KR100358532B1 - 니트릴라제유전자프로모터를활성화하는조절인자및그것을코딩하는dna - Google Patents

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Abstract

본 발명은 니트릴라제 유전자 촉진제를 활성화하기 위한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드와 SEQ ID NO:2의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드의 2개 성분으로된 조절인자 및 그 부호화DNA에 관한 것이다. 니트릴라제는 로도코카스속의 미생물내에 촉진제 영역을 함유하는 니트릴라제 유전자와 함께 본 조절인자를 위한 유전자 부호화를 도입합으로써 제조할 수가 있다.

Description

니트릴라제 유전자 프로모터를 활성화하는 조절인자 및 그것을 코딩하는 DNA
본발명은 니트릴라제유전자의 발현에 포함된 조절인자 및 그것을 코딩하는 DNA에 관한 것이며, 특히 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis) SK92균주에서 유래된 조절인자 및 니트릴라제 유전자 프로모터를 활성화하는 조절인자 및 그것을 코딩하는 DNA, 이 DNA를 함유하는 재조합 플라스미드 및 상기 재조합 플라스미드로 형질 전환된 형질 전환체에 관한 것이다.
유기산을 그 대응하는 니트릴류로부터 변환하여 제조하는 종래의 방법으로서는 화학합성 방법과 생물학적 방법을 들 수 있다. 후자에는 니트릴류를 가수분해하는 촉매로서 미생물 또는 미생물 유래 효소를 사용하는 것도 포함되며, 이 방법은유기산을 온화한 조건하에서 제조할 수 있는 장점이 있다. 로도코커스속에 속하는 미생물은 니트릴류를 수화 또는 가수분해하여 대응하는 아미드 또는 유기산을 제조하는데 사용되는 촉매로서 알려져 있다. (일본공개특허 제251,192/1991, 91,189/1987, 470/1990 및 84,198/1990 호 공보참조)
니트릴류의 가수분해에 유전자를 재조합하여 클론화된 니트릴라제 유전자를 사용하면 미생물 중에 동일 유전자의 복수 복사물(multiple copies)을 함유시킬 수 있으므로 니트릴을 수화하는 미생물의 촉매능력을 상기의 종래 방법에 비하여 현저히 향상시킬것으로 기대된다. 이와 같은 높은 촉매활성을 갖는 미생물 촉매를 얻기위하여 본 발명자들은 로도코커스 에리스로폴리스 SK92균주로부터 성공적으로 니트릴라제 유전자를 클로닝하고, 이.콜리(E.coli) 락토스 프로모터의 하류영역에 상기 유전자를 삽입하여 플라스미드를 구성하였다.
이 플라스미드를 도입한 이.콜리는 IPTG(이소프로필-베타-디-티오갈락토시드)의 존재하에 배양하는 동안에 높은 니트릴라제 활성을 나타냈다.
또한, 본 발명자들은 미생물 촉매로서 높은 성능을 얻기위하여 로도코커스속의 형질전환체를 얻으려 시도하였다. 이 시도에서는 니트릴라제 유전자를 로도코커스-이.콜리 하이브리드 플라스미드 벡터(일본국 공개특허 제64,589/1993 및 68,566/1993호 공보참조)에 삽입하고 이렇게 구성된 벡터를 로도코커스속의 미생물체에 도입하였다. 그러나 니트릴라제 활성은 발현되지 않았고, 따라서 로도로커스속 형질전환체에서 니트릴라제 활성을 발현하는 방법이 요구되고 있다.
본 발명자들은 로도코커스속에서 유래된 유전자는 니트릴라제 유전자의 프로모터가 기능하지 못하기 때문에 발현하지 못하며, 프로모터가 기능하기 위해 필요한 조절인자를 코딩하는 유전자가 SK92 유래의 염색체 DNA상의 어디엔가 존재할 것이라 추정하였다.
스크리닝에 의하여 본 발명자들은 그것이 니트릴라제 구조 유전자의 상류영역에 존재한다는 것을 발견하여 로도코커스 형질전환체에서 니트릴라제활성의 발현에 성공하였다.
즉, 본 발명은 2성분 즉 서열번호1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 구성되며, 니트릴라제 유전자 프로모터를 활성화하는 조절 인자 및 그것을 코딩하는 DNA에 관한 것이다.
본 발명의 조절인자를 코딩하는 유전자를, 그의 프로모터를 함유한 니트릴라제 유전자와 함께 도입한 경우에는 로도로커스속의 미생물은 니트릴라제를 제조할 수 있게 된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 다음 단계로 실시한다.
(1) 균주 SK92에서 염색체DNA의 제조 :
염색체 DNA를 로도코커스 에리스로폴리스 SK92로부터 분리한다.
(2) DNA 라이브러리의 구성
염색체 DNA를 제한 효소로 절단하고 목적유전자를 함유한 DNA단편을 SK92의 니트릴라제 유전자를 프로브(probe)로 사용하여 서던하이브리디제이션법에 의하여 검출한다. 이 단편을 이.콜리와 로도코커스속의 세포 내에서 복제할 수 있는 하이브리드 플라스미드 벡터내에 삽입하여 라이브러리를 제조한다.
(3) 이.콜리의 형질전환과 재조합 DNA의 선별 :
단계(2)에서 구성한 재조합체 라이브러리를 사용하여 형질 전환체를 제조한다. 단계 (2)에서 얻은 프로브를 사용하여 콜로니하이브리디제이션법을 실시하여 목적 재조합 DNA를 담지하는 콜로니를 선별한다.
(4) 재조합 플라스미드의 제조 :
플라스미드를 단계(3)에서 얻은 재조합체로부터 제조한다.
(5) 로도코커스속의 미생물의 형질전환과 형질전화체의 니트릴라제 활성 :
생성한 플라스미드를 로도코커스속의 미생물에 도입하여 그 니트릴라제활성을 측정한다.
(6) 결실플라스미드와 니트릴라제 활성 :
결실플라스미드는 단계(4)에서 얻은 플라스미드로부터 여러 영역을 결실시켜 결실플라스미드를 제조하여 니트릴라제구조 유전자의 발현에 필수적인 영역을 특정한다. 제조된 플라스미드는 반드시 이.콜리에서 복제할수 있는 것일 필요는 없으며, 로도코커스속의 세포에서 복제할수 있는 DNA영역만 포함하면 충분하다.
(7) 뉴클리오티드 서열 :
단계(6)에서 특정한 영역의 뉴클리오티드 서열을 결정한다.
상기 하이브리드 플라스미드 벡터로서는 pK1, pK2, pK3 및 pK4를 들 수 있다. 이들 플라스미드를 아르.로도크루스(R.rhodochrous) ATCC12674에 도입하고, 각각 일본 통상산업성공업기술원 생명공학공업기술연구소에
아르.로도크루스ATCC 12674/pK1(FERM BP-3728),
아르.로도크루스ATCC 12674/pK2(FERM BP-3729),
아르.로도크루스ATCC 12674/pK3(FERM BP-3730),
아르.로도크루스ATCC 12674/pK4(FERM BP-3731),
으로서 기탁하였다.(일본공개특허공보 제 68556/1993호 참조)
로도코커스속의 세포를 복제할수 있는 상기 DNA영역으로서는 플라스미드 pRC001, pRC002, pRC003 및 pRC004로부터 유래된 것을 들 수 있으며, 이들은 플라스미드의 전체이어도 좋고, 그 일부의 단편이어도 좋다. 상기 플라스미드는 각각 균주 아르.로도크루스 ATCC4276, ATCC14349, ATCC14348 및 IF03338(일본공개특허 제 68,556/1993호 공보참조)로부터 유래된다.
로도코커스 에리스로폴리스 SK92는 일본국공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM BP 3324로 기탁하고, 니트릴라제 유전자와 조절유전자를 함유하는 플라스미드 pSK108은 이 pSK108을 담지하는 형질전환체 JM109/pSK108(FERM BP-5322)로서 기탁하였다. 상기 균주 SK92는 이미 그 균학적 성질에 의거해서 로도코커스속에 속하는 것으로 동정되었다.(일본국 공개특허 공보 제 280,889/1991호 참조)
이 미생물은 또한 다음의 구체적인 성질에 의거해서 로도코커스 에리스로폴리스로서 동정된다.
시험항목 결과
아데닌의 분해 +
티로신의 분해 +
요소 분해 +
이용물질
이노시톨 +
말토스 -
만니톨 +
람노스 -
소르비톨 +
나트륨메타히드록시-벤조에이트 -
나트륨벤조에이트 +
나트륨시트레이드 +
나트륨락테이드 +
테스토스테론 +
아세트아미드 +
나트륨피루베이트 +
0.02% 나트륨아지드 존재하의 생육 +
10℃ 에서의 생육 +
40℃ 에서의 생육 -
0.01% 크리스털바이오렛 존재하의 생육 -
0.3% 페닐에탄올 존재하의 생육 +
5% NaCl 존재하의 생육 +
7% NaCl 존재하의 생육 +
실시예
이하, 본 발명을 다음 실시예를 참조하여 상세히 설명하나, 그것들이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한 SK92로 부터의 니트릴라제유전자를 클로닝과 이.콜리와 로도코커스에서의 그들의 발현을 참고예로서 설명한다.
(1) SK92로 부터의 염색체DNA의 제조
균주SK92를 MY배지(플리펩톤 0.5%, 박토-효모추출물 0.3%, 박토몰트추출물 0.3%)100㎖중에서 진탕하면서 30℃에서 72시간 배양하였다. 그 세포들을 수확하고 그 펠리트를 4㎖식염-EDTA용액(0.1M EDTA, 0.15M NaCl, pH8.0)에 현탁시키고. 8mg의 리소짐을 현탁액에 가하였다. 현탁액을 진탕하면서 37℃에서 1∼2시간 배양한 다음 냉동시켰다. 다음에 10㎖의 트리스-SDS-용액(1%SDS, 0.1M NaCl, 0.1M 트리스, pH9.0)을 서서히 진탕하면서 가한 다음, 프로테인나제K(머크사제)를 최종농도가 0.1mg가 되도록 가하였다.
이 혼합물을 37℃에서 1시간, 다음에 60℃에서 진탕하면서 배양하였다. TE(TE : 10mM트리스, 1mM EDTA, pH8.0)로 포화된 등량의 페놀을 혼합물에 가하고, 교반후 원심분리하였다. 2배이상 양의 에탄올을 상부층에 가하고 유리봉을 사용하여 DNA를 회수하였다. 이어서 90%, 80%, 및 70%에탄올로 페놀을 제거하였다. 다음에 DNA를 3㎖ TE버퍼중에 용해하고 리보뉴클리아제A 용액(미리 100℃에서 15분간 가열처리함)을 10㎍/㎖의 양으로 가하였다. 혼합물을 진탕하면서 37℃에서 30분간 배양한 다음, 프로테인아제K를 가하였다. 혼합물을 진탕하면서 37℃에서 30분간 배양하였다. 이 혼합물에 등량의 TE-포화페놀을 가한다음, 원심분리하여 상부층과 하부층으로 분리하였다. 상부층을 같은 조작으로 2회 처리하고 나서, 4%이소아밀알콜을 함유하는 등량의 클로로포름으로 같은 추출 조작을 하였다 (이 조작을 이하 페놀처리라 한다)
다음에 2배이상 양의 에탄올을 상부층에 가하고 유리봉으로 DNA를 회수함으로써 염색체 DNA를 얻었다.
(2) DNA라이브러리의 구성
균주 SK92로부터의 니트릴라제유전자를 함유하는 DNA단편을 pUC118 벡터에 삽입함으로써 제조한 10㎍의 플라스미드 pSK002(참고예 참조)를 2㎕의 제한효소 Sac I. 10㎕의 반응버퍼(10배 농도) 및 78㎕의 멸균수의 혼합물로 37℃에서 2시간 소화하고, 소화물을 0.7% 아가로스겔상에서 전기영동시켜서 길이 1.1kb의 Sal I단편을 분리하였다.
한편, 단계(1)에서 얻은 SK92로부터의 염색채DNA를 Eco RI로 소화시키아가로스겔상에서 전기영동시키고 상기 1.1kb Sal I단편을 DIG DNA표지키트(베링거맨하임)을 사용하여 표지하고 이것을 프로브로 사용하여 서던하이브리디제이션법(서던 E. M. Mol Bionl, 98,503(1975)에 의하여 약 14Kb DNA 단편을 검출하였다. 프로브와 하이브리다이즈된 14Kb단편을 함유하는 DNA분획을 아가로스겔로부터 잘라낸 다음, 별도로 제조한 Eco RI 으로 전단한 하이브리드플라스미드 벡터 pK4(로도코커스속 유래의 플라스미드 pRC004와 이.콜리 유래의 벡터 pHSG299를 함유하는 FERM BP-3731)(일븐국공개특허 제 64,589/1933공보와 68,566/1993호 공보참조)내에 삽입하였다.
벡터로서 사용하는 상기 pK4단편을 다음과 같이 제조하였다. 10㎕의 반응버퍼(10배 농도), 77㎕의 멸균수와 2㎕ 제한효소 Eco RI를 10㎕의 벡터 pK4에 가하였다. 그 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음 페놀로 처리하고 에탄올로 침전 시킨후 건조하고 50㎕ 멸균수에 용해시켰다. 이것에 1㎕ 의 알칼린 포스파타제(타카라주조(주)), 10㎕의 반응버퍼(10배 농도) 및 39㎕의 멸균수를 가하였다. 이 혼합물을 65℃에서 반응시키고 페놀로 처리하고, 에탄올로 침전시킨 후 건조하고 멸균수에 용해시킨다.
이와 같이 14Kb단편을 함유하는 1㎕의 상기 DNA분획을 리게이션키드(타카라주조(주))를 사용하여 4℃에서 하루밤 반응시켜, 상기 Eco RI-절단 pK4에 삽입하여 DNA라이브러리를 제조하였다.
(3) 이.콜리의 형질전환과 재조합DNA의 선별
이.콜리 JM109(타카라주조(주)제)를 1㎖의 LB배지(1%박토-트립톤추출물, 0.5%박토효모추출물, 0.5% NaCl)에 접종하여 37℃에서 5시간 동안 예비 배양하였다. 배양물 100㎕를 50㎖의 SOB배지(2%박토-트립톤, 0.5%박토효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO4, 1mM MgCl2)에 접종하고, 18℃에서 20시간동안 배양하였다. 세포를 원심분리하여 회수하고 펠리트를 13㎖ 냉TF용액(20mM PIPES-KOH, pH6.0, 200mM KCl, 10mM CaCl2, 40mM MnCl2)중에 현탁시킨 다음 0℃에서 10분간 방치한 다음 다시 원심분리 하였다.
상등액을 제거한후 이.콜리 펠리트를 3.2㎖의 냉TF용액중에 현탁하고 0.22㎖의 디메틸설폭시드를 가하였다. 현탁물을 0℃분간 방치하였다.
단계(2)에서 제조한 재조합 플라스미드(DNA라이브러리)10㎕을 이렇게 제조한 200㎕의 콤페텐트 세포(competent cell)에 가하였다.
혼합물을 0℃에서 30분간 배양한 다음 42℃에서 30초간 가열 쇼크(heat-shock)하고 0℃에서 2분간 냉각하고, 0.8㎖의 SOC배지(2%박토-트립톤, 0.5%박토-효모추출물, 20mM 포도당, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO4, 1mM MgCl2)을 가하였다.
이 혼합물을 진탕하면서 37℃에서 60분간 배양하였다.
배양물을 100㎍/㎖암피실린을 함유하는 LB한천 배지의 플레이트에 플레이트당 200㎕의 양으로 도말하였다. 이 플레이트를 37℃에서 배양하였다. 플레이트상에서 생육한 균주로부터 니트릴라제유전자를 담지하는 형질 전환체는 다음과 같은 방법으로 콜로니하이브리디제이션법에 의해 선별하였다. 플리이트상에서 생육한 콜로니를 나일론박막(닛폰폴에서 제조한 바이오다인 A)에 옮겨서 미생물을 용해하여 DNA를 박막상에 고정시킨 다음, 단계(2)에서 구성한 프로브(1.1Kb단편)로 하이브리드화 한 다음, 목적재조합 DNA를 함유하는 콜로니를 DIG형광검출키트(베링거맨하임)을 사용하여 선별한다.
(4) 재조합 플라스미드의 제조
단계(3)에서 선택한 형질전환체를 LB배지 100㎖중에서 37℃에서 하루밤 배양하고 세포를 수확해서 멸균수로 세척하였다. 5㎖의 용액I(2mM 포도당, 10mM DETA,25mM트리스-HCl버퍼, pH8.0)과 25mg라이소자임을 세포에 가하고, 0℃에서 30분간 방치하였다. 여기에 10㎖의 용액 II(1N NaOH, 5% SDS)를 가하고 혼합물을 0℃에서 5분간 방치하였다. 여기에 7.5㎖의 용액 III(3M 나트륨아세테이트, pH4.8)을 가하고 혼합물을 0℃에서 30분간 방치한 다음 원심분리 하였다.
그 상등액에 50㎖의 에탄올을 가하였다. 이것을 다시 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 여기에 5㎖의 용액 IV(10mM, 나트륨아세테이트, 50mM 트리스-HCl버퍼, pH8.0)과 2.5㎕의 10mg/㎖ 리보뉴클레아제 A를 가하였다. 혼합물을 실온에서 20분간 방치한 다음 12㎖의 에탄올을 가하였다. 그 후 원심분리 후 건조하고, 멸균수에 용해시켰다.
(5) 로도코커스속 미생물의 형질전환 및 형질전환체의 니트릴라제 활성대수증식기 중의 로도코커스 로도크루스 ATCC12674를 원심분리하여 수확하고 빙냉멸균수로 3회 세척하여 멸균수에 현탁시켰다. 단계(4)에서 얻은 1㎍의 플라스미드 pSK104를 10㎕의 세포현탁액과 혼합하고 혼합물을 빙냉하였다. DNA와 미생물의 혼합물을 전기천공장치(electroporation apparatus)CET-200(제펜스펙트로스코픽(주))의 쳄버에 도입하고 시료를 3.8KV/cm의 전장강도와 1ms의 펄스폭으로 20회 펄스처리시켰다. 이렇게 처리한 세포현탁액을 10분간 얼음위에 놓고 37℃에서 10분간 가열쇼크 하였다.
500㎕의 MYK배지(0.5%폴리펩톤, 0.3%박토-몰트추출물, 0.3%박토-효모추출물, 0.2%KH2PO4, 0.2%K2HPO4(pH7.0))을 여기에 가하였다. 다음에 세포현탁액을 진탕하면서 26℃에서 3시간 동안 배양하였다. 현탁액을 75㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 MYK한천플레이트상에 도말하고 26℃에서 3일간 배양했다.
생성한 로도코커스속 형질전환체를 50㎍/㎖카나마이신 함유 10㎖ MYK배지에 접종하고 30℃에서 24시간 동안 예비배양하였다. 이 배양물 1㎖를 유도물질로서 1.5% 에틸렌시아노하이드린(ECH) 및 75㎍/㎖카나마이신을 함유하는 100㎖의 GGP배지(1.5%포도당, 0.1%박토-효모추출물, 1.0%글루타민산 나트륨, 0.05% KH2PO4, 0.05% K2HPO4, 0.05% MgSO47H2O, (pH7.2)에 가하였다. 미생물을 30℃에서 48시간동안 배양해서 수확하고 그 펠리트를 50mM 포스페이트 버퍼 pH7.7에 현탁시키고, 현탁액의 일부를 100mM 아크릴로니트릴을 함유하는 50mM 포스페이트 버퍼, pH7.7중에서 30℃, 20분간 반응시켰다. 1N HCl을 가하여 반응을 중단시키고 반응용액 중에 형성된 아크릴산의 양을 고속 액체크로마토그래피(HPLC)에 의하여 측정하였다.
그 결과, 형질 전환체 ATCC12674/pSK104중에 8mM 아크릴산이 형성된 것을 확인할수 있었다. 이것은 니트릴라제의 발현에 필요한 조절인자를 코딩하는 유전자가 니트릴라제 구조 유전자의 상류 또는 하류에 존재한다는 것을 나타낸다.
(6) 결실플라스미드 및 니트릴라제 활성
pSK104는 니트릴라제의 발현에 필요하지 않는 다수의 영역을 아직 함유하고 있는 것으로 추정되므로, 여러 가지 결실플라스미드를 제조하여 결실플라스미드로 형질전환된 미생물의 니트릴라제활성을 조사하였다. (표1, 제1도)
표1 결실플라스미드 및 아크릴산형성
표에서 명백한 바와 같이 ATCC12674/pSK108(6.2Kb Hind III-EcoRV단편)(제2도)는 니트릴라제 활성이 높음을 알 수 있다. 추가로 결실플라스미드를 구성하여 조절인자를 코딩하는 유전자를 조사하였다. 그 결과, 유전자는 니트릴라제 구조 유전자로부터 먼 상류 영역(약 3Kb Bam HI-EcoRV 단편)에 위치하고 있음을 나타내었다.
(7) 뉴클리오티드 서열
단계 (6)에서 나타난 니트릴라제 발현에 필수적인 조절인자를 코딩하는 유전자의 서열을 형광 시퀸서 ALF II(파마시아)를 사용하여 결정하였다. 서열 분석결과 서열번호 5의 뉴클리오티드 서열 ; 서열번호 1과 2의 아미노산 서열을 각각 코딩하는 2개의 오픈 리딩프레임이 존재한다는 것을 발견하였다. 아미노산 서열 데이터 베이스 NBRF(일본국 생화학 연구소)와 비교해 보면 이 조절인자는 2성분 조절계에 속하는 것으로 추측된다. 이들 오픈 리딩 프레임의 뉴클리오티드 서열은 서열번호 3과 4에 나타낸다.
참고예
(1) 균주 SK92로부터의 염색체 DNA의 제조
SK92로부터 염색체 DNA를 실시예, 단계(1)과 같은 방식으로 제조하였다.
(2) 프로브의 제조 및 DNA라이브러리의 구성
기질로서 10㎕의 DNA(20-배로 희석한), 10㎕의 반응 버퍼(10배의 농도), 4㎕의 5mM dNTP, 프라이머＃1(아미노산 서열NCWEHFG에 대응하는 20뉴클리오티드)으로서 5' -AACTGCTGGGA(AG)CACTTCCA-3' 와 프라이머＃2(아미노산 서열 DPVGHYS에 대응하는 20뉴클레오티드)로서 5' -GA(AG)TA(AG)TG(AG)CC(CG)AC(ACTG)GG(AG)TC-3' 를 각각 5㎕(500pmol) 및 Tth DNA 폴리머라제(토요보세끼)1㎕를 함유하는 100㎕용액을 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(Polymerase chain Reactin)을 실시하였다.
상기 2개의 프라이머는 공지의 여러 가지 니트릴라제와 상동성(homology)이 높은 아미노산 서열에 의거해서 제조하였다. 93℃에서 30초간(변성단계), 45℃에서 30초간(어닐링단계) 및 72℃에서 2분간(신장단계)시료를 배양하는 것을 1회로 하여 50회 반응시켰다. 이 반응용액으로부터 SK92로부터의 니트릴라제를 코딩하는 410bpDNA단편을 얻었다. 이 DNA단편을 DIG DNA포지키드(베링거맨하임)을 사용하여 표지하여 프로브로 하였다.
10㎕의 반응버퍼(10배의 농도), 37㎕의 멸균수와 3㎕의 제한효소 Sal I를 SK92로부터의 염색체 DAN 50㎕에 가하였다. 혼합물을 37℃에서 2시간 반응시킨 다음에 에탄올로 침전시켜, 아가로스겔상이서 전기영동하였다. 1.1kb부근의 DNA단편을 DNA PREP(DIA-IATRON)을 사용하여 회수하였다. 이 DNA단편을 리게이션키트(타카라주조(주))를 사용하여 이.콜리벡터 pUC118의 Sal I 부위에 삽입하여 재조합 DNA라이브러리를 제조하였다.
상기 pUC118 단편은 다음과 같이 제조하였다.
10㎕의 반응버퍼(10배의 농도), 77㎕의 멸균수 및 2㎕의 제한효소 Sal I을 10㎕의 pUC118에 가하였다.
혼합물을 37℃에서 2시간 반응시킨후 페놀로 처리하고 에탄올로 침전시켜 건조하고 50㎕의 멸균수에 용해하였다. 여기에 1㎕의 알칼린 포스파타제(타마라주조(주)), 10㎕의 반응버퍼(10배농도) 및 39㎕의 멸균수를 가하였다. 시료용액을 65℃에서 반응시키고 페놀로 처리하고, 에탄올로 침전, 건조하고 멸균수에 용해하였다.
(3) 이.콜리의 형질전환체 및 재조합 DNA의 선별
이.콜리 JM109의 콤페텐트 세포를 실시예 단계(3)과 같은 방식으로 제조하였다. 단계(2)에서 제조한 재조합 플라스미드를 함유하는 10㎕용액(DNA라이브러리)를 콤페텐트 세포 200㎕에 가하였다. 이 세포를 0℃에서 30분간 방치한 다음 42℃에서 30초간 열쇼크하여 0℃에서 2분간 냉각하였다. 이것에 0.8㎖의 SOC배지를 가하고진탕하면서 37℃에서 60분간 세포를 배양하였다. 배양물을 100㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB한천배지의 플레이트에 플레이트당 200㎕의 양으로 도말한 다음 37℃에서 배양하였다. 한천배지상에서 생육한 콜로니로부터의 니트릴라제 유전자를 담지하는 형질전환체는 다음과 같은 방식으로 콜로니하이브리디제이션법에 의해 선별하였다.
한천배지상에서 생육한 형질전환체를 나일론박막(폴(주)제 바이오다인 A)에 옮겨서 용해하여 DNA를 고정하였다. DNA를 단계(2)에서 제조한 프로브(410bP단편)로 처리하여 목적재조합 DNA를 함유하는 콜로니를 DIG형광검출키트(배링거맨하임)를 사용하여 선별하였다.
(4) 재조합 플라스미드의 구성과 제한효소지도의 작성
단계(3)에서 선택한 형질전환체를 실시예, 단계(4)와 같은 방식으로 처리하였다. 이렇게하여 얻은 재조합 플라스미드 pSK002를 및 개의 제한효소로 절단하여 제한효소지도를 작성하였다.
(5)형질전환된 이.콜리에 의한 니트릴라제의 생산과 니트릴의 산으로 변환
JM109/pSK002균주를 50㎕/㎖ 암피실린을 함유하는 1㎖의 2×YT배지(1.6%박토-트립톤, 1.0%박토, 효모추출물, 0.5%NaCl)에 접종하고 37℃에서 8시간 동안 배양하였다.
1㎖의 배양물을 50㎕/㎖암피실린과 1mM IPIG를 함유하는 100㎖의 2×YT배지에 접종하고, 37℃에서 14시간동안 배양하였다. 수확후에 미생물을 50mM의 포스페이트버퍼 pH7.7에 현탁하고 현탁액의 일부를 100mM 아크릴로노트릴을 함유하는 50mM 포스페이트버퍼 pH7.7에서 30℃, 30분간 반응시켰다.
1N HCl을 가하여 반응을 중단시키고 반응응액내에 형성된 아크릴산의 양을 HPLC 으로 측정하였다. 이 대조시험에서는 형질전환전의 균주 JM109를 사용하였다. 그 결과, 숙주 JM109에서는 아크릴산이 검출되지 않는 반면에 형질전환체 JM109/pSK002에서는 18mM의 아크릴산의 형성이 확인되었다.
(6)니트릴라제유전자를 함유하는 DNA단편을 하이브리드플라스미드벡터에 도입
니트릴라제 구조 유전자 및 그 프로모터를 함유한 것으로 추측되는 DNA 단편(5.8 kb BgIII-Hind III 단편)을 하이브리드 플라스미드벡터 pk4내로 클로닝하여 플라스미드 pSK120을 구성하였다.
(7) 로도코커스속 미생물의 형질전환과 형질전환체의 니트릴라제 활성
대수 증식기중의 로도코커스 로도크루스 ATCC12674를 원심분리로 수확하고 빙냉 멸균수로 3회 세척하여 멸균수에 현탁하였다. 1.0㎍의 세포현탁액을 단계(6)에서 얻은 1㎍의 플라스미드 pSK 120과 혼합하고, 이 혼합물을 빙냉하였다. 이 DNA와 미생물의 혼합물을 유전자 도입장치 CET-200(닛뽄분꼬)의 챔버내로 도입하고 시료를 3.8KV/cm의 전장강도와 1ms의 펄스폭으로 20회 펄스시켰다. 이렇게 처리한 세포 현탁액을 10분간 얼음위에 재치하고 37℃에서 10분간 가열쇼크를 가하였다. 500㎕의 MYK배지를 현탁액에 가하고 혼합물을 진탕하면서 26℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양물을 75㎕/㎖카나마이신을 함유하는 MYK한천배지의 플레이트에 도말하고 26℃에서 3일간 배양하였다. 이렇게하여 얻은 로도코커스속의 형질전환체를 50㎕/㎖의 카나마이신을 함유하는 10㎖ MYK배지에 접종하고 30℃에서 24시간 동안 예비배양하였다. 배양물 1㎖을 75㎕/㎖의 카나마이신을 함유하는 100㎖의 GGP배지에 가하였다. 여기에 유도물질로서 1.5% ECH를 가하였다. 이 형질전환체를 30℃에서 48시간 동안 배양한 다음 회수후 세포를 50mM 포스페이트 버퍼, pH7.7에 현탁시키고 그 니트릴라제 활성을 단계(5)와 같은 방식으로 조사하였으나 아무런 활성도 발견되지 않았다.
서 열 표
서열번호 : 1
길이 : 244
형 : 아미노산
토플로지 : 직쇄
분자형 : 단백질
기원
생물명 : 로도코커스 에리스로폴리스
주명 : SK 92
서열번호 : 2
길이 : 531
형 : 아미노산
토플로지 : 직쇄
분자형 : 단백질
기원
생물명 : 로도코커스 에리스로폴리스
주명 : SK 92
서열 :
서열번호 : 3
길이 : 735
형 : 핵산
쇄형 : 2중
토플로지 : 직쇄
기원
생물명 : 로도코커스 에리스로폴리스
주명 : SK 92
서열 :
서열번호 : 4
길이 : 1605
형 : 헥산
쇄형 : 2중
토플로지 : 직쇄
기원
생물명 : 로도코커스 에리스로폴리스
주명 : SK 92
서열 :
서열번호 : 5
길이 : 2336
형 : 핵산
쇄형 : 2중
토플로지 : 직쇄
기원
생물명 ; 로도코커스 에리스로폴리스
주명 : SK 92
서열 :
제1도는 결실플라스미드 (deletion plasmid)의 개략도이고, 도면 중 SK92로 부터의 DNA단편(fragment)상의 화살표는 본발명의 조절인자를 코딩하는 유전자 및 니트릴라제를 코딩하는 유전자의 위치와 방향을 나타낸다.
제2도는 재조합 플라스미드 pSK108의 제한효소지도.

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 2개성분으로 되며, 니트릴라제 유전자 프로모터를 활성화하는 조절인자 및 그것을 코딩하는 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 서열번호 3 및 4의 뉴클리오티드 서열을 갖는 조절인자 및 그것을 코딩하는 DNA.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 니트릴라제 유전자 프로모터의 활성화를 니트릴의 존재하에서 증대시키는 조절인자 및 그것을 코딩하는 DNA.
  4. 제1항 또는 제2항의 조절인자를 코딩하는 DNA, 프로모터영역을 포함하는 니트릴라제유전자 및 로도코커스속에 속하는 미생물의 세포내에서 복제할 수 있는 DNA영역을 포함한 재조합 플라스미드.
  5. 제4항에 있어서, 로도코커스속에 속하는 미생물의 세포내에서 복제하는 DNA영역을 플라스미드 pRC001, pRC002, pRC003과 pRC004로부터 선택(select)한 재조합 플라스미드.
  6. 제4항의 재조합플라스미드에 의해 형질전환된 로도코커스속에 속하는 미생물.
  7. 제3항의 조절인자를 코딩하는 DNA, 프로모터영역을 포함하는 니트릴라제유전자 및 로도코커스속에 속하는 미생물의 세포내에서 복제할 수 있는 DNA영익을 포함한 재조합 플라스미드.
  8. 제5항의 재조합플라스미드에 의해 형질전환된 로도코커스속에 속하는 미생물.
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