MXPA05013000A - Produccion segura de un producto de interes en semillas hibridas - Google Patents

Abstract

Un proceso para la producción de un producto de interés en una semilla F1 obtenida por una hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, la hibridación genera una dotación genética en la semilla F1 para la producción combinando en la semilla F1 primera y segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda plantas madre transgénicas, seguido por el aislamiento del producto de interés de la semilla F1 o una planta de semillero de la misma.

Description

PRODUCCIÓN SEGURA DE UN PRODUCTO DE INTERÉS EN SEMILLAS HÍBRIDAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un proceso de alto rendimiento y producción segura de un producto de interés en semillas híbridas (semillas Fl) . La invención también se relaciona con semillas producidas por este y con un producto de interés aislado de las semillas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los problemas principales de los procesos de ingeniería genética actuales de plantas pueden ser resumidos como sigue: 1. Rendimiento generalmente bajo del producto de interés. Los ejemplos son proteínas farmacéuticas, enzimas, otras proteínas, polímeros, azúcares, polisacáridos, etc. Bajo rendimiento significa costos de purificación/ procesamiento corriente abajo altos. 2. Contaminación genética debido al cruce libre de plantas modificadas genéticamente con variedades no transgénicas o familiares naturales así como la presencia de plantas "voluntarias" en los campos después de la cosecha. Esos eventos ocurren fácilmente de manera espontánea debido a que las plantas son organismos que se reproducen por sí mismos o debido a errores humanos o acciones deliberadas. Ambos problemas son el otro lado de la moneda del mismo problema: el bajo rendimiento es usualmente el resultado de nuestro deseo de construir una planta que sea productora y que al mismo tiempo retenga la capacidad de pasar a través de un ciclo de desarrollo y reproducción completo. Combinar el proceso de desarrollo y reproducción con el proceso de expresión trasnsgénica no da una solución. Los sistemas de expresión transgénica inducibles (US 05187287; ÜS05847102; Mett et al . , 1993, Proc. Nati . Acad. Sci . , 90, 4567-4571; Aoyama & Chua, 1997, Plant J. , 11, 605-612; McNellis et al . , 1998, Plant J. , 14, 247-257 ; ÜS06063985; Caddick et al . , 1997, Na ture Biotech, 16, 177-180; WO09321334; Weinmann et al . , 1994, Plant J. , 5, 559-569) o específicos de un órgano (US05955361 ; WO09828431; De Jaeger et al., 2002, Nature Biotech. , 20_, 1265-1268) tampoco proporcionan una solución al problema de contaminación genética y no proporcionan un alto rendimiento del producto de interés. Todos los promotores inducibles y específicos de un tejido usados en los sistemas mencionados anteriormente tienen actividad basal, por ejemplo, son "permeables", los cuales en el curso de generaciones producen silenciamiento transgénico, haciendo disminuir inevitablemente el rendimiento del producto de interés. Además, el rendimiento no es el único problema, dado que las plantas transgénicas que contienen genes recombinantes bajo el control de esos sistemas inducibles no satisfacen criterios de bioseguridad rigurosos, por ejemplo en el caso de la producción de biofármacos recombinantes. El uso de vectores de amplificación basados en elementos virales de plantas puede proporcionar potencialmente una solución parcial a los problemas mencionados, especialmente cuando esos vectores son usados para la expresión transitoria (US5491076; ÜS5977438; ÜS5316931; US5589367; US5866785; WO0229068) . Sin embargo, la mayoría de los vectores para experimentos de expresión transitoria fueron desarrollados para especies de plantas seleccionadas, predominantemente de la familia Nicotiana (US5466788; ÜS5670353; ÜS5866785; WO02088369) . La eficiencia de los vectores virales para la producción de proteína/ARN recombinante de interés es determinada también por su capacidad para el movimiento eficiente célula a célula y sistémico. Los últimos parámetros dependen de la especie y la variedad, restringiendo de este modo severamente la libertad de elección de anfitriones para la expresión transitoria. Una solución potencial a este problema es el diseño de plantas transgénicas que contengan el vector viral integrado de manera estable en el ADN cromosomal. El uso de los vectores virales diseñados para la expresión de secuencias ajenas en plantas vía transfección o incorporación estable en el ADN cromosomal de la planta fue descrito en numerosas revisiones (Stanley, J., 1993, Curr Opin Genet Dev. , 3_, 91-96; Schlesinger, S. 1995, Mol Biotechnol . , 3 155-165; Porta, C. & Lomonossoff, G. 2002, Biotechnol . & Genet . Eng. Rev. , 19,245-291; Awram et al . , 2002 ñdv Virus Res . , 58, 81-124). Sin embargo, los intentos por diseñar plantas transgénicas con un vector de amplicon integrado de manera estable en el ADN cromosomal usualmente enfrenta el problema del silenciamiento transgénico, tornando de este modo este método inútil. En el mejor caso, proporciona un rendimiento que es ligeramente mayor que el proporcionado por un promotor constitutivo fuerte, como se mostró a finales de los años 80 por Hayes y sus colegas para los genes GUS y NPT (Hayes et al., 1989, Nucí . Acids Res . , 17 2391-2403). Desde entonces no ha habido un progreso significativo para lograr la producción de una proteína recombinante biológicamente segura, con un alto rendimiento, en plantas transgénicas basado en replicones virales. El trabajo de Mallory y sus colegas (2002, Nature Biotechnol . , 2_0, 622-625) sobre amplicones en plantas híbridas, por el que se proporciona a las plantas híbridas un supresor de silenciamiento genético postranscripcional (PTGS) , ofrece una solución parcial al problema. Sin embargo, este método no dio un alto rendimiento de un producto de interés, dado que no es compatible con el desarrollo de la planta normal. Además, no se resolvieron los problemas de bioseguridad. Gooding y sus colegas (1999, Nucleic Acids Res . , 27, 1709-1718) reportaron la replicación de vectores geminivírales en embriones de trigo aislados en un estudio científico. Las aplicaciones técnicas posibles no fueron tratadas. Además, este método no puede ser escalado y por lo tanto no es útil para aplicaciones técnicas. Por lo tanto un objetivo de la invención es proporcionar un proceso novedoso para producir un producto de interés, como una proteína de interés en un sistema de producción de planta, especialmente con alto rendimiento. Otro objetivo de la invención es proporcionar un proceso biológicamente seguro para producir un producto de interés, especialmente una proteína de interés, en un sistema de producción de planta, por el que la distribución en el ambiente del material genético transgénico implicado en el proceso es fuertemente controlado y ocurre con baja probabilidad. ün objetivo más de la invención es proporcionar un proceso para producir un producto de interés como una proteína de interés en un sistema de producción de planta, por el que el crecimiento de la planta y el aislamiento del producto de interés pueden ser desacoplados en espacio y tiempo sin pérdida de rendimiento o calidad del producto de interés .

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN Esos objetivos son logrados por el proceso de producción de un producto de interés en una semilla Fl, que comprende: obtener la semilla Fl mediante una hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, generando la hibridación una dotación genética en la semilla Fl para la producción combinando en la semilla Fl la primera y segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda plantas madre transgénicas. El producto de interés puede entonces ser aislado de la semilla Fl o una planta de semillero de la misma. La invención proporciona además un proceso para la producción de un producto de interés en una semilla Fl obtenida por medio de una hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, generando la hibridación una dotación genética en la primera semilla Fl para la producción combinando la semilla Fl a la primera y segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda planta madres transgénicas, por lo que el producto de interés no es expresado en la primera o la segunda planta madre, seguido por el aislamiento del producto de interés de la semilla Fl o una planta del semillero de la misma . La invención proporciona además un proceso para la producción de un producto de interés en una semilla Fl obtenida mediante una hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, generando la hibridación una dotación genética en la semilla Fl para la producción combinando en la semilla Fl la primera y segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda plantas madre transgénicas, por lo que el producto de interés no es expresado en la primera o la segunda planta madre, siendo el producto de interés una proteína de interés, seguido por el aislamiento del producto de interés de la semilla Fl o una planta del semillero de la misma. Además, se proporcionan las semillas producidas o producibles por los procesos anteriores y el producto de interés aislado de las semillas. Preferiblemente, la reproducción sexual de una planta que crece de las semillas es menoscabada, de manera más preferible, la planta es sexualmente estéril. Los inventores de la invención han encontrado un proceso para producir un producto de interés en semillas de planta (semillas Fl) . La dotación genética requerida para el proceso es generada en las semillas hibridando plantas madre, es decir que ninguna de las plantas madre tiene la dotación genética completa requerida para el proceso. Las semillas donde el producto de interés es producido son destruidas cuando el producto es aislado de las mismas. En consecuencia, el proceso de la invención es de seguridad biológica- alta, puesto que la dotación genética requerida para el. _ proceso tiene una probabilidad muy baja de ser distribuido al ambiente. Adicionalmente, las semillas Fl pueden ser estériles para mejorar aún más la seguridad biológica, puesto que una planta que crezca de la semilla no podrá reproducirse. Además, el proceso de la invención tiene la' ventaja, sorprendente de que el silenciamiento genético no es un problema para la producción del producto de interés. Esto puede deberse a la coexistencia corta de las dotaciones' genéticas parciales de las plantas madre en las semillas. De manera notable, puesto que la producción del producto de interés no ocurre básicamente en las plantas madre, no puede ser transmitido el silenciamiento transgénico a las semillas. Puesto que el silenciamiento transgénico difícilmente ocurre, el producto de interés puede ser producido con un alto rendimiento. Una ventaja más - "de la invención es que la planta que crezca y el aislamiento del producto de interés pueden ser separados en espacio y tiempo, puesto que el producto de interés es usualmente más estable en las semillas que en otros tejidos de la planta. Esto agrega flexibilidad al proceso total de la invención..

La primera y segunda plantas madre transgénicas contienen la primera y segunda dotación genética parcial, respectivamente. Las dotaciones genéticas parciales son preferiblemente transgénicas. La hibridación de la primera y segunda plantas madre transgénicas generan la dotación genética en la semilla Fl obtenida por esa hibridación. La generación de la dotación genética en la semilla dispara la producción del producto de interés en la semilla. Hibridar significa preferiblemente polinización cruzada de la primera y segunda plantas madre transgénicas. La hibridación combina la primera y segunda dotaciones genéticas parciales en la semilla Fl para dotar a la semilla Fl con una dotación genética. Ambas de la primera y segunda dotaciones genéticas son necesarias para la producción del producto de interés en la semilla. Por lo tanto, el producto de interés no es expresado en la primera o la segunda plantas madre transgénicas. Niveles menores de producción del producto de interés pueden tomar lugar en una planta madre, por ejemplo debido a la expresión permeable de la primera y segunda dotaciones parciales. Esa expresión permeable es demasiado débil para una producción económica del producto de interés. Preferiblemente, sin embargo, no toma lugar la producción del producto de interés ni en la primera ni en la segunda plantas madre. El producto de interés producido por el proceso es preferiblemente una proteína de interés, por ejemplo una proteína farmacéutica. También pueden ser producidas dos, tres o más proteínas de interés en semillas de acuerdo a la invención. La proteína de interés es preferiblemente una proteína que es heteróloga a la planta de la semilla. La proteína de interés puede ser una enzima. Si la enzima es producida en la semilla, el producto también puede ser un compuesto químico que sea producido en la semilla inter alia , por la acción de la enzima. Pueden ser necesarias dos, tres o más enzimas para la producción del compuesto químico. Los ejemplos de compuestos químicos que pueden ser producidos usando la invención incluyen vitaminas, polímeros (por ejemplo ácido polihidroxibutírico y otros poliésteres biodegradables), ácidos grasos, grasa, aceite, carbohidratos, isoprenoides superiores, etc. Las semillas que contienen el producto de interés pueden ser cosechadas de una planta madre y las proteínas de interés o los compuestos químicos pueden ser aislados de las semillas de acuerdo a procedimientos conocidos. Las semillas de las cuales el producto de interés es aislado pudieron haber germinado. El producto de interés puede acumularse en el embrión en desarrollo, en el endospermo, en los cotiledones o en semillas en germinación. La producción del producto o proteína de interés por la generación de la dotación genética puede ser lograda en muchas formas diferentes. Si va a ser producida una proteína, cada dotación genética parcial puede proporcionar una parte de una secuencia codificadora para la proteína, las partes pueden ser combinadas en la semilla por ejemplo, por recombinación a nivel del ADN, o por transempalme de ARN o al nivel del ARN, o por transempalme de proteína al nivel de la proteína. Otro método general es proporcionar la secuencia codificadora de la proteína de interés con la primera dotación parcial en una forma donde la proteína no sea expresable y proporcionar un componente genético con la segunda dotación parcial que dispare la expresión de la proteína. La expresión puede ser disparada, por ejemplo, proporcionando con la segunda dotación parcial una ARN polimerasa que permita la transcripción de la secuencia codificadora de un promotor heterólogo no reconocido por las polimerasas nativas de la planta, o proporcionando con la segunda dotación parcial una recombinasa que transforme la secuencia codificadora expresable por ejemplo colocando la secuencia codificadora bajo el control del promotor. Para incrementar aún más el control sobre la producción del producto de interés en las semillas, la secuencia codificadora de la recombinasa u otra enzima que active o dispare la producción puede ser dividida en dos fragmentos. Un fragmento puede ser proporcionado a las semillas por la primera planta madre, el otro fragmento puede ser proporcionado a la semilla por la segunda planta madre. Los dos fragmentos pueden ser expresados bajo el control de dos promotores diferentes regulados de manera desarrollística y montados en la recombinasa activa o enzima por transempalme mediado por inteina en las semillas Fl . De esta forma, el inicio de la producción de producto de interés puede ser controlado, por ejemplo puede ser cambiado a una etapa final de desarrollo de la semilla. Los detalles sobre el transempalme mediado por inteina pueden encontrarse en la PCT/EP03/02986. En una modalidad importante, la dotación genética comprende un ADN replicante o un ARN replicante generado por la hibridación. El ADN replicante o el ARN replicante están implicados en la producción del producto de interés. Preferiblemente, la proteína de interés es expresada del ADN replicante o el ARN replicante. El ADN replicante puede ser un replicón, es decir, que puede tener un origen de replicación funcional en la semilla. Preferiblemente, el replicón es un replicón viral, es decir que puede tener componentes de un ADN virus similar a una secuencia que codifique para una replicasa ADN viral o una proteína implicada en la propagación del replicón viral de célula a célula. De manera similar el ARN replicante puede ser un replicón de ARN, es decir que puede tener un origen de replicación funcional en las semillas. Preferiblemente, el replicón de ARN es un replicón viral, es decir que puede tener componentes de un ARN virus similares a una secuencia que codifique para una ARN polimerasa dependiente del ARN viral o una proteína implicada en la propagación del replicón viral de célula a célula. De manera más preferible, el replicón ADN viral o el replicón ARN viral puede codificar para la proteína de interés. El ADN replicante o el ARN replicante puede ser de origen viral de planta. El ADN replicante puede basarse en un geminivirus . En el caso de un ARN replicante, el ARN replicante se basa preferiblemente en un ARN virus de una sola hebra en sentido positivo. Los ARN virus de una sola hebra de sentido positivo son los tobamovirus . De manera más preferible, el ARN replicante se basa en el Virus del Mosaico del Tabaco. El ADN replicante o el ARN replicante puede ser generado en la semilla Fl a partir de un componente de la primera dotación genética parcial y un componente de la segunda dotación genética parcial. Un replicón de ADN puede ser generado en la semilla hibridando una primera planta madre que tenga integrado en su genoma un precursor del replicón como la primera dotación genética parcial con una segunda planta madre que pueda contener o codificar para un componente capaz de generar (o producido por replicación) el replicón del precursor. El componente proporcionado con la segunda planta madre puede ser una enzima (como una recombinasa específica del sitio, una flipasa o una integrasa) capaz de generar el replicón rearreglando el precursor del replicón. Los ejemplos para esta modalidad se muestran en las Figuras 3, 7 y 9. El ARN replicante puede ser generado a partir de un componente de la primera dotación genética parcial y un componente de la segunda dotación genética parcial por recombinación específica del ARN. De manera alternativa, la primera dotación genética parcial puede comprender un precursor del ARN replicante. El precursor puede ser una copia del ADN del ARN replicante que esté integrada en el genoma de la primera planta madre. El ARN replicante puede entonces ser generado de la semilla por la transcripción de la copia de ADN del ARN replicante por un componente, especialmente una ARN polimerasa, codificada en la segunda dotación genética parcial. Si es usada un ARN polimerasa como componente, la ARN polimerasa deberá ser adaptada al promotor usado para transcribir la copia de ADN del ARN replicante. Si el producto de interés, especialmente la proteína de interés, es codificado en una primera dotación genética parcial y la segunda dotación genética parcial proporciona por ejemplo una función reguladora de la producción, la primera dotación genética parcial es proporcionada preferiblemente a la hibridación por la planta madre hembra. De manera más preferible, la planta madre hembra es un macho estéril. De esta manera, puede mejorarse aún más la seguridad biológica, puesto que nada del polen de esta primera planta madre transgénica (hembra) es distribuido al ambiente, y el polen de la segunda planta madre (macho) no codifica para el producto de interés. De manera similar, si la dotación genética comprende un ADN replicante o ARN replicante, el ADN o ARN replicante es proporcionado preferiblemente por la dotación genética parcial de la planta madre hembra. La primera dotación genética parcial y la segunda dotación genética parcial están integradas preferiblemente en la planta madre respectiva, de modo que puedan ser transmitidas a la semilla. Para este propósito, ellas son integradas preferiblemente, de manera estable, en los genomas de las plantas madre. Las plantas madre pueden ser producidas transformando plantas con un vector que contenga la dotación genética parcial deseada de acuerdo a métodos conocidos de biotecnología de plantas. Las plantas madre se vuelven preferiblemente homocigóticas con respecto a la dotación genética parcial. Las líneas de plantas madre pueden propagarse y mantenerse por sí mismas. Las semillas de la invención (semillas Fl) pueden ser cosechadas y usadas para aislar el producto de interés.

Por lo tanto, el material transgénico que incluye la dotación genética contenida en las semillas no es distribuido hacia el ambiente o propagado por transferencia a la progenie de las semillas. Preferiblemente, la reproducción sexual de las plantas que crecen de las semillas es menoscabada, preferiblemente abolida, y de manera más preferible, las semillas Fl son estériles para evitar la transferencia del material transgénico a la progenie de las semillas. En modalidades preferidas, la reproducción sexual de las plantas que crecen de las semillas es menoscabada o las semillas son estériles debido a la fuerte expresión del producto de interés o debido a la fuerte replicación del ARN o ADN replicante. De manera alternativa o adicional, el desarrollo de plantas que crecen de las semillas es bloqueado por modificación genética antes de alcanzar la etapa de crecimiento reproductivo, lo cual puede ser logrado por la expresión específica en el tejido de una sustancia tóxica o una proteína tóxica que interfiera con el desarrollo normal de la planta. Esa proteína tóxica puede ser seleccionada del grupo que consiste de la barnasa, proteína de Shiga, factores de transcripción de plantas, o enzimas que controlan el estado hormonal de la planta. Preferiblemente, el desarrollo de la planta es bloqueado antes de la etapa de floración, de manera más preferible antes de que se formen las primeras hojas. Una proteína tóxica (como la barnasa, véase el ejemplo 5) puede ser expresada como fragmentos de proteína que generan la función de la proteína tóxica tras el transempalme de la proteína de fragmentos de proteína para formar la proteína tóxica funcional. Si la proteína tóxica es expresada como dos fragmentos, esos dos fragmentos pueden ser transcritos bajo el control de dos promotores diferentes, especialmente dos promotores específicos de tejido diferentes o dos promotores desarrollísticamente activos diferentes. La formación de la proteína tóxica funcional puede entonces depender de dos promotores que tengan diferentes especificidades tisulares, es decir, que la proteína tóxica se forma en forma activa en tejidos donde ambos promotores son activos. Este método permite el control mucho más estricto sobre la expresión de la proteína tóxica funcional que el que puede ser logrado con un solo promotor específico de un tejido lo cual con frecuencia dará una expresión permeable. Además, este método permite lograr patrones de expresión novedosos, por ejemplo un patrón de expresión que no puede . ser logrado con un promotor específico de un tejido, conocido; combinar diferentes promotores específicos de un tejido para dos fragmentos abre una diversidad de combinaciones de posibles patrones de expresión.

El proceso de la invención muestra todo su potencial en aplicaciones a gran escala. A gran escala significa la aplicación con muchas plantas al mismo tiempo, por ejemplo, en un invernadero. De manera más preferible, a gran escala significa la aplicación en campos de granjas. En aplicaciones a gran escala, muchas plantas de la línea de la primera planta madre y muchas plantas de la línea de la segunda planta madre son sembradas o plantadas cerca una de la otra para permitir la polinización cruzada eficiente de las plantas de la línea de la primera planta madre con las plantas de la línea de la segunda planta madre. Para evitar la autopolinización, los métodos conocidos de producción híbrida de semillas, por ejemplo usando la esterilidad macho de cualquiera de la primera o segunda planta madre puede ser combinada con el proceso de la invención. Un ejemplo de ese método es el que se describe en la PCT/EP03/02986. El documento de prioridad DE 103 25 814 de la presente solicitud de patente se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras ÍA y IB muestran un esquema general del proceso de la invención de producción de alto rendimiento de un producto de interés en semillas híbridas (las semillas Fl de la invención) . Figura 1A- Principio general de la invención. Una línea de una primera planta madre A es hibridada con una línea de una segunda planta madre B para producir semillas Fl . Las semillas de ambas líneas madre no producen el producto de interés y esas semillas son viables . En las semillas Fl, se genera una dotación genética que permite la producción del producto de interés, en este caso GFP que es observada por su fluorescencia (puntos claros en la fotografía) . Como resultado de la fuerte expresión del producto de interés, opcionalmente en combinación con una fuerte replicación de un vector viral que codifica para el producto de interés, las semillas Fl no son viables. Figura IB- Etapas de desarrollo de la planta (enmarcadas) . Después de la hibridación de una célula de esperma con un gametofito hembra, se produce una semilla (semilla Fl) que expresa el producto de interés (cuadro de la izquierda) . El desarrollo de la planta de la semilla Fl es bloqueado. El cuadro de la derecha indica la incapacidad de la semilla Fl para crecer hasta una planta fértil. La Figura 2 es un esquema que muestra la región de T-ADN del plásmido pICH4300 y BGMV (Virus del Mosaico Dorado del Frijol) - formación basada de un replicón de ADN en una semilla híbrida (véase el Ejemplo 1) . La Figura 3 es un esquema que muestra la región de T-ADN del plásmido pICH1500 y la formación de un replicón de ADN en presencia de actividad de integrasa (véase el ejemplo 1). Los elementos genéticos del pICH1500 pueden ser proporcionados a la semilla con la primera dotación genética parcial. La integrasa PhiC31 puede ser codificada y proporcionada a la semilla con la segunda dotación genética parcial. La Figura 4 muestra embriones inmaduros del frijol Phaseolus vulgaris (A, imagen grande a la izquierda) y un cotiledón de una semilla germinante de haba Vigna radia ta (B, imágenes pequeñas a la derecha) bombardeada con el plásmido pICH5184. Los embriones de frijoles que expresan GFP como el producto de interés están circulados. La Figura 5 muestra brotes de una semilla germinante de haba bombardeada con el vector pICH5184 bajo la luz del día (izquierda) y bajo luz UV (derecha) . La Figura 6 muestra esquemas de las regiones de T-ADN de los plásmidos recombinantes o constructos pICH10881, pICH14540, pICH14550, pICH14560, pICH14530 y el constructo pICOl. La Figura 7 muestra un esquema de la región de T-ADN del plásmido pICH10830 y WDV (Virus que Impide el Crecimiento del Trigo)- formación basada en un replicón de ADN (véase el ejemplo 2) . La Figura 8 muestra los resultados del bombardeo con plásmido pICHl0830 que contiene un virus que impide el crecimiento del trigo (WDV) - cásete de expresión de GFP en embrión de trigo (A) y tejidos de semilla de maíz (B) cuatro días después de la transformación. La Figura 9 muestra un esquema de la región de T- ADN del "plásmido pICH14520 y la formación del replicón en presencia de actividad de integrasa PhiC31. LIR y SIR son Regiones Intergénicas Larga y Corta del virus que impide el - crecimiento del trigo; MP - proteína de movimiento; Rep- replicasa viral; RepA replicasa viral A. La Figura 10 describe la región de T-ADN del - plásmido ' pICH4351 y la formación de un replicón de ARN. El elemento punteado de gris después de GFP indica un elemento IRES (sitio de entrada de ribosoma interno) . La Figura 11 describe la región de T-ADN del plásmido pICH10921 y la formación de un replicón de ARN en presencia de actividad de integrasa PhiC31. La Figura 12 describe representaciones esquemáticas del plásmido pICHldOO. La Figura 13 describe una representación esquemática del plásmido recombinante pICHl0680. La Figura 14 describe una representación esquemática de los plásmidos . recombinantes pICH12784, "PICH12820," pICH1478?' y pICH14770. . La Figura 15 describe una representación esquemática de los plásmidos recombinantes pICH14800, PICH14790, pICH14820 y pICH14810.

MEJORES MODOS Y DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los autores de esta invención han encontrado, de manera sorprendente, que una alta tasa de división celular sola no es suficiente para proporcionar la replicación de virus en embriones al menos de plantas dicotiledóneas, sino que depende de la etapa de desarrollo del embrión también y usualmente se desvía a las etapas finales del desarrollo de la semilla. Otro descubrimiento sorprendente fue la capacidad de los precursores de replicón basados en virus incorporados de manera estable al ADN cromosomal para replicarse tras la activación en semillas transgénicas (las semillas Fl) . Hasta donde mejor sabemos, no existe una técnica anterior que describa este fenómeno. En el proceso de la invención, la reproducción de la planta y la producción basada en la planta de un producto de interés son estrictamente separados, permitiendo mejorar de manera drástica el rendimiento del producto. Utilizando las fuentes normalmente necesarias para el desarrollo y reproducción de la planta para la producción del producto de interés, por ejemplo produciendo el producto de interés en las semillas, preferiblemente a ciertas etapas adecuadas del desarrollo o la etapa de germinación inicial, ayuda a controlar la contaminación genética . Nosotros proponemos usar una etapa de desarrollo, específicamente la fusión y fertilización del gameto, como un cambio genético que convierte la fase de crecimiento de la semilla en una fase de producción. Hemos modificado diferentes componentes de la dotación genética en diferentes plantas madre. Los componentes (dotaciones genéticas parciales) , aunque están inactivos en las plantas madre, generan la dotación genética después del proceso de hibridación, disparando de este modo la producción del producto de interés. En una modalidad preferida, usamos ADN o ARN replicando (procesos de amplificación) para la producción, por lo que se crea un sistema de producción de alto rendimiento que obtiene de la producción del embrión y/o endospermo y da como resultado la acumulación del producto de interés en una semilla en desarrollo, mientras que preferiblemente la semilla se vuelve incapaz de una reproducción sexual posterior. El producto de interés se acumula y puede ser aislado de las semillas en desarrollo, semillas maduras, o semillas germinadas. Las piedras angulares de esta invención son los descubrimientos sorprendentes que: a) Los vectores virales son capaces de replicarse en semillas de plantas en las etapas finales del desarrollo de la semilla y las etapas iniciales de germinación de la semilla, pero no o difícilmente durante las etapas iniciales de la formación de las semillas, especialmente para plantas dicotiledóneas. b) los precursores de vectores virales que se integran de manera estable en el ADN cromosomal, pueden ser activados eficientemente en semillas híbridas tras cruzarse con una planta que proporcione un elemento activador. La activación en las semillas de un replicón incorporado de manera estable en el ADN cromosomal a expensas del desarrollo de la planta no ha sido demostrado anteriormente y permite un control estrecho sobre el proceso de la invención y evita la replicación permeable que pudiera disparar el silenciamiento transgénico o interferir con el desarrollo de la semilla en una etapa muy temprana . El diseño de replicones es basado en el Virus del Mosaico Dorado del Frijol (BGMV) es descrito en el EJEMPLO 1 y mostrado en las Figuras 2 y 3. El vector plCH4300 que contiene GFP (proteína flourescente verde) como un gen reportero o indicador fue usado para probar la competencia de los embriones en diferentes etapas de su desarrollo para la replicación geminiviral. Los resultados de esos experimentos se muestran en la Figura 4. Es evidente que no existen signos de replicación viral (sin expresión de GFP) visibles en las superficies de los embriones de frijol .jóvenes bombardeados, pero se detectó la expresión clara de GFP en las células de embriones más avanzados (Fig. 4) en sus etapas finales del desarrollo. La replicación eficiente - también toma lugar durante la germinación de la semilla (Fig. 5) . El diseño de vectores basados en Virus que evita el Crecimiento del Trigo (WDV) es descrito en el EJEMPLO 2.

La Figura 7 muestra esquemáticamente el vector WDV para experimentos de expresión transitoria. Los resultados de los experimentos con semillas de trigo y maíz se muestran en la. Fig. 8. Es evidente que el vector WDV se replica eficientemente en embriones de trigo y maíz, pero con menor .eficiencia en- el endospermo del maíz. Esos datos fueron cruciales para establecer la capacidad de trabajo de la invención, puesto que la replicación permeable a etapas indeseadas (muy tempranas) de desarrollo de . la semilla comprometería el crecimiento de la semilla y la aplicabilidad técnica de este método. También permite una elección más amplia de promotores específicos de la semilla para activar o disparar el proceso de replicación por recombinación específica del sitio. La activación del vector viral durante las etapas iniciales de desarrollo del embrión mediada por la recombinación de su parte (Figuras 3 y 9) puede llevar el precursor del replicón a una etapa competente en -la' -replicación, pero la replicación preferiblemente no ocurre hasta que el embrión alcanza una etapa más avanzada ("replicación competente") de su desarrollo. La elección del promotor tiene influencia sobre la eficiencia de esta tecnología. Pueden ser usados promotores inducibles y específicos de un tejido para disparar la producción con alto rendimiento en la semilla. Los promotores inducibles pueden ser divididos en dos categorías de acuerdo a sus condiciones de inducción: aquéllos inducidos por factores abióticos (temperatura, luz, sustancias químicas) y aquéllos que puedan ser conducidos por factores bióticos, por ejemplo, ataque por patógenos o plagas. Los ejemplos de la primera categoría son inter alia promotores inducibles por calor (US 05187287) inducibles por frío (US05847102) , un sistema inducible por cobre (Mett et al., 1993, Proc. Nati : Acad. , 90, 4567-4571) inducibles por esteroides (Aoyama & Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis et al., 1998 Plant J. , 14, 247-257; US06063985) un sistema inducido por etanol (Caddick et al., 1997, Na ture Biotech . , 16, 177-180; WO09321334), y un sistema inducido por tetraciclina (Weinmann et al., 1994. Plant J. , 5, 559-569). Uno de los desarrollos más tardíos en el área de los sistemas inducibles químicamente para plantas es un promotor quimérico que puede ser activado por el glucocorticoide dexametasona y desactivado por tetraciclina (Bohner et al., 1999, Plant J. , 19, 87-95). Para una revisión sobre los sistemas inducibles químicamente véase: Zuo & Chua, (2000, Current Opin. Biotechnol., Yl, 146-151). Sin embargo, los promotores más adecuados apara practicar la invención son promotores específicos de la semilla. Existe una amplia elección de promotores específicos de la semilla que pueden ser útiles para practicar la invención. Esos promotores incluyen inter alia el promotor del gen de la lectina de bisanto (Psll) (de Pater et al, 1996, Plant Mol. Biol., 32, 515-523), el promotor del gen de la proteína de la semilla sin almacenamiento de Vicia faba llamado USP (Fiedler et al, 1993, Plant Mol. Biol., 22, 669-679), el promotor específico del endospermo del gen de la globulina de la avena asglo 5 (Schubert et al., 1994, Plant Mol. Biol., 26, 203-210), el promotor del gen del maíz 02 (Gallusci et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 15, 391-400), promotores de la embriogénesis tardía de genes abundantes (lea) , específicamente el AtEm6 que proporciona la expresión a través del embrión de Arabidopsis (Vicient et al., 2000, J. Exp. Botany, 51_, 1211-1220), el promotor del gen del maíz rabl7 (Busk et al., 1997, Plant J. , 11, 1285-1295), los promotores de beta-faseolina y beta-conglicinina (Odell et al., 1994, Plant Physiol., 106, 447-458), el promotor del gen de arcelina-5 de Phaseolus vulgaris (Gossens et al . , 1999, Plant Physiol , 120, 1095-1104), el promotor del gen de D-hordeína (Horwath et al . , 1999, Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 97, 1914-1919), el promotor del gen de la lipooxigenasa 1 de la cebada (Loxl) (Rouster et al . , 1998, Plant J. , 15, 435-440), etc. Para evaluar de manera preliminar la aplicabilidad del promotor elegido para dirigir la expresión de una proteína de interés, hemos usado el gen reportero GUS en experimentos de expresión transitoria con plásmidos recombinantes derivados de pICOl (Figura 6), donde el promotor 34S fue reemplazado con el promotor específico de la semilla. Para dirigir la expresión de la integrasa PhC31 hemos elegido varios promotores específicos de semillas de monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo el promotor del gen USP de Vicia faba (Fiedler et al, 1993, Plant Mol . Biol . , 22,669-679), el promotor del gen AtEm6 (Vicient et al . , 2000, J. Exp . Botany, 51, 1211-1220), el promotor del gen del maíz rabl7 (Busk et al . , 1997, Plant J. , 11, 1285-1295) así como promotores constitutivos de genes de actina 2 de arabidopsis y actina 1 de arroz (los plásmidos recombinantes plCH14540, plCH14550, plCH14560, plCH10881 y plCH14530 respectivamente, véase la Figura 6) . Pueden ser usadas muchas otras recombinasas específicas del sitio en esta invención. Los ejemplos de esos sistemas incluyen inter alia el sistema Cre-Lox del bacteriófago Pl (Austin et al . , 1981, Cell, 25, 729-736), el sistema Flp-Frt de Saccharomyces cerevisiae (Broach et al . , 1982, Cell, 29, 227-234) , el sistema R-RS de Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al . , 1985, J. Mol . Biol . , 182, 191-203). Existe una técnica anterior relacionada con replicones virales en embriones de anfitriones naturales así como especies de plantas no anfitrionas (Wang & Maule, 1994, Plant Cell , 6 777-787; Gooding et al . , 1999, Nucleic Acids Res . , 27, 1709-1718; Escaler et al . , 2000, Virology, 267, 318-325; Ugaki et al . , 1991, 19, 371-377). Es muy probable que la gama de anfitriones pueda incrementarse significativamente si ciertas propiedades de los replicones virales que determinan su especificidad sobre el anfitrión son sacrificadas, como el movimiento célula a célula y sistémico. Es muy probable que esos replicones virales puedan replicarse eficientemente en células de una gama más amplia de especies de plantas, incluyendo células de semilla, por lo que las especies de plantas no son las anfitrionas naturales para los replicones virales. En esos casos, el movimiento sisté ico y célula a célula de los replicones virales puede ser afectado pero no la capacidad de replicación. Actualmente, pueden ser usados grupos de virus pertenecientes a diferentes grupos taxonómicos para la construcción de vectores basados en virus de acuerdo a los principios de la presente invención. Esto es cierto para virus que contienen ARN y ADN, ejemplos de los cuales se dan más adelante (a través de este documento, cada nombre de especie o tipo es precedido por el nombre del orden, familia y género al que pertenece. Los nombres de los órdenes, familias y géneros están en itálicas o cursivas, si están aprobados por la ICTV. Los nombres taxonómicos en las citas (y en inscripciones no itálicas o cursivas) indican que este taxón no tiene un nombre aprobado por la ICTV internacional. Los nombres de especies (vernácula) se dan en instrucción regular. Los virus sin asignación formal de género o familia son indicados) : ADN Virus : ADN Virus dsCirculares : Familia: Caulimoviridae, Género: Badnavirus, Especies tipo : virus del moteado amarillo de cornelina, Género: Caulimovirus, Especies tipo : virus del mosaico de la coliflor, Género: "virus similares a SbCMV", Especies tipo : virus del moteado clorótico de la Soya, Género: "virus similares a CsVMV", Especies tipo : virus del mosaico de la vena de la mandioca, Género: "virus similares al RTBV", Especies tipo : virus baciliforme de arroz tungro, Género: "virus similares a los aclaradores de la vena de petunia", Especies tipo : virus aclaradores de la vena de Petunia; ADN Virus ssCirculares : Familia: Geminiviridae, Género: Mastrevirus (Geminivirus Subgrupo I), Especies tipo : virus del moteado del maíz, Género: Curtovirus (Geminivirus Subgrupo II) , Especies tipo : virus de la parte superior del rizo de la remolacha, Género: Begomovirus (Geminivirus Subgrupo III) , Especies tipo : virus del mosaico dorado del frijol; ARN Virus : ARN Virus ss: Familia: Bromoviridae, Género: Alfamovirus, Especies tipo: virus del mosaico de la alfalfa, Género: Ilarvirus, Especies tipo: virus del moteado del tabaco, Género: Bromovirus, Especies tipo : virus del mosaico de bromeria, Género: Cucumovirus, Especies tipo : virus del mosaico del pepino; Familia: Closteroviridae, Género: Closterovirus, Especies tipo: virus del amarillamiento de la remolacha, Género: Crinivirus, Especies tipo : virus del amarillamiento infeccioso de la lechuga, Familia: Comoviridae, Género: Comovirus, Especies tipo: virus del mosaico de capuí, Género: Fabavirus, Especies tipo: virus 1 del marchitamiento del frijol ancho, Género: Nepovirus, Especies tipo: virus de las manchas anulares del tabaco; Familia: Potyviridae, Género: Potyvírus, Especies tipo : virus Y de papa, Género: Rymovirus, Especies tipo: virus del mosaico del ballico, Género: Bymovirus, Especies tipo : virus del mosaico amarillo de la cebada; Familia: Sequíviridae, Género: Sequivirus, Especies tipo: virus del moteado amarillo de la pastinaca, Género: Waikavirus, Especies tipo : virus esférico del arroz tungo; Familia: Tombusviridae, Género: Carmovirus, Especies tipo: virus del moteado del clavel, Género: Dianthovirus, Especies tipo : virus de las manchas anulares del clavel, Género: Machlomovirus, Especies tipo : virus del moteado clorótico del maíz, Género: Necrovirus, Especies tipo : virus de la necrosis del tabaco, Género: Tombusvirus, Especies tipo: virus de la atrofia del tomate, Género no Asignado de ARN Virus ss, Género: Capillovirus, Especies tipo: virus del agrietamiento momentáneo del manzano; Género: Carlavirus, Especies tipo : virus latente del clavel; Género: Enamovirus, Especies tipo : virus del mosaico emparentado con el guisante, Género: Furovirus , Especies tipo : virus del mosaico del trigo contenido en el suelo, Género: Hordeivirus, Especies tipo: virus del mosaico rayado de la cebada, Género: Idaeovirus, Especies tipo : virus del marchitamiento del arbusto de la frambuesa; Género: Luteovirus, Especies tipo : virus del marchitamiento amarillo de la cebada; Género: Marafivirus, Especies tipo: virus fino rayado del maíz; Género: Potexvirus, Especies tipo: virus X de la papa; Género: Sobemovirus, Especies tipo : virus del mosaico del frijol del sur, Género: Tenuivirus, Especies tipo: virus rayado del arroz, Género: Tobamovirus, Especies tipo: virus del mosaico del tabaco, Género: Tobravirus, Especies tipo : virus del batido del tabaco, Género: Trichovirus, Especies tipo : virus de las manchas cloróticas de las hojas del manzano; Género: Tymovirus, Especies tipo: virus del mosaico amarillo del nabo; Género: Umbravirus, Especies tipo : virus del moteado de la zanahoria; ARN virus ss Negativo: Orden: Mononegavirales , Familia: Rhabdoviridae, Género: Cytorhabdovirus, Especies tipo : virus del amarillamiento necrótico de la lechuga, Género: Nucleorhabdovirus, Especies tipo: 'virus del marchitamiento amarillo de la papa; ARN Virus ss Negativos: Familia: Bunyaviridae, Género: Tospovirus, Especies Tipo : virus del marchitamiento punteado del tomate; ARN Virus ds : Familia: Parti tiviridae, Género: Alphacryptovirus, Especies tipo: virus críptico del clavo blanco 1, Género: Betacryptovirus, Especies tipo : virus críptico del clavo blanco 2, Familia: Reoviridae, Género: Fijivirus, Especies tipo: virus de la enfermedad de Fi i, Género: Phytoreovirus, Especies tipo : virus de tumor cicatrizante, Género: Oryzavirus, Especies tipo: virus de la atrofia rasgada del arroz; Virus no Asignados: ADNss Genoma: Especies: virus de la parte superior del racimo del banano, Especies: virus del decaimiento del follaje del cocotero, Especies: virus de la atrofia del clavo subterráneo, Genoma: ADNds, Especies: virus del amarillamiento de la vena del pepino; Genoma: ARNds, Especies: virus atrofiante del tabaco, Genoma: ARNss, Especies, virus del ajo A, B, C, D, Especies virus del moteado de la vid, Especies virus del mosaico de la línea blanca del maíz, Especies virus latente del olivo 2, Especies: virus de ourmia melón, Especies virus del moteado zonal de Pelargonia; Satélites y Viroides : Satélites: ARNss Virus Satélite: Virus Satélite del Subgrupo 2, Especies tipo: satélite de la necrosis del tabaco, ARN Satélite, Subgrupo 2 Sa téli tes de ARNm tipo B, Subgrupo 3 Satélites de ARN lineal tipo C, Subgrupo 4 Satélites de ARN circulares del Tipo D, Viroides, Especies tipo : viroide del tubérculo ahusado de la papa. En su mayoría, los vectores de origen viral de plantas son usados como plásmidos capaces de replicarse de manera autónoma en plantas (replicones) para esta invención. Sin embargo, los principios necesarios para diseñar esos plásmidos usando elementos no virales son conocidos. Por ejemplo, han sido descritos muchos orígenes putativos de replicones de células de plantas (Berlani et al., 1988, Plant Mol . Biol . , 11, 161-162; Hernandes et al., 1988, Plant Mol . Biol . , 10, 413-422; Berlani et al., 1988, Plant Mol . Biol . , ll r 173-182; Eckdahlet al., 1989, Plant Mol . Biol . , 1_2, 507-516). Se ha demostrado que las secuencias que se replican de manera autónoma (elementos ARS) de genomas de plantas superiores tienen características estructurales y de secuencia en común con elementos ARS de levaduras y animales superiores (Eckdahl et al., 1989, Plant Mol . Biol . , 12, 507-516). Los elementos ARS de plantas son capaces de conferir la capacidad de replicación autónoma a plásmidos en Saccharomyces cerevisiae . Estudios de secuencias de ADN nuclear de maíz capaces de promover la replicación autónoma de plásmidos en levaduras mostraron que representan dos familias de secuencias altamente repetidas dentro del genoma del maíz. Aquellas secuencias tienen un patrón de hibridación genómica característico. Típicamente únicamente existió una copia de una secuencia homologa de ARS sobre cada fragmento genómico de 12-15 kb (Berlani et al., 1988, Plant Mol .

Biol . , 11: 161-162). Otra fuente de replicones de origen vegetal son los elementos separadores de ARN ribosomal de plantas que puedan estimular la amplificación y expresión de genes heterólogos en plantas (Borisjuk et al., 2000, Na ture Biotech . , 1_8_, 1303-1306). El efecto deseado de una alta tasa de amplificación también puede ser logrado usando promotores fuertes. Esos promotores pueden proporcionar un alto número de copias de un transcripto de interés, dando de este modo un resultado neto similar al de un vector replicante. Por lo tanto, se contempla que un replicón o vector precursor de esta invención no necesariamente se deriva de un virus de planta. Los ADN virus de planta promueven una forma fácil de diseñar replicones (vectores) que podrían ser especialmente útiles para la transformación dirigida del ADN, pero los vectores producidos total o parcialmente de elementos del ARN virus de plantas o aún virus que no son de plantas son posibles . Los replicones basados en virus de plantas son evidentemente ventajosos. Esos replicones, además de la replicación pueden proporcionar funciones útiles adicionales, por ejemplo, para el movimiento célula a célula a larga distancia. Además, con frecuencia pueden ser removidos más fácilmente de las células de plantas a posterior! usando métodos conocidos de erradicación de virus de plantas infectadas.

En esta invención son usados preferiblemente replicones virales que pueden ser activados por recombinación específica del sitio (cambio) de una cierta parte del vector viral (véase las Figuras 3, 9 y 11) . Esos replicones pueden basarse en ADN virus (BGMV, WDV) y ARN virus (TMV) . Es evidente de las Figuras que el rearreglo de los vectores virales de ADN por recombinación específica del sitio es suficiente para iniciar la replicación del ADN viral. La situación es diferente en el caso de vectores basados en TMV puesto que el rearreglo del ADN solo en general no es suficiente para iniciar la replicación. Se requiere transcripción para disparar la amplificación de esos replicones de ARN. Esos requerimientos permiten usar pasos de control adicionales para la expresión del a plicón basado en ARN, puesto que el promotor constitutivo que dirige la transcripción (véase la Fig. 11) puede ser reemplazado con un promotor inducible o específico de la semilla, estrechando el control y proporcionando más flexibilidad para el proceso de confinamiento espacial y temporal de la amplificación. Para practicar de manera eficiente la invención, se prefiere el análisis de muchas combinaciones diferentes de promotores específicos de la semilla para cada tipo de replicón viral para encontrar la mejor combinación posible que proporcione el rendimiento más ^alto posible.

Un elemento importante de la invención es la incapacidad de las semillas híbridas para establecer una progenie, es decir, que las semillas son preferiblemente estériles, por ejemplo, debido a su incapacidad para desarrollar plantas fértiles. Se espera que en la mayoría de los casos la replicación de un vector viral proporcione este efecto deseado, menoscabando de este modo aún más el desarrollo de la semilla. Sin embargo, si la replicación del vector que proporciona el producto de interés no es suficiente, puede ser aplicada una tecnología adicional para mejorar el efecto deseado. En el EJEMPLO 5 se describe el uso de un gen citotóxico (barnasa) montando por transempalme mediado por inteina en las semillas híbridas. Los fragmentos de barnasa fusionados con inteina se localizan en diferentes plantas madre y pueden estar bajo el control de diferentes promotores regulados de manera desarrollística. Los fragmentos serán puestos juntos tras la hibridación y pueden formar un producto citotóxico como resultado del transempalme mediado por indeina. El uso de diferentes promotores con diferentes patrones de expresión superpuestos aún parcialmente diferentes permiten continuar la actividad de la barnasa al tejido requerido en una forma más precisa que usando los mismos promotores específicos de un tejido para dirigir o activar la expresión de ambos fragmentos de barnasa. El promotor específico de meristemo apical del brote del gen de Arabidopsis STM (Long et Al . , 1996, Nature, 379, 66-69) y un promotor especifico de la germinación del gen ATHB5 Arabidopsis (Johannesson et al., 2003, Plan t Mol . Biol . , 51, 719-729) fueron usados en el ejemplo 5 para dirigir la expresión de los dos fragmentos de barnasa (véase la Figura 15) . Esos promotores proporcionan un patrón de actividad de barnasa adecuado, puesto que sus actividades se superponen a un meristemo apical de las semillas en germinación. Esta invención so se limita al uso de esos dos promotores puesto que pueden ser usados mucho otros promotores regulados de manera desarrollística y específicos del tejido para practicar esta modalidad. Los ejemplos de promotores útiles para esta modalidad incluyen un promotor del gen HBP-la de Arabidopsis expresado en tejido fotosintéticamente activo (Mikami et al., 1995 Mol . Gen . Genet . , 248_, 573-582) promotor del gen napina específico en la semilla (Ellerstrom at al., 1996, Plant Mol . Biol . , 32j_ 1019-1027), promotores de los genes rbcS. regulados desarrollísticamente (Manzara et al., 1991, Plant Cell, 3j_ 1305-1316), etc. En los ejemplos, se usó predominantemente la liberación de T-ADN mediada por Agrobacterium en células de plantas, por lo que el T-ADN contiene la primera y/o segunda dotación genética parcial como vector. Pueden ser usados diferentes métodos para la liberación de los vectores en células de plantas como la introducción directa del vector en las células por medio del bombardeo con microproyectiles, electroporación o transformación de propotoplastos mediada por PEG. Se pretende la transformación de la planta mediada por Agrobacterium . De este modo el ADN puede ser transformado en células de planta por varias tecnologías adecuadas como por el vector de plásmido Ti portado por Agrobacterium (US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763), bombardeo de partículas o microproyectiles (US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1) . En principio, también pueden ser usados otros métodos de transformación de plantas por ejemplo, microinyección (WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966B1) , electroporación (EP00564595B1; EP00290395B1; WO 08706614A1) , etc. La elección de métodos de transformación depende de las especies de plantas a ser transformadas. Por ejemplo el bombardeo de microproyectiles puede ser preferido para la transformación de monocotiledóneas, mientras que para dicotiledóneas, la transformación mediada por Agrobacterium da generalmente mejores resultados. La presente invención se lleva a cabo preferiblemente con plantas multicelulares superiores. Las plantas preferidas para usarse en esta invención incluyen cualquier especie de planta cuando se da preferencia a especies agrícola y hortícolamente importantes. Las plantas de cultivo comunes para usarse en la presente invención incluyen alfalfa, cebada, frijol, cañóla, caupí, algodón, maíz, clavo, loto, lentejas, mijo, cebada, guisantes, cacahuates, arroz, centeno, clavo dulce, girasol, haba de las indias, soya, sorgo triticado, bacata, frijol aterciopelado, alga roda, trigo, wisteria y plantas de anís. Las especies de plantas preferidas para practicar esta invención incluyen, pero rio se limitan a representativas de Gramineae, Composi teae , Solanaceae y Rosaceae . Las especies preferidas adicionales para el uso en esta invención son plantas de los siguientes géneros: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Bro aalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscya us, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Sécale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, y las Olyreae, las Pharoideae y muchas otras. Las preferidas son plantas para las cuales existen sistemas de producción de semillas híbridas. Esos sistemas son usados preferiblemente junto con la presente invención para producir una alta proporción de semillas que son híbridas de las primeras y segundas plantas madre. Las más preferidas son el maíz, trigo, penisetos, soya, colza, cañóla, tabaco y arroz. Las proteínas de interés, o fragmentos de las mismas, que pueden ser expresadas, en orientación sentido o antisentido, usando esta invención incluyen: enzimas modificadoras de almidón (almidón sintasa, enzima fosforilante del almidón, enzima desramificante, enzima ramificante del algodón, enzima ramificante del algodón II, almidón sintasa unida a granulos) , sucrosa fosfatasa sintasa, sucrosa fosforilasa, poligalacturonasa, polifructan sucrasa, ADP glucosa pirofosforilasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, fructosil transferasa, glicógeno sintasa, pectina esterasa, aprotinina, avidina, levansucrasa bacteriana, proteína glgA de E. coli, MAPK4 y ortólogas, enzima de la asimilación/metabolismo del nitrógeno, glutamina sintasa, osmotina de plantas, albúmina 2S, taumatina, recombinasa/integrasa específica del sitio (FLP, Cre, recombinasa R, Int, Integrasa R de SSV1, Integrasa phiC31 o un fragmento o variante activa de la misma) , isopent nil transferasa, Sea M5 (clamodulina de la soya) , toxina del tipo del colepterano o un fragmento insecticida activo, proteínas de fusión de enzima conjugadora de ubiquitina (E2), enzimas que metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos, superóxido dismutasa, la forma de proenzima inactiva de una proteasa, toxinas de proteínas de plantas, rasgos que alteran la fibra en plantas productoras de fibra, toxina activa en coleópteros de Bacillus thuringiensis (toxina Bt2, proteína cristalina insecticida (ICP) , toxina CrylC, endotoxina delta, toxina polipeptídica, protoxina, etc.), toxina AalT específica de insectos, enzimas degradantes de celulosa, celulasa El de Acidothermus celluloticus, enzimas modificadoras de lignina, cinamoil alcohol deshidrogenasa, trehalosa-6-fosfato sintasa, enzimas de la vía metabólica de la citocinina, HMG-CoA reductasa, pirofosfatasa inorgánica de E. coli, proteína de almacenamiento de las semillas, licopen sintasa de Erwinia herbicola, ACC oxidasa, proteína codificada por pTOM36, fitasa, cetohidrolasa, acetoacetil CoA reductasa, PHB (polihidroxibutanoato) sintasa, proteína portadora de acilo, napina, EA9, fitoeno sintasa de planta no superiores, proteína codificada por pT0M5, ETR (receptor de etileno) , piruvato fosfato dicinasa plastídica, proteína del poro transmembranal inducible por nemátodos, rasgos que mejoran la función fotosintética o plastídica de células de plantas, estilbeno smtasa, una enzima capaz de hidroxilar fenoles, catecol dioxigenasa, catecol 2, 3-dioxigenasa, cloromuconato cicloisomerasa, antranilato sintasa, proteína AGL15 de Brassica, fructosa 1, 6-difosfatasa (FBPasa) , AMV RNA3, PVY replicasa, PLRV replicasa, proteína de recubrimiento de potivirus, proteína de recubrimiento de CMV, proteína de recubrimiento de TMV, replicasa de luteovirus, ARN mensajero de MDMV, replicasa geminiviral mutante, C12 : 0 de Umbellularia californica preferiblemente acil-ACP tioesterasa, CIO o C12:0 de planta preferiblemente acil-ACP tioesterasa, C14:0 preferiblemente acil-ACP tioesterasa (lu;;D) , factor A de sintasa de planta, factor B de sintasa de planta, 6-desaturasa, proteína que tiene una actividad enzimática en la oxidación peroxisomal de ácidos grasos en células de planta, acil-CoA oxidasa, 3-cetoacil-CoA tiolasa, lipasa, acetil-CoA-carboxilasa de maíz, 5-enol?iruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSP) , fosfino tricin acetil transferasa (BAR, PAT), proteínas CP4, ACC desaminasa, ribozima, proteína que tiene un sitio de escisión postranslacional, proteína de fusión que consiste de un dominio de unión de ADN del activador transcripcional Gal4 y un dominio de activación transcripcional, una fusión traslaciqnal de proteína oleosma con proteína de interés capaz de dirigir la proteína de fusión a la fase lipídica, gen DHPS que confiere resistencia a la sulfonamida, nitrilasa bacteriana, 2,4-D monooxigensa, acetolactato sintasa o acetohidroxiácido sintasa (ALS, AHAS) , poligalacturonasa, nitrilasa bacteriana, fusión de la región hidrofóbica terminal amino de una proteína traslocadora de fosfato madura residente en la membrana envolvente interna del plástido con proteína de interés a ser dirigida a la membrana, etc. Cualquier proteína humana o animal que pueda ser expresada, especialmente en semillas híbridas usando el sistema de la invención. Los ejemplos de esas proteínas de interés incluye, inter alia, las siguientes proteínas (proteínas farmacéuticas: proteínas de respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena, receptores de célula T, etc.), antígenos, factores estimulantes de colonia, relaxinas, hormonas polipeptídicas, citocinas y sus receptores, interferones, factores del crecimiento y factores de la coagulación, enzimas lisosomales enzimáticamente activas, polipéptidos fibrinolíticos, factores de la coagulación de la sangre, tripsinógeno, 1-antitripsina (AAT) , así como proteínas conservadoras de la función como fusiones, versiones mutantes y derivados ' sintéticos de las proteínas anteriores .. El proceso de la invención puede comprender además la expresión de un gen que codifique para una proteína supresora de silenciamiento genético postranscripcional (PTGS) o una variante que conserve la función o fragmento de la misma en una planta para suprimir la PTGS de la secuencia codificadora transgénica. El gen de la proteína supresora de PTGS. o la variante conservadora de la función o fragmento de la misma puede ser proporcionada a una planta del mismo vector que contenga la secuencia codificadora transgénica o un vector extra. La proteína supresora de PTGS es preferiblemente de origen viral o vegetal. Los ejemplos de proteínas supresoras de PTGS son la proteína del virus XP 25 de la papa, la proteína del virus AC2 del mosaico de la mandioca africana, la proteína del virus Pl del moteado amarillo del arroz, la proteína del virus 19K de la atrofia del arbusto del tomate rgs CAM o una variante conservadora de la función o fragmento de una de esas proteínas. La variante conservadora de la función o fragmento preferiblemente tiene una identidad de secuencia del- 75%, preferiblemente de al menos el 75%, con una de las proteínas anteriores. Los detalles sobre las proteínas supresoras de PTGS y su uso pueden encontrarse en la WO 0138512.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 VECTORES DE BGMV Clonación de un vector de replicación geminiviral que contiene GFP : Se amplificó ADN de pUC19 con los cebadores dnaapr7 (aac tgc agt cta gac tgg ccg tcg ttt tac aac) y dnaaprd (aac tgc aga acá att gct cga ggc gta ate atg gtc a) , y el fragmento amplificado y digerido con Pstl y religado. El plásmido resultante, pICH1144, es similar a pUCl9, pero el polienlazante ha sido reemplazado con Xhol, Mfel, y Pstl. El ADN se extrajo de tejido de Phaseolus vulgaris infectado con el virus del mosaico dorado del frijol (BGMV) aislado de DSMZ PV-0094 obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) . Un fragmento del genoma que abarca la región común de BGMV (CR; contiene el origen de replicación de BGMV) fue amplificado por PCR con los cebadores dnaapr3 (ggg aat tea cta gta aag ate tgc cgt cga ctt gga att g) y dnaapr4 (caá tgc ate atg gcg cat cae gct tag g) y clonado como un fragmento de EcoRI-Nsil en pICH1144 digerido con Mfel y PstI, dando como resultado el plásmido pICH1156. El inserto de BGMV en pICH1156 fue secuenciado. Se amplificaron otros dos fragmentos del genoma de ADNA de BGMV de ADN de Phaseolus vulgaris infectado con BGMV con pares de cebadores dnaapr9 (aag ctg cag aag gat ect ctg gac tta cae gtg gaa tgg) /dnaaprl3 (cgc tcg agg ccg tcg act tgg aat tgt c) , y dnaapr5 (gaa gat ctg caá gag gag gtc age a)/dnaaprl0 (aag ctg cag ate tat ttc tat gat tog ata acc). La suma de esas cantidades de fragmentos contribuyó al genoma de BGMV completo sin la proteína de recubrimiento. Esos fragmentos fueron digeridos con Xhol/Pstl y Pstl/BglII (respectivamente) y clonados en una ligación de 3 vías en pICH1156 digerido con Xhol y BglII. El plásmido resultante contiene el genoma de ADNA de BGMV completo sin el gen de la proteína de recubrimiento flanqueado por las regiones comunes de ADNA de BGMV duplicadas. Se conservaron tres clonas para pruebas: pICH1663, 1664 y 1667. Un sitio de multiclonación que contenía BamHl y PstI reemplaza el gen de la proteína de recubrimiento. Se clonó una secuencia codificadora de GFP sintético (SGFP) como un fragmento de BamHI-PstI de pICOll (promotor de Hbt - secuencia codificadora de GFP sintética - terminador Nos en pUC18), en los sitios de BamHI-PstI de pICH1663 pICHl664 y pICH1667, dando como resultado los plásmidos pICH1693, pICH1694 y pICH1697. La GFP se colocó bajo el control del promotor de la proteína de recubrimiento. Para probar la funcionalidad de las clonas pICH1693, pICHl694 y pICHl697 fueron bombardeadas en hojas cortadas de Nicotiana benthamiana y Phaseolus vulgaris usando un Sistema Biolístico de Liberación de Partículas 1000/HE (Biorad) . Las células epidérmicas que expresan GFP pudieron ser determinadas los siguientes días en las hojas de ambas especies para todos los plásmidos recombinantes.

Clonación en un vector binario Se produjo un vector binario que contiene la parte prorreplicante de pICH1694 subclonando un fragmento de Xhol-NarI de pICHl694 en pICBVll digerido con Xhol y Clal . La clona resultante, pICH4300 (Fig. 2), contiene el gen de GFP bajo el control del promotor de la proteína de recubrimiento de BGMV y los genes All/2/3 entre CR duplicadas .

Clonación de un proveedor geminiviral "cambiado" El pICH7300 es similar al pICH4300 pero se removieron varios sitios de enzima de restricción (Salí, Ncol, Mfel, y BglII) usando cebadores mutantes superpuestos a los sitios de reacción. El pICH7300 fue usado como punto de partida para producir el pICHl500 (Fig. 3) , una clona incapaz de replicarse debido a la inversión de un fragmento que contiene parte de la replicasa y una de las regiones comunes. Los sitios de recombinación AttP y AttB están colocados en las extremidades _ de la inversión para proporcionar el cambio de la región invertida proporcionando integrasa, generando por lo tanto un vector funcional. Los sitios AttB y AttB son flanqueados por secuencias intrónicas artificiales las cuales permiten el empalme de las secuencias de AttR resultantes de la recombinación mediada por integrasa, de transcriptos de All.

Prueba de competencia de los embriones de replicación geminiviral : Se bombardeó el ADN del plásmido pICH4300 sobre una serie de tejidos de planta. Pudieron ser detectadas células fluorescentes brillantes en hojas de Phaseolus vulgaris, cotiledón de frijol rehidratado de semilla madura y semilleros en germinación, y embriones inmaduros. No todas las etapas de desarrollo del embrión fueron susceptibles a la replicación geminiviral de acuerdo a lo ensayado por fluorescencia de GFP. Los embriones blancos pequeños con cotiledones de hasta 4 a 5 mm de longitud no exhibieron ninguna célula que exprese GFP. En contraste, los cotiledones más grandes con un color más verdoso fueron muy competentes para la replicación geminiviral. Otras especies también fueron susceptibles a la replicación geminiviral, al menos en las hojas, incluyendo Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, Arabidopsis thaliana , Orychophragmus violaceus y frijol de Mung.

Clonación de clonas de integrasa de PhiC31 El pICPlOlO es un vector binario que contiene la integrasa del fago C31 de Streptomyces (de David Ow, Plant Gene Expression Center, US Department of Agriculture-Agricultural Research Service, Albany, CA 94710, USA) fusionada al promotor de Actina 2 de Arabidopsis (un fragmento de 1344 nt que contiene el promotor, primer exón, primer, intrón y 10 nucleótidos del primer exón del gen de la actina 2). Para incrementar el transporte de integrasa al núcleo, se fusionó una señal de localización nuclear del antígeno T SV40 (Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, Andreas et al., 2002, Nucleic Acids Res . , 3_0, 2299-2306) al extremo C terminal de la integrasa de PhiC31. Se agregó la secuencia de NLS a las secuencias de integrasa por amplificación por PCR de pICPlOlO usando el cebador c31prl (gca cgc cga agg cga cga ag) y un cebador de PCR que contiene una extensión que contiene la secuencia de NLS (31nlsl: gga t.cc taa acc ttc etc ttc ttc tta ggc gee gct acg tct tec gtg) , y subclonando como un fragmento de BspEI-BamHI en pICPlOlO, dando como resultado el plásmido pICH10881 (Figura 6) . Para subclonar fácilmente diferentes promotores, la integrasa y el terminador Nos fueron subclonados de pICH10881 como un fragmento de Pstl Apal en el pICH13901, un vector binario de Icón Genetics que contiene un cásete de selección del promotor Nos- secuencia codificadora de NptII - terminador Nos y un polienlazante K?n-l-Xhol-Pstl-Apal-Hind3, que da como resultado el plásmído pICH13901 (no mostrado) . Se amplificaron varios promotores con cebadores específicos del gen de ADN genómico de las especies apropiadas y se clonaron como un fragmento de Kpnl/Xhol en pICH13091. Los promotores también fueron subclonados como fragmentos de EcoRl/Xhol en pICOl (Figura 6) y se probaron por su actividad como fusiones con el gen reportero GUS usando bombardeo de microproyectiles de semillas en desarrollo (no mostrado) . Para activar la expresión de la integrasa PhC31, se eligieron varios promotores específicos de semillas de monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo el promotor del gen USP de Vicia faba (Fiedler et al , 1993, Plant Mol . Biol . , 22 , 669-679), el promotor del gen AtEmd (Vicient et al . , 2000, J. Exp . Botany, 51, 1211-1220), el promotor del gen rabl7 de maíz (Busk et al . , 1997, Plant J. , 11, 1285-1295) así como promotores constitutivos de los genes de actina 2 de arabidopsis y actina 1 de arroz (los plásmidos recombinantes pICH14540, pICH14550, pICHl4560, pICH10881 y pICH14530 respectivamente, véase la Figura 6) .

Transformación estable y experimentos de hibridación Se transformaron discos de hoja de Nicotiana benthamiana con los plásmidos recombinantes pICH1500, pICH4550 y pICH4540 (integrasa) , generando transformantes independientes para cada plásmido recombinante. Se cruzaron diez transformantes de pICH1500 con al menos 5 transformantes de cada plásmido recombinante de integrasa. Las semillas en desarrollo inmaduras fueron disectadas y se observó la fluorescencia de GFP bajo una luz azul con un microscopio.

EJEMPLO 2 VECTORES DE WDV Se extrajo el ADN de muestras de hojas de trigo infectadas con virus que impide el crecimiento del trigo (WDV) obtenidas de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) . Un genoma completo de WDV (2.8 kb) fue amplificado por PCR usando cebadores dirigidos en orientaciones opuestas y superponiendo el único sitio de EcoRI del genoma: FwdvEl aGAATTCacaccgatgggctc RewdvEl tGAATTCtgcacactcccacg El fragmento amplificado fue clonado en el vector pGEM-T (Promega). Se secuenciaron dos clonas. El análisis BLAST reveló que la secuencia amplificada difirió significativamente de las cuatro cepas de WDV secuenciadas completamente (GEWDVXX, WDVGNS, WDW311031, NC 003326) presentes en las bases de datos EMBL/Genbank, son muy similares a un aislado de virus secuenciado parcialmente (1.2 kb) de Hungría (AJ311038; Arch . Virol . 147 (1):205-216, 2002) . Sobre la base de los datos de la secuencia obtenidos, se diseñaron dos cebadores (ttC CAT Gga gtt acc tcg gg agt ect tgt tg y ttG CAT GCG GCC Gca aaa tag tat ttt att cat etc atg te) para la amplificación de un genoma completo con la excepción del gen de la proteína de recubrimiento. Se efectuó la PCR del ADN de hojas infectadas descrito anteriormente. El producto amplificado por PCR fue clonado como el fragmento de Sphl-Ncol en el vector pUC19 que contiene la versión mutante de GFP (S65TGFP) digerido con Sphl y Ncol. La clona resultante pICH10680 contiene un solo genoma de WDV con GFP reemplazando a CP (Figura 13) . Un genoma completo con LIR duplicada se clonó en un vector binario en dos pasos. Primero, se subclonó un fragmento de BamHI-Apal de pICH10680 en vector Binario digerido con BglII y Apal . Esta clona intermedia, que contiene un genoma de WDV parcial con GFP en lugar de CP, digerido con PspoMi y Pcil (cortado con Kleno ) , se usó en un segundo paso de clonación de un fragmento de Smal-Notl de plCH10680. La clona resultante, plCH10830 (Figura 7), contiene un genoma completo de WDV con GFP reemplazando a CP, y está flanqueado por LIR duplicada, permitiendo la escisión y amplificación del replicón de WDV-GFP.

Prueba de competencia de embriones de replicación geminiviral : Se bombardeó pICH10830 en embriones en desarrollo de trigo y maíz. Las células que expresan una fuerte fluorescencia de GFP fueron observadas en los embriones, pero también pudieron ser detectadas en el endospermo (Figura 8) .

Clonación de un provector de TODV "cambiado Con la misma estrategia que se describió para los vectores de BGMV, se produ o un vector de WDV "cambiado", pICH14520 (Figura 9) . Esta clona se vuelve capaz de iniciar la replicación solo después de cambiar por exposición a la integrasa de PhiC31. Para probar la funcionalidad de esta clona esta fue bombardeada en embriones de maíz sola o con clonas de integrasa pICH14530 o pICH14560. Las células fluorescentes con GFP pudieron ser detectadas únicamente cuando el pICH14520 fue bombardeado con integrasa.

Transformación estable y experimentos de hibridación El pICH14520 y la clona de integrasa fueron transformadas en maíz. Transformantes seleccionados de ambos plásmidos recombinantes fueron cruzados juntos en ambas direcciones y las semillas inmaduras disectadas en diferentes etapas del desarrollo y observadas bajo una luz azul usando un microscopio o una lámpara UV de mano.

EJEMPLO 3 VECTORES DE CR-TMV Clonación de un vector replicante de cr-TMV que contiene GFP : El pICH4351 (Figura 10) es un vector viral basado en cr-TMV, un tobamovirus que infecta cruciferas (Dorokhov et al . , 1994, FEBS Letters, 350, 5-8). El pICH4351 contiene las secuencias no traducidas 5' de Cr-TMV seguidas por RdRp y MP (nucleótidos 1 a 5629 del acceso al Genbank Z29370, los últimos 16 aminoácidos de MP fueron truncados sin pérdida de la función de MP, y una T en la posición 5605 en Z29370 mutó a C) , fusionada al promotor de Actina 2 de Arabidopsis (un fragmento de 787 nt 5' del inicio de la transcripción, acceso U41998 de Genbank, An et al . , 1996, Plant J. , 10, 107-121). La MP es seguida por un sitio de LoxP. Este sitio no tiene significado funcional para el uso de este plásmido recombinante y está presente debido a que también estuvo presente en los plásmidos usados para construir éstos. El LoxP es seguido por una secuencia de IRES de cr-TMV (nucleótidos 4804 a 4873 del acceso Z29370 del Genbank) y por GFP ORF. El Ires se clonó en esta posición en un mejorador translacional para incrementar la expresión de GFP. La GFP es seguida por las secuencias no traducidas 3' cr-TMV (nucleótidos 6083 a 6312 del acceso Z29370 del Genbank) seguidas por el terminador Nos de Agrobacterium . Este plásmido recombinante es clonado en un vector binario de Icón Genetics pICBVIO, que contiene un cásete para la selección de Kanamicina en plantas (promotor Nos-secuencia codificadora de NPTII-terminador Nos) . En este plásmido recombinante, la GFP es expresada del promotor subgenómico de CP localizada en el extremo de MP. Después de la liberación al núcleo por bombardeo o agroinfiltración, un transcripto primario producido en el núcleo del promotor de Actina2 es exportado al citoplasma donde toma lugar la replicación.

Clonación de un provector de cr-TMV "cambiado" El pICH10921 es un provector viral producido a partir de pICH4351 (Figura 11) . Difiere del pICH4351 por el hecho de que un fragmento de ADN que se extiende desde Ires hasta el terminador Nos fue cambiado en orientación inversa para hacer el plásmido recombinante incapaz de replicarse. Para permitir el cambio de este fragmento, un sitio AttP (gta gtg ccc caá ctg ggg taa ect ttg agt tct etc agt tgg ggg cgt aga) y un sitio AttB (tcg aag ccg cgg tgc ggg tgc cag ggc gtg ccc ttg ggc tec ccg ggc gcg tac tec acc tea ccc ate) de PhiC31 son colocados en las extremidades de la inversión. Para probar si el cambio de la parte invertida conduce a un vector funcional, se transformó pICH10921 en la cepa de agrobacterium GV3101 y se usó para agroinfiltración de hojas de Nicotiana benthamiana . No se detectaron manchas de GFP cuando el pICH10921 fue infiltrado solo, pero pudieron observarse numerosos focos de replicación de GFP cuando el pICH10921 fue coinfiltrado con agrobacterias transformadas con pICH10881 (que contienen un vector de expresión de integrasa) .

Transformación estable y experimentos de hibridación Los pICH10921, pICH10881, pICH14540 y pICH14550 se transformaron por separado en Nicotiana benthamiana por transformación en discos de hojas usando 50 mg/L de Kanamicina para la selección de transformantes (Horsh et al . , 1985, Science, 227 , 1229-1231). Los transformantes seleccionados de ambos plásmidos recombinantes fueron cruzados juntos en ambas direcciones y las semillas inmaduras disectadas y observadas .bajo una luz azul usando un microscopio. Se detectó la expresión de GFP en semillas híbridas .

EJEMPLO 4 Generación de plantas transgénicas de Zea mays Se usó un gen de higromicina fosfotransferasa (HPT) bajo el control del promotor de ubiquitina de maíz como marcador seleccionable para la transformación de monocotiledóneas (Figura 12). Se aplicó higromicina B como agente de selección a concentraciones de 25-100 mg/1. El siguiente método se usó para generar plantas transgénicas de Zea mays : Los cultivos de callo fueron inducidos de embriones maduros e inmaduros de las líneas A188, Hill etc. Los medios de cultivo se basaron en sales de Chu (N6) y vitaminas (Chu et al., Scientia Sínica, 18 (5): 659-68, 1975) . El medio de inducción y propagación de callo fue suplementado con 30 g/1 de sucrosa, 600 mg/1 de L-prolina, 2.0 mg/1 de 2,4-D y 0.3% de gelrita. No se usó medio de preregeneración. El medio de regeneración contenía sales de N6 y vitaminas 30 g/1 de sucrosa, 2 mg/1 de Zeatina y 0.05 mg/1 de 2,4-D. Se incluyó tiosulfato de Plata en el medio de regeneración a concentraciones de 0.01-0.06 mM.

Bombardeo con microproyectiles El bombardeo con microproyectiles se efectuó utilizando el Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System (Bio-Rad) . Las células fueron bombardeadas a 900-1100 psi, a una distancia de 15 mm desde un punto de lanzamiento de macroportadores hasta la pantalla de detención y a una distancia de 60 mm de la pantalla de detención a un tejido blanco. La distancia entre el disco de ruptura y el punto de lanzamiento del macroportador fue de 12 mm. Las células fueron bombardeadas después de 4 horas de pretratamiento osmótico. El recubrimiento al oro del ADN de acuerdo al protocolo original de Bio-Rad' s (Sanford et al., 1993, In: Methods in Enzymology, ed. R. Wu, 217, 483-509) se efectúo como sigue: se mezclaron 25 µl de polvo de oro (0.6, 1.0 mm) en glicerol al 50% (60 mg/ml) con 5 µl de ADN plasmídico a 0. 2 µg/µl, 25 µl de CaCl2 (2.5 M) y 10 µl de espermidina a 0.1 M. La mezcla fue agitada vorticialmente durante 2 min seguida por incubación durante 30 min. a temperatura ambiente, centrifugación (2000 rpm, 1 min) , lavando con etanol al 70% y 99.5%. Finalmente el sedimento fue resuspendido en 30 µl de etanol al 99.5% (6 µl/ensayo) . Se efectúo un nuevo procedimiento de recubrimiento con oro de ADN (PEG/Mg) como sigue: se mezclaron 25 µl de suspensión de oro (60 mg/ml en glicerol al 50%) con 5 µl de ADN plasmídico en un tubo de Eppendorf y suplementado posteriormente con 30 µl de PEG al 40% en MgCl2 1.0 M. La mezcla fue agitada vorticial ente durante 2 min. y entonces incubada durante 30 min a temperatura ambiente sin mezclar. Después de la centrifugación (2000 rpm, 1 min) el sedimento fue lavado dos veces con 1 ml de etanol al 70%, una vez con 1 ml de etanol al 99.5% y dispersada finalmente en 30 µl de etanol al 99.5%. Las alícuotas (6 µl) de suspensión de ADN-oro en etanol fueron cargadas sobre discos macroportadores y se dejaron secar durante 5-10 min.

Preparación del ADN plasmídico Los plásmidos fueron transformados en E. coli cepa DH10B, se hicieron crecer maxi preps en medio LB y el ADN fue purificado usando Qiagen kit . Selección Para los experimentos de transformación estable, los filtros con la células tratadas fueron transferidos sobre MS2 sólido con el agente de selección esterilizado por filtración apropiada (150 mg/L de higromicina B (Duchefa) . 3% de sucrosa y mantenidas en la oscuridad. Cada 7 días el material fue transferido a medio de selección nuevo. Las placas fueron mantenidas en la oscuridad y después de aproximadamente 6 semanas el material de planta fue transferido a placas de Petri con medio de regeneración y un agente de selección apropiado (150 mg/1 de higromicina B) . Las placas fueron incubadas a una intensidad de luz alta, 16 horas del día.

EJEMPLO 5 El sistema basado en barnasa para controlar el desarrollo de semillas híbridas . El gen de barnasa fue dividido usando inteina PCC6803 DnaB Synechocystis sp. Los fragmentos de ADN para las partes N y C terminal de Barnasa flanqueados por los sitios de restricción apropiados fueron sintetizados químicamente por una compañía de síntesis de ADN comercial. La secuencia del extremo N terminal es: 5'gcaatcgatg gcacaggtta tcaacacgtt tgacggggtt gcggattatc ttcagacata tcataagcta cctgataatt acattacaaa atcagaagca caagccctcg gctgggacgt ccgc 3 ' La secuencia del extremo C terminal es: 5 ' cgccatgggg tggcatcaaa agggaacctt gcagacgtcg ctccggggaa aagcatcggc ggagacatct tctcaaacag ggaaggcaaa ctcccgggca aaagcggacg aacatggcgt gaagcggata ttaactatac atcaggcttc agaaattcag accggattct ttactcaagc gactggctga tttacaaaac aacggaccat tatcagacct ttacaaaaat cagataagga tccgc 3 ' . El extremo terminal N de la Barnasa fue fusionado a la parte N de la inteina de DnaB. El fragmento N de la intina DnaB fue amplificado de ADN de Synechocystis usando los cebadores DnaBintNprl { 5 ' gtAAGCTTGA CGT cagagag agtggatgca tcagtggaga tag 3') y DnaBintNpr2 ( 5 ' caCTGCAGct ataattgtaa agaggagctt tctag 3'). El fragmento de Barnasa (un fragmento de Clal AatlI) y el fragmento de inteina (un fragmento de AatII PstI) fueron clonados en un vector binario de Icón Genetics dando como resultado la clona P1CH12794 (Fig. 14) . El extremo C terminal de la Barnasa fue fusionado a la parte de C de inteina DnaB. El fragmento inteina-C DanB amplificado de ADN de Synechocystis usando los cebadores dnaBintCprl (gt GAG CTC G ATC GAT TCA TGA gcc cag aaa tag aaa agt tgt etc) y dnaBintCpr2 (te AAG CTT CCA TGG tct tgc tct tea ctg tta tgg acá atg atg tea t) . El fragmento de inteina (es un fragmento de Sacl Ncol) y el fragmento de Barnasa (un fragmento de Ncol BamHl) fueron clonados en un vector binario de Icón Genetics, dando como resultado la clona pICH12820 (Fig. 14) . La funcionalidad de las clonas de fusión de Barnasa-inteina N y C terminales fue probada por agroinfiltración de hojas de Nicotiana benthamiana . Como se esperaba, el área de la hoja coinfiltrada con ambos plásmidos recombinantes se volvió necrótica, mientras que las áreas infiltradas con cualquier plásmido recombinante solo permanecieron sanas. Los PICH12794 y pICHl2820 fueron subclonados en pICBVld, un vector binario de Icón Genetics con el cásete de NptII para la selección de kanamicina de transformantes de planta. Los plásmidos resultantes son pICH14780 y plCH14770 (Fig. 14) . El promotor específico del meristemo apical de brote del gen de STM Arabidopsis (Long et . Al . , 1996, Nature, 379, 66-69) fue amplificado de ADN genómico de Arabidopsis usando los cebadores STMfwd (cg caattg gtggcaagaggtctaccatct) y STMrev (ge gagctcttctctttctctcactagtatt) y subclonados como un fragmento de Mfel Sac 1 en pICH14770 y pICH14780 (digerido con EcoRl Sacl) , dando como resultado los plásmidos pICHl4790 y pICH14800 (Fig 15) . La región promotora fue secuenciada con ambos plásmidos. pICH14790 y pICH14800 consisten de las fusiones de barnasa-inteina C y N terminal bajo el control del promotor de STM. El promotor específico de la germinación del gen ATHB5 de Arabidopsis (Johannesson et al., 2003, Plant Mol . Biol . , 51, 719-729) fue amplificado de ADN genómico Arabidopsis usando los cebadores ATHB5F d (cg gaatt ccagctcatcaaccaaactctgt) y ATHB5rev (ge gagctctttgctctgtgtctagactatcc) y subclonado como un fragmento EcoRI Sacl como en pICH14770 dando como resultado el plásmido pICH14810 (Fig 15) . El fragmento amplificado fue secuenciado del pICH14810 y subclonado como EcoRl Sacl en pICH14780 dando como resultado pICH14820 (Fig 15) . Los pICH14810 y pICH14820 consisten de las fusiones de Barnasa-inteina 5' y 3' bajo el control del promotor específico de la germinación. Los 4 plásmidos fueron introducidos en Agrobacterium cepa GV3101 y usados para la transformación de Arabidopsis . Todas las plantas transgénicas fueron fenotípicamente normales. Las plantas transgénicas fueron cruzadas con las plantas que contenían el plásmido recombinante de barnasa complementario, con el mismo promotor o un promotor diferente. El uso de diferentes promotores permite restringir la actividad de la Barnasa para el área de desarrollo del promotor usado. Las semillas de Fl fueron cosechadas después de desecar y sembrar. Ellas germinaron pero enfermaron debido a la falta de meristemo.

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES 1. Proceso para la producción de un producto de interés en una semilla Fl obtenida por una hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, la hibridación genera una dotación genética en la semilla Fl para la producción combinando en la semilla Fl la primera y segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda plantas madre transgénicas, seguida por el aislamiento del producto de interés de la semilla Fl o un semillero de la misma.
2. 2. Proceso para la producción de un producto de interés en una semilla Fl obtenida por una hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, la hibridación genera una dotación genética en la semilla Fl para la producción combinando en la semilla Fl la primera y segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda plantas madre transgénicas, por lo que el producto de interés no es expresado en la primera o segunda plantas madre, seguida por el aislamiento del producto de interés de la semilla Fl o un semillero de la misma.
3. 3. Proceso según la reivindicación 1 ó 2, donde el producto de interés es un ARN, una proteína, una enzima, o un compuesto químico similar a un polímero de la síntesis del cual está implicada la enzima.
4. 4. Proceso para la producción de un producto de interés en -una' semilla Fl obtenida por una hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, la hibridación genera una dotación genética en la semilla Fl para la producción combinando en la semilla Fl la primera y ' segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda plantas madre transgénicas, por lo que el producto de interés no es expresado en la primera o segunda plantas madre, siendo el producto de interés una proteína de interés, seguida por el aislamiento del producto de interés de la semilla Fl o un semillero de la misma.
5. 5. Proceso según cualquiera de las . eivindicaciones 1 a 4, donde la dotación genética comprende un ADN replicante o un ARN replicante que está implicado en la producción del producto de interés.
6. 6. Proceso para la producción de un producto de interés en una semilla Fl obtenida por una hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, la hibridación genera una dotación genética en la semilla Fl para la producción combinando en la semilla Fl la primera y segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda plantas madre transgénicas,. por lo que la dotación genética comprende un ADN replicante o un ARN replicante que está implicado en la producció . de producto de interés, seguida por el aislamiento del producto de interés de la - semilla Fl o un semillero de la misma.
7. 7. Proceso según la reivindicación 5 ó 6, donde el ADN replicante o el ARN replicante codifica para el producto de interés.
8. 8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde el ADN replicante o el ARN replicante es generado en la semilla Fl de un componente de la primera dotación genética parcial y un componente de la segunda dotación genética parcial.
9. 9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde el ADN replicante es un replicón viral de ADN que es generado o es convertido en replicante por la hibridación.
10. 10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde el ADN replicante es generado por recombinación específica del sitio del ADN.
11. 11. Proceso según la reivindicación 10, donde la recombinación específica del sitio de ADN es catalizada por una recombinasa, integrasa o una flipasa.
12. 12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, donde el ADN replicante es generado combinando en la semilla Fl una recombinasa específica del sitio de una primera planta madre y un precursor el ADN replicante de una segunda planta madre.
13. 13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, donde el ADN replicante es un plásmido autónomo.
14. 14. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde el ARN replicante es un replicón viral de ARN que es generado o que es vuelto replicante por la hibridación.
15. 15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 ó 14, donde el ARN replicante es generado a partir de un componente de la primera dotación genética parcial y un componente de la segunda dotación genética parcial por recombinación específica del ARN.
16. 16. Proceso según la reivindicación 15, donde el ARN replicante es generado por la transcripción del ADN de la primera dotación genética parcial, por lo que la transcripción es causada por un componente o producto de expresión de la segunda dotación genética parcial.
17. 17. Proceso según la reivindicación 16, donde el ARN replicante es codificado por la planta madre hembra implicada en la hibridación.
18. 18. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17, donde la transcripción del ARN o proteínas necesarias para la formación del ADN o ARN replicante es controlada por un promotor constitutivo, promotor específico de la semilla o un promotor regulado químicamente .
19. 19. Proceso según _ cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17, donde el ADN replicante o el ARN replicante es de origen viral vegetal o de planta.
20. 20. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 19, donde el ADN replicante se basa en un geminivirus.
21. 21. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 19, donde el ARN replicante se basa en un virus de ARN de una sola hebra de sentido positivo.
22. 22. Proceso según la reivindicación 21, donde el ARN replicante se basa en un tobamovirus .
23. 23. Proceso según la reivindicación 22, donde el tobamovirus es un Virus del Mosaico del Tabaco.
24. 24. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 23, donde la replicación del ADN o ARN replicante vuelve a la planta que crece de la semilla Fl incapaz de reproducirse sexualmente.
25. 25. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la reproducción sexual de una planta que crece de la semilla Fl es menoscabada, preferiblemente abolida, de manera más preferible, la semilla Fl es estéril.
26. 26. Proceso para la producción de un producto de interés en una semilla Fl obtenida por la hibridación de una primera y una segunda plantas madre transgénicas, generando la hibridación una dotación genética en la semilla Fl para la producción combinando en la semilla Fl la primera y segunda dotaciones genéticas parciales de la primera y segunda plantas madre transgénicas, donde la semilla Fl es incapaz de reproducirse sexualmente, seguida por el aislamiento de producto de interés de la semilla Fl o un semillero de la misma.
27. 27. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde la planta que crece de la semilla Fl es incapaz de reproducirse sexualmente debido al bloqueo del desarrollo de la planta antes de alcanzar la etapa de crecimiento reproductivo.
28. 28. Proceso según la reivindicación 27, donde el bloqueo del desarrollo de la planta se logra por expresión específica del tejido de una sustancia o proteína tóxica que interfiere con el desarrollo normal de la planta.
29. 29. Proceso según la reivindicación 28, donde la proteína es seleccionada del grupo que consiste de barnasa, proteína de Shiga, factores de transcripción de planta, o enzimas que controlan el estado hormonal de la planta.
30. 30. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, donde el producto de interés se acumula en el embrión en desarrollo, en el endospermo, los cotiledones o en semillas en germinación.
31. 31. Proceso según _ cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, donde las plantas son monocotiledóneas o dicotiledóneas.
32. 32. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, donde la planta madre hembra de la hibridación es un macho estéril.
33. 33. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, donde el producto de interés es codificado en la dotación genética parcial por ser proporcionado por la planta madre hembra de la hibridación, siendo el producto de interés preferiblemente una proteína de interés.
34. 34. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, donde la producción del producto de interés en la semilla es disparada por la generación de la dotación genética.
35. 35. Producto producido o producible de acuerdo al proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.
36. 36. Semillas producidas o producibles de acuerdo al proceso según una de las reivindicaciones 1 a 34.
37. 37. Semillas según la reivindicación 36, donde la reproducción sexual de una planta que crece de la semilla es menoscabada, preferiblemente la planta es sexualmente estéril .