CN101454456B - 植物基于病毒的诱导型表达系统 - Google Patents

Abstract

产生一种或多于一种目的蛋白质的方法，其包括：(a)提供植物或植物细胞，其包含：包含编码RNA复制子的核苷酸序列，以及与所述编码所述RNA复制子的核苷酸序列有效相连的第一诱导型启动子的第一异源核苷酸序列；所述RNA复制子不编码这样的蛋白质，所述蛋白质在所述植物中提供了所述RNA复制子的细胞间的移动；所述RNA复制子编码聚合酶和所述一种或多于一种的目的蛋白质，所述聚合酶能被改造用于复制所述RNA复制子；以及(b)在步骤(a)的所述植物或植物细胞中诱导所述诱导型启动子，从而在所述植物或植物细胞中产生所述一种或多于一种的目的蛋白质。

Description

植物基于病毒的诱导型表达系统

发明领域

本发明涉及使用病毒表达系统在植物或植物细胞中产生或表达一种或多于一种的目的蛋白质的方法。本发明还涉及用于该方法的植物或植物细胞，特别是转基因植物或植物细胞。本发明还提供了产生本发明的植物或植物细胞的方法。

发明背景

大体上可以使用病毒载体实现在植物中异源蛋白质的高产量表达。但是，尽管存在不同的植物病毒表达系统，植物病毒表达系统主要用于在用重组病毒载体感染(Donson等人，1991，Proc Natl Acad Sci U S A，88：7204-7208；Chapman，Kavanagh & Baulcombe，1992，Plant J.，2：549-557)或转染(Marillonnet等人，2005，Nat.Biotechnol.，23：718-723；Santi等人，2006，Proc Natl Acad Sci USA.103：861-866；WO2005/049839)植物宿主后在植物中目的蛋白质的瞬时表达。尽管有一些科学出版物和公开的专利申请，仍然没有可用的已经建立的商用基于病毒的产生系统(可容易地放大并且提供高产量)，这主要是由于两个主要原因：

首先，瞬时的植物基于病毒的表达系统通常被限定在特定的宿主中，所述宿主由于其对于环境因素的易感性而不适于大规模培养。此外，它们通常被限定于植物宿主的某些部分，因此排除了大多数来自生产过程的植物生物质，并且因此将每单位植物生物质的重组产品的相对产量减少到这样的水平，所述水平是与在转基因植物中使用常规转录启动子可以达到的水平相当的。

其次，通过生成具有稳定整合到每个细胞中的病毒复制子的转基因植物宿主来放大基于病毒的产生系统的尝试也未能提供解决方案，这尤其是因为所述复制子在此类位置中表现不佳，也是因为病毒复制子的稳定形成会危害植物生长和发育。通常，在瞬时表达系统中的系统病毒载体可以耐受相对较短(最高达1kb)的异源核酸插入片段，因此限制为表达相对小的蛋白质。用于转染的病毒载体(农杆菌介导的递送，WO2005/049839)可以表达更大的插入片段，但是需要整株植物的农杆菌浸润(agro-infiltration)。显然，此类系统便于产生许多重组蛋白质，包括抗原，因为它们需要较短的时间来使用和放大，但是，在许多其它应用中基于病毒载体的表达系统的转基因形式是有用的。特别地，需要以大量和相对低的花费生产重组蛋白质(例如不同的纤维素酶和其它工业酶)是个问题，其中基于农杆菌浸润的瞬时表达系统(WO2005/049839)不是商业可行的。在转基因植物宿主中表达病毒载体通常对于植物生长和发育是有害的。同样，此类表达最终将导致转基因沉默。为了寻找这一问题的解决方案，尝试借助于转录后基因沉默(PTGS)阻抑制子从植物染色体释放沉默的病毒复制子(US6395962；Mallory等人，2002，Nat.Biotechnol.，20：622-625)。基于植物三联RNA病毒(Mori等人，2001，Plant J.，27，79-86)——雀麦草花叶病毒(BMV)的糖皮质激素诱导型表达系统产生了非常低产量的目的蛋白质(3-4μg/g新鲜重量)(可能是由于PTGS)，所述产量与标准(非-病毒)转录启动子所提供的产量相当。

目前，还没有这样的大规模植物病毒表达系统，所述系统的产量和效率足够高从而能在市场上与其它大规模表达系统如细菌、真菌或昆虫细胞表达系统相竞争。此类植物表达需要尽可能好地实现下列标准：

(i)高产量，包括目的蛋白质在尽可能多的植物组织和尽可能多的所述组织的细胞中表达；

(ii)为了预防蛋白质表达对于存活的植物细胞的有害影响，目的蛋白质或产物的表达应当在同一时间在被处理的植物或植物组织的所有植物细胞中开始。

通常目的蛋白质或产物在产生所述产物或蛋白质的每个细胞中聚集到某一点。但是，在聚集过程中，可降解的过程通常使得倾向于减少目的蛋白质或产物的产量或品质。因此，存在应当收获目的产物或蛋白质的最优时间点。这一最优时间点应当是在植物的所有组织或细胞中以及在所有选定批次的植物中在相同时间可达到的，从而使得整个过程有效率并且有利可图。

发明的一般描述

因此，本发明的目标是提供在植物系统中表达一种或多种蛋白质的方法，其能容易地被升级为大规模应用，产生大量的待表达的蛋白质，并且同时，由于目的重组蛋白质未受控表达的可能性很低而是生物安全的。本发明的另一目标是提供产生转基因植物的有效方法，所述转基因植物编码病毒复制子，其适合于从所述病毒复制子表达目的蛋白质。

因此，本发明提供了产生一种或多于一种目的蛋白质的方法，包括

(a)提供植物或植物细胞，其包含

第一异源核苷酸序列，其包含编码RNA复制子的核苷酸序列，以及与所述编码所述RNA复制子的核苷酸序列有效相连的第一诱导型启动子；

所述RNA复制子不编码这样的蛋白质，所述蛋白质在所述植物中提供了所述RNA复制子的细胞间的移动；

所述RNA复制子编码聚合酶和所述一种或多于一种的目的蛋白质，所述聚合酶能被改造用于复制所述RNA复制子；以及

(b)在步骤(a)的所述植物或植物细胞中诱导所述诱导型启动子，从而在所述植物或植物细胞中产生所述一种或多于一种的目的蛋白质。

本发明还提供了产生一种或多于一种的目的蛋白质的方法，其包括

(a)提供植物，其包含

(i)第一异源核苷酸序列，其包含编码RNA复制子的核苷酸序列，以及与所述编码所述RNA复制子的核苷酸序列有效相连的第一诱导型启动子；

所述RNA复制子不编码这样的蛋白质，所述蛋白质在所述植物中提供了所述RNA复制子的细胞间的移动；

所述RNA复制子编码聚合酶和所述一种或多于一种的目的蛋白质，所述聚合酶能被改造用于复制所述RNA复制子；以及

(ii)包含编码蛋白质的序列的第二异源核苷酸序列，所述蛋白质使得所述RNA复制子能够细胞间移动，其中所述第二异源核苷酸序列包含第二诱导型启动子，所述启动子与编码使得所述RNA复制子能够细胞间移动的所述蛋白质的所述序列有效连接；以及

(b)在步骤(a)的所述植物中诱导所述第一和所述第二诱导型启动子，从而在所述植物中产生所述一种或多于一种的目的蛋白质。

本发明还提供了上述方法的步骤(a)中提供的植物或植物细胞。本发明还提供了产生本发明的植物或植物细胞的方法，包括向植物核染色体中引入所述第一异源核苷酸序列以及任选地所述第二异源核苷酸序列，然后再生包含所述第一以及任选地所述第二异源核苷酸序列的经转化的植物。本发明的发明人令人惊讶地发现了在植物或植物细胞中产生一种或多于一种的目的蛋白质的方法，其达到在现有技术中不能达到的表达水平。同时，本发明的方法是生物学安全的，并且可升级为工业水平。本发明的异常的表达水平是通过病毒表达系统达到的，所述病毒表达系统以迄今未知的程度避开了植物或植物细胞的抗病毒应答，例如转基因沉默。在本发明中，从编码RNA复制子的核苷酸序列释放RNA复制子并且表达所述使得所述RNA复制子能够细胞间移动的蛋白质是受到诱导型启动子控制的。由于RNA复制子的渗漏转录而从编码RNA复制子的核苷酸序列中的任何不想要的RNA复制子的释放被限定在发生了此类渗漏转录的那些细胞中，因为所述RNA复制子不能在缺乏提供细胞间移动的所述蛋白质时在所述植物或所述植物细胞中进行细胞间移动。重要的是，在未被诱导的状态中没有以能够触发转基因沉默的水平表达病毒序列。因此，转基因沉默不太可能发生。此外，通过遗漏在所述植物中提供所述RNA复制子的细胞间移动的蛋白质而对RNA复制子的表达产量造成的有害影响通过提供相对于所述RNA复制子反式的编码下述蛋白质的序列来补偿，所述蛋白质使所述RNA复制子能够细胞间移动。提供所述RNA复制子的细胞间移动的所述蛋白质的表达受到诱导型启动子的控制。这保留了将所述病毒复制子的渗漏表达限制于其中已经发生此类渗漏表达的细胞中，并且避免了基因沉默，但是允许所述目的蛋白质在诱导的状态中的高表达水平。因此，在本发明中，基因沉默对于目的蛋白质产量的有害影响基本不存在。

此外，发明人已经令人惊讶地发现，当植物细胞用本发明的所述第一异源核苷酸序列转化时的转化效率高于RNA复制子编码提供细胞间移动的蛋白质的情形。在一些情形中，如果RNA复制子编码提供细胞间移动的蛋白质，则根本不可能获得具有所述第一异源核苷酸序列的初级转化体。本发明改善转化效率的这一作用可以是由于本发明RNA复制子不能细胞间移动。

在本发明的一个实施方案中，所述植物或植物细胞包含第二异源核苷酸序列，所述第二异源核苷酸序列包含编码使得所述RNA复制子能够细胞间移动的蛋白质的核苷酸序列，其中所述第二异源核苷酸序列包含与编码使得所述RNA复制子能够细胞间移动的所述蛋白质的所述核苷酸序列有效连接的第二诱导型启动子。本发明的这一实施方案允许进一步增加所述一种或多于一种目的蛋白质的产生的产量。

在产生一种或多于一种目的蛋白质的方法的步骤(a)中，向植物或植物细胞提供了所述第一异源核苷酸序列。向所述植物或植物细胞提供了所述第一异源核苷酸序列，从而获得转基因植物或转基因植物细胞。在一个实施方案中，所述转基因植物或所述转基因植物细胞在核染色体中包含所述第一异源核苷酸序列。

还向所述植物或植物小提供了所述第二异源核苷酸序列，从而获得转基因植物或转基因植物细胞。在一个实施方案中，所述转基因植物或所述转基因植物细胞在核染色体中包含所述第二异源核苷酸序列。

本领域已知产生包含异源核苷酸序列的转基因植物，所述异源核苷酸序列被稳定整合到核染色体中或是游离的。通常，所述异源核苷酸序列将包含选择性标记基因，用于选择具有整合的所述异源核苷酸序列的植物细胞或植物组织。然后可以使用植物生物技术领域中的标准技术从经转化的细胞或组织中再生出在所述转基因植物的细胞中包含所述异源核苷酸序列的整株转基因植物。本发明的所述异源核苷酸序列通常是DNA。

如果要提供包含所述第一和所述第二异源核苷酸序列的植物，所述第一和所述第二异源核苷酸序列可以是用于转化植物细胞或植物的一个大异源核苷酸序列的一部分。在该实施方案中，所述大异源核苷酸序列包含所述第一和所述第二异源核苷酸序列。可选地，包含所述第一异源核苷酸序列的第一植物和包含所述第二异源核苷酸序列的第二植物可以独立生成。然后所述第一和所述第二植物可以杂交(例如通过有性杂交或通过细胞融合)，以获得包含所述第一和所述第二异源核苷酸序列的植物。在另一个备选中，包含所述第一异源核苷酸序列的转基因植物或植物细胞可以用所述第二异源核苷酸序列再转化，用于产生包含所述第一和所述第二异源核苷酸序列的植物或植物细胞；或者包含所述第二异源核苷酸序列的转基因植物或植物细胞可以用所述第一异源核苷酸序列再转化，用于产生包含所述第二和所述第一异源核苷酸序列的植物或植物细胞。在本文中，“异源”表示相对于所述植物是异源的。

所述第一异源核苷酸序列包含编码所述RNA复制子的核苷酸序列区段。所述第一异源核苷酸序列还包含与编码所述RNA复制子的所述核苷酸序列区段有效连接的第一诱导型启动子。所述诱导型启动子允许在本发明的方法的步骤(b)中诱导编码所述RNA复制子的所述核苷酸序列区段的转录。转录从编码所述RNA复制子的所述核苷酸序列区段中释放所述RNA复制子。所述RNA复制子是RNA水平上的复制子。在植物细胞核中产生的所述RNA复制子然后可以迁移到细胞溶胶中，在所述细胞溶胶中编码所述RNA复制子的蛋白质可以被产生并且可以复制RNA复制子。

所述RNA复制子编码这样的蛋白质，所述蛋白质在通过诱导所述诱导型启动子释放所述RNA复制子后被表达。在本发明中，由所述第一异源核苷酸序列编码的所述第一RNA复制子是编码用于复制所述RNA序列的聚合酶的RNA序列，借此所述RNA序列被改变以被其上编码的聚合酶所复制。所述聚合酶因此是RNA-依赖性RNA聚合酶，其在本文中也被成为“复制酶”。所述RNA复制子优选具有用于翻译所述聚合酶的序列和用于结合所述聚合酶的序列，以允许所述RNA复制子在所述植物的细胞或所述植物细胞中复制。所述RNA复制子还编码待表达的所述一种或多于一种的目的蛋白质，以及表达所述一种或多种的目的蛋白质所需的序列，例如亚基因组启动子、转录增强子或翻译增强子。

在优选的实施方案中，所述RNA复制子来源于RNA病毒，例如单联(monopartite)RNA病毒。“单联”意思是单联病毒具有由一个核酸分子组成的基因组。因此，本发明的所述RNA复制子优选是单联RNA复制子，即其由单一类型的RNA分子构成。在优选的实施方案中，所述RNA复制子来源自正义单链RNA病毒，因为此类病毒包含复制和表达所需的遗传元件并且通过进化被优化用于本发明的目的。在所述优选的实施方案中，所述RNA复制子是正义单链RNA复制子。

“来源自”意思是使用本发明所需的RNA病毒的那些遗传元件，其中其它可以被缺失或使其功能障碍。在本发明中，可以将编码提供所述病毒的细胞间移动的所述蛋白质的序列缺失或使其功能障碍，例如通过部分缺失或突变对于细胞间移动关键的序列部分。可选地，编码目的蛋白质的序列可以完全或部分地替换编码用于细胞间移动的所述蛋白质的序列。“来源自”表明取自植物病毒的所述RNA复制子的序列不需要与所述RNA病毒的相应RNA序列完全相同，但是可以例如具有适当地突变或者可以表现出功能保守性差异，例如如WO 2005/049839所述的内含子插入到编码所述复制酶的序列部分中。由于所述差异是功能保守的，所述序列优选编码能够实现复制子功能的蛋白质，这与其在所述复制子所源自的所述RNA病毒中所做的相似。本发明的所述RNA复制子或其聚合酶可以源自的适当的正义单链RNA病毒是烟草花叶病毒(TMV)或马铃薯X病毒。其它所述RNA复制子可以源自的植物病毒在下文中给出。

但是，还可以人工合成所述RNA复制子或编码其的cDNA，其中可以或可以不使用天然病毒的遗传元件。

本发明的所述RNA复制子不需要由所述第一异源核苷酸序列的一个连续核苷酸序列区段所编码。相反，所述第一异源核苷酸序列可以具有两个或多个序列区段，它们一起编码所述RNA复制子。两个或多个此类序列区段可以是连续的或者可以由另一序列部分所打断。所述植物的细胞中所述RNA复制子的形成然后可以涉及序列特异性DNA或RNA重组。在DNA重组的情形中，所述RNA复制子可以通过切除阻断所述RNA复制子被表达的序列部分来形成。可选地，不连续编码所述RNA复制子的两个或多个序列区段之一可以通过重组被翻转，从而形成编码所述RNA复制子的单一的连续序列区段。还可能的是，所述RNA复制子可以通过在两个复制子前体之间的重组来形成，所述两个复制子前体都不是RNA复制子。此类重组可以是如WO02/097080中所描述的核酶介导的反式剪接。

本发明的所述RNA复制子不编码在所述植物中提供所述RNA复制子的细胞间移动的蛋白质。本发明的这一特征允许将所述RNA复制子的任何渗漏释放限制在所述渗漏释放的植物细胞中。在所述植物中提供所述RNA复制子的细胞间移动的蛋白质通常被称作为“移动蛋白”。植物病毒通常编码并表达一种或多种允许病毒或所述病毒的基因组RNA细胞间扩散的蛋白质。本发明的RNA复制子必需不能表达移动蛋白，所述移动蛋白将允许在所述植物中所述RNA复制子的显著的细胞间扩散。除非是在诱导型启动子的控制之下，否则所述植物或所述植物细胞应当不表达在所述植物中提供所述RNA复制子的细胞间移动的蛋白质。在一个实施方案中，所述RNA复制子可以包含天然RNA病毒的移动蛋白的一部分，前提是所述移动蛋白的一部分不允许所述RNA复制子在所述植物中进行细胞间的显著扩散。

在本发明的方法和植物的一个实施方案中，所述植物包含第二异源核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码使得所述RNA复制子能够细胞间移动的蛋白质的核苷酸序列，其中所述第二异源核苷酸序列包含与下述核苷酸序列有效连接的第二诱导型启动子，所述核苷酸序列编码使得所述RNA复制子能够细胞间移动的所述蛋白质。所述蛋白质可以来源自与所述RNA复制子的聚合酶所来源的相同植物RNA病毒，或者来自另一RNA病毒。编码RNA复制子的所述核苷酸序列和编码使得能够细胞间移动的蛋白质的所述核苷酸序列受到分开的诱导型启动子的控制，从而避免了来自一个诱导型启动子的渗漏表达将导致移动蛋白的表达和所述RNA复制子的形成。因此，编码RNA复制子的所述核苷酸序列和编码使得能够细胞间移动的蛋白质的所述核苷酸序列在所述植物或植物细胞中存在于不同的表达盒中。但是，这些分开的诱导型启动子不需要是诱导型启动子的不同类型。所述分开的诱导型启动子可以是相同类型的并且可以具有相同的序列。

所述第一、所述第二的所述诱导型启动子或任何其它诱导型启动子可以由相同的或不同的诱导信号或诱导剂所诱导。可以用于本发明的诱导型启动子在下文中给出。在一个实施方案中，所述第一和/或所述第二异源核苷酸序列的诱导型启动子是化学诱导的。在另一个实施方案中，所述第一和/或所述第二异源核苷酸序列(以及任选地其它异源核苷酸序列)的诱导型启动子是由相同的诱导剂例如IPTG、乙醇、四环素或糖皮质激素所诱导的。

在本发明方法的步骤(b)中，步骤(a)的所述植物或所述植物细胞中的所述诱导型启动子被诱导，从而起始所述一种或多于一种的目的蛋白质的表达，从而在所述植物或植物细胞中产生所述一种或多于一种的目的蛋白质。诱导模式取决于诱导型启动子的类型。如果诱导型启动子是化学诱导型的，则向所述植物或所述植物细胞提供能够诱导启动子的化学剂。如果不同的诱导型启动子用于所述第一和所述第二异源核苷酸序列，则同时向所述植物或所述植物细胞应用不同的化学剂，例如作为不同诱导剂的混合物。如果所述方法在液体培养基中的植物细胞中进行，可以将诱导剂加入到培养基中。如果所述方法在植物中进行，可以通过用所述诱导剂的溶液或悬液喷雾所述植物来将所述诱导剂应用到所述植物中。

本发明的方法可以用于产生一种目的蛋白质或多于一种的目的蛋白质。如果要产生一种目的蛋白质，编码所述目的蛋白质的核苷酸序列可以包括在编码所述RNA复制子的所述核苷酸序列中。在一个实施方案中，编码所述目的蛋白质的核苷酸序列可以替换所述RNA复制子所来源的植物RNA病毒的移动蛋白基因。可选地，可以用编码目的蛋白质的核苷酸序列替换所述RNA复制子所来源的RNA病毒的外壳蛋白基因。如果要表达两个目的蛋白质，可以用编码目的蛋白质的核苷酸序列替换(完全或部分)移动蛋白基因和外壳蛋白基因。

如果要产生两个或多个目的蛋白质，所述植物或植物细胞可以包含第三异源核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码另一RNA复制子的核苷酸序列以及与所述编码所述另一RNA复制子的所述序列有效连接的第三诱导型启动子。所述另一RNA复制子优选不编码在所述植物中提供所述RNA复制子或所述另一RNA复制子的细胞间移动的蛋白质。所述另一RNA复制子然后可以编码一种或多种另一目的蛋白质。如果所述植物编码两个或多个RNA复制子，则使得所述RNA复制子能够细胞间移动的蛋白质也可以使得所述另一RNA复制子能够细胞间移动。可选地，所述另一RNA复制子的细胞间移动可以由使得所述另一RNA复制子能够细胞间移动的另一蛋白质来提供，其表达可以受到另一诱导型启动子的控制。

所述另一RNA复制子可以通过所述聚合酶来复制，所述聚合酶是由所述第一异源核苷酸序列所编码的所述RNA复制子所编码的。但是，在一个实施方案中，所述另一RNA复制子编码用于复制所述另一RNA复制子的另一聚合酶，其中所述另一聚合酶可以不同于所述RNA复制子的聚合酶。

在一个实施方案中，所述RNA复制子和所述另一RNA复制子可以是非竞争性RNA复制子。来自非竞争性RNA复制子或非竞争性病毒载体的蛋白质的产生描述在WO 2006/79546(PCT/EP2006/000721)中。

可以在所述植物或植物细胞中产生后将所述一种或多于一种的目的蛋白质从不想要的细胞成分中纯化出来。从植物或植物细胞中纯化蛋白质的方法是本领域已知的。在一种方法中，如WO 03/020938中所述的目的蛋白质涉及植物质外体。

通常，本发明可以被应用于任何植物，其中感染性RNA病毒存在并且建立了病毒载体系统。在一个实施方案中，双子叶植物用于实践本发明。在另一个实施方案中，使用茄科(Solanaceae)植物。优选的植物是烟草属(Nicotiana)物种，例如本生烟(Nicotiana benthamiana)和烟草(Nicotianatabacum)；优选的除烟草属物种外的植物物种是碧冬茄(Petunia hybrida)、芸苔(Brassica campestris)、芥菜(B.juncea)、水芹、芝麻菜、白芥、草莓、菠菜、Chenopodium capitatum、苜蓿、莴苣、向日葵和黄瓜。

本发明的产生方法还可以在本文提到的植物细胞中进行。所述细胞可能是植物组织例如叶的一部分，或者所述细胞可以存在于细胞培养物例如悬浮培养物中。

适当的RNA复制子可以来自下文给出的RNA病毒的列表。本发明可以应用于单联植物RNA病毒。本发明可以基于的最优选的植物RNA病毒是烟草花叶病毒组，特别是烟草花叶病毒；以及马铃薯X病毒组，例如马铃薯X病毒。在烟草花叶病毒的情形中，通常是移动蛋白ORF被待表达的所述目的蛋白质的ORF所替换。外壳蛋白ORF也可以被移除或者被目的蛋白质的ORF所替换。

本发明的主要应用是在植物、植物叶或植物组织或细胞培养物中产生目的蛋白质。如果本发明的方法在植物中进行，则优选不进入人或动物食物链的植物，例如烟草属物种。不进入人或动物食物链的植物可以在开放的田地中栽培，并且在诱导所述RNA复制子释放后(当一种或多于一种的目的蛋白质在植物组织中的表达水平达到其峰值时)在某一时期内收获。优选地，整株植物或植物部分应当被限制在封闭的环境中，例如温室或特别设计的用于提供所述水平表达所需的孵育时期的室。

本发明的产生方法的效率是这样的，使得达到植物表达系统中的新规模。用本发明可达到的表达水平是这样的，从而使得用于下游加工(包括目的蛋白质的分离和纯化)的支出足够低，使得本发明的方法与其它大规模表达系统不相上下。在现有技术的使用稳定转化了病毒载体的植物的表达系统中，表达水平低，因为这些系统的渗漏使得复制子甚至在未诱导的状态中产生，从而触发破坏产量的PTGS机制。此外，能够细胞间移动的RNA复制子破坏了携带所述稳定掺入到植物染色体DNA中的复制子的稳定转化的植物细胞的产生。令人惊讶地，发明人发现，与获得携带能够细胞间移动的RNA复制子的转基因植物相比，更容易获得包含下述载体的转基因植物，所述载体编码不能细胞间移动的RNA复制子。很可能是这一现象还有助于在包含不能细胞间移动的病毒载体的转基因植物中的高表达水平。本发明提供了可以大规模使用的第一高产量诱导型植物表达系统。

附图简述：

图1.发明的一般原理A——能够细胞间移动的RNA复制子的扩散；B——缺乏细胞间移动的本发明的RNA复制子被限制于发生了所述RNA复制子的不想要的形成的细胞中。

图2A描述了质粒pICH17155、pICH17401、pICH16141、pICH17171、pICH18867、pICH17424和pICH17388的T-DNA区域。图2B描述了质粒pICH18693、pICH18969、pICH18951、pICH19940和pICH20592的T-DNA区域。图2C描述了质粒pICH26022和pICH26356的T-DNA区域。在更大的表示TVCV聚合酶的灰框中的白框表示在核中稳定转录物并且因此使得在细胞核中形成的RNA复制子向细胞溶胶中的转移更加有效的内含子。3’Nos——胭脂碱合酶基因的转录终止区域；pNos——胭脂碱合酶基因的启动子；p35S——CaMV的35S启动子；pAct2——拟南芥(A.thaliana)肌动蛋白2基因的启动子；NLS——核定位信号；lacO——大肠杆菌lac操纵子的操纵基因序列；；lacI——大肠杆菌lac操纵子的阻抑基因；BAR——赋予对除草剂膦丝菌素抗性的基因；int——内含子序列的5’部分；AttP——整合酶phC31识别的重组位点。NPTII——新霉素磷酸转移酶II；sGFP——合成的绿色荧光蛋白；NTR——烟草花叶病毒组非翻译的区域；PalcA——编码醇脱氢酶的诱导型构巢曲霉菌(A.nidulans)alcA基因的诱导型启动子；alcR——构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)的alc调节子的转录激活子。TVCV MP——芜菁脉露病病毒移动蛋白；PVXCP——马铃薯X病毒外壳蛋白；PVX Pol——马铃薯X病毒RNA依赖性RNA聚合酶；25K、12K、8K——三基因区段；sgp——亚基因组启动子。

图3显示了用诱导型lac系统的瞬时表达测试。用不同组合的构建体浸润叶，处理6天后，在UV光下对其进行监控。黑背景前的光斑表明GFP荧光。叶的左侧：lac阻抑物缺乏；叶的右侧：lac阻抑物存在。pICH17424是具lacO的5’-前载体(provector)，pICH17388是无lacO的相应的对照构建体。pICH17401是lac阻抑物构建体。所有的样品还包含GFP3’-前载体和整合酶。

图4A显示用lac阻抑物稳定转化的植物的叶子。将植物用在其启动子中包含lacO序列的载体pICH17171以及用缺乏lacO序列的相应的对照构建体pICH16141进行农杆菌浸润。

图4B显示通过用IPTG处理消除阻抑。将用lac阻抑物稳定转化的本生烟植物用在其启动子中包含lacO序列的载体pICH17171以及用相应的对照构建体pICH16141进行农杆菌浸润。将5mM IPTG包括在浸润缓冲液中用于诱导(右图)。左图是缺乏诱导物IPTG。

图5显示了用提供RNA复制子的构建体再次转化包含lacI阻抑物的植物(pICH17155或pICH17401)。用5mM IPTG浸润植物。品系N6(左图)显示高的诱导性，但是也是高的背景，而品系N8(右图)显示低背景和低诱导性。

图6显示了用基于TMV载体的乙醇-诱导型系统的瞬时表达测试。对照：浸润后2天(2days post-infiltration)用水处理的植物；乙醇-处理的：浸润后2天用4％乙醇处理的植物。

图7显示了使用基于PVX载体的乙醇-诱导型系统的瞬时表达测试。对照：浸润后2天用水处理的植物；乙醇-处理的：浸润后2天用4％乙醇处理的植物。

图8显示了在UV光下的携带有pICH18951的T-DNA的稳定转化体的叶。绿(光)点对应于用携带有pICH18693的农杆菌浸润并且用醇喷雾的区域。

图9显示了在用含水醇溶液处理(浇灌——1％醇，并且喷雾——4％醇)后表达GFP的转基因本生烟植物(F1后代)。

图10显示了在用4％醇溶液喷雾后表达GFP的转基因烟草植物(F1后代)。

图11描述了质粒pICH25408的T-DNA区域。在更大的表示TVCV聚合酶的灰框中的白框表示在核中稳定转录物以及因此使得在细胞核中形成的RNA复制子转移到细胞溶胶中的内含子。在更大的表示TVCV聚合酶的灰框中的白框表示在核中稳定转录物以及因此使得在细胞核中形成的RNA复制子转移到细胞溶胶中的内含子。3’Nos——胭脂碱合酶基因的转录终止区域；pNos——胭脂碱合酶基因的启动子；3’Ocs——章鱼碱合酶基因的转录终止区域；NPTII——新霉素磷酸转移酶II；NTR——烟草花叶病毒组非翻译的区域；PalcA——编码醇脱氢酶的诱导型构巢曲霉菌(A.nidulans)alcA基因的诱导型启动子；alcR——构巢曲霉菌(Aspergillusnidulans)的alc调节子的转录激活子。TVCV MP——芜菁脉露病病毒移动蛋白；sgp——亚基因组启动子。

图12显示了总的可溶性蛋白质的电泳分析结果的考马斯-染色的聚丙烯酰胺凝胶，所述总的可溶蛋白质提取自不同的转基因植物(N18，N19和N20)，所述转基因植物携带有具有拟酶肽基因的质粒pICH25408的T-DNA区域。

道1——对照，从未处理的植物分离的总的可溶性蛋白质；道2——用携带有编码alcR激活子(pICH18693)的质粒的农杆菌浸润并且用4％乙醇处理的植物；道3——用携带有编码alcR激活子(pICH18693)的质粒、编码携带有拟酶肽基因的病毒载体的质粒(pICH25408)的农杆菌混合物浸润并且用4％的乙醇处理的植物。

图13显示了总的可溶性蛋白质的电泳分析结果的考马斯-染色的聚丙烯酰胺凝胶，所述总的可溶蛋白质提取自F1植物，所述F1植物是从携带有编码具有拟酶肽基因的病毒载体的质粒pICH25408的T-DNA区域的转基因植物和携带有编码alcR激活子(pICH18693)的T-DNA区域的转基因植物之间的杂交获得的。植物用4％的乙醇处理。

发明详述

本发明描述了使用可以来源自单联RNA病毒的RNA复制子来高产量、大规模产生目的蛋白质的诱导型表达系统。所述RNA复制子能够在植物中表达一种或多于一种的目的蛋白质。本发明的方法具有生物安全性特征，提供了对于RNA复制子释放的严密控制并且预防了所述RNA复制子感染其它植物(由于其不能进行短距离(细胞间)移动)以及任选地，还预防了长距离移动。

我们已经令人惊讶地发现移除所述RNA病毒载体的细胞间移动功能促进了在植物或植物细胞的染色体DNA中编码所述RNA复制子的稳定转化的植物的选择和再生。本发明的基本原理示于图1中。在能够细胞间移动的病毒载体的情形中，诱导型系统的渗漏引起了病毒载体释放到细胞溶胶中并且进一步扩散到邻近细胞(图1A)。最终，这导致在植物宿主中病毒载体的非受控扩散，破坏了所述植物的生长和发育。在克服所述问题并且通过转录后基因沉默(PTGS)机制控制病毒载体复制的植物宿主的情形中，PTGS对于植物宿主中目的蛋白质的表达水具有负面作用。在本发明中，诱导型系统的渗漏不具有此类显著的作用，因为本发明的RNA复制子不能细胞间移动，因此PTGS实际上是可以忽略的。所述RNA复制子基本上被限制在由于启动子渗漏而导致其被释放的细胞中(图1B)，因此改善了对不想要的目的蛋白质表达的控制并且降低了PTGS对于系统生产力的潜在的负面作用。

在本发明中，诱导型和组织特异性启动子可以用于在植物或植物细胞中触发目的蛋白质的产生。根据其诱导条件，诱导型启动子可以被分为两类：由非生物因素(温度、光、化学物质)诱导的启动子和由生物因素(例如病原体或害虫攻击)诱导的启动子。第一类的实例包括但不限于热诱导型(US 05187287)和冷诱导型(US05847102)启动子、铜-诱导型系统(Mett等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，90，4567-4571)、类固醇诱导型系统(Aoyama & Chua，1997，Plant J.，11，605-612；McNellis等人，1998，Plant J.，14，247-257；US06063985)、乙醇-诱导型系统(Caddick等人，1997，NatureBiotech.，16，177-180；WO09321334；WO0109357；WO02064802)、异丙基β-D-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)-诱导型系统(Wilde等人，1992，EMBO J.，11：1251-1259)和四环素-诱导型系统(Weinmann等人，1994，Plant J.，5，559-569).用于植物的化学诱导型系统领域中最近的发展之一是可以由糖皮质激素地塞米松启动并且由四环素关闭的嵌合启动子(Bohner等人，1999，Plant J.，19，87-95).化学诱导型系统是最适合于实施本发明的。对于化学诱导型系统的综述参见：Zuo & Chua，(2000，Current Opin.Biotechnol.，11，146-151)和Moore等人，(2006，Plant J.，45：651-683).对于本领域技术人员显而易见的是选定的诱导型系统的功能性所需的任何蛋白质例如阻抑物或激活子必须要在所述植物或所述植物细胞中表达，用于使得诱导型系统有功能(参见实施例)。

在本发明的一个实施方案中，我们使用IPTG-诱导型系统用于控制RNA复制子释放和目的蛋白质产生。示例性构建体的设计描述在实施例1中。将编码lacI阻抑物的细菌基因克隆为受到强组成型35S启动子的控制。将双份lac操纵基因序列插入到驱动本发明的RNA复制子转录的拟南芥肌动蛋白2启动子中。使用实施例2中描述的瞬时表达测定测试该系统。当编码RNA复制子的异源核苷酸序列与携带lacI阻抑物的构建体一起被浸润到植物中时，这一系统不显示出任何所述RNA复制子释放的抑制，这可能是由于在阻抑物合成前的RNA复制子的形成(图3，右下)。事实上，当使用前载体系统时，需要位点-特异性重组酶用于装配进RNA复制子的DNA前体中(Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：6852-6857)从而延迟复制子形成、复制子释放的阻抑是明显的(图3，右上角)。在不存在提供了lacI阻抑物的载体时(图3，左上)，在前载体系统的情形观察到RNA复制子形成阻抑完全不存在。

在本发明的另一个实施方案中(实施例3)，我们测试了用提供了lacI阻抑物的构建体稳定转化的转基因植物阻抑RNA复制子从瞬时递送的第一异源核苷酸序列释放的能力，所述核苷酸序列受到具有lac操纵基因序列的启动子的控制。从图4A中显而易见，与用缺乏lac操纵基因序列的构建体pICH16141的对照实验相比，包含此类序列的构建体pICH17171的农杆菌浸润未给出有效的RNA复制子释放。用相同构建体和1mM IPTG对所述转基因植物的共浸润导致诱导了RNA复制子释放(在pICH17171的情形中)(图.4B，右图)，而在无IPTG的对照实验中，没有观察到RNA复制子的释放(图4B，左图)。用使得RNA复制子能够细胞间移动的构建体稳定再转化包含lacl阻抑物的植物产生了在未诱导的状态中具有严重背景表达的双重转化体(图5)。综合对于LacI/lacO系统获得的数据，很明显，关于RNA复制子释放的具有可以忽略的背景表达的最佳对照是在缺乏细胞间移动的RNA复制子的情形中获得的(pICH17171，图4A；图4B，左图)。包含功能性MP的构建体在未诱导的状态中显示出严重的背景表达(pICH17424，图3，右上；图5，对照)。同样，具有所述构建体的初级转化体最终成为转基因表达沉默的，从而无法用于目的蛋白质的高产量表达。

在本发明的另一个实施方案中，使用乙醇诱导型系统来控制转基因植物中RNA复制子的释放。构建体的设计描述在实施例5中，并且构建体的图示显示于图2B中。所述构建体的瞬时表达实验的结果显示于图6中。很明显乙醇诱导型系统提供了对于RNA复制子释放的严密控制，例如仅在构建体与alcR激活子被共浸润的实验中观察到GFP表达。实际上，不存在alcR构建体和/或化学诱导物乙醇时没有观察到背景表达(存在alcR构建体时观察到可以忽略的表达)。提供RNA复制子的构建体(pICH18951)的转基因本生烟植物与alcR构建体在存在4％乙醇时的农杆菌浸润显示了由强GFP表达报告的RNA复制子的形成(图8)。令人惊讶地，在乙醇诱导型系统中，没有获得具有包含功能性MP的病毒构建体的初级转化体(甚至没有对RNA复制子释放的控制渗漏)(实施例5)。这可以解释为由于RNA复制子的细胞间移动导致的植物愈伤组织/细胞培养物中系统的渗漏(Roberts等人，2005，Plant Physiol.，138：1259-1267)。这一解释由下述令人惊讶的发现支持：如果在所使用的植物宿主中RNA复制子不编码用于细胞间移动的蛋白质，那么提供受到乙醇诱导型启动子控制的RNA复制子的初级转化体可以无任何难度的获得。我们还证明了具有提供RNA复制子的载体的转基因植物与包含alcR的转基因产物(transgenics)的杂交-后代在用乙醇处理后显示出强的GFP遍在表达(图9和10)。在本发明的另一个实施方案中，我们证明了我们的系统用除报道基因(例如GFP)之外的蛋白质也有效工作。用于拟酶肽表达的构建体显示在图11中。在用醇处理后在本生烟植物的F1后代中重组拟酶肽产生的分析表明在考马斯-染色的凝胶上可检测的高表达水平(主蛋白带之一)。

在实施例中，我们使用基于TMV的RNA复制子。但是，属于不同分类群的许多不同病毒可以用于构建根据本发明的基于RNA病毒的载体。如果被ICTV所批准，目、科和属名为斜体。引用(非斜体)中的分类名表明该类不具有ICTV国际批准的名称。物种(本国)名以标准体给出。指出了未被正规分配为属或科的病毒。

RNA病毒：

ssRNA病毒：科：雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)，属：苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)，模式种：苜蓿花叶病毒，属：等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)，模式种：烟草条纹病毒，属：雀麦花叶病毒组(Bromovirus)，模式种：雀麦花叶病毒，属：黄瓜花叶病毒组(Cucumovirus)、模式种：黄瓜花叶病毒；

科：纺锤病毒科(Closteroviridae)，属：线形病毒组(Closterovirus)，模式种：甜菜根黄病毒，属：线性病毒属(Crinivirus)，模式种：莴苣传染性黄病毒，科：豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，属：豇豆花叶病毒组(Comovirus)，模式种：豇豆花叶病毒，属：豆病毒属(Fabavirus)，模式种：蚕豆萎蔫病毒1，属：蠕传多角体病毒组(Nepovirus)，模式种：烟草环斑病毒；

科：马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，属：马铃薯Y病毒组(Potyvirus)，模式种：马铃薯Y病毒，属：黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)，模式种：黑麦草花叶病毒，属：大麦黄化花叶病毒属(Bymovirus)，模式种：大麦黄花叶病毒；

科：Sequi病毒科(Sequiviridae)，属：Sequi病毒属(Sequivirus)，模式种：欧洲防风黄点病毒，属：矮化病毒属(Waikavirus)，模式种：水稻东格兽球状病毒；科：蕃茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，属：麝香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)，模式种：石竹斑点病毒，属：香石竹病毒组(Dianthovirus)，模式种：香石竹环斑病毒，属：玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，模式种：玉米褪绿斑驳病毒，属：坏死病毒组(Necrovirus)，模式种：烟草坏死病毒，属：番茄丛矮病毒组(Tombusvirus)，模式种：番茄丛矮病毒，ssRNA病毒未分配的属，属：毛状病毒组(Capillovirus)，模式种：苹果凹茎病毒；

属：石竹隐潜病毒组(Carlavirus)，模式种：石竹潜伏病毒；属：碗豆耳突花叶病毒组(Enamovirus)，模式种：豌豆耳突花叶病毒，

属：真菌传棒状病毒组(Furovirus)，模式种：土传小麦花叶病毒，属：大麦病毒属(Hordeivirus)，模式种：大麦条斑花叶病毒，属：悬钩子病毒属(Idaeovirus)，模式种：悬钩子丛矮病毒；

属：黄矮病毒组(Luteovirus)，模式种：大麦黄矮病毒；属：玉米雷亚多非纳病毒属(Marafivirus)，模式种：玉米雷亚多非纳病毒；属：马铃薯X病毒组(Potexvirus)，模式种：马铃薯X病毒；属：南方菜豆花叶病毒组(Sobemovirus)，模式种：南方菜豆花叶病毒，属：细病毒组(Tenuivirus)，模式种：稻条纹病毒，

属：烟草花叶病毒组(Tobamovirus)，模式种：烟草花叶病毒，

属：烟草脆裂病毒组(Tobravirus)，模式种：烟草脆裂病毒，

属：苹果退绿叶斑病毒属(Trichovirus)，模式种：苹果褪绿叶斑病毒；属：芜菁黄化病毒组(Tymovirus)，模式种：芜菁黄花叶病毒；属：伞形植物病毒属(Umbravirus)，模式种：胡萝卜斑点病毒；负ssRNA病毒：目：单负病毒目(Mononegavirales)，科：弹状病毒科(Rhabdoviridae)，属：质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)，模式种：莴苣坏死黄化病毒，属：核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)，模式种：马铃薯黄矮病毒；

负ssRNA病毒：科：布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，属：蕃茄斑萎病毒属(Tospovirus)，模式种：蕃茄斑萎病毒；

dsRNA病毒：科：分体病毒科(Partitiviridae)，属：a潜隐病毒属(Alphacryptovirus)，模式种：白三叶草潜隐病毒1，属：β潜隐病毒属(Betacryptovirus)，模式种：白三叶草潜隐病毒2，科：呼肠病毒科(Reoviridae)，属：斐济病毒属(Fijivirus)，模式种：斐济病病毒，属：植物呼肠病毒属(Phytoreovirus)，模式种：伤瘤病毒，属：矮缩病毒属(Oryzavirus)，模式种：水稻草丛矮化病毒；

未分配的病毒：基因组ssDNA：物种：香蕉束状顶病毒(banana bunchytop virus)，物种：椰子叶衰败病毒(coconut foliar decay virus)，物种：地下三叶草矮病毒(su bterranean clover stunt virus)，

基因组：dsDNA，物种：黄瓜脉黄化病毒(cucumber vein yellowingvirus)；基因组：dsRNA，物种：烟草矮化病毒(tobacco stunt virus)，

基因组：ssRNA，物种：Garlic病毒A、B、C、D，物种：葡萄斑点病毒(grapevine fleck virus)，物种：玉米白线花叶病毒(maize white linemosaic virus)，物种：橄榄潜伏性病毒2型(olive latent virus 2)，物种：Ourmia甜瓜病毒(ourmia melon virus)，物种天竺葵带状斑点病毒(Pelargonium zonate spot virus)；

卫星和类病毒：卫星：ssRNA卫星病毒：亚组2卫星病毒，模式种：烟草坏死卫星病毒(tobacco necrosis satellite)，

卫星RNA，亚组：2B型mRNA卫星，亚组：3C型线性RNA卫星，亚组：4D型环形RNA卫星，

类病毒，模式种：马铃薯纺锤块茎病类病毒(potato spindle tuberviroid)。

不同RNA病毒具有一种或多种病毒蛋白质用于细胞间或短距离移动。例如，在TMV的情形中，需要一种蛋白质(MP)；三联雀麦花叶病毒(BMV)需要两个蛋白质——3a和CP。单联RNA病毒马铃薯X病毒(PVX)具有负责细胞间移动的四种蛋白质：由三基因区段(TGB)编码的蛋白质和外壳蛋白(CP)。但是缺乏细胞间移动所需的两种或多种蛋白质中的一种足以阻断病毒载体的有效短距离移动。就植物病毒移动蛋白的更多细节，参见WJ Lucas近期的综述(2006，Virology，344：169-184)。

在本发明中，所述第一异源核苷酸序列具编码所述RNA复制子的序列区段。可选地，所述第一异源核苷酸序列具有一起编码所述RNA复制子的多于一个的序列区段，即，所述RNA复制子不是由一个连续DNA所编码的。相反，所述RNA复制子是由两个或多个序列区段所不连续编码的，其中所述区段可以彼此邻近存在。所述RNA复制子的形成随后需要所述区段的重排，例如通过重组。用于所述重组的重组酶可以由经改造的植物宿主提供，从而将所述病毒复制子的诱导型表达限制在能够表达所述重组酶的植物宿主中。例如，序列区段可以编码所述RNA复制子的所述聚合酶的一部分，并且编码所述聚合酶的另一部分的另一序列区段可以以相对于与第一序列区段而言被翻转的方向存在于所述第一异源核苷酸序列中。被翻转部分侧翼可以是重组位点(见WO2004/108934)。在该状况中，第一异源核苷酸序列或其序列区段的转录物将不是RNA复制子，因为从转录物中没有翻译出功能性聚合酶。倘若识别重组位点的位点-特异性重组酶允许翻转所述区段之一，从而连续编码复制子。在该实施方案中，提供重组酶可以作用为开关来开启RNA复制子形成以及在诱导的状态中的目的序列的表达，并且有助于高生物安全性。优选地，所述重组酶受到诱导型启动子的控制。如果重组酶被用于开启本发明的过程，可以向所述植物或植物叶瞬时提供所述重组酶，其中所述提供可以作用为开关，用于表达所述一种或多于一种的目的蛋白质。优选地，这样的重组酶可以在植物细胞中被稳定地编码，并且重组酶的表达受到组成型或诱导型启动子的控制。通过诱导所述启动子诱导重组酶表达随后可以引起所述目的序列的表达。在一个实施方案中，重组酶将由所述第一异源核苷酸序列所编码，并且重组酶的表达将受到所述第一异源核苷酸序列的诱导型启动子的控制。

可选地，两种区段可以都存在于稳定掺入到不同的植物染色体中的不同T-DNA上。RNA复制子的形成随后需要两个区段的转录以及两个转录物的反式-剪接，以用于装配所述RNA复制子。这一实施方案可以用于在后代植物或细胞中快速分离一起编码所述RNA复制子的区段，如WO02/097080所述，从而有助于系统的生物安全性。

在实施例中，我们描述了编码一种类型的来源于植物病毒的RNA复制子的转基因植物。但是，在本发明方法中，两种或多种不同的RNA复制子(特别是两种或多种不同的单联RNA复制子)可以用于转基因植物或植物细胞，其中此类不同的RNA复制子优选来源于不同的植物病毒。所述不同RNA复制子所来源的此类不同的植物病毒优选是协同的或非竞争性病毒。“协同的”和“非竞争性”在本文中同义使用。系统病毒可以共存在并且在相同植物细胞中有效扩增。类似地，来自协同RNA病毒的RNA复制子可以共存在并且在相同植物细胞中有效扩增。此类协同的RNA复制子对的实例是一对RNA复制子，其中一个RNA复制子来源于TMV，另一个RNA复制子来源于PVX。此类协同的RNA复制子可以从不同的表达盒中被释放，使用相同或不同的诱导型启动子。在相同的植物细胞中，协同的RNA复制子可以用于表达两个或多个目的蛋白质或蛋白质亚基，例如单克隆抗体的重链和轻链。使用不同(非竞争性)病毒载体在相同植物或在相同植物细胞中表达两个或多个目的蛋白质的方法描述在WO2006/79546(PCT/EP2006/000721)中，其在本文以其全文引用作为参考。

在实施例中，我们在植物细胞中主要使用了农杆菌介导的T-DNA递送，其中所述T-DNA包含所述第一和/或所述第二异源核苷酸序列。可以使用多种方法将载体递送到植物细胞中，例如将异源核苷酸序列通过下述方法直接引入到细胞中：微粒轰击、电穿孔或PEG-介导的原生质体转化。农杆菌介导的植物转化是优选的。因此，可以通过多种技术将异源核苷酸序列转化到植物细胞中，例如通过农杆菌(Agrobacterium)携带的Ti-质粒载体(US5,591,616；US4,940,838；US5,464,763)、粒子或微粒轰击(US05100792；EP 00444882B1；EP 00434616B1)。原则上，其它植物转化方法也可以使用，例如显微注射(WO 09209696；WO 09400583A1；EP175966B1)、电穿孔(EP00564595B1；EP00290395B1；WO 08706614A1)等。转化方法的选择取决于待转化的植物物种及其它。例如对于单子叶植物转化，微粒轰击可以是优选的，而对于双子叶植物，农杆菌-介导的转化一般给出更优结果。

本发明优选用高等多细胞植物进行。用于本发明中的优选的植物包括优先提供农业经济和园艺重要物种的任何植物物种。用于本发明的常规作物植物包括苜蓿、大麦、菜豆、卡诺拉油菜、豇豆、棉、谷类、三叶草、莲、兵豆、羽扇豆、黍、燕麦、豌豆、花生、稻、黑麦、草木樨、向日葵、香豌豆、大豆、高粱、黑小麦、西印度豆薯、黎豆、野豌豆、小麦、紫藤和坚果植物。优选用于实践本发明的植物物种包括但不限于：禾本科(Graminae)、菊科(Compositae)、茄科(Solanacea)和蔷薇科(Rosaceae)的代表。此外用于本发明的优选的物种，以及上文特定指出的那些植物来自属：鼠耳芥属(Arabidopsis)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、金鱼草属(Antirrhinum)、芹属(Apium)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、山白竹属(Bambusa)、芸苔属(Brassica)、雀麦属(Bromus)、Browaalia、山茶属(Camellia)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、鹰嘴豆属(Cicer)、藜属(Chenopodium)、菊苣属(Chichorium)、柑橘属(Citrus)、咖啡属(Coffea)、薏苡属(Coix)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Curcubita)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、曼陀罗属(Datura)、胡萝卜属(Daucus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、属(Eleusine)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、老鹳草属(Geranium)、大豆属(Glycine)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、兵豆属(Lens)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、Majorana、苹果属(Malus)、芒果属(Mangifera)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、龙面花属(Nemesia)、烟草属(Nicotiana)、驴食豆属(Onobrychis)、稻属(Oryza)、稷属(Panicum)、天竺葵属(Pelargonium)、狼尾草属(Pennisetum)、碧冬茄属(Petunia)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、李属(Prunus)、毛茛属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、Ribes、茶

子属(Ricinus)、悬钩子属(Rubus)、甘蔗属(Saccharum)、智利喇叭花属(Salpiglossis)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、狗尾草属(Setaria)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、蜀黍属(Sorghum)、钝叶草属(Stenotaphrum)、可可树属(Theobroma)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、野豌豆属(Vicia)、豇豆属(Vigna)、葡萄属(Vitis)、玉蜀黍属(Zea)、以及莪利竹族(Olyreae)、Pharoideae和许多其它。

在本发明的一个实施方案中，来自TMV的RNA复制子与烟草属植物使用。在另一个实施方案中，来自PVX的RNA复制子与烟草属植物使用。

使用本发明可以以正义或反义方向表达的目的蛋白质或其片段包括淀粉修饰酶(淀粉合酶、淀粉磷酸化酶、脱支酶、淀粉分支酶、淀粉分支酶II、颗粒体结合的淀粉合酶)、蔗糖磷酸合酶、蔗糖磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、多聚果聚糖蔗糖酶、腺苷二磷酸-葡糖焦磷酸化酶、环化糊精糖基转移酶、果糖基转移酶、糖原合酶、果胶酯酶、抑酶肽、抗生物素蛋白、细菌果聚糖蔗糖酶、大肠杆菌(E.coli)glgA蛋白、MAPK4和直向同源物、氮同化/代谢酶、谷氨酰胺合酶、植物渗透蛋白、2S清蛋白、奇异果甜蛋白、位点特异性重组酶/整合酶(FLP、Cre、R重组酶、Int、SSVI整合酶R、整合酶phiC31、或其活性片段或变体)、异戊烯基转移酶、Sca M5(大豆钙调蛋白)、鞘翅类之昆虫型毒素(coleopteran type toxin)或杀虫活性的片段、泛素缀合酶(E2)融合蛋白、代谢脂类、氨基酸、糖类、核酸和多糖的酶、超氧化物岐化酶、蛋白酶的非活性酶原形式、植物蛋白毒素、在纤维生产植物中改变纤维的性状、来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的鞘翅类之昆虫活性毒素(Bt2毒素、杀虫晶体蛋白(ICP)、CryIC毒素、δ内毒素、多肽毒素、毒素原等)、昆虫特异性毒素AaIT、纤维素降解酶、来自解纤维热酸菌(Acidothermus celluloticus)的E1纤维素酶、木质素修饰酶、肉桂酰醇脱氢酶、海藻糖-6-磷酸合酶、细胞分裂素代谢途径的酶、HMG-CoA还原酶、大肠杆菌无机焦磷酸酶、种子贮存蛋白、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)番茄红素合酶、ACC氧化酶、pTOM36编码的蛋白质、肌醇六磷酸酶、酮水解酶(ketohydrolase)、乙酰乙酰辅酶A还原酶、PHB(聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutanoate))合酶、酰基载体蛋白、油菜籽蛋白、EA9、非高等植物八氢番茄红素合酶、pTOM5编码的蛋白质、ETR(乙烯受体)、质体丙酮酸磷酸双激酶(plastidicpyruvate phosphate dikinase)、线虫-诱导型跨膜孔蛋白、增强植物细胞的光合或质体功能的性状、芪合酶(stilbene synthase)，能够羟基化酚类的酶、儿茶酚双加氧酶、儿茶酚2，3-双加氧酶、氯黏康酸环化异构酶、邻氨基苯甲酸合酶、芸苔属AGL15蛋白、果糖1，6-二磷酸酶(FBPase)、AMVRNA3、PVY复制酶、PLRV复制酶、马铃薯Y病毒组外壳蛋白、CMV外壳蛋白、TMV外壳蛋白、黄矮病毒组复制酶、MDMV信使RNA、突变双粒病毒组复制酶、加州月桂(Umbellularia californica)C12：0优选的酰基-ACP硫酯酶、植物C10或C12：0优选的酰基-ACP硫酯酶、C14:0优选的酰基-ACP硫酯酶(luxD)、植物合酶因子A、植物合酶因子B、6-去饱和酶、在植物细胞中脂肪酸的过氧化物酶体(peroxysomal)-氧化中具有酶促活性的蛋白质、酰基辅酶A氧化酶、3-酮脂酰辅酶A硫解酶、脂肪酶、玉米乙酰辅酶A羧化酶、5--烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(EPSP)、膦丝菌素乙酰基转移酶(BAR、PAT)、CP4蛋白、ACC脱氨酶、核酶、具有翻译后切割位点的蛋白质、由Gal4转录激活子的DNA结合结构域和转录激活结构域组成的蛋白质融合、能够将融合蛋白靶向到脂相的油质蛋白与目的蛋白质的翻译融合、赋予氨磺酰抗性的DHPS基因、细菌腈水解酶、2，4-D单加氧酶、乙酰乳酸合酶或乙酰羟酸合酶(ALS、AHAS)、多聚半乳糖醛酸酶、细菌腈水解酶、位于质体的内包膜的成熟磷酸易位蛋白的氨基末端疏水区域与待靶向到所述膜中的目的蛋白质的融合等。

可以使用本发明的系统表达任何人或动物蛋白质。此类目的蛋白质的实例包括下述蛋白质(药物蛋白质)等：免疫应答蛋白(单克隆抗体、单链抗体、T细胞受体等)、抗原、集落刺激因子、松弛素、多肽激素、细胞因子及其受体、干扰素、生长因子和凝固因子、酶促活性的溶酶体酶、纤维蛋白溶酶多肽、凝血因子、胰蛋白酶原、1-抗胰蛋白酶(AAT)，以及功能性保守的蛋白质例如上述蛋白质融合体(fusion)、突变形式和合成衍生物。

本专利申请要求优先权的在2006年5月29日提交的欧洲专利申请No.06 011 002和2006年6月2日提交的美国临时专利申请60/810,398的公开内容在本文以其全文引入作为参考。

实施例

实施例1

IPTG-诱导型lac-系统：构建体设计

使用引物lacIpr1(SEQ ID NO：1)(5’-gat cca tgg aac cag taa cgt tatac-3’)和lacIpr2(SEQ ID NO：2)(5’-tc tgg atc ctc act gcc cgc ttt cca gtc g-3’)通过PCR扩增lac阻抑物(lacI，Acc.J01636)，并将其作为NcoI-BamHI片段克隆进标准二元载体pICBV1中，产生构建体pICH17155(图2A)。通过使用引物lacIpr5(SEQ ID NO：3)(5’-cgc cat ggg ccc taa gaa gaa gaggaa ggt tga acc agt aac gtt ata cga tgt c-3’)替代lacIpr1将核定位信号(NLS)引入N-末端，给出构建体pICH17401(图2A)。将这一构建体稳定转化到烟草和本生烟植物中，使用标准的转化技术(Horsh等人，1985，Science，227，1229-1231)。

将合成的lac操纵基因序列(SEQ ID NO：4)(aat tgt gag cgc tca caa tt)引入一些病毒载体的TATA-框和肌动蛋白2-启动子的转录起始之间(An等人，1996，PlantJ.，10：107-121)。这是通过将两个重叠的PCR-产物组合进行的，所述PCR-产物是用引物A：brb4nosph(SEQ ID NO：5)(5’-ggaacc ctg tgg ttg gca cat-3’)和lacOact2pr2(SEQ ID NO：6)(5’-cga att gtgagc gct cac aat tta tat agg cgg gtt tat ctc-3’)和引物B：lacOactpr1(SEQ IDNO：7)(5’-taa att gtg agc gct cac aat tcg ctt tga agt ttt agt ttt att g-3’)和rdrppr4(SEQ ID NO：8)(5’-ttt ctgcag gaa atg aaa ggc cgc gaa aca ag-3’)来制备的。将得到的产物作为Kpn1-SphI片段克隆到病毒载体pICH16141中，得到载体pICH17171。其它病毒载体是通过使用方便的限制性酶亚克隆启动子而源自pICH17171的。这些载体被优化用于表达(Marillonnet等人，2005，Nat Biotechnol.，23：718-723)，并且包含完全的MP(pICH18867)或MP的缺失(pICH17171)。此外，构建了5’-前载体(pICH17424)(Marillonnet等人，2004，Proc Natl Acad Sci USA，101：6852-6857)，其被证明对于瞬时测试是有用的(见实施例2)。

实施例2

瞬时系统中阻抑效率的测试

在测试中使用具有不同构建体的农杆菌菌株混合物进行瞬时表达实验。我们在瞬时测定中使用完整装配的病毒载体时不能观察到任何阻抑。最有可能地，构建体在阻抑物翻译前已经被转录为病毒RNA复制子。因此，我们使用病毒前载体pICH17424(图2A)和pICH6892(Marillonnet等人，2004，Proc Natl Acad Sci USA，101：6852-6857)，它们在植物中通过位点特异性重组酶的活性被装配成为病毒RNA复制子的DNA前体(Marillonnet等人，2004，Proc Natl Acad Sci USA，101：6852-6857)。这一额外步骤将延迟病毒载体的装配并且为阻抑物被翻译并且结合到病毒构建体中的操纵基因序列提供了足够的时间。事实上，使用这一方法，我们可以看到病毒扩增的强阻抑(图3)。

实施例3

在稳定转化的植物中的lacI阻抑物活性以及通过IPTG的诱导

使用标准转化技术，在烟草和本生烟植物中稳定转化阻抑物构建体pICH17401(图2A)(Horsh等人，1985，Science，227，1229-1231)。通过用包含lacO的病毒构建体进行经转化植物的农杆菌浸润来证明阻抑物活性(图4A)。通过用相同构建体并且在浸润缓冲液中包括IPTG的农杆菌浸润类似地测试诱导性(图4B)。

实施例4

用病毒构建体再次转化包含阻抑物的植物

携带在其基因组中稳定整合的lacI-阻抑物重组DNA(pICH17401，图2A)的烟草植物用包含lac操纵基因的完整的病毒载体构建体(pICH18867，图2A)第二次进行转化。可以再生一些植物，但是它们全部都显示出或多或少的病毒载体的严重背景表达。

将IPTG(5mM)浸润到双转化体的叶中可以实际上在一些转基因植物中诱导RNA复制子的扩增(图5)。但是，我们发现，具有RNA复制子的渗漏表达的所有初级转化体都最终将被转基因沉默并且产生在诱导条件下不显示任何RNA复制子释放的后代。

实施例5

用于乙醇诱导型系统的构建体的设计

乙醇诱导型系统的原理由Caddick和其同事所描述(1998，NatBiotechnol.，16：177-180)。如Caddick和其同事所描述的(1998，NatBiotechnol.，16：177-180)，设计受到CaMV35S启动子控制的转录激活子alcR(构建体pICH18693，图2B)。这一构建体被稳定转化到烟草和本生烟植物中(Horsh等人，1985，Science，227，1229-1231)。通过PCR使用引物alcApr1(SEQ ID NO：9)(5’-cat gaa ttc tag gat tgg atg cat gcg g-3’)和alcApr2(SEQ ID NO：10)(5’-cag ctc gag gtc gtc ctc tcc aaa tga aat g-3’)扩增alcA启动子，并且将其作为EcoRI-Xho1片段与基于TMV的病毒载体相融合(所述病毒载体具有功能性MP(pICH18969，图2B)或不具有功能性MP(pICH18951，图2B))，以及独立地与功能性病毒MP(pICH19940，图2B)相融合。此外，将构建体pICH18951和pICH19940组合到一个载体(pICH20592，图2B)中。除了pICH18969外的所有这些构建体被转化到烟草和本生烟中，使用标准转化技术。不能获得这样的初级转化体，其具有编码有功能性MP的RNA复制子的构建体。

还使用引物alcApr4(SEQ ID NO：11)(5’-cgc gca tgc tac tag gat tggata cat gcg gaa c-3’)和alcApr5(SEQ ID NO：12)(5’-ttt ggt ctc atc aac tccaaa tga aat gaa ctt cc-3’)扩增alcA启动子，并将其作为SphI-BsaI片段克隆到基于PVX的病毒载体pICH25233中，替换35S启动子并且给出构建体pICH26022(图2C)。alcA启动子与参与细胞间移动的PVX外壳蛋白的融合(pICH26356，图2C)是通过将来自pICH19940的EcoRI-SacI片段克隆到pICH22066中所进行的。

实施例6

由乙醇诱导的TMV-构建体的瞬时表达

在本生烟植物中通过农杆菌浸润测试上述构建体(图6)。在浸润后2天用4％乙醇溶液或用水(作为对照)处理植物。病毒载体的扩增和GFP的表达仅在乙醇处理的植物中并且仅在激活子alcR存在时被诱导。在alcR存在时在对照植物中观察到非常弱的背景表达。

实施例7

由乙醇诱导的PVX-构建体的瞬时表达

将alcA-CP构建体(pICH26356)与alcR(pICH18693)和CP-缺乏的病毒载体(pICH21692)共浸润。仅在用乙醇处理的植物上可以检测到细胞间移动，对于35S启动子-CP构建体不能观察到差异(图7)。

实施例8

用病毒构建体pICH18951和pICH20592稳定转化的植物的分析

根据标准方案转化本生烟和烟草植物(Horsh等人，1985，Science，227，1229-1231)。通过用alcR构建体(pICH18693)的农杆菌浸润和乙醇处理，就转基因的存在分析再生的植物。事实上，大多数植物在叶的浸润部分中显示出GFP-表达，并且在其它部分中没有背景。

实施例9

整株转基因植物的诱导

将包含pICH18951或pICH20592的转基因植物(在实施例8中描述的)与包含转录激活子alcR(pICH18693)的那些杂交。通过用4％乙醇喷雾或者通过根浸泡(用1％乙醇)和喷雾(4％乙醇)的组合来用乙醇处理那些植物的F1后代。在这些植物的几乎全部部分中检测到病毒扩增以及因此的GFP-表达(图9)。最特别地，还在用根浸泡处理的那些植物的茎和叶柄中检测到强表达。植物的这些部分通常不显示或仅显示微弱的表达，这使用标准的放大方法，即整株植物的真空-浸润(Marillonnet等人，2005，Nat.Biotechnol.，23：718-723)。用4％乙醇喷雾植物而不用根浸泡导致GFP仅在软的叶组织中表达，而不再茎和叶柄中表达(图10)。

实施例10

诱导型病毒载体系统用于在植物中表达重组拟酶肽的用途

以与质粒pICH20592(见实施例5)类似的方式设计质粒pICH25408(图11)。根据标准方案用pICH25408转化本生烟植物(Horsh等人，1985，Science，227，1229-1231)。通过用alcR构建体(pICH18693)的农杆菌浸润和乙醇处理随后通过用聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)电泳进行重组蛋白质的表达分析，就转基因的存在分析再生的植物。用alcR构建体(pICH18693)农杆菌浸润以及用乙醇处理的叶组织的部分被用于总可溶性蛋白质提取，这通过2×Laemmli缓冲液(125mM tris-HCl，pH7.8，10％-巯基乙醇，20％甘油，0.001％溴酚蓝，10％SDS)，然后通过在PAAG中电泳分离。就不同初级转化体的此类分析的结果显示在图12中。

在下一步中，将用pICH25408转化的植物与携带alcR基因(pICH18693)的植物杂交。将从用乙醇处理后的F1后代的叶组织中分离的总可溶性蛋白质在PAAG上进行分析。分析结果显示在图13中。很明显拟酶肽高水平表达(大约1mg/g的新鲜叶生物质)。

序列表

<110>爱康遗传有限公司(Icon Genetics GmbH)

<120>植物基于病毒的诱导型表达系统

<130>PCT-14361

<140>PCT/EP2007/4688

<141>2007-05-25

<150>EP06011002.0

<151>2006-05-29

<150>US60/810,398

<151>2006-06-02

<160>12

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>1

gatccatgga accagtaacg ttatac        26

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>2

tctggatcct cactgcccgc tttccagtcg    30

<210>3

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>3

cgccatgggc cctaagaaga agaggaaggt tgaaccagta acgttatacg atgtc    55

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>4

aattgtgagc gctcacaatt                                           20

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

ggaaccctgt ggttggcaca t                                         21

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

cgaattgtga gcgctcacaa tttatatagg cgggtttatc tc     42

<210>7

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

taaattgtga gcgctcacaa ttcgctttga agttttagtt ttattg 46

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

tttctgcagg aaatgaaagg ccgcgaaaca ag    32

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

catgaattct aggattggat gcatgcgg         28

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>10

cagctcgagg tcgtcctctc caaatgaaat g     31

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>11

cgcgcatgct actaggattg gatacatgcg gaac     34

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>12

tttggtctca tcaactccaa atgaaatgaa cttcc    35

Claims (14)

1.产生一种或多于一种的目的蛋白质的方法，其包括

(a)提供植物或植物细胞，其包含

(i)在核染色体中的第一异源核苷酸序列，其包含

编码RNA复制子的核苷酸序列，以及

与所述编码所述RNA复制子的核苷酸序列有效相连的第一诱导型启动子；

所述RNA复制子不编码这样的蛋白质，所述蛋白质在所述植物中提供了所述RNA复制子的细胞间的移动；

所述RNA复制子编码用于复制所述RNA复制子的聚合酶和所述一种或多于一种的目的蛋白质；以及

(ii)包含编码蛋白质的序列的第二异源核苷酸序列，所述蛋白质使得所述RNA复制子能够细胞间移动，其中所述第二异源核苷酸序列包含第二诱导型启动子，所述启动子与编码使得所述RNA复制子能够细胞间移动的所述蛋白质的所述序列有效连接；以及

(b)在步骤(a)的所述植物或植物细胞中分别诱导所述第一和所述第二诱导型启动子，从而在所述植物中或在所述植物细胞中产生所述一种或多于一种的目的蛋白质，其中所述第一和所述第二诱导型启动子是由相同的诱导信号诱导的。

2.根据权利要求1的方法，其中所述第一或所述第二诱导型启动子是化学诱导型启动子。

3.根据权利要求2的方法，其中所述化学诱导型启动子选自乙醇-诱导型启动子、IPTG-诱导型启动子和四环素-诱导型启动子。

4.根据权利要求1至3的任一项的方法，其中所述诱导型启动子是热激诱导型启动子。

5.根据权利要求1的方法，其中所述RNA复制子来源自正义单链RNA病毒。

6.根据权利要求5的方法，其中所述正义单链RNA病毒是烟草花叶病毒或马铃薯X病毒。

7.根据权利要求1的方法，其中所述植物包含第三异源核苷酸序列，所述第三异源核苷酸序列包含编码另一RNA复制子的核苷酸序列以及与编码所述另一RNA复制子的所述序列有效连接的第三诱导型启动子，所述另一RNA复制子不编码在所述植物中提供所述RNA复制子或所述另一RNA复制子的细胞间移动的蛋白质，所述另一RNA复制子编码目的蛋白质。

8.根据权利要求7的方法，其中所述植物包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列包含编码使得所述另一RNA复制子能够细胞间移动的蛋白质的核苷酸序列，其与编码使得所述RNA复制子能够细胞间移动的所述蛋白质的核苷酸序列有效连接。

9.根据权利要求8的方法，其中使得所述RNA复制子能够细胞间移动的所述蛋白质和使得所述另一RNA复制子能够细胞间移动的所述蛋白质是相同的蛋白质或不同的蛋白质。

10.根据权利要求7至9中任一项的方法，其中所述第三诱导型启动子是由与所述第一诱导型启动子相同的诱导剂所诱导的。

11.根据权利要求7的方法，其中所述RNA复制子和所述另一RNA复制子是非竞争性复制子。

12.根据权利要求11的方法，其中所述非竞争性复制子是来源自不同病毒属的植物病毒的植物病毒复制子。

13.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)包括从种子生长植物，所述种子包含所述第一异源核苷酸序列以及任选地所述第二和/或第三异源核苷酸序列。

14.植物细胞，其包含

(i)在核染色体中第一异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列包含编码RNA复制子的核苷酸序列和与编码所述RNA复制子的所述核苷酸序列有效连接的第一诱导型启动子；

所述RNA复制子不编码在所述植物中提供所述RNA复制子的细胞间移动的蛋白质；

所述RNA复制子编码用于复制所述RNA复制子的聚合酶；以及

(ii)包含编码蛋白质的核苷酸序列的第二异源核苷酸序列，所述蛋白质使得所述RNA复制子能够细胞间移动，其中所述第二异源核苷酸序列包含第二诱导型启动子，所述启动子与编码使得所述RNA复制子能够细胞间移动的所述蛋白质的所述核苷酸序列有效连接。

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