MXPA06003715A - Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn. - Google Patents
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Abstract
Proceso para expresar una secuencia de interes en un cultivo de planta, parte de planta o celula de planta, que comprende: (a) proporcionar un cultivo de planta, parte de planta o celula de planta que contenga en el nucleo de la celula un ADN heterologo con una secuencia que codifique un replicon de ARN enlazado o enlazable operativamente con un promotor de transcripcion, donde la secuencia que codifica un replicon de ARN contiene: (i) secuencias para la funcion de replicon del replicon de ARN secuencias que se derivan de una secuencia de un virus de ARN de planta, (ii) una secuencia de interes; donde las secuencias para la funcion del replicon muestran, en las ubicaciones seleccionadas de las secuencias del virus de ARN de planta las diferencias de conservacion de la funcion de la secuencia del virus de ARN de planta, causando esas diferencias una frecuencia incrementada de formacion de replicon en comparacion con un replicon de ARN que no muestra esas diferencias; y (b) causar la expresion de la secuencia de interes.
Description
SISTEMA. DE EXPRESIÓN DE PLANTA DERIVADO DE VIRUS DE ARN
Campo de la invención. La presente invención se refiere a los cultivos de planta, partes de planta o célula de planta que tienen un ADN heterólogo que codifica un replicón de ARN para expresar una secuencia de -interés. La invención también proporciona un proceso para expresar una secuencia de interés en cultivos de planta, partes de planta o célula de planta. El. proceso y los vectores proporcionan las células de planta con una frecuencia aumentada de formación de ARN de replicón de ARN derivado' de virus. Este ADN heterólogo o parte (s) del mismo puede ser incorporado de manera estable en el ADN cromosomal o episomal nuclear de la planta o entregado transitoriamente. La invención también proporciona procesos de transformación mediada por Agrobacterium de plantas con vectores virales (ARN) o replicones virales (ARN) .
Entorno de la invención. Entre los sistemas de expresión de transgénicos de planta, la expresión de un transgénico bajo el control de un promotor heterólogo ha estado en uso durante varios años. Aparte de esos sistemas de expresión de planta convencionales, pueden usarse los sistemas de expresión basados en virus para la producción rápida de proteina en plantas (para repaso, ver: Porta & Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol. r 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol . , 240, 81-94) y son una herramienta poderosa para los estudios de genómicos funcionales (Dalmay et al., 2000, Plant Cell, 12, 369-379; Ratcliff et al., 2001, Plant J. , 25, 237-245; Escobar et al., 2003, Plant Cell, 15_, 1507-1523) . Numerosas publicaciones y Patentes en el campo describen sistemas basados en vectores virales de ADN y ARN (Kumagai et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sel. USA, 90, 427-430; Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol. 20, 622-625; Mor et al., 2003, Biotechnol. Bioeng. , 81, 430-437; US5316931; US5589367; ÜS5966785; US5491076; US597-7438; US981236; WO02088369; WO02097080; 098¾4342) . Los sistemas existentes de vector viral están usualmente restringidos a .un estrecho · ango de huésped en términos de su mejor desempeño y aún del nivel de expresión de esos vectores en su huésped más favorable está muy por debajo de los limites biológicos superiores del sistema. Una cuestión importante de los sistemas basados en virus es el método de entrega del replicón viral a una' célula de planta. El método más ampliamente aplicado de entrega para la producción a gran escala (producción simultánea en diversas plantas, p. ej . , en un terreno de granja o un invernadero) es el uso de copias infecciosas de vectores virales de ARN (Kumagai et al., 1995, Proa. Nati. Acad. Sel. USA, 92, 1679-1683) . Debido a una tendencia relativamente alta de los vectores recombinantes de ARN viral para perder los insertos heterólogos durante los ciclos de su replicación, el método requiere la transcripción in vitro de plantillas de ADN, y como resultado es ineficiente y caro. Otro enfoque para resolver el problema de la entrega podría ser la presencia de un precursor de replicón de ARN viral en cada célula de una planta transgénica, de modo que pudiera ser liberado al activar el proceso de replicación a través de complementar una función del vector viral (p. ej . , usando el virus auxiliar - Patente US5965794) o usando otros sistemas de intercambio regulados (p. ej . , la recombinación especifica en sitio - Patente US6632980) .
A pesar de las muchas publicaciones en el campo que incluyen tecnologías patentadas, aún no hay s stemas de producción a gran escala basados en virus que trabajen con eficiencia suficiente y rindan para la producción comercial de alto rendimiento, predominantemente debido a dos razones principales: la primera, los sistemas de expresión de plantas transitorias basados en virus generalmente se restringen a huéspedes, específicos, que pueden no ser adecuados para el cultivo a gran escala debido a su susceptibilidad a los factores ambientales. Además, generalmente están restringidos a ciertas partes de un huésped de planta, excluyendo por lo tanto la mayoría de la biomasa de la- planta del proceso de producción, y como resultado se -minimiza la producción relativa del producto recombinante por unidad de biomasa de planta por debajo de un nivel comparable al que se logra con un promotor de transcripción convencional en una planta transgénica; en segundo lugar, los intentos para escalar el sistema de producción basado en virus a través de generar huéspedes de planta transgénicos que tengan el precursor de replicón viral establemente integrado en cada célula tampoco han proporcionado una solución, en particular debido al bajo desempeño de los . replicones en esa posición, a la "escapatoria" del gen de interés para ser expresado a partir de ese replicón y a la falta de un sistema de intercambio eficiente para esos vectores. Se logró cierto progreso con los vectores basados en PVX usando supresores del silenciador de PTGS como activadores de la formación del replicón de ARN (Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol., i'' 622-625), pero el sistema es todavía impráctico, ya que no se proporciona una solución para un control eficiente del intercambio (supresor de PTGS) que activa la replicación del vector viral. Sin embargo, este sistema proporcionó un nivel de expresión del gen GUS que alcanzó el 3% de la proteína soluble total (TSP, siglas en inglés) , que es el mejor que se conoce hasta ahora para este tipo de sistema, pero que aún no es mejor que un sistema convencional de expresión transgénica bajo el control de un promotor fuerte. Otro sistema de inducción basado en un virus de planta de ARN tripartita ( ori et ai., 2001, Plant J., 2_7, 79-86), el Virus del Mosaico del Bromo (BMV, siglas en inglés) , dio una producción muy baja de la proteina de interés- (3-4 pg/g de peso fresco) , que es comparable con las producciones proporcionadas por los promotores transcripcionales estándar.
Los bajos niveles de expresión hasta ahora logrados con los sistemas de expresión de planta son una razón principal del por qué estos sistemas son duramente competitivos con otros sistemas de expresión como los sistemas de expresión de célula bacterial, fungal o de insecto. Los niveles de expresión bajos dan lugar a costos muy altos corriente abajó para el aislamiento de la proteina y la purificación en un entorno . amplio del material de planta. Por lo tanto, los costos para el procesamiento corriente abajo disminuyen rápidamente, a medida que se incrementa la producción de la proteina o del producto de interés por unidad de biomasa de planta.
Actualmente no hay un sistema de expresión transgénica de planta a gran escala cuya producción y cuya eficiencia pudieran ser suficientemente altas como para competir en el- mercado con otros sistemas de expresión a gran escala tales como los sistemas de expresión de célula bacterial, fungal o de insecto. Una expresión de planta asi deberla cumplir lo mejor posible con los siguientes criterios : (i) alta producción, incluyendo la expresión de la proteina de interés en tantos tejidos de planta como fuera posible y en muchas células de esos tejidos.
(ii) Para prevenir un efecto deletéreo de la expresión de la proteina en el crecimiento de la planta, la expresión de la proteina o del producto, de interés deberla ser intercambiable de modo que la' expresió pueda ser intercambiada en un punto deseado en el tiempo.
(iii) El intercambio debería ser tal que la expresión pueda ser intercambiada simultáneamente o casi simultáneamente en todos los tejidos o células de una planta y, al mismo tiempo, en todas las plantas de un grupo de plantas seleccionado, p. e . , en todas las plantas de un lote seleccionado de plantas. Típicamente, la proteína o el producto de interés se acumula en cada célula que produce ese producto o proteína hasta un cierto punto. Sin embargo, durante la acumulación se establecen con frecuencia procesos degradantes que tienden a reducir la producción o la calidad de la proteina o del producto de interés. Por lo tanto, hay un punto óptimo en el tiempo después del intercambio de la expresión, en el que el producto o la proteina de interés debería ser cosechado. Este punto óptimo en el tiempo debería ser alcanzado al mismo tiempo en todos los tejidos o células de una planta y el todas las plantas de un lote seleccionado, para hacer el proceso general eficiente y provechoso.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es el proporcionar un cultivo transgénico de planta, parte de planta o célula de planta para un sistema de expresión de planta de alta producción. Otro objetivo es el proporcionar un proceso para expresar transitoriamente una secuencia de interés en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta. Otro objetivo de la invención es el proporcionar un proceso eficiente para expresar una o más secuencias de interés en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, por medio del cual* el proceso pueda usarse con eficiencia en una gran escala. Además, un objetivo de la invención es el proporcionar un método para controlar la expresión de la(s) secuencia (s) de ácido nucleico de interés en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, que sea de seguridad ecológica y biológica mejorada.
Desaripción general de la invención. Los objetivos de arriba se logran a través de 'un cultivo transformado de planta, parte de planta o célula de planta que contenga en el núcleo de la célula un ADN heterólogo con una secuencia que codifique un replicón de ARN, " estando esa secuencia enlazada o siendo enlazable operativamente con un promotor de transcripción, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene: (i) secuencias para la función de replicón de ese replicón de ARN, siendo las secuencias derivadas de una secuencia de un virus de ARN de planta, y
(ii) una secuencia de interés para ser expresada a partir de ese replicón de ARN,
donde las secuencias para la función del replicón corresponden a las secuencias del virus de ARN de planta y muestran en las ubicaciones seleccionadas dé la secuencia del virus de ARN de planta las diferencias conservadoras de la función de la secuencia del virus de ARN de planta. Esas diferencias pueden causar una frecuencia incrementada de formación del replicón en comparación con un replicón de ARN que no muestre esas diferencias.' Preferiblemente, el cultivo de planta, parte de planta o célula de planta está transformado de manera estable con el ADN heterologo.
Además, los objetivos de arriba se logran a través de un proceso de 'expresar una secuencia de interés en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, que comprende: (a) proporcionar un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta que contenga en el núcleo de la célula un ADN heterologo como se definió arriba, y (b) causar la expresión de la secuencia de interés .
Las células de ese cultivo de ese cultivo de planta, parte de planta o célula, de planta pueden ser transformadas estable- .o transitoriamente con el ADN heterologo.
La invención también proporciona un proceso para producir una planta transgénica establemente transformada en un cromosoma nuclear con un ADN heterologo como se definió arriba, que comprende transformar una planta o una parte de planta con un vector que contenga al ADN heterologo, seleccionar el tejido de la planta que contenga en un cromosoma nuclear el ADN heterólogo, y regenerar la planta transgénica a partir de ese tejido.
La invención también proporciona un proceso para expresar transitoriamente una secuencia de interés en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, que comprende : transformar un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta con un ADN heterólogo que tenga una secuencia que codifique un replicón de ARN enlazado o enlazable operativamente con un promotor de transcripción, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene: (i) secuencias para la función de replicón de ese replicón de ARN, siendo .esas secuencias derivadas de una secuencia de un virus de ARN de planta, (ii) una secuencia de interés,
donde las secuencias para la función del replicón muestran, en ubicaciones seleccionadas de las secuencias del virus de ARN de planta las diferencias conservadoras de la función de la secuencia de ese- virus de ARN de planta. Esas diferencias pueden causar una frecuencia incrementada de formación del replicón en comparación con un replicón de ARN que no muestre esas deferencias.
La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico para producir el cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de la invención o para realizar el proceso de la invención. La molécula de ácido nucleico es como se define en las reivindicaciones y como se define además en la descripción de abajo con referencia al cultivo de planta, parte de planta . o célula de planta y al proceso de la invención.
Cuando los inventores de la presente invención introdujeron un ADN heterólogo que codificaba los replicones virales de ARN en los cromosomas nucleares de las plantas o las partes de planta para expresar una proteina de interés codificada en ese replicón de ARN, encontraron que la frecuencia con la que aparecían los replicones de "ARN en el citosol era muy baja- y ocurría sólo en una pequeña fracción de las células que contenía al ADN heterólogo. De acuerdo con ello, el nivel de expresión de la proteína de interés también era muy bajo. Se consideraron muchas razones posibles para este problema, incluyendo efectos de posición del cromosoma, elementos inadecuados de regulación de la transcripción, silenciamiento de gen, transporte defectuoso del replicón desde el núcleo hacia el citosol, un efecto deletéreo de la secuencia de interés en la transcripción, función de procesamiento del ARN o el replicón, etc. Entonces, sorprendentemente, se encontró que ciertas porciones de la secuencia ricas en A/T(U) en el replicón eran las responsables de la baja frecuencia de formación del replicón en el citosol. Cuando se suprimió el efecto deletéreo de esas porciones de la secuencia ricas en A/T(U), la frecuencia de formación del replicón en el citosol creció con fuerza, dando como resultado una producción fuertemente . incrementada de la proteina de interés . ¦
La eficiencia de la presente invención es tal que se logra una nueva dimensión en los sistemas de expresión de planta. Los nxveles de expresión que se alcanzan con la presente invención son tales que los gastos para el procesamiento corriente abajo (incluyendo la separación y la purificación de la proteina de interés) son lo suficientemente bajos para hacer al proceso de la invención competitivo con otros sistemas de expresión a gran escala. En los sistemas de expresión de la técnica anterior que usan plantas establemente transformadas, el nivel de expresión es bajo aún si se usan vectores basados en virus, dado que los replicones se producen en una pequeña fracción de las células. Los replicones que se distribuyen en la planta no pueden remediar este problema, ya que la distribución es baja, notablemente a través de grandes distancias. Por. lo tanto, la expresión no procede de manera uniforme en la planta y la degradación de la · proteína de interés ya habrá tenido lugar en algunas partes de la planta mientras en otras la expresión de la prot.eína aún no se ha iniciado. La invención permite activar la expresión de manera uniforme a través de la planta. La pequeña fracción de las células que no produce un replicón puede ser invadida rápidamente por los replicones de las células vecinas. La invención proporciona el primer sistema de expresión de planta de alta producción que puede ser usado a gran escala. La invención permite inclusive producir dos o más replicones en la misma célula, con lo cual la probabilidad de tener arabos replicones en las mismas células es aún muy alta. Además, la eficiencia del sistema de expresión de la invención es tal que se reduce la de otra forma limitante especificidad de planta de los virus de ARN.
La eficiencia mejorada como se describe arriba puede lograrse en combinación con la transformación estable así como con la transformación transitoria de las plantas, partes de planta o células de planta.
El cultivo de planta, parte de planta o célula de planta transformada ( opcionalmente de manera estable) y la molécula de ácido nucleico tienen un ADN heterólogo que codifica un replicón de ARN. La secuencia que codifica un replicón de ARN contiene- (i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, siendo esas secuencias derivadas de una secuencia de un virus de ARN de planta, y (ii) una secuencia de interés a ser expresada a partir de ese replicón de ARN.
La secuencia que codifica un replicón de ARN contiene una secuencia de interés que será expresada desde el replicón (ii) de ARN. La secuencia de interés que será expresada puede conducir a la formación de un ARN de ¦ interés, como un ARN para la interferencia de ARN para suprimir una función de la planta. Preferiblemente, sin embargo, la secuencia de interés codifica para una proteina de interés y contiene secuencias reguladoras para trasladar la proteina de interés, p. ej . , a partir del replicón de ARN o a partir del ARN subgenómico del replicón de ARN. La secuencia de interés puede incluir una codificación de secuencia para una señal meta para dirigir la proteina de interés hacia un compartimiento en particular de la célula o para secretar la secuencia de interés. También pueden ser codificadas las secuencias de aminoácido para separar la proteina de interés a partir ' de una señal de direccionamiento . La secuencia de interés es una secuencia que es heteróloga a cualesquiera secuencias del virus de ARN de planta, p. ej . , el proceso de la invención no comprende un caso restringido para la transformación de un virus de ARN de planta de tipo silvestre dentro de plantas u hojas de plantas. Por lo tanto, la proteina de interés no es una proteina codificada por el virus de ARN de planta del que se derivan las secuencias para la función del replicón.
Las secuencias para la función (i) del replicón del replicón de ARN corresponden a las secuencias del virus de ARN de planta Ínter alia en que el formador puede ser una copia de ADN de este último. Las secuencias para la función del replicón proporcionan' el replicón de ARN con la función para replicar en el citosol. Las secuencias para la función del replicón típicamente codifican para una o más proteínas involucradas en la replicación como una polimerasa de ARN (replicasa) dependiente del ARN. Las secuencias para la función del replicón pueden codificar además para las funciones de un replicón de ARN como una o más proteínas involucradas en la distribución de célula a célula o sistémica de un -virus de ARN en una planta, como una proteína de movimiento o una proteina de cubierta. Las secuencias para la función del replicón son derivadas preferiblemente de una secuencia de un virus de ARN de planta, dado que los virus de ARN de planta son una fuente · fácilmente accesible para las funciones del replicón. "Ser derivadas" significa que las secuencias para la función del replicón son esencialmente una copia del ADN de las secuencias correspondientes del virus de ARN y esa copia de ADN completa una parte del ADN heterologo contenido en, o que será introducido en, el núcleo de la célula. "Ser derivado" significa también que las secuencias para la función del replicón no son una copia exacta de ADN de la correspondiente secuencia de ARN del virus de ARN, sino que muestran diferencias de conservación de la función como se describe abajo. Dado que esas diferencias son de conservación de la función, las secuencias para la función del replicón codifican preferiblemente para las proteínas capaces de realizar las funciones de. replicón de manera similar a como lo hacen para el virus de ARN. Esas diferencias de conservación de la función pueden sin embargo, dar como resultado diferencias cuantitativas en la funcionalidad de las proteínas virales codificadas, en comparación con un caso en el que esas funciones de conservación de la función estén ausentes. En una representación, en ADN heterologo y las secuencias para la función del replicón no codifican para una proteina requerida para el movimiento de larga distancia como una proteina de · cubierta (notablemente una proteina i' tobamoviral) . ".En otra representación, el ADN heterologo carece de una proteina de movimiento. Por lo tanto, las secuencias para la función del replicón del ADN heterologo no tienen que codificar para todas las funciones del virus de ARN a partir del cual se derivan las secuencias para la función del replicón.
Las secuencias para la función del replicón muestran, en ubicaciones seleccionadas de la secuencia del virus de ARN, diferencias de conservación de la función relativas a la secuencia del virus de ARN de planta, causando esas diferencias una frecuencia incrementada de formación de replicón en comparación con un replicón de ARN que no muestre las diferencias. Esas diferencias son causales para la frecuencia incrementada de de formación del replicón en las células de las plantas, una vez que el proceso general ha sido activado (ver abajo) . La conexión causal entre la frecuencia incrementada de formación del replicón y dichas diferencias puede ser probada experimentalmente comparando la frecuencia de formación del replicón entre las secuencias para la función del replicón que tienen las diferencias y las secuencias para la función del replicón que no tienen las diferencias. La comparación experimental puede hacerse p. ej . , contando los protoplastos que expresan la secuencia de interés como se describe en -los ejemplos. Preferiblemente, para este propósito se usa una secuencia de interés que codifica para una proteína reportera fácilmente detectable como la proteína verde fluorescente (GFP, siglas en inglés) . Como se describe mayormente abajo, también es preferible realizar la comparación experimental con replicones de ARN que no sean capaces de distribuirse de célula a célula.
Las diferencias de conservación de la función son introducidas en las secuencias para la función del replicón en ubicaciones seleccionadas de la secuencia del virus de ARN de planta. Las ubicaciones seleccionadas son las ubicaciones en las secuencias para la función del replicón del virus de ARN de planta que son responsables de una baja probabilidad " de que aparezca en el citosol, como un replicón funcional, un replicón de ARN transcrito en el núcleo. Preferiblemente, esas ubicaciones seleccionadas tienen un alto contenido de A/T (U) , i.e., un alto contenido de A y/o un alto contenido de T (un alto contenido 4e U en el nivel del ARN) , o tienen sitios crípticos de empalme, i.e., porciones de secuencia que pueden ser reconocidas por la maquinaria de empalme nuclear como sitios de empalme.
Las ubicaciones ' seleccionadas pueden ser identificadas en un virus de ARN en el cual está basado un replicón de ARN a través de analizar el perfil de ARN del virus de ARN como r se ejemplifica" abajo. Además, las ubicaciones seleccionadas pueden ser identificadas experimentalmente analizando el ARN formado en una célula de planta después de la transformación con un' ADN heterólogo que codifique un replicón de ARN que . no muestre las diferencias (de conservación de la función) de acuerdo con la invención. Este análisis . experimental puede hacerse por RT-PCR, preferiblemente junto con el secuenciado de los productos de RT-PCR. En la prueba RT-PCR, la replicase es preferiblemente vuelta disfuncional p. ej . a través de una mutación de salto de marco para prevenir que se amplifiquen los replicones de ARN que alcancen el citoplasma; esa amplificación puede conducir a la contaminación de los transcritos de ARN con el virus de tipo silvestre o a una sobre representación de los replicones de ARN amplificados en el citoplasma. De esta manera pueden ser identificados los productos de empalme no deseados que indican eventos de empalmado que destruyen al replicón de ARN. Además, los sitios exactos de empalmado no deseado pueden ser identificados y luego remediados introduciendo las diferencias de conservación de la función en las ubicaciones seleccionadas.
Por lo tanto, la invención también proporciona un proceso para expresar una secuencia de interés en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, donde: (A) el cultivo de planta, parte de planta o célula de planta se proporciona con un ADM heterologo como aquí se definió, pero carente de las diferencias de conservación de la función; (B). probar el ARN derivado de el ADN heterologo para los productos de empalme no deseados en las secuencias para la función del replicón (p. e . , por RT-PCR) ; (C) identificar (p. ej . en la secuencia de un producto del RT-PCR) una ubicación seleccionada como una ubicación de un evento de empalme no deseado; (D) introducir una diferencia de conservación de la función (p. ej . , un intrón) de acuerdo con la invención dentro de, o cerca de, la ubicación seleccionada identificada en el paso (C) dentro del ADN heterologo del paso (A) para producir el ADN heterologo de la invención, y expresar una secuencia de interés en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con la invención, p. e . a partir de una planta estable o transitoriamente transformada con el ADN heterologo de la invención.
Las diferencias de conservación de la función causan una frecuencia incrementada de formación del replicón de ARN suprimiendo el efecto deletéreo de las ubicaciones seleccionadas en la frecuencia de formación del replicón de ARN. Las diferencias de conservación de la función pueden comprender' una reducción de un alto contenido de A/U en el replicón, de ARN, reduciendo un alto contenido de A/T en - las secuencias para la función del replicón de la secuencia que codifica al replicón de ARN. El 'alto contenido de ' A/ü puede ser reducido con la eliminación · al menos parcial o el reemplazo al menos parcial a través de bases G/C (p. ej . , usando la degeneración del código ctenético) , siempre que esas diferencias sean conservadoras de la función. Además, pueden removerse los sitios de empalme críptico que flanquean a las regiones ricas en A/U de esas secuencias derivadas del virus de ARN de planta. Las diferencias conservadas de la función pueden ser introducidas en una o, preferiblemente, en varias ubicaciones seleccionadas.
Las diferencias de conservación de la función comprenden la inserción de uno o más intrones, lo más preferible de intrones nucleares, o de una o más secuencias capaces de formar intrones nucleares cerca o dentro 'de las ubicaciones ricas en A/U de las secuencias que son derivadas de las · secuencias del virus de ARN de planta. Sorprendentemente, se ha encontrado que la introducción de intrones en o cerca de las ubicaciones ricas en A/U da como resultado una frecuencia incrementada de la formación del replicón de ARN-. Pueden introducirse varios intrones y aqui se dan ejemplos para varios números de intrones introducidos. Los efectos de más de un intrón son acumulativos. Además, la inserción del intrón puede ser combinada . con otras diferencias de conservación de la , función en otras ubicaciones seleccionadas.
La Figura 8 muestra un ejemplo para la introducción de secuencias capaces de formar un intrón nuclear, aunque en el gen de interés que se va a expresar. En el ejemplo de la Figura 8, el intrón es formado a partir de dos mitades de intrón al giro catalizado de recombinasa de una parte del ADN heterclogo. Este principio también puede ser aplicado a las secuencias para la- función del replicón del replicón de ARN. En una representación en la que se forma dos replicones de ARN diferentes en la misma célula, la recombinación entre los dos diferentes replicones puede dar como lesultado la formación de un intrón a partir de dos mitades de intrón presentes en replicones diferentes. Además, un replicón de ARN puede formarse a través de la recombinación entre dos precursores, ninguno de los cuales es un replicón. También en este caso, puede ensamblarse un intrón a partir de dos mitades de intrón derivadas de diferentes moléculas del precursor .
v El cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de la invención puede ser transformado de manera estable con el ADN heterólogo. Transformado de manera estable significa que contienen el ADN heterólogo en el núcleo de la célula de modo que el ADN heterólogo se mantiene en el núcleo', de la célula como se mantienen los cromosomas nucleares. El 7\DN ¦ heterólogo puede estar contenido -dentro o puede ser un elemento episomal. Sin embargo, preferiblemente el ADN heterólogo se incorpora de manera estable en un cromosoma nuclear de tal modo que puede ser heredado a las células de la progenie o a las plantas de la progenie.·· Les métodos de producción de cultivos de plantas, partes de plantas o célula de plantas que están transformados de manera estable son conocidos en la técnica de biotecnología de plantas. Estos métodos usualmente requieren la selección de los transformadores para la transformación estable usando un agente selectivo y un gen marcador selectivo.
Preferiblemente ¡ todos los cultivos de planta, parte de planta o célula de planta contienen en su núcleo al ADN heterólogo para dar una alta producción de . una proteína de interés. Más preferiblemente, las células contienen el ADN heterologo integrado de manera estable en un cromosoma nuclear. En el caso de una planta, esto significa que "la planta es una planta transgénica.
El ADN heterologo que tiene la secuencia que codifica al replicón de ARN está enlazado o es enlazable , operativamente con un promotor de transcripción. Alternativamente, la secuencia que codifica al replicón de ARN esté enlazada o es enlazable operativamente con un promotor de transcripción. Si el ADN heterologo o la secuencia están enlazados operativamente con el promotor de transcripción, el promotor de transcripción es preferiblemente un promotor regulado, como un promotor regulado en lo inducible, lo específico del tejido o en el desarrollo para hacer regulable la expresión de la secuencia de interés. Más preferiblemente, el promotor está regulado en lo inducidle o en el desarrollo, lo que permite que la expresión sea inducida en un momento deseado o que la expresión sea activada cuando la planta alcanza un estado de desarrollo definido, respectivamente. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de interés puede ser activada en las semillas de las plantas si el promotor es un promotor específico de la semilla. La invención es de gran valor para proporcionar tejidos específicos (p. ej . , tejidos de semillas) con replicones de ARN, con lo que esos tejidos pueden estar menos adecuados para la distribución de célula a célula del replicón que, p . ' ej . , el tejido de la hoja. Los más preferibles son los promotores químicamente regulados, dado que permiten activar la expresión a voluntad en todos o en la mayoría de los tejidos de una planta. Aún más importante, los promotores químicamente inducibles son los promotores de elección para las aplicaciones a gran escala, dado que el inductor químico puede ser aplicado a un gran número de plantas al mismo tiempo. Los ejemplos de promotores regulados se conocen en la técnica. Las aplicaciones a gran escala son aplicaciones en las que una secuencia de interés seleccionada es expresada en muchas plantas de forma concomitante. La aplicación a gran escala puede realizarse en un invernadero .
La secuencia que codifica un replicón de ARN puede ser alternativamente enlazable de manera .operativa con un promotor de transcripción, lo que permite activar la expresión de la secuencia de interés enlazando operativamente con un promotor la secuencia que codifica un replicón de AR . Hay varias formas de llevar esta representación a la practica. Una opción es separar, en el ADN heterólogo, a la secuencia que codifica el replicón de ARN y al promotor, a través de un bloque de secuencia que impide un enlace operable entre el promotor y el ADN heterólogo. Este bloque de secuencia puede estar flanqueado por sitios de -recombinación de modo que 1 bloque puede ser cortado por una recombinasa que reconozca esos sitios de recombinación. Por lo tanto puede establecerse el enlace operable para la transcripción de la secuencia que codifica el replicón de ARN y puede- activarse la expresión. Otra opción es el tener una porción de una secuencia necesaria para la transcripción (p. ej . , un promotor o porción de promotor) en orientación girada y flanqueado por sitios de recombinación. El proporcionar una recombinasa adecuada puede girar a la porción de la secuencia de regreso en la orientación correcta, con lo que puede establecerse, un enlace operable.
En una representación de la invención, la secuencia que codifica un replicón de ARN tiene uno o más segmentos que codifican juntos para ese replicón de ARN, i.e., el replicón de ARN no es codificado por un ADN continuo. En vez de ello, .el replicón de ARN es codificado de forma discontinua por dos o más segmentos, por lo que esos segmentos pueden estar presentes en el mismo cromosoma, preferiblemente contiguos uno del otro.' La formación del replicón de ARN puede requerir entonces el reacomodo de los segmentos, p. ej . , por recombinación. Como un ejemplo, una parte de una secuencia para la función del replicón (p. ej . , una parte de una secuencia que codifica t' para una replicada) puede estar presente en el ADN heterologo en una orientación girada con relación a las otras partes de esa secuencia. La parte girada puede estar flanqueada por sitios de recombinación. Entonces el transcrito del ADN heterologo no será un replicón, dado que la función del replicón no puede proporcionarse (p. e . , porque el transcrito no codifica para una- replicasa funcional) . Proporcionando una recombinasa especifica del sitio que reconozca ¦ los sitios de recombinación, puede girarse uno de los segmentos de regreso de tal modo que una función del replicón sea codificada continuamente. En esta representación, el proporcionar . la recombinasa puede funcionar como un intercambio para activar la formación del replicón" y la expresión de una secuencia de interés (ver más, abajo) . Esta representación se realiza preferiblemente en conexión con cultivos de planta, parte de planta o célula de planta transformados de manera estable.
Alternativamente, los segmentos pueden estar presentes en diferentes cromosomas. La formación de un replicón de ARN requerirá entonces la transcripción de ambos segmentos y el trans--empalmado de ambos transcritos para ensamblar el replicón de ARN. Esta representación puede usarse para segregar rápidamente' los segmentos que codifican juntos al replicón de ARN en las plantas o t' células de la- progenie, como se describe al detalle en la Patente PCT/EP03/02986.
El proceso de la invención puede comprender los pasos (a) y (b)' . El paso (a) puede comprender la transformación estable o transitoria de un cultivo de planta, parte de planta o célula de plant "con el ADN heterologo de la invención. Como se discutió arriba, es preferible la transformación estable de un cromosoma nuclear. Preferiblemente, el proceso de la invención es un proceso para expresar una proteina de interés codificada por la secuencia de interés. El paso (b) comprende el causar la expresión do la secuencia de interés, p. ej . , activando la expresión. Ya se han mencionado varios métodos para causar o activar la expresión. Los ejemplos incluyen el inducir un promotor inducible enlazado operativamente con el ADN heterologo; Traer ese ADN heterologo bajo enlace operable hacia un promotor usando la recombinación; establecer la codificación continua de una secuencia para la formación del replicón usando la recombinación, etc. Si se usa una recombinasa para activar el .proceso de la invención, esa recombinasa puede ser 'proporcionada de manera transitoria al cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, lo que actuaría como un intercambio para el paso (b) . .Alternativamente, la recombinasa puede ser codificada de -manera estable 'en las células, y expresar la recombinasa bajo el control de un promotor regulado, preferiblemente inducible. El inducir la expresión de la recombinasa a través de inducir el promotor puede causar entonces la expresión en el paso (b) . En el caso de la transformación transitoria,- el paso (b) puede lograrse automáticamente al realizar el paso (a) .
Preferiblemente, el proceso de la inven«ión se realiza con muchas plantas en paralelo, proporcionando muchas plantas de acuerdo, con (a) y causando la expresión de la secuencia de interés de . acuerdo con (b) con todas las plantas en el mismo paso, p. ej . , aplicando un inductor químico para un promotor químicamente inducible a todas las plantas, por ejemplo por aspersión.
En una representación importante del proceso de la invención, la planta o las partes de planta (por ejemplo, las hojas) son transformadas de forma transitoria con el ADN heterólogo de la invención para la expresión transitoria de la secuencia de interés. El término "transformación transitoria" significa la introducción del ADN heterólogo sin la selección de las células transformadas para la incorporación estable del ADN heterólogo en el cromosoma de una planta. La transformación transitoria - usualmente proporciona la expresión transitoria del (los) gen (es) codificado ( s ) por el ADN heterólogo. La transformación transitoria puede lograrse a través de cualquiera de los métodos de transformación que se' dan abajo. Preferiblemente se realiza a través de la transformación transitoria mediada por Agrobacterium del T-ADN que contiene al ADN heterólogo de la invención. Un método preferible de transformación transitoria mediada por Agrobacterium es la agroinfiltración . La agroinfiltración (agro-inoculación) es la más preferible. Los más rápidos y más altos niveles de expresión de la secuencia de interés pueden obtenerse si se transforman por agroinfiltración las plantas completas (i.e., las partes arriba del suelo que incluyen a todas las hojas) . Esto puede lograrse sumergiendo las plantas de cabeza en la suspensión de Agrobacterium, aplicando vacio, y liberando rápidamente el vacio.
En una representación preferible del proceso de expresión transitoria- de una secuencia de interés, la secuencia que codifica, el replicón de ARN es enlazada operativamente con un promotor transcripcional, preferiblemente un promotor transcripcional constitutivo. En otra representación preferible, la planta pertenece al género Nicotiana y las secuencias para la función del replicón se derivan de un tobamovirus, preferiblemente del virus del mosaico del tabaco. En una representación particularmente preferible, las plantas de tabaco que incluyen el tallo y todas las. hojas son transformadas transitoriamente por agroinfiltración . Esta última representación puede ser usada para las aplicaciones a gran escala del proceso de la invención. En las aplicaciones a gran escala, el proceso se aplica de forma concomitante a muchas* plantas (al menos a 5, preferiblemente al menos, a 10, más preferiblemente al menos a 100 plantas) .
La presente invención puede en lo principal . ser aplicada á cualesquiera plantas para las cuales existen virus de ARN infecciosos. Los pares adecuados · de planta/virus de ARN pueden derivarse de la lista de virus de ARN que se da abajo. Debido a la muy alta eficiencia de formación del replicón de acuerdo con la invención, la especificidad de especies de planta de los virus de plantas es mucho menos pronunciada cuando se practica esta invención. De manera similar, la presente invención puede ser usada con replicones de ARN basados en cualquier virus de ARN. Los virus de 7\RN han evolucionado generalmente afuera del núcleo de la célula de sus plantas huéspedes, y habrán elegido ubicaciones que hacen ineficiente a un replicón basado en ese virus cuando el replicón es t' producido dentro del núcleo de la célula, principalmente si el replicón está codificado de manera estable en un cromosoma nuclear. La invención puede aplicarse a todos los virus de ARN, aunque el nivel de mejora puede variar entre virus de- ARN de diferentes plantas. Los virus de ARN de planta más preferibles sobre los que puede basarse la invención son los tobamovirus, principalmente el virus del mosaico del tabaco, y los Potexivirus tales como el virus X de la papa. En el caso del virus del mosaico del tabaco, será generalmente la proteína de cubierta la que es reemplazada por la secuencia a expresar. La proteína de movimiento puede ser removida o reemplazada por una secuencia a expresar. Preferiblemente, sin embargo, un replicón de ARN derivado del. virus del mosaico del tabaco debería codificar para la proteína de movimiento y la proteína de movimiento ser reemplazada por la secuencia a expresar. Es altamente preferible que el ADN heterólogo carezca- de al menos un marco de lectura abierto del virus de ARN de planta, como una proteína de cubierta o una proteína de movimiento .
aplicación principal de la presente invención es la producción de una proteina de interés en cultivos de plantas, partes de plantas o célula de plantas. La proteina de interés es .codificada por la secuencia de interés. La secuencia de interés es preferiblemente heterologa al virus de ARN de planta. En cualquier caso, la secuencia de interés no es una secuencia, que tenga o que codifique funciones del virus de ARN.
Si el proceso de la invención se realiza en plantas, son preferibles las plantas que no entren en la cadena alimentaria- humana, o animal, como las especies Nicotiana (p. e . , Nicotiana benthamiana , Nicotiana tabacum) . Las partes de plantas son, p. ej . , órganos de plantas o tejidos específicos de plantas, como hojas o semillas. Aquí, las semillas se consideran como, partes de la planta si el proceso de la. invención es hecho en las semillas que estén creciendo o estén unidas a una planta madre. Sin embargo, las semillas también se consideran como plantas aunque en una cierta etapa de desarrollo de una planta. Más preferiblemente, las plantas de la invención son vendidas o distribuidas como semillas, las semillas se crecen como plantas, y la expresión de la secuencia de interés es inducida o activada en un punto deseado de esas plantas .
Muchas especies de plantas, como la Nicotiana tabacum o la Beta vulgaris han sido- hasta ahora imposibles de transformar .con un vector viral o un replicón por medio r de la transformación mediada con Agrobacteriu . Puede suponerse que la razón para esta imposibilidad fue la activación de los mecanismos de defensa de la planta en respuesta a un doble reto de ia planta con dos patógenos, a saber, la Agrobacterium y el vector viral. Ahora, los inventores han encontrado que el uso de suspensión altamenté diluida de Agrobacteria para la transformación mediada por Agrobacterium permite lograr una mayor eficiencia de transformación con los vectores virales. Por lo tanto, la invención logra una aplicabilidad amplia de la transformación por vector viral mediada por Agrobacterium para muchas especies de. plantas. La suspensión altamente diluida de Agrobacteria para esta representación, tiene una concentración de células de la Agrobacteria que corresponde a una densidad óptica calculada a 600 nm de cuando mucho 0.04, preferiblemente cuando mucho de 0.01, más preferiblemente cuando mucho de 0.004, y lo más preferible, cuando mucho de 0.001, donde las densidades ópticas calculadas se definen por una dilución de al menos un doblez de 25, preferiblemente al menos un doblez de 100, más preferiblemente al menos un doblez de 250, y lo más preferiblemente al menos un doblez de 1000, respectivamente, de una suspensión de la Agrobacteria de una DO a 600 nm de 1.0. La especie de planta más preferiblemente- transformadas de acuerdo con esta r representación es la Nicotiana tabacum.
La eficiencia de transformación de la transformación del vector viral (ARN) mediada por Agrobacterium puede ser aún mejorada usando en el T-ADN el ADN heterólogo de acuerdo con la invención. Asi, la invención proporciona un proceso para expresar una secuencia de interés en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, que comprende: transformar un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta con una suspensión de Agrobacteria, conteniendo la Agrobacteria en el T-ADN un ADN heterólogo con una secuencia que codifica un replicón (preferiblemente un replicón de ARN) enlazada o enlazable operativamente con un promotor de transcripción, donde la secuencia que. codifica un replicón contiene: (i) secuencias para la función del replicón de ese replicón, siendo derivadas las secuencias de una secuencia de un virus de planta (preferiblemente un virus de ARN de planta) , (ii) una secuencia de interés a expresar, donde la suspensión de Agrobacteria tiene una concentración de células de la Agrobacteria correspondientes a una densidad óptica calculada a 600 nm de cuando mucho 0.04, preferiblemente cuando mucho de 0.01, más preferiblemente cuando mucho de 0.004, y lo más preferible cuando mucho de 0.001, donde las densidades ópticas calculadas se definen por una dilución de al menos un doblez de 25, preferiblemente al menos un doblez de 100, más preferiblemente al menos un doblez de 250, y lo más preferiblemente al menos un doblez de 1000, respectivamente, de una suspensión de la Agrobacteria de una DO a 600 nm de 1.0.
Los inventores han encontrado que este proceso no solamente disminuye la similaridad que las células de la cepa Agrobacterium distribuyen en el ambiente, mejorando por lo tanto la seguridad biológica de este proceso. El proceso también mejora la eficiencia de expresión de proteina, presumiblemente disminuyendo la exposición y el estrés para esa planta u hojas de planta a la infección con una cepa de Agrobacterium que es patógena para esa planta. Sorprendentemente, los inventores han encontrado que la eficiencia del proceso aumenta, dentro de ciertos limites, con la disminución en la concentración de las suspensiones de Agrobacteria usadas para transformar o transfectar las plantas o las partes de planta. Principalmente, la capacidad de los- replicones para el movimiento de célula a célula, generada en las células de la planta, mejora con la disminución en la concentración de las suspensiones de Agrobacteria . Las razones de este fenómeno inesperado aún no han sido identificadas. Se especula que este fenómeno se debe a una respuesta de la planta a la infección por Agrobacteria y que esta respuesta no ocurre (u ocurre a un menor grado) con las concentraciones menores de Agrobacteria. En los procesos de transformación de la técnica anterior que usan Agrobacteria, se usan concentraciones mucho mayores de Agrobacteria, generalmente en el rango de una DO a 600 nm de 0.5 a 1.0.
La planta u hojas de planta se infiltran preferiblemente con una suspensión de células de la cepa Agrobacterium, teniendo la suspensión una concentración de células de Agrobacteria que se obtiene diluyendo una suspensión de células de la cepa Agrobacterium de una DO (densidad óptica) de 1.0 a 600 nm de al menos un doblez de 25, preferiblemente al menos un doblez de 100, más preferiblemente al menos un doblez de 25?, y lo más preferiblemente al menos un doblez de 1000. Esas diluciones conducen por lo tanto a que las suspensiones de Agrobacteria tengan valores de DO calculada a 600 nm de cuando mucho 0.04, preferiblemente cuando mucho de 0.01, más preferiblemente cuando mucho de 0.004, y lo más preferible, de cuando mucho 0.001, respectivamente.
Este proceso de usar suspensiones de Agrobacteria con valores de DO calculada por - debajo de 0.04, puede combinarse con otras representaciones descritas en esta invención. La infiltración o la agroinfiltración pueden definirse como un método de transformación o transfixión usando una suspensión de Agrobacteria, donde se usa una diferencia de presión para presionar a la Agrobacteria dentro de un tejido de planta (espacio intercelular).
Breve descripción de las Figuras. La Figura 1 describe el principio general de la invención, basado en la frecuencia incrementada de formación del replicón con base en virus de ARN.
Las Figuras 2A y 2B muestran el perfil de predicción del intrón de la región transcrita del vector plCH8543. Los números de nucleótido se dan sobre el eje horizontal. El eje vertical muestra la probabilidad para la correspondiente región de secuencia/secuencia que va a ser una secuencia de codificación (codificación) , para servir como un sitio donante (Donante) o un sitio aceptante (Aceptante) . Las partes circuladas corresponden a las ubicaciones seleccionadas en la que deberían introducirse las diferencias de conservación de la función.
La Figura 3 muestra el perfil de predicción del intrón de la primera mitad de la región transcrita del vector plCH15466. Las regiones circuladas fueron modificadas (comparar con la Figura 2A) con las diferencias de conservación dé la función de acuerdo con la invención.
La Figura 4 muestra el perfil de predicción del intrón de la segunda mitad de la región transcrita del plCH1590. Las regiones circuladas fueron modificadas (comparar con la Figura 2B) con las diferencias de conservación de la función de acuerdo con la invención.
Las Figuras 5A y 5B muestran el perfil de predicción del intrón de la región transcrita del plCH15499. Las regiones circuladas corresponden a seis intrones nucleares de la planta insertados.
Las Figuras 6A y 6B son representaciones esquemáticas de las regiones T-ADN de vectores con y sin diferencias de conservación de la función de acuerdo con la invención.
Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran la expresión GFP después de la agroinfiltración de las construcciones virales en hojas de Nicotiana benthamiana y Nicotiana tabacum. Se indica el número de identificación del vector (plCH) para cada área infiltrada.
7A - Nicotiana benthamiana, 8 días después de la agroinfiltración; 7B - Nicotiana tabacum, 8 días después de la agroinfiltració ; 7C - Protoplastos de Nicotiana benthamiana aislados 5 días después de la agroinfiltración . Muchos-puntos claros en la imagen derecha indican una frecuencia extremadamente alta de formación de replicón y de expresión GFP.
La Figura 8 es una representación esquemática de un precursor de replicón basado en virus de ARN diseñado de acuerdo con la presente invención, que da nivel cero de expresión del gen de interés (GFP, indicado con G) en el estado no inducido.
P - promotor de transcripción; T - región de terminación de transcripción; SM - gen marcador seleccionable;. Ac2 - promotor del gen ACTIN2 Arabidopsis; polimerasa de ARN dependiente de RdRP de ARN viral; MP — proteina viral de movimiento; NTR - región viral 3' no trasladada.
La Figura 9 muestra un perfil de predicción de intrón para el ' gen AtDMCl especifico de meiosis de Arabidopsis thaliana (GenBank Acc. No. U76670), usando el cordón directo (+ cordón) . Las regiones de codificación del intrón están circuladas.
Las Figuras 10A y 10B muestran la predicción de regiones problemáticas potenciales (circuladas) dentro del cordón directo (+ cordón) del genoma del virus X de la papa (PVX) (GenBank Acc. No. AF172259) .
Las Figuras 11A, 11B y 11C muestran la predicción de regiones problemáticas potenciales (circuladas) del cordón directo (+ cordón) de los genomas del virus del mosaico de la alfalfa de ARN1 (GenBank Acc. No. K02703) , ARN2 (GenBank Acc. No. 02702) y ARN3 (GenBank Acc. No. L00163) , respectivamente.
La Figura 12 muestra las 'regiones T-ADN de las construcciones plCH12691 y plCHl6888.
P - promotor de transcripción; T - región de terminación de ' transcripción; SM - gen < marcador seleccionable;- Ac2. - promotor del gen ACTIN2 Arabidopsis; polimerasa de ARN dependiente de RdRP de ARN viral; MP -proteina viral de movimiento; NTR ¦ - región viral 3' no trasladada.
La Figura 13 muestra hojas bajo luz UV de diferentes lineas de N. - benthamiana transformadas de manera estable que portan las regiones T-ADN de cualquiera de plCHl2691 ó plCH16888. Las hojas fueron agroinfiltradas con vectores (plCH10881 ó plCH14313) que proporcionan integrasa.
la Figura 14 muestra hojas de Beta vulgaris una semana después de la agroinfiltración con plCH18711 a la luz del dia (izquierda) y con iluminación UV (derecha). Los parches de luz en la fotografía derecha indican fluorescencia GFP-. Los intrones (recuadros punteados) en la construcción que se muestran al fondo están numerados.
Descripción detallada de la invención. Sorprendentemente, hemos encontrado que la incorporación de intrones de planta dentro de ciertas regiones de vectores de ARN viral de planta y la remoción o el reemplazo de los intrones crípticos dentro de las secuencias para la función del replicón pueden aumentar dramáticamente (al menos xlO2 dobleces) la eficiencia de la aparición de los replicones de ARN en el citoplasma de las plantas huéspedes. Este aumento en la eficiencia se reflejó en al menos un parámetro mensurable: la proporción relativa de células que mostraren replicación del vector, p. ej . , en la frecuencia aumentada de la formación del replicón. Esta optimización del inicio, de la formación del replicón de ARN condujo a la capacidad de activación sincronizada de la expresión de una secuencia de interés en una planta completa, dando como resultado una producción dramáticamente incrementada de la proteína recombinante de interés en un tiempo menor que para un vector no modificado.
A pesar de las publicaciones concernientes al . incremento de la expresión nuclear transgénica por la incorporación de intrones en las regiones de codificación del ADN recombinante (Mascarenhas et al., 1990, Plant Mol. Biol.,. 15, 913-920; Bourdon et al., 2001, EMBO Reports, 2, '394-398; Rose, AB . , 2002, RNA, 8, 1444-1453; Patente US * 5,955,330), no hay indicio en la técnica anterior que muestre que la incorporación de intrones dentro de los replicones de ARN viral tuvieran ningún efecto positivo en la frecuencia de la formación del replicón viral y subsecuentemente, en el nivel de expresión de una secuencia de interés proporcionada por el .replicón. Este efecto es sorprendente, considerando que la transcripción de mARN nuclear y la replicación del ARN viral tienen lugar en diferentes compartimientos subcelulares . Aún si la copia cADN de un replicón viral es colocada en el núcleo, sólo la primera copia del precursor del replicón viral es producida en el núcleo y luego amplificada en el citoplasma bajo condiciones diferentes de las del núcleo. En la técnica anterior, se describió el uso de intrones para prevenir el efecto citotóxico de' la expresión "de escape" de los genes virales en la E. coli durante la clonación con cADNs de virus tipo silvestre (Johansen, I.E. 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 12400-12405; Yang et al., 1998, Arch . Virol., 143, 2443-2451; Lopez-Moya & García, 2000, Virus Res., 6_8, 99-107). No hay indicio de que la inclusión del intrón pueda incrementar la frecuencia de formación del replicón a partir de un clon de cADN viral. Los resultados obtenidos para los virús de ARN de tipo silvestre y sus copias de cADN no pueden ser comparados con los vectores de expresión derivados de virus diseñados para la expresión de una secuencia heteróloga de interés en plantas, predominantemente a expensas de otras propiedades de virus tipo silvestre como la alta capacidad de contagio y la estabilidad de estos virus. La capacidad de contagio no es un tema de -la presente invención. Precisamente, la i' capacidad de - contagio no es un tema en un proceso de expresar una secuencia de interés en una planta transformada de manera estable. La capacidad de contagio de un vector de ADN viral o de su transcrito tampoco es un tema cuando una planta es transformada con Agrobacteria que contiene el vector de ADN en el T-ADN..
La presente invención proporciona un método para incrementar fundartteritalmente la frecuencia de formación del replicón derivado de- virus de ARN, estos replicones se derivan a la transcripción del precursor de ADN y se diseñan para la expresión de la secuencia de interés. Este método resuelve las limitaciones de los sistemas existentes de expresión basada en vector viral, tales como la limitación de tamaño' para las secuencias heterólogas a expresar y la alta inestabilidad de los vectores. Además, el método ofrece mejores características de bioseguridad, permite diseñar control a prueba de escape sobre la expresión transgénica (nivel cero de expresión en el estado no inducido) , ya que este diseño puede ser una parte integrada de la estrategia para el diseño del replicón derivado de virus de ARN. Al proporcionar alta frecuencia de formación de replicón derivado de virus de ARN, el enfoque aqui descrito permite un rápido inicio de la expresión de una secuencia de interés en un cultivo de planta completa, parte de planta o célula de planta que contenga en el núcleo de la célula un ADN heterólogo que codifique al replicón de ARN. Practicando la invención, el desempeño de prácticamente cualquier replicón derivado de virus de ARN diseñado para la expresión de una secuencia heteróloga de interés, puede ser significativamente mejorado á través del . incremento dramático de la frecuencia de formación del replicón.
Los virus de ARN que pertenecen a diferentes grupos taxonómicos son adecuados para construir los replicones de ARN de acuerdo con esta invención. Abajo se presenta una lista de ' virus de ARN a los que puede aplicarse esta invención. Los nombres taxo entre comillas (y no en letra itálica) indican que este taxo no tiene un nombre ICTV aprobado internacionalmente . Los nombres de las especies (vernáculas) se dan en letra normal. Se indican los virus sin asignación formal al género o la familia. ¦
Virus de ARN: Virus de ssARN: Familia: Bro oviridae, Género: Alfamoyirus, Especies tipo: virus del mosaico de la alfalfa, Género; Ilavirus, Especies tipo: virus de la raya del tabaco, Género: Bromovirus, Especies tipo: virus del mosaico del bromo, Género: Cucumovirus, Especies tipo: virus del mosaico del pepino; . · Familia: Closteroviridae, Género: Closterovirus, Especies tipo: virus amarillo de la remolacha, Género: Crinivirus, Especies tipo: virus amarillo infeccioso de la lechuga, Familia: Comcviridae, Género: Comovirus, Especies tipo: virus del mosaico del guisante ( *cowpea ') , Género : Fabavirus, Especies tipo: virus 1 marchitador del haba, Género: Nepovirus, Especies tipo: virus de mancha de anillo del tabaco;
Familia: Potyviridae, Género: Potyvirus, Especies tipo: Virus Y de la papa, Género: Ry ovirus, Especies tipo: virus del mosaico amarillo del ballico;
Familia: Sequiviridae, Género: Sequivirus r Especies tipo: virus de la mancha amarilla de la chirivia, Género: Waikavirus, Especies tipo: virus tungro esférico del arroz; Familia: ' Tombusviridae, Género: Carmovirus, Especies tipo: virus jaspeado del clavel, Género: Dianthovirus, Especies tipo: virus de mancha de anillo del clavel, Género: Machlomovxrus, Especies tipo: virus clorótico jaspeado del maiz, Género: Necrovirus, Especies tipo: virus de la necrosis del tabaco, Género: Tombusvirus,
Especies tipo: .virus de la atrofia del arbusto de tomate,
Géneros no asignados de virus ssAR , Género: Capillovirus, Especies tipo: virus acanalador del tallo del manzano; Género: Carlavirus, Especies tipo: virus latente del' clavel, Género: Enamovirus, Especies tipo: virus del mosaico de enación ("enation") del chícharo, Género: Furovirus, Especies tipo: virus del mosaico del trigo portado en el suelo, Género: Hordeivirus, Especies tipo: virus rayado del mosaico de la cebada, Género: Idaeovlr s , Especies tipo: virus achicador del arbusto de frambuesa; Género: Luteovirusr Especies tipo: virus amarillo achicador de la cebada; . Género : Marafivirus Especies tipo: virus rayado' fino del maíz; Género: Potexvirus, Especies tipo: virus X de la papa; Género: Sobemovixus, Especies tipo: virus del mosaico de la habichuela del sur, Género: Tenuivirus, Especies tipo: virus rayado del arroz, Género: Tobamovirus, Especies tipo: virus del mosaico del tabaco, Género: Tobravirus-, Especies tipo: virus cascabel del tabaco, Género: Trichovirus, Especies tipo: virus de la mancha de hoja cloxótica de], manzano; Género: Tymovirus, Especies tipo: virus del mosaico amarillo del nabo; Género: Umbravirus, Especies tipo: virus jaspeado de la zanahoria;
Virus de ssARN- Negativo: Orden: Mononegavirales, Familia: i'' Rhabdoviridae Género: Cytorhabdovirus, Especies tipo: virus ' necrótico amarillo de la lechuga, Género: Nucleohabdovirus, Especies tipo: virus amarillo achicador de la' papa;
Virus de ssARN negativo: Familia: Bunyaviridae , Género: Tospovlrus, Especies tipo: virus moteado marchitador del tomate; Virus dsAN: Familia: , Partitivlridaa, Género: Alphacryptovirus, Especies tipo: virus 1 críptico del trébol blanco, Género': betacryptovirus, Especies tipo: virus 2 críptico del trébol blanco, Familia: Reoviridae; Género: Fijivirus, Especies tipo: virus de la enfermedad de Fiji, Género: Phytoreovirus , Especies tipo: virus de herida de tumor, Género: Oryzavirus, Especies tipo: virus de la atrofia desigual del arroz; Virus no asignados : Genoma: ssARN, Especie virus A,B,C,D, del ajo, Especie virus de la mancha de la vid, Especie virus del mosaico de la línea blanca del maíz, Especie virus 2 latente del olivo, Especie: virus del melón ourmia, Especie virus de mancha zonificada del pelargonio.
El principio general de la invención se muestra en la Figura l._ Se sabe que los virus de ARN de planta (una t' excepción son ,1os viroides -pequeños ARN' s no codificadores que amplifican en el núcleo de la célula de la planta- para un repaso, ver Diener .O., 1999, Arch. Virol. Suppl., 15, 203-220; Flores, R. , 2001, CR Acad. Sci. 111, 324, 943-952) nunca ocurren en el núcleo de la planta, sino en- el citoplasma. Por lo tanto, las secuencias de los virus de ARN pueden no estar adaptadas para soportar los eventos de procesamiento del ARN nuclear debido a la presencia de motivos que pueden estar involucrados en series complejas de los pasos del procesamiento, incluyendo el transporte del ARN procesado en el citoplasma, en el que están involucrados los precursores pre-mARN' s, rARN y tARN. Los eventos del procesamiento, tales como la cubierta final de 5' , el empalmado, la generación final de 3' , los de poliadenilación, degradación, base y modificación del azúcar, así como la edición (en plástidos y mitocondria) son estudiados intensivamente. Sin embargo, muchos elementos de esos eventos aún permanecen poco claros. Los cambios más dramáticos al pre-mARN en el núcleo ocurren durante el empalmado del pre-mARN, el proceso por el cual las secuencias de ARN que intervienen (intrones) son removidas del transcrito inicial y los exones son ligados de manera concomitante. El empalmado es mediado por el soma de empalme, una compleja estructura que comprende partículas pequeñas de ribonucleoproteina ricas en uridilato. El, soma de empalme realiza la reacción de empalme en dos pasos . consecutivos: el primero desdoblamiento en el sitio de empalme 5' corriente arriba de la unión exón/intrón que conduce a la formación del lazo, y un sequndo paso - desdoblamiento en el sitio de empalme 3' de la unión intrón/exón corriente abajo seguido por ligaduras de exones corriente arriba y corriente abajo (para repaso ver: Kramer, A., 1996, Annu. Rew. Biochem. , 65, 367-409; Simpson, GG. & Filipowicz, . 1996, Plant. Mol. Biol., 3_2, 1-41). Los · dinucleótidos .5' y 3' del sitio de empalme (5'/GU; AG/3' ) que flanquean a las secuencias de intrón son altamente conservados en las plantas mayores y un único reemplazo G podría abandonar la actividad de empalmado en el sitio concerniente. Es sorprendente que a pesar de una alta conservación de los sitios de empalmado entre plantas y anímales, los intrones heterólogos en las plantas usualmente no están empalmados o están incorrectamente empalmados (van Santen, VL. et al., 1987, Gene, 56, 253-265; Wiebauer, K. , Herrero, J.J., Filipowicz, W. 1988, Mol. Cel. Biol., _8, 2042-2051). Considerando que los ARN' s virales de planta no estuvieran bajo presión evolutiva para resistir la maquinaria de procesamiento del ARN nuclear, estos ARN' s son muy tendientes a volverse sujetos de ese procesamiento, incluyendo el empalmado, una vez que están, colocados en el ambiente nuclear. Esta situación es-, completamente diferente de la de los transcritos de ARN codificados por los genes nucleares, ya que los últimos transcritos están adaptados evolutivamente para conservar su funcionalidad, a pesar de las series de modificaciones del ARN que tienen lugar en el núcleo. Sin embargo, esas modificaciones pueden tener consecuencias dramáticas para la formación del replicón de ARN viral. La reingenieria del virus de planta, para hacer vectores de expresión para- los genes heterólogos, puede agregar más a la inestabilidad de los replicones basados en virus de ARN, ya que añadiría otros elementos que podrían interactuar con las secuencias de AR de origen viral, produciendo ARN defectuoso que sea incapaz de replicar. Nuestra invención se dirige a estos problemas a través de sometiendo al vector de expresión a modificaciones que incrementan significativamente la frecuencia de la formación del replicón de ARN funcional, cuando el vector de expresión es introducido como un precursor de ADN én plantas o células de plantas, para proporcionar la expresión transitoria o la integración estable en el ADN crornosorna1 de la planta. Creemos que las modificaciones de las secuencias derivadas de virus deben ser la solución más profunda para aumentar la eficiencia de los replicones basados en virus de ARN. En esta invención nos enfocamos predominantemente en las modificaciones . (las diferencias conservadoras de la t' función) dentro de las secuencias derivadas del virus de ARN de planta, ya que estas son cruciales para aumentar la eficiencia de la formación del replicón de ARN.
Sorprendentemente, nuestro primer intento para encontrar evidencia que existen las regiones potencialmente problemáticas fue exitoso y, aún más sorprendente, obtuvimos la . confirmación experimental al encontrar inesperadamente una mejora de órdenes de magnitud. Un análisis de. la secuencia derivada del virus de ARN del vector, de expresión plCH8543 (Ejemplo 1,- Figura 6A) usando el programa del servidor Netgenell
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) para la presencia de intrones crípticos y sitios de empalme de ARN, mostró la presencia de regiones parecidas al intrón que podrían ser empalmadas por la maquinaria de procesamiento del ARN .nuclear (ver las regiones circuladas en la Figura 2) . Hay muchos otros programas que . pueden usarse para identificar las regiones potencialmente problemáticas (las ubicaciones seleccionadas) dentro de las secuencias de ARN viral de planta, tales como el programa de predicción de exón/intrón (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html), o el programa' de predicción de señal de empalmado
(http: //12b . itba .mi . cnr . it/~webgene/www. splicevietf. html) , para una variedad de organismos, i'
· Considerando que ninguno de los programas existentes es idea, y todos están sujetos a errores, las regiones problemáticas potenciales también pueden determinarse de forma experimental. Esto puede hacerse analizando los transcritos derivados de un vector de ADN bajo prueba en un ambiente nuclear con la ayuda de técnicas rutinarias tales como la RT-PCR (Frohman, MA. , 1989, Methods Enzymol., 218, 340-356) o su versión más avanzada • disponible para la cuantificación precisa de la concentración de diferentes transcritos, llamada PCR en tiempo real (Gibson et al., 1996, Genome Res., 6^ 995- 1001) , preferiblemente seguida por la secuenciación de los productos PCR amplificados. Las diferencias de conservación de la función de la invención cambian dramáticamente el perfil del ARN, por ejemplo reemplazando las secuencias parecidas al intrón con las parecidas al exón, p. ej . , introduciendo mutaciones silenciosas con el reemplazo de las regiones ricas en A/ü (parecidas al intrón) con las regiones ricas en G/C (parecidas al exón) (ver Figura 3, regiones circuladas) . Los intrones de planta, a diferencia de los exones, son usualmente ricos en A/T(U) (Lorkovic, Zu\ et al., 2000, Trends Plant Sci., 5, 160-167; Brown, JW & Simpson, CG. 1998, Annu . Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol., 49, 77-95; Csank, C. et al., 1990, Nucí. Acid Res., 18, 5133-5141;. Goodall & Filipowicz, 1989, Cell, 58, 473-483), pero hay excepciones, por ejemplo, cuando en las plantas monocotiledóneas se encontraron intrones ricos en G/C (Goodall & Filipowicz, 1989, Cell, 58, 473-483; Goodall & Filipowicz, 1991, EMBOJ. , 10, 2535-2644) . Para practicar esta invención, las ubicaciones seleccionadas de alto contenido de A/T(U) incluyen no solamente los tensores de secuencia de al menos 20 nucleótidos de longitud con un contenido de ¾/T(U) de al menos 55%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente 80% o mayor, sino también los tensores más cortos ("islas") de 6-19 nucleótidos en una fila de secuencias conteniendo puramente A/T(U) . Aqui, las ubicaciones de alto contenido de A/ü incluyen las secuencias que son más ricas en A que ricas en ,.U, las secuencias que son ricas en A, las secuencias que- son más ricas en U que ricas en A, y las secuencias que son ricas en U. Adicionalmente, cualquier secuencia transcrita de interés puede ser probada para las modificaciones postranscripcionales que causan un -cambio en las secuencias de los ácidos nucleicos (p. ej.-, empalme de ARN) a través de RT-PCR (Frohman, MA. 1989, Methods Enzymol., 218, 340-356) . Para aquellos familiarizados con la técnica es una tarea trivial el usar el RT-PCR para detectar las regiones con ARN que son sometidas a modificaciones postranscripcionales , como eliminación de secuencias del transcrito de ARN original. En el Ejemplo 2 demostramos que la modificación de la región rica en A/U aumenta el número de células que expresan GFP al menos en 10 dobleces. Esto se demuestra claramente en la Figura 7, comparando las áreas agroinfiltradas con plCH15466 (vector modificado, Figura 6A) y plCH14833 (vector de control, Figura 6?) . El remover la proteína de movimiento (MP) permite una cuenta precisa .de las células primarias que poseen replicones de ARN funcionales, ya que no se realiza el movimiento de célula a célula desde 'el sitio de la infección primaria hacia las células vecinas. En el Ejemplo 3, se realizó la modificación de otra región parecida a intrón rica en U- que contiene muchos sitios crípticos de empalme (Figura 2B) y que cubre al promotor subgenómico de la proteína del movimiento (MP) (Figura 4, circulado). Esta modificación dio un efecto dramático en el aumento de la frecuencia de formación de replicón a partir del vector viral plCH1590. Como se estableció en los experimentos de conteo de protoplasto (Ejemplo 3) , el aumento fue de aproximadamente 100 dobleces en comparación con el vector plCH14833 no modificado para ambas especies de Nicotiana probadas - N. benthamiana y N. tobáceo (ver las áreas infiltradas correspondientes en la Figura 7, A, B) . En general, usando los enfoques descritos en esta invención, la frecuencia de formación de .replicón de ARN puede ser aumentada en i' aproximadamente 300 dobleces, p. ej . , aumentando la proporción de células con replicones funcionales desde cerca de 0.2% (vector de control) hasta más de 50% (vector modificado) . Creemos que este no- es el límite, y que es muy realista el alcanzar una frecuencia del 100%.
Esta alta eficiencia . de formación del replicón abre la puerta para expresar dos o más genes diferentes a partir de dos replicones de ARN diferentes con la misma célula de planta, p. ej . , expresando conjuntamente genes diferentes a través de usar vectores basados en virus de ARN de planta. El logro- de la liberación sincronizada de dos o más replicones al mismo tiempo en la misma célula es crucial para esa expresión conjunta, ya que el principio "primero en llegar, primero en ser servido" es especialmente cierta para los vectores virales. El movimiento sistémico o de célula a célula no ayuda, ya que los diferentes vectores virales normalmente no se traslapan en sus áreas de .distribución, o el traslapado es insignificante. Cálculos simples demuestran la importancia de la tecnología descrita en esta invención para lograr la expresión conjunta de dos secuencias de interés en la misma célula de planta a partir de dos replicones. En el caso de un vector viral no optimizado con una frecuencia de formación de replicón funcional de sólo 0.2% de todas las células, la ·. proporción de células que expresan con untamente dos genes a partir de dos replicones de ARN diferentes será de 0.2x0.2=0.04%, mientras que para la construcción con la frecuencia aumentada, de formación de replicón de ARN funcional . (50% , ó 1/2 de las células), esa proporción de células será de 0.5x0.5=0.25, p. ej . , cerca de 625 dobleces mayor. Con algunos de los vectores con mejor desempeño (p. e . , el plCH16191, Figura 7C) , la proporción de células que tiene el replicón funcional alcanza ca. '90.% (Figura 7C, derecha arriba) . Esto significa que al usar, ese vector para expresar dos secuencias de interés diferentes a partir de dos " réplicones independientes, la expresión conjunta puede tener lugar en cerca del 80% de todas las células. Parece muy posible que la tecnología pueda mejorarse más y que pueda alcanzarse el 100% de expresión conjunta.
Vale la pena hacer notar que las diferencias de conservación de la función en las secuencias heterologas de interés a expresar a partir del replicón de ARN también podría usarse para aumentar la frecuencia de formación del replicón de ARN, principalmente en combinación con diferencias en las secuencias para la función del replicón. Por ejemplo, pueden introducirse dentro de esas secuencias de interés las, modificaciones que son necesarias para la formación y/o B1 procesamiento del replicón. .
En una representación importante de esta invención, la frecuencia de formación del replicón es mejorada insertando intrones nucleares en las secuencias para la formación del' replicón (Ejemplo A). La incorporación de intrones dentro de la región de codificación de la polimerasa de ARN ' dependiente del ARN viral (RdRP) (Ejemplos 4 y 8) resultó en un aumento significativo (al menos de 50 dobleces) en La frecuencia de formación del replicón a partir de (Figura 7 A, B) vectores que portaban las diferencias de conservación de la función como aqui se definen (plCH15034, plCHl5025, plCH15499, en la Figura 6, A, B) . El perfil de ARN para un vector que contenia insertados 6 intrones de Arabidopsis se muestra en la Figura 5. En otro ejemplo (Ejemplo 7), la inserción de intrones en las secuencias MP aumenta la frecuencia de formación del replicón al menos 100 veces.
Muchos intrones nucleares pueden ser usados para practicar esta invención. Los ejemplos de esos intrones incluyen, pero no se limitan a, los intrones tpiActl del arxoz, y los genes s¿ilT (Rethmeier et al., 1997, Plant J. ,12 , 895-899; Xu et al., 1994, Plant Physiol. , 100, 459- 467; McElroy et al., 1990, Pnat Cell, 2, 163-171); los Adhl, GapAl del maíz, genes actin y Bzl (Callis et al., 1987, Genes Dev., 1, 1183-11200; Donath et al., 1995, Plant Mol. Biol., 28, 667-676; Maas et al., 1991, Plant Mol. Blol., 16, 199-207; Sinibaldi & Mettler, 1992, en WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, vol 42, Academic Press, · New York, pp. 229-257) , del gen SSU301 ribisco de la petunia (Dean et • al., 1989, Plant Cell , .1, 201-208), los genes Al EFlcx, UBQ10, UBQ3, PATl de Arabidopsis (Curie et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 228, 428-436; Norris et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21, 895-906; Rose & Last, 1997, Plant J. , 11, 455- 464), y muchos otros. También pueden usarse intrones sintéticos para esta invención, los intrones más pequeños utilizables o sus partes pueden estar limitados para empalme de los sitios donante y aceptante que usualmente flanquean las secuencias internas del intrón. Preferiblemente, los intrones deberían tener un tamaño de al menos 50 nt . , más preferiblemente un tamaño de 100 a 200 nt., pero de hecho no hay limitaciones respecto al tamaño de los intrones. Sin embargo, el tamaño de la construcción debería mantenerse adecuado para las manipulaciones. El origen del intrón, su estructura y su tamaño pueden ser seleccionados de forma individual dependiendo de la naturaleza del vector.. Los experimentos de expresión transitoria pueden ser usados para probar la eficiencia de r un intrón seleccionado o de las correspondientes partes del intrón.
Las modificaciones arriba descritas tienen un efecto acumulativo, p. e . , si la(s) inserción (es) de intrón se combinan con una modificación del promotor subgenómico MP, el incremento en la frecuencia de formación del replicón puede ser de aproximadamente 300 dobleces
(Ejemplo 5) . Las regiones preferibles para inserción del intrón, con objeto de tener un incremento en la frecuencia de formación del replicón de ARN se llaman aqui ubicaciones seleccionadas. Esas ubicaciones pueden contener estructuras "parecidas al intrón". Esto se confirma con la inserción de intrones en el MP, de hecho en proximidad cercana con una región problemática como el promotor subgenómico MP
(Ejemplo 7). Se observó un incremento en 100 dobleces en .la frecuencia de formación del replicón. La inserción de intrones dentro de regiones "parecidas al exón" no tiene un efecto tan pronunciado como la inserción en las regiones parecidas al intrón (Ejemplo 6) .
Los experimentos discutidos arriba se realizaron con sistemas de expresión transitoria con base en la entrega del precursor de ADN mediado con Agrobacteria dentro de las células de planta. Sin embargo, la aplicación t' más útil de esta invención será para las plantas transgénicas con un precursor de ADN del replicón de ARN incorporado de manera estable dentro de un cromosoma nuclear de la planta. Esto permite superar muchas limitaciones de los sistemas basados en el vector viral de planta, tales como las restricciones para el tamaño máximo de las secuencias h'eterólogas que pueden tolerar los vectores virales . Dado que el precursor de ADN estará presente en cada célula de la planta transgénica, no hay requerimiento absoluto para el movimiento sistémico o para el movimiento de célula a célula del replicón de ARN (distribución del replicón) . Esto puede ser compensado con la alta eficiencia de formación y transporte de los replicones de ARN de la invención dentro del citoplasma. Sin embargo, la capacidad del vector para el movimiento de célula a célula puede ser de valor adicional, ya que la formación del replicón de ARN no siempre ocurre en todas las células. ¿
Pueden usarse diferentes métodos para proporcionar una célula de planta con el ADN heterólogo. Los vectores pueden ser transformados en células de planta a través de un vector plásmido Ti portado por la Agrobacterium (Patentes US 5,591,616; US 4,940,838/ US 5,464,763) o po.r bombardeo de partículas o microproyectiles (Patentes US*, 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1) . También pueden usarse otros métodos de transformación de la planta tales como microinyección (Patentes WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966B1) , electroporación (Patentes EP00564595B1; EP00290395B1; WO 08706614A1) o transformación de protoplastos mediada con PEG, etc. La elección- del método para la entrega' del vector puede depender de la éspecie de planta a transformar. Por ejemplo, el bombardeo de microproyectiles es generalmente preferible para la transformación de monocotiledóneas, mientras que para las dicotiledóneas da por lo general mejores resultados la transformación mediada por Agrobacterium.
En los ejemplos descritos abajo, usamos la entrega de vectores mediada con Agrobacteria (los ADN heterólogos) dentro de células de Nicotiana . Sin embargo, los vectores pueden ser ' introducidos en las plantas de acuerdo con cualquiera de las técnicas estándar adecuadas para la transformación estable o transitoria de la especie de planta de interés. Las técnicas de transformación para las dicotiledóneas son muy conocidas en la técnica e incluyen las técnicas basadas en Agrobacterium y las técnicas que no requieren de Agrojbacterium. Las técnicas sin Agrobacterium involucran la absorción el material genético exógeno directamente por los protoplastos o las células. Estas técnicas incluyen la absorción mediada con PEG o electroporación, la entrega mediada por bombardeo' y la microinyección. Los ejemplos de estas técnicas se describen en Paszkowski et al., EMBO J 3, 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199, 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986), y Klein et al. , ¦ Nature 32 , 70.73 (1987). En cada caso, las células transformadas son regeneradas a plantas completas usando técnicas estándar.
La transformación mediada con Agrobacterium es una técnica preferible para la transformación de las dicotiledóneas debido a su alta eficiencia de transformación y su amplia utilidad con muchas especies diferentes. Las muchas especies de cultivos que pueden ser transformados de · manera rutinaria con Agrobacterium incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, semilla de colza, papa, frijol de soya, alfalfa y álamo (Patentes EP 0 317 511 (algodón), EP 0 249 432 (tomate) WO 87/07299 {Brassica) , US 4,795,855 (álamo)).
transformación con Agrobacterium involucra tipicamente la transferencia del vector binario que porta el ADN de interés en una cepa adecuada de Agrobacterium que puede depender .del complemento de genes vir portados por la cepa huésped Agrobacterium ya sea en un plásmido corresidente o cromosómicamente (Uknes et al., Plant Cell 5:159-169 (1993). La transferencia del vector binario recombinante a la Agrobacterium puede realizarse por un^ procedimiento de acoplamiento triparental usando E. coli que porte el vector binario recombinante, una cepa auxiliar de E. coli que porte un. plásmido tal como el pRK2013, que es capaz de movilizar al vector binario recombinante hacia la cepa meta de Agrobacterium. Alternativamente, el vector binario recombinante puede ser transferido a la Agrobacterium por transformación del ADN (Hófgen & Willmitzer, Nucí. Acids Res. 16, 9877 (1988)).
La transformación de la especie meta de planta a •través de Agrobacterium usualmente involucra el cultivo conjunto de la Agrobacterium con explantas de los protocolos de seguimiento de planta conocidos en la técnica. El tejido transformado que porta un marcador de resistencia a un antibiótico o herbicida presente entre las fronteras del T-ADN del plásmido primario puede ser regenerado en el medio seleccionable . Esto permite la ' generación de plantas transgénicas transformadas de manera estable en un · cromosoma nuclear con- un T-ADN que contenga el ADN heterólogo de la invención.
En los ejemplos de esta invención, en paralelo con la agro-transformación estable, nosotros usamos la agro-inoculación, un método' de entrega mediado con Agrobácterium del T-ADN para la expresión transitoria del (los) 'gen(es) de interés (Vaqueo et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96, 11128-11133) . La agro-inoculación es una herramienta extremadamente útil no sólo para los sistemas de producción "de pequeña a mediana escala de proteina recombinante, sino como un elemento de un sistema de optimización de ¦ vector,'¦ -que ¦ permite obtener resultados rápidos con diferentes variantes de construcciones.
La invención también puede usarse para la producción industrial a gran escala de proteínas recombinantes^ En nuestros' "•experimentos utilizamos cultivos de toda la noche de Agrobacteria . El cultivo de toda la noche se preparó por ¦ agroinfiltración, como se describe en la técnica anterior (Marillonnet et al., 2004, Proc. Nati. Acad. Sci.' USA, 101, 6853-6857). üsualmente, un cultivo de toda la noche alcanza una' densidad óptica (D.O.) de 3-3.5 unidades a. una longitud de onda de 600 nm y es diluida de 3 - 5 veces antes de la agroinfiltración, produciendo en general de 5-9 x iO9 unidades formadoras de colonia (Turpén et al. 1993, . Virol. Methods, 42, 227-240) . Hemos encontrado que una dilución de 102, preferiblemente de 103 y más preferiblemente de 104 dobleces de un cultivo de auch de toda la noche funciona de modo . muy eficiente, especialmente en combinación con secuencias para la función del replicón que tengan las diferencias de conservación de la función como aquí se describen. Sorprendentemente, los vectores en las hojas de tabaco infiltradas mejoraron más su desempeño dando uña mejor producción de GFP con las diluciones crecientes de la Agrobacteria transformadora. Por- ejemplo, una dilución de 103 dobleces dio mejor resultado que una dilución de 102 dobleces. Una dilución de 102 dobleces proporciona mejor producción de GFP que una dilución de 10 dobleces. Una posible explicación para este fenómeno es el efecto negativo de la suspensión altamente concentrada de Agrobactérium en la función de un vector viral, p.. e . , en el movimiento de célula a célula, posiblemente como el resultado de una respuesta de la planta a las altas concentraciones de la bacteria patógena. Este fenómeno es de especial valor para los procesos industriales a gran escala de expresión de la proteína, ya que permite reducir la cantidad de agrobacteria requerida para la producción de la proteína recombinante vía la agroinfiltración por al menos un orden de magnitud en comparación con los procesos de la técnica anterior.
En el. Ejemplo 9 de esta invención, un precursor de ADN de un , replicón inactivado basado en ARN viral se incorpora de manera estable en el ADN cromosomal . El replicón se optimiza de acuerdo con la invención. Además, el replicón contiene una estructura que previene la expresión de la secuencia de interés. La expresión, asi como la formación del replicón de ARN funcional, puede activarse girando una parte de la construcción con la ayuda de la recombinación específica del sitio. Este giro puede conducir a la formación de dos introñes así como al ensamble de una secuencia funcional de interés. El sistema descrito en el Ejemplo 9 muestra no solamente la optimización de un vector viral, sino también la solución · para evitar el "escape" de las construcciones establemente integradas en el ADN cromosomal, incluyendo la expresión "escapable" del gen de .interés a partir de esa construcción. En muchas- aplicaciones, es crucial .. tener - nivel cero de expresión en el estado no inducido, especialmente para las proteínas citotóxicas o para alcanzar altos estándares de bioseguridad con los sistemas de expresión de planta para expresar proteínas técnicas o farmacéuticas .
La transcripción del ADN heterólogo y/o de la recombinasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o de , cualquier otro regulable (p. ej . , regulado en términos del desarrollo) . Los promotores inducibles pueden ser divididos en dos categorías de acuerdo con sus condiciones de inducción: los inducidos por factores abióticos (temperatura, luz, sustancias químicas) y aquellos que pueden ser inducidos por factores bióticos, por ejemplo, ataque de patógenos o pestes. Los ejemplos de la primera categoría son promotores inducibles por calor (Patente US 05187287) e inducibles por frío (Patente US 05847102), un sistema inducible por cobre (Mett et al., 1993, Proc. Nati. Acad.- Sci . , 90, 4567-4571), sistemas inducibles ' por . esteroides (Aoyáma & Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis et al., 1998, Plant J. , 14, 247-257; Patente US 06063985) , y sistema inducible por etanol (Caddick et al., 1997, Nature Biotech. , 16, 177-180; Patente WO 09321334), y un sistema inducible por tetraciclina (Weinmann et al., 1994, Plant J. , 5, 559-569). Uno de los más recientes desarrollos en el área de los sistemas químicamente inducibles para plantas es un promotor quimérico que puede ser activado por dexametasona glucocortxcoide y desactivado por tetraciclina (Bohner et al., 1999, Plant J. , 19, 87-95). Para un repaso sobre los sistemas químicamente inducibles ver: Zuo & Chua (2000, Current Opin. Biotechnol. , 11, 146-151) y Padidara, M (2003, Curr. Opin. Plant Biol . , _6, 169-177). Otros ejemplos de promotores inducibles son los promotores que controlan la t' expresión de los genes relacionados con la patogénesis (PR) en plantas. Estos promotores . pueden ser inducidos a través del tratamiento de una planta con ácido salicilico, un componente importante -de las vías de señalización de la planta en respuesta al ataque patógeno, o de otros compuestos químicos (benzo-1, 2, 3-tiadiazola o ácido isonicotinico) que son capaces de activar el gen de expresión PR (Patente US 05942662) .
Esta invención no se limita a los vectores basados en TMV que se describen en los ejemplos 1 - 9, sino que puede extenderse a los replicones basados en otros virus' de ARN de planta. El análisis de otras secuencias de ARN viral de la planta (Ejemplo 10, Figuras 10, 11) muestra ubicaciones seleccionadas muy similares a las descritas para el TVM y las secuencias de los genes nucleares pre-mARN de planta (Figura 9) . Esta es una fuerte evidencia que soporta . la sugerencia de que, usando los enfoques descritos en esta invención, prácticamente cualquier replicón derivado de virus de ARN de planta puede ser mejorado, fundamentalmente removiendo/reemplazando las regiones problemáticas y/o insertando intrones nucleares.
La presente invención se realiza preferiblemente con cultivos de. plantas superiores multicelulares, partes o t' células de las mismas. Las plantas para uso en esta invención incluyen cualquier especie de planta/ dando preferencia a las especies agronómica y hortxculturalmente importantes. Las plantas de cultivo comunes para uso en la presente invención incluyen alfalfa, cebada, frijoles, cañóla, guisante, algodón, maiz, trébol, loto, lentisco, altramuz, mijo, avena, chícharos, cacahuates, arroz, centeno, trébol de olor, -girasol, guisante dulce, frijol de soya, triticala de sorgo, frijoles de ñame, frijoles de lavanda, frijol de arveja, trigo, glicina y planta de nuez. Las especies de plantas- preferibles para practicar esta invención incluyen, pero no se restringen a, ' las representativas de las Gramíneas, las Compuestas, las Solanáceas y las Rosáceas-.
Otras especies preferibles para uso en esta invención son las plantas de los siguientes géneros: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscores, Elaéis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, ., Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobryc is, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranuncülüs, Rapharius, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Sécale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, St.enotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, y las Olireae, las Pharoideae, y muchas otras. ^
Las plantas más preferibles para esta invención son las plantas que no. entran en la- cadena alimentaria animal o humana, como la especie' Nicotiana, p. ej . la Nicotiana benthemiana y la Nicotiana tabacum.
Las proteínas de interés, sus fragmentos (funcionales o no funcionales) y sus derivados artificia'Ies que pueden ser expresados en plantas o células de plantas usando la presente, invención incluyen, pero no se limitan a, las enzimas modificadoras de la fécula (sintasa de fécula, enzima de fosforilación de la fécula, enzima de desramificación, enzima de ramificado de la fécula, enzima II de ramificado de la fécula, sintasa de la fécula de aglutinado del granulo)", sintasa de fosfato de sacarosa, fosforilasa de sacarosa, poligalacturonasa, sucrato de polifructano, . fosforilasa ADP de glucosa, f glicosiltransferasa . de ciclodextrina, fructosil transferasa, sintasa de glicógeno, pectin esterase, aprotinina, avidina, levansucrasa bacterial, proteina glgA, MAP4 y ortólogos de E. coli, enzima del metabolismo de asimilación de nitrógeno, sintasa de glutamina, osmotin de planta, albúmina 2S, taumatina, recombinasa/integrasa especifica' del sitio . (FLP, tCre, recombinasa R, Int, Integrasa R SSVI,: Integrasa phiC31, o un fragmento activo o variante de la misma) , enzimas modificadoras del aceite (como desaturasas de ácidos grasos, elongasas, etc.), isopentenil transferasa, Sea M5 (calmodulina de frijol de soya) toxina tipo ecleopterana o un fragmento activo relativo al insecticida, proteínas- de fusión de la enzima de conjugación de ubiquitín (E2), enzimas que metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos, dismutasa de superóxido, forma inactiva de proenzima de una proteasa, toxinas de proteina de planta, características que alteran la fibra en las plantas productoras de fibra,' toxina activa de Coleopterana del Bacillus thurinigíensis (toxina Bt2, proteína de cristal de insecticida (ICP) , toxina' CryIC, endotoxina delta, toxina polipéptida, protoxina, etc. ) , toxina Aalt específica de insecto, enzimas de degradación de la celulosa,, celulasa El d.el Acidothermus celluloticus, enzimas modificadoras de la lignina, dehidrogenasa de alcohol de cinamoilo, sintasa trehalosa-6-fosfato, enzimas de vía metabólica de la citoquinina, reductasa HMG-CoA, pirofosfatasa inorgánica de E. Coli, proteina de almacenamiento de semilla, sintasa de liqopeno de Erwinia herbicola, oxidasa ACC, proteina codificada pTOM36, fitasa, quetohidrolasa, reductasa CoA de acetoacetilo, sintasa PHB- (polihidroxibutanoato) , enzimas involucradas en la · síntesis de los polihidroxilalcanoatos (???), proteina portadora de acilo, napina, EA9, sintasa fitoena de planta no superior, proteína. pT0M5 codificada, ETR {receptor de ebileno) , diquinasa plastídica de piruvato fosfato, proteína de poro de transmembrana inducible'- por nematodo, características ' que mejoran la función fotosintética o plástida de la célula de planta, sintasa de stilbeno, una enzima capaz de hidroxilatar los . fenoles, catecol dioxigenasa, catecol 2, 3-dioxigenasa, cicloisomerasa de cloromuconato, sintasa de antranilato, proteína AGL15 de Brassica, fructosa 1, 6-bifosfatasa (FBPasa), ARN3 de AMV, replicasa PVY, replicasa PLRV, proteína de cubierta de potivirus, proteína de cubierta CMV, proteína de cubierta TMV, replicasa de luteovirus, ARN mensajero MDMV, replicasa mutante germiniviral, C12:0 de Umbellularia californica, prefiriendo tioesterasa acil-ACP, C10 ó C12:0 de planta prefiriendo tioesterasa acil-ACP, C14:0 prefiriendo tioesterasa acil-ACP (luxD) , factor A de sintasa de planta, factor B de sintasa de planta, desaturasa D6, proteínas que tengan una actividad enzimática en la biosintesis y las modificaciones de los ácidos grasos, p. ej . la ß-bxidación peroxisomal de los ácidos grasos en las células de planta, oxidasa de acil- CoA, tiolasa de 3-quetoacil~CoA, lipasa, carboxilasa de acetil-CoA del maíz, etc.; sintasa de 5- enolpiruvilshicimate-3-fosfato (EPSP) , transferasa de fosfinotricin acetilo (BAR, PAT) , proteina CP4, deaminasa ACC, proteina que tenga sitio de desdoblamiento postraslacional, gen DHPS que confiera resistencia a la sulfonamida, nitrilasa bacterial, 2,4-D monooxigenasa, - sintasa . de acetolactato o sintasa de acetohidroxiácido (ALS, AHAS) , poligalacturonasa, Taq polimerasa, nitrilasa bacterial, muchas otras enzimas de origen bacterial o fago incluyendo endonucleasas, metilasas, ligasas de ADN y ARN, polimerasas de AD y ARN, transcriptasas inversas, nucleasas (DNasas. y RNasas) , fosfatasas, transferasas, etc. de restricción.
La presente invención puede usarse para el propósito de cultivo y purificación molecular de proteínas comercialmente valiosas y farmacéuticamente importantes incluyendo enzimas industriales (celulasas, lipasas, proteasas, fitasas, etc.) y proteínas fibrosas (colágeno, proteína de tela de araña,, etc.)- La pxoteína de la salud humana o animal puede ser expresada y purificada usando el enfoque descrito en nuestra invención, los ejemplos de esas proteínas de interés incluyen inter alia las proteínas de la respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una cadena, receptores de célula T, etc.), antígenos incluyendo aquellos derivados de microorganismos patógenos, factores estimulantes, de la colonia, relaxinas, hormonas de polipéptido incluyendo somatotropina (HGH) y proinsulina, citocinas .y sus receptores, interferones, - .'factores de crecimiento y factores de coagulación, enzima lisosomal enzimáticamente activa,' polipéptidós fibrinolíticos, factores de coagulación sanguínea, tripsina, tripsinógeno, al-antitripsina (AAT) , albúmina de suero humano, glucocerebrosidasas, toxina B nativa del cólera, trombina, lipasa gástrica humana, factor de estimulación de colonia de macrófago · de grahulocito (GM-CMF) , serpina, lactoferrina-, lisozima, oleosina, protrombina, alfa-galactosidasa, así como proteínas conservadoras de funciones como fusiones, versiones mutantes y derivados sintéticos de las proteínas de arriba.
El contenido de la Solicitud de Patente Internacional PGT/EP03/12530 y de la Solicitud de Patente Europea 0401'6012.9 se incorporan aquí como referencia, en sus totalidades..
EJEMPLOS . Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención. Pueden hacerse modificaciones y variaciones, sin apartarse del espíritu y la competencia de la invención.
EJEMPLO 1. Construcción de un vector de ARN basado en TMV.
Se obtuvieron cADN's clonados del tobamovirus infeccioso de cruciferas (cr-T V; Dorokhov et al., 1994, FEBBS Lett. 350, 5-8) y del virus aclarador de la vena del nabo (TVCV; Lartey et al., 1994, Arch. Virol.138, 287-298), del Profesor Atabekov de la Universidad de Moscú, Rusia. Un vector viral que contenía una proteína de fluorescencia verde (GFP) , fue hecho en varios pasos de clonado. La construcción resultante, el plCH8543) (Figura 6A) , contiene en orden secuencial: un fragmento bp 787 del promotor actin 2 de Arajidopsis {ACT2, ref . An et al., 1996, acceso a GenBank AB026654, bp 57962 a 58748), el extremo 5' del TCVC (acceso a GenBank BRU03387, bp 1 a 5455), un fragmento de' cr-TMV (acceso a GenbBank Z29370, bp 5457 a. 5677, con timina 5606 cambiada a citosina para remover el codón de inicio de la prpteina de cubierta, CP) , las secuencias "taa tcg ata act cga q" , un gen sintético de GFP (sGFP) , región 3' no trasladada de cr-TMV (3'NTR; acceso a GenBank Z29370, bp 6078 a 6312), y finalmente el terminador de la sintasa nopalina (Nos) . El fragmento (completo fue clonado entre las fronteras izquierda (LB) y derecha (RB) del T-ADN del plCBVlO, un vector binario derivado del CarbR pBIN19. El plCH85.43 fue transformado en la cepa GV3101 de Agrobacterium e infiltrado en una hoja de Nicotiana benthamiana. Él foci de ia fluorescencia GFP que apareció a 3 dpi creció y se volvió, confluente. Sorprendentemente, aunque la mayoría de 'las, células en el área infiltrada finalmente expresaron LA GFP debido a la replicación viral y al movimiento, sólo' una fracción de las células iniciaron la replicación, como se detectó a través de un número de GFP independiente que expresaba el foci. Resultó claro que el factor limitante no es' la entrega del ADN a las células de la planta, dado que la infiltración de las hojas de Nicotiana benthamiana con un gen de GFP bajo control del promotor 35S conduce a La expresión de GFP en casi todas las células en el área infiltrada (no se muestra) .
Para confirmar esta observación, hicimos una construcción de vector viral que contenia una mutación en el MP. Esta construcción, llamada plCH14833, es similar al plCH8543 pero difiere por una eliminación del bp 389 en el r gen MP, corriente arriba del sitio EcoRI presente en el MP. La secuencia del fragmento Ncol a EcoRI que incluye esta eliminación se da en el anexo como SEQ.ID No. 1. Toda la construcción viral (desde el promotor ACT2 hasta el terminador Nos) fue clonada entre las fronteras izquierda y derecha del T-ADN del plCBV49, un vector binario KanR derivado del pBIN19. Debido a la eliminación en el MP, los replicones producidos a partir de esta construcción no pueden moverse de célula a célula, pero son capaces de replicarse de manera autónoma dentro de una célula. El movimiento de célula a célula puede ser restaurado cuando se proporciona el MP en trans, p. ej . , a partir de un promotor constitutivo tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.
Para hacer una construcción de expresión del MP, el gen TVCV del MP fue amplificado por PCR a partir del cADN del TVCV (acceso a GenBank Z29370, bp 4802 a 5628) y subclonado en un vector binario bajo el control del promotor 35S. La construcción resultante, llamada plCH10745 (no se muestra) , y el plCH14833 fueron transformados en la cepa GV3101 de Agrobacteríum y varias diluciones de un cultivo de toda la noche fueron infiltradas en hojas de
Nicotiana bentha íana como lo describen English y colegas
(1997, Plant J.., 12, 597-603), excepto en que el medio de t' infiltración carecía de acetosiringona . La infiltración del plCH14833 solo, condujo a la aparición de unas cuantas células de expresión de GFP dentro del área infiltrada. Al contar los protoplastos preparados a partir del área infiltrada, encontramos que sólo de uno a tres protoplastos expresaban GFP de un total de 500 protoplastos (0.2 a 0.6%) . La infiltración conjunta de plCH14833 y plCH10745 condujo a la formación de foci de expresión de la GFP que creció a partir de cada célula inicial de expresión de GFP. Finalmente, debido al movimiento de célula a célula, una gran proporción de células en" el área infiltrada expresaron GFP (Figura 7A) . .
Los virus de ARN tales como los tobamovirus se replican en el citoplasma y nunca entran al núcleo. Por lo tanto, han evolucionado en un ambiente en el que no están expuestos a la maquinaria de procesamiento de pre-mARN nuclear. Como resultado, no es sorprendente que los transcritos del replicón de ARN generados en el núcleo a partir' de las construcciones virales artificiales no puedan ser reconocidos y · procesados correctamente por la maquinaria de procesamiento del ARN. Además, los replicones de ARN de los vectores vírales son muy grandes: aproximadamente de 7,000 nt en el caso del replicón basado en TMV. Muy pocos genes de planta tienen un tamaño tan grande y la mayoría de esos genes contienen intrones que facilitan el procesamiento de los pre-mARN' s, exportan del núcleo, y mejoran la estabilidad de los transcritos procesados. Por lo tanto, establecimos la hipótesis de que las modificaciones de los pre-mARN' s que aumentarían la eficiencia del procesamiento preciso y de la exportación de · los transcritos . correctamente procesados desde el núcleo hacia el citosol, conducirían a un aumento del número de células que iniciarían - la replicación viral, resultó que hay dos enfoques que pueden usarse para hacer los vectores basados en virus de ARN que pueden iniciar de modo más eficiente la replicación viral después de la entrega de ADN al núcleo: (1) un enfoque es 1.a remoción de las representaciones de secuencia que pueden inducir eventos de procesamiento no deseados (tales como eventos alternativos de empalme usando sitios crípticos de empalme, o eventos de terminación prematuros).; (2) un segundo enfoque es la adición de intrones para aumentar la cantidad de transcritos correctamente procesados, para mejorar la exportación del ARN desde el núcleo hacía el citoplasma, y/o mejorar la estabilidad de los transcritos.
EJEMPLO 2. La remoción de las secuencias parecidas al intrón aumenta la frecuencia de formación del replicón de ' ARN viral en el citoplasma. · ' Analizamos la secuencia del replicón de ARN del plCH4351 usando- ' el programa del servidor Netgenell- (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) y notamos varias representaciones de secuencia parecidas al intrón que -podrían inducir eventos alternativos de empalmado. Una de esas representaciones es una región 0.6 kb rica en uridina (correspondiente a los ht 827· al 1462 en el acceso a GenBank - BRU03387) al inicio del RdRP (Figura 2A) . Esta región fue reemplazada en' el plCH14833 por una secuencia mutagenizada de PCR que difiere de la secuencia original por una sustitución del nucleótido 54 (secuencia que se da en el anexo ' como ID SEC. No. 2; cf. Figura 3) . Las sustituciones del nucleótido 52 se' hicieron para reemplazar las secuencias' ricas en T por más 'secuencias ricas en GC. Todas las sustituciones de nucleótido se hicieron silenciosas para no cambiar la secuencia de la proteína RdRP. este ' fragmento mutagenizado también contiene dos sustituciones de nucleótido (en la posición 829 y en la 1459; coordinados relativos al acceso a GenBank BRU03387) que fueron introducidas para remover el donante putativo críptico de empalme y los sitios del aceptante, respectivamente). Para probar el efecto de- estas mutaciones, el clon plCH15466 resultante (Figura 6A) fue agroinfiltradó en hojas de N. benthamiana con o sin el plCH10745 (proteina de movimiento in trans) . Ocho días ¦después de la infiltración, - se observó un aumento de 10 dobleces en el número de células de expresión de GFP en el área infiltrada con el · plCH15466 (comparado con el plCH14833, Figura 7). Esto sugiere' que la remoción de las secuencias parecidas al . intrón del amplicón viral previene los eventos1 indeseados dé empalme alternativo y da como resultado un inicio más eficiente del replicón viral. La infiltración conjunta del plCH15466 y · el plCH10745 conduce al movimiento de célula á célula del replicón modificado a una velocidad similar a la del replicón no modificado. Esto muestra que la modificación de la " secuencia de ARN no afectó el movimiento' de célula a célula del vector viral.
EJEMPLO 3. Remoción de las secuencias parecidas al intrón en el promotor subgenomico de MP.
Una ' segunda ' ' región pote'ncialmente problemática corresponde al promotor subgenomico de MP (Figura 2B) . Esta región es muy rica en T y muy cercanamente parecida a las secuencias del intrón. Como consecuencia, muchos donadores crípticos de empalme y sitios de aceptadores son predichós en las secuencias cercanas a través de programas de t' predicción de, intrón. Infortunadamente, no pueden hacerse fácilmente modificaciones a esta región sin afectar la función del promotor subgenómico. Decidimos mutagenizar completamente la- región completa sin preocuparnos por el promotor subgenómico, y ' proporcionar ' MP en trans para compensar la pérdida esperada de la expresión de MP- Como el MP no se expresará _ a partir de esta construcción, también eliminamos la mayoría de la secuencia de MP excepto por las secuencias 3'· que' contienen el · promotor subgenómico CP que se requiere para conducir la expresión del gen de interés. Por lo tanto, reemplazamos un fragmento de bp 383 en el plCH14833 (bp 4584 a 54-55 en · el acceso a GenBank BRU03387) por un fragmento mutagenizado de bp -297 (ID SEC. No. 3). La ¦ construcción plCHl5900 resultante (Figura 6A) se infiltró en hojas dé Nicotiana benthamiana con o sin el plCHl0745. De forma "interesante, se detectó un fuerte incremento en el número de células que iniciaron la replicación en comparación con las áreas de la hoja infiltradas por el plCH14833. Al contar los protoplastos que _ expresaban GFP preparados a partir de las áreas infiltradas de la hoja,' estimamos que esta modificación da como resultado un aumento de 80 a 100 dobleces en el número de células que iniciaron la replicación viral, en comparación con el plCH14833 no modificado. El plCH15900 fue con untamente infiltrado con el plCHl0745 (cartucho de expresión MP -de p35S) y se detectó un incremento en la fluorescencia GFP debido al movimiento de célula a célula. Este aumento fue sin embargo muy limitado debido a tantas células que ya expresaban GFP aún en ausencia del movimiento de célula a célula. · Una dilución de 1000 dobleces ' ('correspondiente1' ¦· aproximadamente a una DO calculada de 0.004 a 600 nm) de la suspensión de agrobacteria que tenia plCH1500 infiltrado en conjunto con una suspensió diluida en 5 dobleces de agrobacteria que contenía plCH10?45 (correspondiente aproximadamente a una OD calculada de 0.8 a 600 nm) dio lugar al foci separado de expresión de GFP. El foci fluorescente era igual de brillante y del mismo tamaño que ' el foci de control obtenido con el plCHl4833. Esto nos dice que la modificación en el plCH15900 y la entrega de MP en trans no compromete la funcionalidad del replicón referente al nivel de replicación, a la expresión del gen de interés y al movimiento de célula' a célula.1 Las mismas construcciones (plCH14933 . y plCH15900, con o sin el plCH10745) se infiltraron conjuntamente a hojas de Nicotiana tabacum. Las modificaciones en el plCH'15900 condujeron a un incremento similar en el número de' células ' que iniciaron la replicación (en comparación con el plCH14833) del que tuvieron en la N. benthamiana .
EJEMPLO 4. La adición de intrones mejora la frecuencia de formación de replicones de ARNB funcionales en el citoplasma. ' ' '; ¦ ,'" 1
Probamos si la adición de intrones dentro de las secuencias' ' del pro-replicón viral incrementaría la frecuencia del inicio de la replicación. Se hicieron dos construcciones, la plCHl'5025 y · la plCH15034 (Figura 6?) , cada una conteniendo tres diferentes intrones de Arabídopsis thaliana en dos regiones diferentes del RdRP. El plCHl5025 fue diseñado para contener los intrones en el medio del RdRP, mientras que el plCH15034 contiene los intrones en el extremo -3' del RdRP, corriente arriba del promotor subgenómico de MP. Los intrones fueron amplificados por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis e incorporados en las secuencias . irales usando PCR 'con cartuchos que traslapaban las uniones intrón/exón planeadas. Los fragmentos que contenían los intrones fueron subclonados en plCH14833 como un fragmento Aval HindIII (ID SEC.' o. 4 e · el anexo) para hacer el plCH15025 o como un fragmento Pstl Ncol (ID SEC. No. 5 en el anexo) para hacer el plCHl5034.
Ambas construcciones fueron agroinfiltradas por separado en hojas de N. benthamiana y comparadas con el plCH14833. Ambas construcciones aumentaron de manera significativa el número de células que iniciaron la replicación viral (Figura 7A) . Se estimó que este aumento era del orden de una mejora de 50 dobleces en relación con el plCH14833. Ambas construcciones fueron también conjuntamente infiltradas con un clon de expresión de MP, y se . encontró que el movimiento de célula a célula era idéntico' al de los . clones sin intrones . Ambas construcciones fueron probadas también en N. tabacum, y se observó una mejora similar a la de N. benthamiana (Figura 7B) .
Se hizo " un tercer clon, el plCH15499, que contenia 6 intrones (Figuras 5, 6B, 7A, 7B) . Esta construcción se probó en N. benthamiana y en N. tabacum. Esta construcción fue más eficiente que cada construcción individual con 3 intrones, pero sin embargo la mejora fue menos que aditiva.
EJEMPLO 5. La adición de intrones y la remoción de las secuencias parecidas al intrcn aumenta la frecuencia de la formación de replicones de ARN funcionales en el citoplasma .
El remover las representaciones parecidas .al intrón y añadir intrones adicionales en una construcción, mostró que. ambos tipos de modificaciones pueden contribuir a mejorar el inicio de la replicación viral. Subclonamós los 6 intrones del plCHl549.9 dentro del plCH15900, que contenia la región mutagenizada del promotor subgenómico de MP. El clon plCH15860 resultante fue infiltrado en hojas de N.benthamiana y se encontró que trabajaba significativamente mejor que cualquiera de los clones parentales dentro del rango de aproximadamente 50% a 90% de todos los' protoplastos qü'e expresaban GFP (Figura 7) . La construcción con mejor desempeño contenia intrones en la región RdRP y en la región modificada del promotor subgenómico de MP (plCH16191, Figura 7C) . En comparación con un clon sin ninguna modificación, esto representa una mejora de 80 a 300 dobleces. Está construcción también fue conjuntamente infiltrada con una construcción de expresión de MP (plCH10745) y · sé encontró que las modificaciones no comprometían el movimiento de célula a célula o la replicación.
EJEMPLO 6. No todas las adiciones de intrón aumentan la frecuencia de la aparición de replicones de ARN funcionales en el citoplasma.
Insertamos dos diferentes intrones de Arabidopsis al principio del RdRP, , dando como resultado el clon plCHl5477 (la secuencia de esta región se muestra como ID SEC. No. 6 en el anexo) . La secuencia en esta región ya se ve muy "parecida al intrón" (p. ej . , rica en GC sin sitios crípticos de empalme) antes de la adición de los intrones. Con esta construcción no se vio mejora en la replicación del inicio viral. Por lo tanto, no cualquier adición de un intrón dará como resultado una mejora del vector viral. Parece que la posición elegida para la inserción del intrón o mutagénesis es un parámetro importante. Por ejemplo, todas las inserciones de intrón o sustituciones de nucleótido que se hicieron en las regiones cerca de estructuras problemáticas tales como. el promotor subgenómico MP, dieron cómo ¦ resultado grandes mejoras, mientras que las inserciones de los intrones en las secuencias que ya son "parécidas al exón" no lo hicieron.
EJEMPLO 7. La inserción de intrones en las secuencias MP aumenta la frecuencia de formación del replicón viral.
Hicimos primero un cambio de marco en el MP por digestión con ..la enzima de restricción Avrll, rellenado y religado. Luego insertamos dos intrones en el MP. El clon resultante (plCH16422 (Figura 6B) fue infiltrado en hojas de Nicotiana benthemiana . Se detectó un aumento de cerca de 100 dobleces en el número de células que contenían el replicón viral funcional .
EJEMPLO 8. La inserción de intrones en un MP que contenga vector mejora la frecuencia del inicio de la replicación viral de los clones funcionales autónomos.
Se subclonó un fragmento Kpnl EcoRl del plCH15499 en el plCH8543.' El clon resultante, 16700 (Figura 6B) , contenía un vector 'viral completo con 6 intrones en el RdRP. Este clon fue infiltrado en una hoja de J\í. benthamiana e inició la 'replicación de manera eficiente. Este clon también fue capaz de moverse de célula a célula sin la necesidad de proporcionar MP adicional en trans .
EJEMPLO 9. Activación de un replicón inactivo integrado de manera estable en un cromosoma .
También es posible transformar de manera estable las construcciones del vector viral que contiene intrón en las plantas trarisgénicas . Para eliminar la replicación viral deletérea que inhibiría el crecimiento de la planta, puede hacerse un clon inactivo (pro-replicón) teniendo una parte del vector presente en orientación de sentido contrario (Figura 8). La incorporación de los sitios de recombinación y de las secuencias del intrón en las extremidades del fragmento invertido permite que este fragmento sea "girado" en la orientación correcta usando una recombinasa apropiada. Los sitios de recombinación serán completamente eliminados del replicón por empalme. Los intrones en el pro-replicón permiten un · inicio eficiente de la replicación después de la recombinación y la transcripción. En un ejemplo especifico, los sitios de recpmbinación están localizados dentro del gen de interés y corriente abajó del pro-replicón. Esa configuración previene cualquier expresión del gen antes de la recombinación. Pueden considerarse otras configuraciones en las que los sitios de recombinación estén ubicados en otras áreas del pro-replicón tal como en el RdRP y corriente arriba del promotor. Las secuencias del intrón en el sitio de recombinación tienen la ventaja de que permiten remover por completo el sitio de recombinación del replicón, pero también aumentan la eficiencia de la replicación viral, como se describió antes.
La parte girada puede estar localizada en el extremo 3' del vector (como se muestra en la Figura 8), en el medio o en el extremo 5' , como se muestra en la Figura 12. Se hicieron dos construcciones, el plCH12691 (que contenia sólo un intrón en el sitio de recombinación) y el plCH16888 que contenia 6 intrones adicionales en el RdRP. La secuencia dé' toda la región T-ADN del plCH12691 se da en ID SEC. No. 7. El plCHlS888 es similar al plCH12691, pero contiene además los tres intrones descritos arriba en el plCHl5025 (ID SEC. No. 4) y los tres intrones descritos en el plCH15034 (ID SEC. No. 5) insertados en la misma posición que en esas construcciones, respectivamente. Ambos del plCH12691 y el plCH16888 fueron transformados de manera estable en Nicotiana ' benthamiana usando la selección de Kanamicin como sigue. Las construcciones plCH12691 y plCH16888 se inmovilizaron por separado en A. tumefaclens (GV3101) y se usaron por separado para la transformación de los discos de hoja .mediada con Agrobacterium de las plantas de Nicotiana como lo describen Horsh y colegas (1985, Science, 227 , 1229-1231) con modificaciones menores. Los discos de las hojas se cultivaron en conjunto durante 30 min en una suspensión agrobacterial en medio basal urashige y Skoog (MS) suplementado con 1 mg/L de ácido alfa-naftalenoacético (NAA) , 0.5 mg/L de 6-benzaminopurina (BAP) , 200 microM de acetosi'rengona (AS), pH 5.5-5.6. Luego los discos de las hojas se colocaron en papel filtro estéril Whatman® para remover el exceso de liquido y se transfirieron a un medio sólido de cultivo conjunto (0.8% de agar preparado .en MS -- suplementado como se describe arriba) durante 48 horas de cultivo en la oscuridad a 22-23°C. Después del cultivo conjunto, los discos de las hojas fueron colocados en un medio de regeneración selectivo (0.8% de agar preparado en MS suplementado con 1 mg/L de BAP, 0.1 mg/L de NAA, 1 mg/L de' MES (pH 5.7-5.8), 300 mg/L de cefataxim, 50 mg/L de kanamicin) . Después de 3-6 semanas de cultivo en el medio de regeneración, los ' retoños regenerados a partir de las células de planta resistentes al kanamicin se transfirieron a un medio de enraizado selectivo (0.8% de agar preparado en MS, suplementado con 300 mg/L de cefotaxim, 200 mg/L de timentin para facilitar la eliminación de la agrobácteria, 50 mg/L de kanamicin, pH 5.7-5.8). Los transformantes regenerados fueron transferidos al invernadero y probados por infiltración con una jeringa sin aguja con una suspensión de agrobácteria que contenia una, construcción de expresión de integrasa (promotor de plCH10881 : actin2 - integrasa PhiC31; ó promotor Spm de plCH14313 : Zea elemento transponible del maíz - integrasa PhiC31) . Más transformantes plCH16888 mostraron foci de replicación viral después de la infiltración con la construcción de integrasa que los transformantes del plCH12691 (Figura 13) . Además, los transformantes del plCH16888 mostraron más foci de infiltración viral por infiltración.
EJEMPLO 10. Las secuencias de ARN viral contienen regiones potencialmente inestables .
Se realizó el análisis del perfil de ARN de los virus de ARN de planta seleccionados, así como de un gen de planta bien 'caracterizado {AtDMCl) , usando el programa (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) del servidor Netgenell. El perfil de ARN que se muestra en la Figura 9 para el AtDMCl refleja claramente la presencia de 14 intrones (circulados), previamente identificados comparando las secuencias- de cADN ' y · de ADN genómico. Es evidente que los perfiles de ARN de dos virus de planta tienen regiones
(ver las - Figuras 10, 11) que pueden causar problemas para O la estabilidad del ARN, si se colocan en el ambiente nuclear de la planta. Hemos analizado los perfiles de ARN de varios otros virus de ARN de planta representativos (no se muestran) , tales como el Virus del Mosaico del Bromo, diferentes cepas de TMV, y muchos otros. Todos ellos tienen regiones problemáticas potenciales que pueden comprometer la eficiencia ..de la formación del replicón basado en virus de ARN de planta si se entregan dentro del ADN de la célula de planta como precursores de ADN.
EJEMPLO 11. Los vectores optimizados trabajan en otras especies . ' " .''¦ " ; ·
Se hizo una construcción completamente optimizada •que contenia la región mutagenizada (descrita en el plCH15466) y 16 intrones (incluyendo los seis intrones del plCH15860, los dos intrones del plCHl6422 y ocho intrones adicionales) . En suma, esta construcción contenia los intrones insertados en las siguientes posiciones (que se dan en relación con la secuencia TVCV, acceso a GenBank BRU03387) : nt 209, nt 828, nt 1169, nt 1378, nt 1622, nt 1844, nt 2228, nt 2589, nt 2944, nt 3143, nt 3381, nt 3672, nt 3850, nt 4299, nt 5287, nt 5444.
Esta construcción fue probada para expresión en Beta vulgaris . La infiltración de toda la planta se realizó como se describe enseguida. Se inoculó Agrobacteria portadora del plCH18711 a 300 mi de LB que contenía 50 µg/ml de Rifampicin y 50 ]iq/ml de Kanamicin (selección para el vector binario) y se cultivaron hasta la saturación. Las bacterias se hicieron pelotillas a 4800 g durante 10 min y se resuspendieron en 3 1 de regulador de infiltración (10 mM de MES pH 5.5, 10 mM de MgS04) para obtener una dilución de 10 dobleces con relación al cultivo saturado de Agrobacteria . Una cubeta conteniendo la solución de infiltración se colocó en un secador (30 mm de diámetro) , con las partes aéreas de una planta sumergidas en la solución. Se aplicó vacío durante dos minutos usando una bomba tipo PM 16763-860.3"' de KNF Neuberger (Freiburg, Alemania), alcanzando desde 0.5 hasta 0.9 bar. Las plantas se regresaron al invernadero bajo condiciones estándar.
La expresión de GFP fue alta en las hojas de las plantas infiltradas . con' el plCH18711 (Figura 14). En contraste, sólo- unos cuantos puntos pequeños pudieron verse en las plantas de control infi.ltradas con el plCH16700 que no contenía intrón (no se muestra) .
ANEXO
ID SEC. No. 1 (fragmento Ncol-EcoRI del plCH14833) : ccatggacaaagtgataaaggcagcttítígtggagacgatagcctgatttacattcctaaaggtttagacttgcctgaíatícaggc gggcgcgaacctcatgtggáacítcgaggccaaactcítGaggaagaagíaíggttacttctgfggtcgttatgttattcaccatgat agaggagccattgtgtattacgatccgcttaaactaatatctaagttaggttgtaaacaíaítagagaígttgttcacttagaagagtta cgcgagtctttgígtgatgíagcíagtaactteaaíaaítgtgcgtatttttcacagtlagatgaggcGgítgccgaggttcataagacc gcggíaggcggttcgtttgctttttgíagtataattaagta^^ gtctcgtacgaacctaaggtgagtgaütccicaatctttcgaagaaggaagagatcttgcGgaaggctctaacgaggttagaattc
ID SEC. No. 2 (parte del plCHl5466) :
ggagataacctgagcttcttcttccataatgagagcactctcaattacacccacagcttcagcaacatcaícaagtacgtgtg(-¾ag acgítcttccctgctagtcaacgctícgígtaccacaaggagttGctggtcacíagagtcaacacttggtactgcaagttcacgagag
{ggaíacgttcactcígttccgtggígtgíaccacaacaatgíggattgcgaagagttttacaaggctaiggacgatgcgíggcacta · caaaaagacgüagcaatgcttaatgccgagaggaccatottcaaggátaacgcígcgltaaacttttggttcccgaaagtgaga gacatggttatcgtcccícícffigacgcítctatcacaactggtaggatgtcíaggagagaggtíatggtgaacaaggacttcgícía
GaGggtcctaaatcacatcaagacctatcaagcíaaggcactgacgtacgcaaacgtgcígagctícgtggagtcíattaggtcla gagtcataaítaacggtgtcactgccaggtctgaatgggacacagacaaggcaatÍcíaggíccaítagcaatgacattcttcGtga tcacgaagctgggtcátgtgcaagat
ID SEC. No. 3 (parte del plCH15900) : gcggacgatacgtgaíccaccatgatagaggagccaítgtgtatíacgatccgcttaaactaaíatctaagctcggctgcaagcac atcagagacgícgtgcaGttagaagagííacgcgagíctttgtgcgacgtagctagíaacttgaacaactgcgcctacüctGacag tíagatgaggccgttgctgaggtccacaagacígcggícggaggGtccttcgcgtícígtagcatcatcaaatacttgtcagacaag aggctgttcagggacctgttcftcgtctgagttgacg . ID SEC. No. 4 (parte del plCH15025) (contiene 3 intrones que se muestran en itálicas subrayadas) :
Cccgagctatactgtaccttcgccgaccgattggtactacagtacaagaaggcggaggagttccaategtgtgatctttccaaacc tctagaagagtcagagaagtacíacaacgcattatccgagctatcagtgcttgagaatctcgactcttttgacttagaggcgtttaag actttatgtcagcagaagaótgtggapccggatatggcagcaaag qtaaatcctaQtccacacMacqataaaaacaceaqaMaaactatqaactQatcaataatcattcctaaaaaaccacacttttq ttttatttctaaagtaatttttactQttataacaq gtggtcgtagcaatcatgaagtcagaattgacgttgccíítcaagaaacctacagaagaggaaaíctcggagtcgctaaaacca ggagaggggtogtgtgcagagcataaggaagtgttgagcttacaaaatgatgctccgtícGcgtgtgígaaaaatctagttgaag' gttccgtgccggcgtatggaafgtgtcctaagggtggtggtttcgacaaattggatgtggacattgctgatítccatctcaagagtgta gatgcagttaaaaagggaactatgatgtctgcggtgtacacagggtctatcaaagttcaacaaatgaagaactacatagattactt aagtgcgícgctggcagctacagtctcaaaccíctgcaag AaaQagcjtcaaaagQtttccacaatQatccctcmttQtitctcíaQ^ atQcatatttQtqatQaQacaaatQtttatíctatgttttac! . gfgctíagagatgttcacggcgílgacccagagícacaggagaaatciggagtgígggatgttaggagaggacgttggítactíaa acctaatgcgaaaagtcacgcgtggggtgiggcagaagacgccaaccacaagítggttattgtgttactcaactgggatgacgg. aaagccggtttgtgatgagacatggttGagggtggcggtgtcaagcgattccttgatatattcggataigggaaaacttaagacgci cacgtcttgcagtccaaatggtgagccaccggagcctaacgccaaagtaa tttggtcgatggtgítcccggttgtggaaaaacga aggagattatcgaaaag ataaaMacatttaattatQctcctíqcatíttaQQtattcgtcQctcttccatttccatq^ ttgcctcaQttctaactgtttgtggtatttttatíttaattaítactacaa gtaaacttctctgaagacttgattttaglccctgggaaggaagctt
ID SEC. No. 5 (parte del plCH15034) (contiene 3 intrones que se muestran en itálicas subrayadas) :
ctgcag qtaaaatatíaaatqccaqacgatattcfficffiqafflgtaactfficctatcaaaQtcaataaaffiatt^ aattittttttagaaccatíaíqtaaüttccíaattaacíaaaccaaaattatacaaaccaa gittgcíggaaaatttggttgcaalgatcaaaagaaacatgaatgcgccggaíttgacagggacaaítgacaítgaggatactgca tctctggtggtígaaaagttttgggattcgíatgttgacaaggáaíttagtggaacgaacgaaaígaccatgacaagggagagcttc tccag gtaagaaGttGtcataaatatíaataacaaattaatatíattaaaatcttta UaQataatc atacGtcctaatfatccatgtttfactaq ttttctacaattéaaa gtggctttcgaaacaagagtcaíctacagttggícagttagcggactttaactttgtggatttgccggcagtagatgagtacaagcat atgatcaagagtcaaccaaagcaaaagttagacttgagtaítaaagacgaatatcctgcatlgcagacgatagtctaccatícga aaaagatcaatgcgattttcggtccaatgttttcagaacttacgaggaígttactcgaaaggattgactcttcgaagtttcígttctaca ccagaaagacacctgcacaaatagaggactícttítGtgacctagactcaacccaggcgatggaaattctggaactcgacatííc gaagtacgataagtcacaaaacgagítccaíígtgctgtagagtacaagatotgggaaaagttaggaattgatgagtggctagct gaggtctggaaacaag gtgaQttcctaagñccattí.tíítgtaatGcticaatgtíatittaacMcagatcaacatcaaaaÜaggttcaattttcatcaaccaaat aatatitttcatgtatatataq gtcacagaaaaacgaccttgaaagatíatacggccggaatGaaaaca-tgtctttggtatcaaaggaaaagfggtgatgtgacaa cctttattggtaataccatcatcat gccgcatgíttgagctcaaígatccccatgg
ID SEC. No. 6 (fragmento del plCH15477, conteniendo 1 intrón que se muestra, en itálicas, subrayadas) :
GíltlagttttattgcaaGaacaacaacaaattacaataacaacaaacaaaatacaaa"caacaacaacatggcacaattícaac aaacaattgacatgcaaactctccaagccgctgcgggacgGaacagcttggígaaígatttggcatctcgtcgcgttíacgataat gcagtcgaggagcígaaigctcgttccagacgtcccaag gtaaaacaacatticaücacatataígaatactíttgtcattgagtacaaaaaagacacttactacttgttQatgaaagttfccQCcttt aiacttatctatatcattttcaicatttcaaactagtatQaaattaggtgatgtttatataatatoataaaacattaatctatagggaeactg ttttgagttagttttgtataatatttttccctgtttgatgttag gttcatttctccaaggcagtgtctacggaacagacactgáttgcaacaaacgcatatccggagttcgagatttcctttactcatacgc aatccgctgtgcactccttggccggaggccttcggicacttgagttggagtatctcatgatgcaagttccgttcggctctctgacctac gacatcggcggaaacttctccgcgcscctcttcaaaggíaattttctttctctactcaaitítctccaagatccaatatttgaagactgat ctatagttaaaattaatctctactcGattcttgttaccícaggtcgcgattacgttcactgGtgcatgc: gttttagttíí ttgcaacaacaacaacaaattacaaíaacaacaaacaaaaíacaaacaacaacaacatggcacaaíítcaac aaacaattgacatgcaaactctccaagccgctgcgggacgcaacagcttggtgaatgatííggcatctcgtcgcjgíttacgataat gcagtcgaggagctgaatgctcgttccagacgtcccaaggtaaaacaacatttcattcacatatatgaatacttttgícattgagtac gaagaagacacttactacttgftgatgaaagtttccgcctttatacttaiclatatcattttcatcatítcaaactágtatgaaattaggtga tgtttatatgatatcatggaa'cattaatetatagggaaactgttttgagttagttttgtate^ aaggcagtgtctacggaacagacactgaítgcaacaaacgcatatccggagttcgagatttccttfacícatacgcaatccgctgt gcactccttggccggaggcGttcggtcacttgagt ggagtatcícatgatgcaagttccgttcggctctctgacctacgacatcggc ggaaacttctccgcgcacctcttcaaaggtaattttctttctctactcaattttctccaagatccaatatttgaagactgatctaíagttaa aattaatctctactccattcttgttacctcaggtcgcgattacgttcactgcígcatgc
ID SEC. No. 7: región . del T-ADN -del plCH12691, donde los Segmentos de, la secuencia tienen la misma función:
Nucleótidos 1 a 25: frontera izquierda (cordón opuesto), Nucleótidos 86 a 1484:' promotor Nos - secuencia de codificación NPTII - terminador Nos (en el cordón opuesto) , Nucleótidos 1506 a 1552: sitio de recombinación TAttP (cordón opuesto) , Nucleótidos 1553 a 159S: intrón parte 5'- (cordón opuesto), Nucleótidos 1600 a 2022: extremo 5' de TVCV RdRP (cordón opuesto) , Nucleótidos 2023 a 2809; promotor actin 2 de Arabidopsis (cordón opuesto) , Nucleótidos 2836 a 2903: sitio de recombinación AttB, Nucleótidos 2904 a 2959: parte 3' del intrón, Nucleótidos 2960 a 7991: parte 5' de MP de parte 3' de TVCV RdRP, Nucleótidos 7992 a 8168: extremo 3' cr-TMV MP, Nucleótidos 8248 a 8967: secuencia de codificación GFP, Nucleótidos 8961 a 9215: región no trasladada 3' de cr-TMV, Nucleótidos 92.34 a 9497: terminador Nos, Nucleótidos 9549 a 9473: frontera derecha del T-ADN (cordón opuesto) : íggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttííaatgtactggggtggatgc aggtcgatctagtaacatagatga.caccgcgcgcgaíaatttatcctagtttgcgcgc atattttgttítctatcgcgíattaaatgtafa attgcgggactctaatcataaaaacccatctcataaataacgícatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaacaga aattatatgataatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaactttattgccaaatgt tgaacgatctgcttgacícta gatccagagtcccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgaíaccgta aagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtc
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gactcGcttaattcíccgcícatggtaccagcttctcgagcgacGctacgcccGcaactgagagaactcaaaggttaccccagttg gggcacaacaaaaatcaaatctaaatttgtgíaattatgaaaatgaaacttacctttgaagaggtgcgcggagaagtttccgccga tgtcgtaggícagagagccgaacggaacttgcaícafgagatactccaactcaagtgaccgaaggcctccggccaaggagtgc acagcggattgcgtatgagíaaaggaaatctcgaactocggatatgcgtügttgcaatcagtgtctgttccgtagacactgccttgg agaaatgaaccttgggacgtctggaacgagcattcagctcctcgactgcattatcgtaaacgcgacgagaígccaaatcattcac caagcígítgcgtcccgcagGggGttggagagí tgcatgtcaaítgtttgttgaaattgtgc ^tgttgttgttgmgtatíttgtttgttgtt atfgtaatttgttgttgítgtígcaaiaaaacíaaaacítcaaagcggagaggaaaatatatgaatttaiaíaggGgggtttatctcttac aacttlattttcggcctttcaaaaaaataa taaaatcgacagacacgaaícatítcgaccacaggtaaagaíaacgtgacctggct gtcagacagcctíttcccicgtgüaactaal aaactaaítaatcatcícagcccttggattagtícttttgctttgatggcttcatgact gigacctgctcgaíccgcgigttaGatgacagctccgtttttttagtggttaacttaaaccgagtcaatccaggcaacgítagtcgtcgt cgtggttggcttgtíraaltagatttcatacaattcaacgtaaíttaattcgttttctaítagaatlgtatcataattaattcagaccgtgaaa 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Claims (1)
- REIVINDICACIONES 1. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, transformado de manera estable, que contiene en el núcleo de la célula un ADN heterologo con una secuencia que codifica un replicón de ARN enlazado o enlazable operativamente a un- promotor de transcripción, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene: (i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, derivándose esas secuencias de una secuencia de virus de ARN de planta, y (ii) una secuencia de interés a ser expresada a partir del replicón de ARN, por medio de la cual las secuencias para la función de replicón muestran todas 'las ubicaciones' seleccionadas de la secuencia de las diferencias de conservación de función del virus de ARN de planta a partir de la secuencia del virus de ARN de planta, causando esas diferencias . una frecuencia incrementada de formación de replicón en comparación con un replicón de ARN que no muestre las ¦ diferencias . " 2. Cultivo de planta, parte de planta o célula -de planta de acuerdo con la reivindicación 1, donde las diferencias de conservación de la función comprenden una reducción del efecto deletéreo en el núcleo de la célula o un alto contenido -de A/U' en un transcrito del ADN heterologo en la formación del replicón de ARN. 3. Cultivo de planta, parte de planta o célula, de planta de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde las ubicaciones seleccionadas de las secuencias del virus de ARN de planta son ubicaciones de alto contenido de A/U. 4. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las diferencias de conservación de la función comprenden una reducción de un alto contenido de A/U en las secuencias para la función de replicón del replicón de ARN. 5. Cultivo' de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con la reivindicación 4, donde el alto contenido de A/U es reducido por la eliminación al menos parcial o el reemplazo "al"' menos parcial a través de bases G/C. " 6. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las diferencias de conservación de la función comprenden la remoción dé 'los sitios crípticos de empalme que flanquean a las regiones ricas en A/U. 7. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo · con cualquiera- de las reivindicaciones 1 a 6, donde las diferencias de conservación de la función comprenden la inserción de uno o más intrones nucleares o de una o más secuencias capaces de formar intrones nucleares cerca de o dentro de las ubicaciones ricas en A/U de las secuencias para la función del replicón. 8. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con la reivindicación 7, donde la(s) secuencia (s) capaces de formar un intrón nuclear son 5 capaces de formar un intrón nuclear por recombinación especifica del sitio. 9. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN 10 tiene uno o más segmentos que codifican juntos para el replicón de ARN, por lo que la formación del replicón de ARN requiere el reacomodo de esos segmentos . 10. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de .acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 15 a 9, donde todos los núcleos de ' las células de la planta contienen el ADN heterologo. 11. Cultivo de- planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el ADN heterologo está contenido en un , 20 cromosoma del núcleo de la' célula. 12. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo -con la' reivindicación 11, donde todas las células del cultivo ' de planta, parte de planta o. célula de planta contienen el ADN heterologo en un cromosoma nuclear. 25 13. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene además,, en las ubicaciones de alto -contenido de A/U e la secuencia de interés, las diferencias de conservación de la función que causan una frecuencia incrementada de formación de replicón en comparación con un replicón de ARN que no muestra las diferencias en la secuencia de interés. 14." Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el virus de -ARN de planta es un tobamovirus, preferiblemente un virus del mosaico del tabaco. 15. Cultivo de planta, parte de planta o célula de planta de acuerdo co cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde las diferencias de conservación de la función son de función silenciosa;' 16. Parte de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,· donde la parte de planta es una semilla . 17. Proceso para expresar una secuencia de interés en un cultivo' de planta, parte de planta o célula de planta, que comprende: (a) proporcionar un cultivo de planta, parte de planta o célula -de planta que contenga en el núcleo de la célula un ADN heterólogo con una secuencia que codifique un replicón de ARN enlazado o enlazable operativamente con un promotor de transcripción, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene: (i) - secuencias para la ' función de replicón del replicón de ARN , secuencias que se derivan de .una secuencia de virus de ARN de planta, (ii) una secuencia de interés; donde las secuencias, para la función del replicón muestran, en las ubicaciones seleccionadas de las secuencias del virus de ARN d'e planta las diferencias de conservación de la función de la secuencia del virus de ARN de planta, causando esas diferencias una f ecuencia ' 'incrementada de formación de replicón en comparación con un replicón de ARN que no muestra esas diferencias; y (b) causar la expresión de la secuencia de interés . 18. Proceso de acuerdo con la reivindicación 17, donde el ADN heterólogo está incorporado de manera estable en ' cromosoma nuclear. 19. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, donde la secuencia de interés codifica una proteina de interés y el paso (b) comprende el causar la expresión' de ' la" proteina de interés. 20. Proceso de acuerdo con la reivindicación 19, donde la expresión de la proteina de interés conduce a la producción de una proteina deseada en la planta, la parte de planta o las células de planta. 21. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN tiene dos o más segmentos que codifican juntos para el replicón de ARN y el paso (b) comprende el reacomodar los segmentos de modo que pueda- formarse el replicón de ARN. 22. Proceso de acuerdo con la reivindicación 21, donde uno de los segmentos está flanqueado por los sitios de recombinación y-' el' réacomodo comprende la recombinación especifica del sitio a través de una recombinasa. 23. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 22, donde el paso (b) ' comprende proporcionar una recombinasa especifica del sitio al cultivo de- planta, parte de planta o célula de planta: 24. Proceso de acuerdo con la reivindicación 23, donde la recombinasa especifica del sitio se proporciona por transfixión transitoria con un vector que codifique la recombinasa. 25. Proceso de acuerdo con la reivindicación 23, donde la recombinasa especifica 'del sitio es codificada de manera estable en un cromosoma- nuclear bajo el control de un promotor regulado y el paso (b) comprende inducir ese promotor regulado. - 26. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 - a 25, donde la recombinasa se selecciona entre' el ' grupo' - consistente de: CRE, filippasa, resolvasa, FLP, integrasa codificada de SSV1, recombinasa, integrasa phiC31, integrasa Inti, recombinasa phi 80, P22, 186 y P4, resolvasa Tn3, la recombinasa Hin, la recombinasa, Cin, recombinasas xerC y xerD de E. coli, recombinasa de Bacillus thuringiensis . 27. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, donde la recombinasa se forma dentro de células de planta a partir de fragmentos no funcionales de la recombinasa por interacción de afinidad. 28. Proceso dé acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26,- donde la recombinasa se forma dentro de células de planta a partir de fragmentos no funcionales de la recombinasa, por trans-empalme de proteina mediada por inteina. 29. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 a 28, donde el ADN 'heterólogo o la secuencia que codifica al replicón de ARN, está enlazado a un promotor de transcripción regulado. 30. Proceso de acuerdo con la reivindicación 29, donde el promotor regulado es un promotor químicamente inducible. 31. Proceso de' acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30/ donde el proporcionar el paso (a)' comprende la transformación de una planta, parte de planta o células de planta con una molécula de ácido nucleico que contenga el ADN heterólogo. 32. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 31, donde el proporcionar el paso (a) comprende la transformación transitoria de un cultivo de una planta, parte de una planta o células de una planta con una molécula de ácido nucleico que contenga el ADN heterologo. 33. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 32, donde el paso (a) se hace por transformación mediada con Agrobacterium. 34. Proceso de · acuerdo · con- cualquiera de las reivindicaciones 17 a 33, donde el paso (a) comprende generar -una planta transgénica transformada de manera estable con el ADN heterologo. 35. Proceso de producción de una planta transgénica transformada de manera estable en un cromosoma nuclear con un ADN heterologo como se' define en la reivindicación 1, que comprende · transformar una planta o una parte de planta con un vector que contenga el ADN heterologo, seleccionar el tejido de la planta que contenga en un cromosoma nuclear el ADN heterologo, y regenerar una planta transgénica a partir de ese tejido. 36. Proceso ' para '; expresar transitoriamente una •secuencia de interés en un cultivo de planta, parte de ¦planta o célula de planta, que comprende transformar un cultivo de planta, parte "de planta o célula de planta con un ADN heterólogo que tenga una secuencia que codifique un replicón de ARN enlazado o enlazable de manera estable con un promotor de transcripción, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene: (i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, derivándose esas secuencias de una secuencia de un virus de ARN de planta, (ii) una secuencia de interés; donde las secuencias para la función de replicón muestran en las ubicaciones seleccionadas de las secuencias del virus de ARN de planta las diferencias de conservación de función de la secuencia del virus de ARN de planta, causando esas diferencias una frecuencia incrementada de formación de replicón en comparación con un replicón de ARN que no muestre las diferencias . ' 37. Proceso de acuerdo' con la reivindicación 36, donde la transformación se realiza por transformación transitoria mediada con Agrobacterium del T-ADN que contiene al ADN heterólogo. 38. Proceso de' acuerdo con la reivindicación 36 ó 37, donde la · transformación se realiza agroinfiltrando el tallo y/o todas las hojas de plantas de Nicotiana tabacum. 39. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 38, donde las diferencias de conservación de función comprenden una reducción del efecto deletéreo en el núcleo de 'la -célula de un alto contenido de A/U en un transcrito del ADN heterólogo en la formación del replicón de ARN. 40. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 39, donde las ubicaciones seleccionadas de las secuencias del virus de ARN de planta son ubicaciones de alto contenido de A/U. 41. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 40, donde las diferencias de conservación de función comprenden una reducción de un alto contenido de ¦ A/U en las secuencias para la función de replicón del replicón de ARN. 42. Proceso de acuerdo con ' la reivindicación 41, donde el alto contenido de A/U sev reduce por la eliminación al menos parcial o el reemplazo al menos parcial a través de bases G/C . , ¦ . ¦ · 43. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 42, donde las diferencias de conservación de función comprenden la remoción de los sitios crípticos de empalme que flanquean a las regiones ricas en A/U: · :' ' ¦ ¦ 44. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 43, donde las diferencias de conservación de función comprenden la inserción de uno o más intrones nucleares o dé una o más secuencias capaces de formar intrones nucleares cerca de o dentro de las ubicaciones ricas en A/U de las secuencias para la función de replicón. 45. Proceso de acuerdo con la reivindicación 44, donde la(s) secuencia ( s ) capaces de formar un intrón nuclear son capaces de formar un intrón nuclear por recombinación especifica del sitio. 46. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 45, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN tiéne uno o más segmentos que codifican juntos para el replicón de ARN, por lo que la formación del replicón de ARN requiere del reacomodo de esos segmentos. 47. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 46·, donde todos los núcleos de las células contienen el ADN heterologo. 48. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 a 47, donde la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene además, en las ubicaciones de alto contenido de A/T(U) en ' la secuencia" . de interés, diferencias de conservación de la función. · 49, Proceso de acuerdó ' con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 48 , donde · una ubicación seleccionada se identifica por: (A) transformar un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta con un ADN heterologo como se define en la reivindicación 17, pero que carece de las diferencias de conservación de la función, (B) realizar el RT-PCR en el ARN derivado del cultivo de planta, parte de planta o célula de planta a partir del ADN heterólogo del paso (A) y secuenciar el producto del RT-PCR, y (C) identificar en la secuencia del producto del RT-PCR una ubicación seleccionada como una ubicación de un evento de empalme no deseado. ; 50.. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones' 17 a 49, donde el virus de ARN de planta es un tobamovirus, preferiblemente un virus del mosaico del tabaco. 51. Proceso de acuerdo' con cualquiera de las reivindicaciones 17 á 50, donde las diferencias de conservación de función son de función silenciosa. 52. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 51, donde el cultivo de planta, parte de planta o célula de planta contiene dos o más ADN' s heterólogos diferentes y el proceso comprende la formación de dos diferentes replicones de ARN a partir de los cuales se expresan con untamente dos proteínas de interés diferentes. 53. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 52, ; donde el replicón de ARN es capaz de mostrar una frecuencia .incrementada de formación de replicón en un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta, diferente de la planta huésped natural del virus de ARN del que se deriva el replicón de ARN. 54. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 53, donde el cultivo de planta, parte de planta o .célula de planta se proporciona con dos diferentes ADN' s eterólogos cada uno de los cuales tiene una secuencia de interés, por lo que se expresan dos diferentes secuencias 1 de interés. 55. " Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 54, donde el transformar- el cultivo , de planta, parte de planta o célula de planta se hace infiltrando el cultivo de planta, parte de planta o célula de planta con una suspensión de Agrobacteria, teniendo la suspensión una concentración correspondiente a una densidad ¦óptica' calculada a' 600 nm de cuando ' mucho 0.04, preferiblemente cuando mucho 0.01, más preferiblemente cuando mucho 0.004, y lo más preferiblemente de cuando mucho de 0.001, donde las densidades' ópticas calculadas se definen por una dilución de al menos 25 dobleces, preferiblemente al menos 100 dobleces,' más preferiblemente al menos 250 dobleces, y lo más preferiblemente de al menos 1000 dobleces, respectivamente, de una suspensión de la Agrobacteria de una DO a 600 nm de 1.0. 56. Proceso para expresar una secuencia de interés en un cultivo de planta,' parte de planta o célula de planta, que comprende transformar un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta con una suspensión de Agrobacteria, conteniendo la Agrobacteria en el T-ADN un ADN heterólogo que tenga una secuencia que codifique un replicón enlazado o enlazable operativamente a un promotor de transcripción, donde la secuencia que codifica un replicón contiene: (i) secuencias para la función de replicón de ese replicón, siendo las secuencias derivadas de una secuencia de un- virus de planta, (ii) una secuencia de interés; donde la suspensión de Agrobacteria tiene una concentración de células de Agrobacteria correspondiente a una densidad óptica calculada a 600 nm de cuando mucho 0..04, preferiblemente cuando mucho 0.01, más preferiblemente cuando mucho 0.004, y lo más preferiblemente de cuando mucho 0.001, donde las densidades ópticas calculadas se definen por una dilución de al menos 25 dobleces, preferiblemente al menos 100 dobleces, más preferiblemente ' al menos 250 dobleces, y -lo más preferiblemente de al menos 1000 dobleces, respectivamente, de una suspensión de la Agrobacteria de una DO a 600 nm de 1.0. 57. Molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica un replicón de ARN enlazado o enlazable operativamente a un promotor de transcripción, donde la secuencia que' codifica un replicón d ARN contiene: (i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, derivándose las secuencias de una secuencia de un virus de ARN de planta, (ii) una secuencia de interés ,a ser expresada a partir del replicón de ARN; donde las secuencias para la función del replicón corresponden a 1-as secuencias del virus de ARN de planta y muestran en ubicaciones seleccionadas de las secuencias del virus de ARN de planta las diferencias de conservación de función de la secuencia ' del virus de ARN de planta, siendo las diferencias capaces de causar una frecuencia incrementada de formación de replicón en comparación con un replicón de ARN · que no muestre las diferencias, cuando la molécula de ácido nucleico es introducida en células de planta o en una planta. RE SUMEN Proceso para expresar una secuencia de interés en un cultivo de'., lanta, parte de planta o célula dé planta, que comprende: (a) proporcionar un cultivo de planta, parte de planta o célula de planta que contenga en el núcleo de la célula- un ADN heterologo con una secuencia que codifique un replicón de ARN enlazado o enlazable operativamente con un promotor de transcripción, donde la secuencia que codifica . un replicón de ARN contiene: (i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, secuencias que se derivan de una secuencia de un virus de ARN de planta, (ii) una secuencia de interés; donde las secuencias para la función del x'eplicón muestran, en las ubicaciones seleccionadas de las secuencias del virus de ARN de planta las diferencias de conservación de la función de la secuencia del virus de ARN de planta, causando esas diferencias una frecuencia incrementada de formación de replicón en comparación con un replicón de- ARN que no muestra esas diferencias; y (b) causar la expresión de la secuencia de interés .
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