JPS63287485A - 単子葉植物の形質転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、単子葉植物に外来遺伝子を導入し、単子葉植
物を形質転換するための方法に関する。

〔従来の技術〕

植物に外来遺伝子を導入して、新しい機能を有する植物
をつくる技術の開発は、食料資源の確保にとって重要な
ことである。これまで、大腸菌や酵母などへの遺伝子導
入技術は確立されており、また動物細胞での遺伝子組換
え技術も進んできているが、植物細胞での遺伝子組換え
技術は必ずしも充分な成果が得られていない。

植物細胞への遺伝子導入方法として従来知られている技
術は、　Ｔ１プラスミドを用いる方法である。これは、
゛植物に感染して腫瘍を起す土壌細菌アグロバクテリウ
ムの保持するＴ１　プラスミドを介して植物に遺伝子を
導入しようとする方法である。この方法の問題点として
は、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏ
’ｂａ−ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａａｉｅｎｃｅ　
）　　の感染力を介した遺伝子導入方法であるために、
宿主域に制限があることである。

アグロバクテリウムの宿主は、約６０％の裸子植物と双
子葉植物であり、単子葉植物には感染しないとされてい
たが、最近ユリ科及びヒガンバナ科の単子葉植物でＴ１
感染が報告された［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）第５
１１巻、第７６３〜７６４頁（１９８４）　］。

しかし、主要穀物でおるイネ、トウモロコシ、コムギ等
の単子葉植物に対しては、感染した報告はない。したが
って、これらの植物を形質転換するには、特別な装置を
必要とする細胞融合方法や細胞内微量注入方法を用いな
ければならない。

Ｔ１　　プラスミドを用いることの第２の問題点は、遺
伝子導入方法の複雑さである。

Ｔ１　　プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域は植物染色体に組
込まれることが知られており、この’Ｉ’−ＤＮＡを広
宿主域プラスミドに接続したものをベクターとして用い
、外来遺伝子’１Ｔ−ＤＮＡ領域の間に挿入した後、ア
グロバクテリウムに導入し、Ｔ１　　プラスミドとの間
の相同組換え（ｈｏｍＯｌｏ−ｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｔｉｏｎ　）により外来遺伝子ｔ−Ｔｉプラスミ
ドに組込むことが可能である。

しかしながら、該方法は操作が複雑で長時間ｔ−要し、
間接的であることなどから、形質転換効率は非常に低く
、実用的な方法とはいえないのが現状である。

このような背景から、植物に外来遺伝子を直接的に導入
、する技術の開発が試みられてきた。

その中で、双子葉植物に感染するカリフラワーモザイク
ウィルス（ＣａＭＶ　）の３５８ＲＮＡプロモーター及
びターミネータ−を接続した植物用発現ベクターが開発
された〔ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ（ＮｕＱｌ
、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅａ、　）　第１４巻、第５８５７
頁（１９８６）　）。

これは、ｐＵＣｌＢ　のポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎ
−ｋｅｒ）部分に、ＣａＭＶの５５　Ｓ　ＲＮＡプロモ
ーター及びターミネータ−配列を挿入し、両配列の間に
外来遺伝子を組込むためのマルチクローニングサイトを
保持させたプラスミドである。このクローニングサイト
にカナマイシン耐性遺伝子やクロラムフェニコール耐性
遺伝子を組込んだ組換えプラスミドをタバコカルスのプ
ロトプラストに導入し、再生したカルスが抗生物質耐性
を獲得したこと、及び遺伝子解析からこのプラスミドに
よるタバコの形質転換が確認されている＠このことは、
該ベクターを用いれば、タバコなどの双子葉植物に外来
遺伝子を導入して発現させることが可能であることを示
している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ＣａＭＶは双子葉植物にのみ感染する植物ウィルスであ
るから、そのプロモーターが双子′葉植物中で発現され
ることを予想することは可能であるが、該プロモーター
が単子葉植物中で発現するか否かについての記載はなく
、単子葉植物に外来遺伝子を直接的に導入する技術につ
いては依然として開示されていないのが現状である。

本発明の目的は、Ｔ１プラスミドによる感染では不可能
なイネ、ムギ、トウモロコシ等の主要単子葉植物に外来
遺伝子を導入するための実用的な方法を提供することに
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は単子葉植物の形質転換方
法に関する発明であって、カリフラワーモザイクウィル
スの１９８及び／又は５５Ｂプロモーターを含有するベ
クターで単子葉植物を形質転換することを特徴とする。

本発明者らは、大腸菌のプラスミドに、双子葉植物ウィ
ルスでめるＣａＭＶのプロモーター及びターミネータ−
配列を接続し、更に植物用薬剤耐性遺伝子を両配列の間
に挿入した組換えプラスミドを構築し、これを用いて単
子葉植物であるイネ培養細胞の形質転換を試みたところ
、意外にも一定の頻度で薬剤耐性細胞が出現することを
見出した。

更に、木組換えプラスミドの薬剤耐性遺伝子がイネ培養
細胞の染色体に組込まれていることを、染色体遺伝子の
分析により確認した。同様にして、クロラムフェニコー
ル耐性遺伝子を導入したイネ培養細胞が、クロ２ムフエ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ活性（ＣＡＴ活性
）を発現していることも確認した。このことは、双子葉
植物にのみ感染するＣ　ａ　Ｍ　Ｖのプロモーターが単
子葉植物中でも活性を発現することを示した最初の例で
あり、本発明は、これら知見に基づいて完成され九もの
である。

本発明において、単子葉植物の形質転換に用いる遺伝子
導入ベクターは、基本的には（１）大腸菌の複製起点（
ｏｒｉ）　　及び選択マーカー、（２）ＣａＭＶの１９
ＳＲＮＡ及び／又は３５８ＲＮＡプロモ一ター配列、（
３）転写終結シグナル〔ポリ（ｐｏｘｙ　）（Ａ）シグ
ナル〕、及び（４）好ましくは植物形質転換体選択マー
カー、が機能的に組込まれたプラスミドである。

本発明方法で使用するベクターの好適例を、第１図〜第
４図に模式図として示す０ これらの構成単位を含むベクターを用いることの利点と
しては、第１に、従来の技術では困難であった単子葉植
物に直接外米遺伝子を導入することができることでろる
ｏ　Ｊｉｇ２には、形質転換した植物細胞の選択マーカ
ーが付与されているので、形質転換細胞の選択が非常に
容易である。更に第３の利点としては、これらのベクタ
ーは大腸菌内で複製できるので、外米遺伝子のクローニ
ングが大腸ｍｔ−用いて容易に行うことができることで
ある。更にまた第４の利点としては、ＣａＭＶの３５Ｓ
ＲＮＡプロモーターがヒト培養細胞〔ヘラ（Ｈｅ１ａ　
）細胞〕内においても働くことを本発明者らが確認し九
ことから、３５８ＲＮＡプロモ一ター配列とターミネー
タ−配列の間に外来遺伝子を挿入したプラスミドを構築
しこれをヒト培養細胞に導入すると、外来遺伝子を発現
させることが可能であることが挙げられるＯ 〔実施例〕 以下、本発明を実施例によって、より具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例Ｉ　　ＣａＭＶの１９８ＲＮＡプ０％−ター及び
ポリ（Ａ）シグナルを有するベクター、ｐＵＣＰ　２Δ
２Ｔ及びｐＵＣＰ２Δ４Ｔの構築カリフラワーモザイク
ウィルス８株（ＣａＭＶ−Ｓ）　　を制限酵素８ａｌ　
ｌの切＠部位でプラスミドｐＢＲ５２２に挿入したプラ
スミドｐＢＲ−ｃａＭＶ−８を制限酵素ＥｃｏＲ１及び
５ａｕ５Ａｌで切断し、１９ｓプロモーター領域を含む
１８２塩基対のＤＮＡ断片を単離し、これを制限酵素Ｅ
Ｃ０ＲＩ及び８ａｕ５Ａｌで切断したプラスミドＭ１３
ｍｐ８に挿入し、プラスミドＭ１５Ｐ２Ｒ８ｔ−得た。

Ｍ１５Ｐ２Ｅ８　ｔ−８ａｌ　ｌで直鎖状にし、ヌクレ
アーゼＢａｄ　３１によって１９８プロモーターの下流
にめるＡＴＧコドンを除去した後、更ＫｇｃＱＲＩ分解
して１９８プロモーター領域を単離した。この１９Ｂプ
ロモーター領域をＭ１５ｍｐ８に挿入して、ダイデオキ
シ法により塩基配列を決定した。この結果、二種類の１
９８プロモーター領域を含むＤＮＡ断片が得られたこと
がわかり、それぞれＭ１５Ｐ２Ｅ８Δ２及びΔ４とした
。制限酵素Ｈ１ｎｄびＨｌＭ　ｌ　で切断したプラスミ
ドｐＫＣ７（ジーン（（）ｅｎｅ　）第７巻、第７９頁
（１９７９）　）に挿入し、プラスミドｐＫｃＰ２ｇ８
Δ２及びΔ４を得ムｐＫｃ２ｇ８Δ２及びΔ４　′ｆｔ
：Ｈ１Ｍ　１　分解、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌクレ
ノウフラグメント処理によりＨｌＭ　ｌ　　による付着
末端を平滑末端に換え、更にＢｇｌ、　［で切断した後
、　ＣａＭＶ−８ＤＮＡを制限酵素Ａｌｕ　ｌ及びＢｇ
ｌ　１分解して得た５２０塩基対から成る３５８プロモ
ーター及びポリに）シグナルを含む領域を挿入し、　ｐ
ＫｃＰ２Ｅ８Δ２Ｔ及びΔ４’Ｉ’を得た。制限酵素Ｅ
ｃｏＲ１及びＰｖｕ　ＩＩ分解によ、９１？Ｅ！プロモ
ーター及びポリ（Ａ）シグナルを含む領域をｐＫｃＰ２
Ｅ８Δ２Ｔ及びΔ４Ｔから単離し、これを制限酵素ｇｃ
ｏＲ１及びＨｌｎｃ　ｌ　　で切断したプラスミドｐＵ
Ｃ８に挿入し、プラスミドｐＵＣＰ２Δ２Ｔ及びΔ４Ｔ
ｔ−得た。

実施例２　　ｐＵＣＰ２Δ２Ｔ及びΔ４Ｔへのカナマイ
シン耐性遺伝子の挿入 プ２スミドｐＫｃ７Ｑ制限酵素Ｂｇｌ　ｌ及びＳｍａ１
分解し、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ：ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子）を含む領域
を単離し、制限酵素ＢａｍＨｌ及びＳｍａ　ｌ　で切断
したＭｌ　３ｍｐ８に挿入し、プラスミドＭ１３ＫｍＢ
Ｓを得、これをＳａｌ　ｌで直鎖状にした後、Ｂａｌ　
３１によりカナマイシン耐性遺伝子の翻訳開始部の上流
に存在するＡＴＧコドンを除去した。更に１１ｉｃｏＲ
１分解を行いカナマイシン耐性遺伝子を含む領域を単離
し、これをＥｃｏＲｌ及びＳｍａ　ｌで切断したＭｌ　
３ｍｐ　８に挿入して、プラスミドＭ１５ＫｍＢＳΔを
得、これをダイデオキシ法により塩基配列を決定した。

ＢａｍＨｌ及びＢａａ　１分解を行いカナマイシン耐性
遺伝子を含む領域をＭ１５ＫｍＢ８Δから単離し、これ
を制限酵素ＢａｍＨ１及びＨｌｎａ　ｌで切断したｐＵ
ＣＰ２Δ２Ｔ又はΔ４Ｔに挿入し、プラスミドｐＵＣＰ
２Δ２ＴＫ及びΔ４’ｒＫを得た。

ｐＵＣＰ２Δ２’ｌ’Ｋ　ｆ　ＢａｍＨ［分解し、一本
鎖ＤＮＡ部分をヌクレアーゼＳ１により除去し平滑末端
に換え念後、再び環状化させて１９８プロそ一ター領域
とカナマイシン耐性遺伝子との間に存在したＢａｍＨ１
部位が欠落したプラスミドｐＵＣＰ２Δ２ＴＫΔＢｔ−
得た。第１図にｐＵＣＰ２Δ２Ｍ−の模式図を示す。

実施例Ｓ　　ｐＵＣＰ２Δ２Ｔ及びｐＵｃＰ２Δ４Ｔへ
のクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入 プラスミドｐＢＲ５２５ｆ：制限酵素８ａｕ３Ａｌで分
解し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む領域を単
離し、これとＢａｍＨｌで切断したｐＵＣＰ２Δ２Ｔ又
はΔ４Ｔに挿入し、プラスミドｐＵＣＰ２Δ２ＴＣ及び
ｐＵＣＰ２Δ４ＴＣを得た。

実施例４　　ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモーター及び
ポリ（Ａ）シグナルを有するベクター ｐＵＣＰＩＴＫの構築 ＣａＭＶ−８ＤＮＡ　ｆ：Ａｌｕ　ｌ及び３６１１１分
解し、５２０塩基対から成る３５Ｂプロモーター及びポ
リ（Ａ）シグナルを含む領域を単離し、ＢｇｌｌｌＫよ
る付着末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノク７ラ
グメント処理によシ平滑末端に換えた０このＤＮＡ断片
を制限酵素Ｈ１ｎａｌｌで切断したＭ１３ｍｐ８　Ｋ挿
入し、これを耳ｃＱＲＩ及び８ａｕ３Ａ１分解し、３５
Ｂプロモーター及びポリ（Ａ）シグナルを含む領域を単
離した。

プラスミドｐＴＲＡ４０３　　（特開昭４１−１３３５
Ｓ８号公報参照）をＢａｍＨｌ分解し、カナマイシン耐
性遺伝子とその下流にＴ−ＤＮＡ由来のＴｍ１−ポリ（
Ａ）シグナルを持ったＤＮＡ断片を単離し、これを制限
酵素Ａｖａ　１部位が反落し次プラスミドｐＢＲ３２２
のＢａｍＨ１部位に挿入した。

これをＡｖａ　ｌで切断し、ヌクレアーゼＳ１により一
本鎖ＤＮＡ部分を除去して付着末端を平滑末端に換えた
後、再び環状化させて、プラスミドｐＮＰＴ−ポリ（Ａ
）を得た■ ｐＮＰＴ−ポリ（Ａ）を制限酵素ＢａｍＨｌ及びＢａａ
　１分解することによりカナマイシン耐性遺伝子とＴｍ
１−ポリ（Ａ）シグナルを持ったＤＮＡ断片を単離し、
これと先に述ぺた３５Ｓプロモーター及びポリ（Ａ）シ
グナルを含む断片及びプラスミドｐＵＣ１８を１ｉｃｏ
ｎ　ｌ及びＳａｃ　ｌで切断したもの、三者を連結させ
て５５Ｂプロモーターの下流にカナマイシン耐性遺伝子
を持ったＤＮＡ断片がｐＵＣ１８のＲｃｏＲｌとＳａｃ
　１部位の間に挿入されたプラスミド、ｐＵｃＰＩＴＫ
ｌ得念。第２図にｐＵＣＰＩＴＸの模式図を示す。

実施例５　プラスミドｐＵＣＰ２Δ２ＴＣへのＴｍｌ　
−ポリ（Ａ）シグナルを含むカナマイシ ン耐性遺伝子の挿入 プラスミドｐＵＣＰＩ　ＴＫをＢａｍＨｌ及びＥｃｏＲ
ｌ分解し、３５Ｓ１０モーターの下流にカナマイシン耐
性遺伝子及びＴｍ１−ボＩＪ　（Ａ）シグナルを持った
ＤＮＡ断片を単離し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレ
ノクフラグメント処理によ９両末端を平滑末端に転換さ
せた後に、ＢｇｌｌｌＪンカーＤＮＡを付加し、更にＢ
ｇ１１分解を行い、これｔ　Ｂｇｌ　ｍで切断したｐＵ
ＣＰ２Δ２ＴＣＫ挿入し、プラスミドｐＵＫＣを得た。

第３図にｐＵＫＣの模式実施例６　抗生物質耐性遺伝子
のイネ培養細胞への導入 （６−１）　　ＤＮＡカクテルの調製 １２５ｍＭ塩化カルシウム及び１０〜５０μｔのプラス
ミドを含む溶液９００μｔと１５５ｍＭ塩化ナトリウム
、５吐塩化カリウム及び５ｍＭグルコースｔ−含む溶液
１００μｔを混合し、室温で３０分間静置する。

（６−２）　　イネプロトプラストの［１ｒ線照射して
生育させたイネの種子を栽培し、巧を取り朽培養してカ
ルスを形成させる。３００吐塩素酸ナトリウムを含むＭ
８ＡＡ培地（アミノ＃Ｉを含んだムラシゲ−スクーグ培
地）で塩素酸耐性のカルスを選択し、更にアミノ酸培地
では生育可能であるが、硝酸塩ｔ−含んだＭＳ培地では
生育不可能な硝酸還元酵素欠損株を選択し、これを増殖
させてライン化した。このイネ細胞を１３Ｍマンニトー
ル、４％セルラーゼＲ８゜及び１％マセロチームＲ１０
から成る溶液中で２８℃４０分間処理してプロトプラス
ト化する。

（６−３）　　ｐＵＣＰ２Δ２’Ｉ’にΔＢの導入（６
−２）で調製したプロドブ２スト１ｍｇと（，６−１）
の方法で調製したｐＵＣＰ２Δ２ＴＫ−ＤＮＡカクテル
１ｓｇｔ−混合し、室温で２〜３時間静置する。４０　
％　（Ｗ／’Ｖ）ポリエチレングリコール浴ｆｆ１ｔ−
１−加え、かくはんし１０分間静置する。

プロトプラスト培養培地（アミノ酸培地）で３〜５−に
希釈し、遠心分離を行う。沈殿した細胞を培地に懸濁し
、２８℃で１日に１２時間照明を受ける条件で培養を続
ける。３週間後に直径５５−のベトリ皿に移して培養し
、更に１週後に５００μｔ／−のカナマイシンを含むア
ガロース培地で包埋し同一条件で１〜２か月培養し、カ
ナマイシン耐性のコロニーを形成させる。その結果４　
Ｘ　１０”−１の頻度でカナマイシン耐性となった細胞
が得られた０カナマイシン耐性となつ九イネ細胞から抽
出したＤＮＡを用いて分子生物学的手法により解析した
結果について述べるＯ カナマイシン耐性となった９個のコロニー（’Ｉ’Ｐ−
１、−２、−３、−４、−’６、＝’Ｉ　Ｅｉ、−２０
、−３３、及び−５４）からＤＮＡを抽出し、Ｂｇｌｌ
及びＥｃｏＲｌで完全分解した後アガロースゲル電気泳
動を行い、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移し
、サザーシハイプリダイゼーションによる解析を行った
０プローブとしてｐＵＣＰ２Δ２ＴＫΔＢをＢｇｌ　ｌ
及びｇｃｏＲＩ分解して得たカナマイシン耐性遺伝子を
含む約１８００塩基対のＤＮＡ断片を〔α−３”Ｐ）−
ｔｉｃＴＰを用いたニックトランスレーションによＶ標
識したものを使用した。この結果９個のコロニーはいず
れもゲノム内にカナマイシン耐性遺伝子が組込まれてお
り、コピー数は’ｒＰ−５及び−６では数気残りの７個
のコロニーでは１個以下であった。

カナマイシンを含む培地で長期間（４Ｓ８か月）培養を
続けた後、サザーンハイプリダイゼーションを行つ九〇
また、カナマイシン耐性コロニーをカナマイシンを含ま
ない培地に移して４か月培養を続けた後サザーンハイプ
リダイゼーションを行つ念。これらの結果からカナマイ
シン耐性遺伝子は培地中のカナマイシンの有無にかかわ
らず安定にゲノム内に保持されることが明らかになった
。ゲノム当９のカナマイシン耐性遺伝子のコピー数とカ
ナマイシンに対する抵抗性の度合を駒べる目的で、ＴＰ
−２及び−４（１コピー以下）又はＴＰ−３及び−６（
数コピー）の培地中のカナマイシン濃度を変えて培養し
、生育の割合を比較した。

その結果を第５図に示す０すなわち第５図はカナマイシ
ンの濃度（μｆ／−１横軸）と生育度Ｃ１％縦軸）との
関係を示すグラフである。なお、対照例として、カナマ
イシン耐性遺伝子を持たない細胞からの結果を併記する
。

（６−４）　　ｐＵｃＰＩＴＫｏ導入 （６−５）と同様の方法でｐＵＣＰ２Δ２ＴＫΔＢにか
、ｔテＩ）ＵＣＰＩＴＫ　　を導入シタｏ−ｔｏｉｉｓ
ｘ１０−８の頻度でカナマイシン耐性となった細胞が得
られた＠核細胞の゛染色体遺伝子を（６−３）と同様の
方法で解析した結果、カナマイシン耐性遺伝子が染色体
に取込まれていることを確認した。

ｐＵＣＰＩＴＣでも同様の結果を得た。

（６−５）　　ｐｖｘｃの導入 （６−３）と同様の方法でｐＵＣＰ２Δ２ＴＫΔＢにか
えてｐＵＫＣを導入した。その結果プロトプラストｍ胞
１個当りＳ　Ｘ　１０−１の頻度でカナマイシン耐性と
なった細胞が得られた。該細胞の染色体遺伝子ｔ（６−
５）と同様の方法で解析した結果、カナマイシン耐性遺
伝子が染色体に取゛　込まれてｈることを確認した。

実施例７　　ＣａＭＶの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター及
びポリ（Ａ）シグナルを有するベクター ｐＵｃＰＩＴｃの構築 ＣａＭＶ−８ＤＮＡｔ−Ａｌｕ　Ｉ及びＢｇｌ　１分解
し、５２０塩基対から成る３５８ＲＮＡプロモーター及
びポリ（Ａ）シグナルを含む領域を単離し、Ｂｇｌ扇に
よる付着末端を大腸菌ＤＮＡポリメ２−ゼＩクレノウフ
２グメント処理により平滑末端に換えた０このＤＮＡ断
片を制限酵素Ｈ１ｎａｌで切断したＭＬ５ｍｐ８に挿入
した。このプラスミドＤＮＡｔ−８ａｌ１分解後、ヌク
レアーゼＢａｌ　５１によって３５８ＲＮＡプロモータ
ーの下流にあるポＩＪ　（Ａ）シグナルを除去し、更に
ＩｃｏＲＩ分解して３５ＳＲＮＡプロ篭−ター領域のみ
を含むＤＮＡ断片を単離した０ プラスミドｐＵＣＰ２Δ２’Ｉ’Ｃ又はΔ４’ｒＣｔ−
制限酵素８ａｕ５Ａｌ　で分解し、Ｔ４ファージＤＮＡ
ポリメラーゼ処理により付着末端を平滑末端に換えた後
ＥｃｏＲＩ分解によシｔ？５ＲＮＡプロモータ領域を除
去する０このＤＮＡ断片と上記の５５ＳＲＮＡプロモー
ター領域のみを含むＤＮＡ断片とを連結させて、プラス
ミドｐＵｃＰ１’ｌ’ｃを得た。第４図にｐＵＣＰＩ　
ＴＣの模式図を示す。

実施例８　ヒト培養細胞への導入 プラスミドｐｔｙｃｐ１’ｒｃ　ｔ−ヒト培養細胞（ヘ
ラ細胞）に常法に従って導入し、導入後４８〜７２時間
後、細胞抽出液を用いて、１４Ｃで標識されたクロラム
フェニコールを基質とし、クロ２ムフエニコールアセチ
ルトランスフエ２−ゼ活性を常法に従って測定したとこ
ろ、本酵素の活性が認められ九〇 〔発明の効果〕 以上詳細に説明した様に、本発明により単子葉植物であ
るイネ細胞の簡便な形質転換方法が提供された。本発明
方法は主要穀物でめるイネ、トウモロコシへコムギ等の
単子葉植物に外米遺伝子を導入して新しい機能を有する
植物を簡便に創製できる点において顕著な効果を有する
。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は、本発明方法で使用するベクターの１
例の模式図、第５図は本発明及び従来の細胞のカナマイ
シン耐性遺伝子をゲノム内に保持することの有無による
カナマイシンの濃度と生育度との関係を示すグラフであ
る。 特許出願人　農業生物資源研究所長 岡　　賓酒造株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カリフラワーモザイクウィルスの１９Ｓ及び／又は
   ３５Ｓプロモーターを含有するベクターで単子葉植物を
   形質転換することを特徴とする単子葉植物の形質転換方
   法。 ２、該ベクターがカリフラワーモザイクウィルスの転写
   終結シグナルを含有するベクターである特許請求の範囲
   第１項記載の単子葉植物の形質転換方法。 ３、該ベクターがｐＵＣＰ２△２ＴＫ△Ｂである特許請
   求の範囲第２項記載の単子葉植物の形質転換方法。 ４、該ベクターがｐＵＣＰ１ＴＫである特許請求の範囲
   第２項記載の単子葉植物の形質転換方法。 ５、該ベクターがｐＵＫＣである特許請求の範囲第２項
   記載の単子葉植物の形質転換方法。