； （ｂ）前記タンパクのアミノ酸配列を改変して、該遺伝
    子の転写を活性化する能力を減少させる工程； （ｃ）該改変型タンパクをコードするＤＮＡ配列を提供
    する工程；および （ｄ）該ＤＮＡ配列を植物細胞中に導入し、そのことに
    より該改変タンパクが発現して、該遺伝子の転写を妨害
    する工程をさらに包含する、方法。
  7. 【請求項７】 植物ゲノムにおける遺伝子の転写アクチ
    ベーターのアミノ酸配列を実質的に有するタンパクを実
    質的に単独でコードするＤＮＡ配列であって、しかし該
    転写アクチベーターをコードする配列とは少なくとも１
    個の塩基対が異なるコード配列を有し、その結果、該タ
    ンパクが該遺伝子の転写アクチベーターのアミノ酸配列
    とは少なくとも１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を
    有する、ＤＮＡ配列。
  8. 【請求項８】 前記コード配列が、１つの塩基対の付加
    または欠損によって、転写アクチベーターをコードする
    配列とは異なり、その結果、該付加または欠損の位置よ
    り下流に、コード配列のフレームシフトが存在する、請
    求項７に記載のＤＮＡ配列。
  9. 【請求項９】 請求項７に記載のＤＮＡ配列であって、
    （ａ）植物遺伝子の転写アクチベーターの認識ドメイ
    ン；および（ｂ）少なくとも１個のアミノ酸が植物遺伝
    子転写アクチベーターの活性化ドメインとは異なる活性
    化ドメイン；で実質的になるタンパクを実質的に単独で
    コードする、ＤＮＡ配列。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載のＤＮＡ配列であっ
    て、前記活性化ドメインをコードする前記配列が、１個
    またはそれ以上のコドンの欠損により、天然の活性化ド
    メインの天然の配列とは異なり、そのことにより前記タ
    ンパクの活性化ドメインが、１個またはそれ以上のアミ
    ノ酸の欠損により天然の活性化ドメインとは異なる、Ｄ
    ＮＡ配列。
  11. 【請求項１１】 請求項９に記載のＤＮＡ配列であっ
    て、前記活性化ドメインをコードする前記配列が、１個
    またはそれ以上のコドンの付加により、天然の活性化ド
    メインの天然の配列とは異なり、そのことにより前記タ
    ンパクの活性化ドメインが、１個またはそれ以上のアミ
    ノ酸の付加により天然の活性化ドメインとは異なる、Ｄ
    ＮＡ配列。
  12. 【請求項１２】 請求項９に記載のＤＮＡ配列であっ
    て、１個またはそれ以上のコドンを、異なるアミノ酸を
    コードするコドンと置換することにより、前記活性化ド
    メインをコードする前記配列が天然の活性化ドメインの
    天然の配列とは異なり、その結果、前記タンパクの活性
    化ドメインが、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換に
    より天然の活性化ドメインとは異なる、ＤＮＡ配列。
  13. 【請求項１３】 植物遺伝子転写アクチベータータンパ
    クの認識ドメインを唯一の遺伝子生産物として有するＤ
    ＮＡ配列。
  14. 【請求項１４】 植物遺伝子転写アクチベータータンパ
    クの認識ドメインで実質的になるタンパク。
  15. 【請求項１５】 植物細胞における前記ＤＮＡ配列の発
    現を引き起こす植物調節配列に作動可能に連結した請求
    項７に記載のＤＮＡ配列を有する、発現カセット。
  16. 【請求項１６】 細菌細胞中で前記発現カセットの複製
    を引き起こす細菌発現調節配列に作動可能に連結した請
    求項１５に記載の発現カセットを有する、細菌の形質転
    換用ベクター。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の細菌の形質転換用
    ベクターの少なくとも１個のコピーを外来プラスミドと
    して含有している、細菌細胞。
  18. 【請求項１８】 請求項１５に記載の発現カセットのＤ
    ＮＡ配列の少なくとも１個のコピーを外来ＤＮＡとして
    含有している、形質転換植物細胞。
  19. 【請求項１９】 単子葉植物種の細胞であることをさら
    に特徴とする、請求項１８に記載の形質転換細胞。
  20. 【請求項２０】 トウモロコシ、サトウモロコシ、コム
    ギ、ライコムギ、またはイネの細胞であることをさらに
    特徴とする、請求項１９に記載の形質転換細胞。
  21. 【請求項２１】 双子葉植物種の細胞であることをさら
    に特徴とする、請求項１８に記載の形質転換細胞。
  22. 【請求項２２】 ダイズ、アルファルファ、タバコ、ヒ
    マワリ、カノラ（ｃａｎｏｌａ）またはトマトの細胞で
    あることをさらに特徴とする、請求項２１に記載の形質
    転換細胞。
  23. 【請求項２３】 請求項２０に記載の細胞を包含する、
    トウモロコシの細胞または組織培養物。
  24. 【請求項２４】 請求項１５に記載の発現カセットのＤ
    ＮＡ配列の少なくとも１個のコピーを外来ＤＮＡとして
    含有している、形質転換されたトウモロコシ植物体。
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