JPH08173169A - ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する
作用を有し配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドの２成分より構成される調節因子およびそれらをコ
ードする遺伝子ＤＮＡ。 【効果】本調節因子をコードする遺伝子をプロモーター
領域を含むニトリラーゼ遺伝子とロドコッカス属菌体内
に共存させることにより、ニトリラーゼの生産が可能と
なる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ニトリラーゼ遺伝子の
発現に関わる調節因子およびそれらをコードする遺伝子
ＤＮＡに関する。詳しくは、ロドコッカス エリスロポ
リス（Rhodococcus erythropolis）ＳＫ９２株に由来
し、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用
を有する調節因子およびそれらをコードする遺伝子ＤＮ
Ａとこれらの遺伝子ＤＮＡを含む組換え体プラスミドお
よび該組換え体プラスミドにより形質転換させた形質転
換体に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ニト
リル化合物から対応する有機酸を製造する方法として
は、化学合成的手法と生物学的手法が知られている。生
物学的手法では、微生物あるいは微生物由来の酵素をニ
トリル化合物の加水分解触媒とするため、温和な条件で
有機酸を生成させることができるという利点がある。ロ
ドコッカス属に属する微生物は、ニトリル類を水和また
は加水分解して対応するアミドまたは有機酸を生産する
ための微生物触媒として知られている（特開平3-251192
号、特開昭62-91189号、特開平2-470 号および同2-8419
8 号各公報参照）。

【０００３】遺伝子組換えの方法でクローン化されたニ
トリラーゼ遺伝子によるニトリルの加水分解では、菌体
内に同遺伝子を多コピー存在させることができるため、
微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させ
ることが期待できる。本発明者らはより高い触媒活性を
持つ微生物触媒を調製する目的で、ロドコッカス エリ
スロポリス ＳＫ９２株のニトリラーゼ遺伝子をクロー
ニングし、大腸菌ラクトースプロモーターの下流に本遺
伝子を挿入したプラスミドを作製した。本プラスミドを
導入した大腸菌はＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトシド）存在下で培養することにより高いニト
リラーゼ活性を示した。さらに、微生物触媒として利用
する場合に、より機能性のよいロドコッカス属細菌組換
え体を作製した。すなわち、ニトリラーゼ遺伝子をロド
コッカス属−大腸菌複合プラスミドベクター（特開平5-
64589 号および同5-68566 号公報参照）に組み込み、ロ
ドコッカス属細菌に導入した。しかしながら、ニトリラ
ーゼ活性は発現せず、ロドコッカス属細菌組換え体にお
いて発現させるための方法が望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ロドコッ
カス属において発現が認められないのはニトリラーゼ遺
伝子のプロモーターが機能しておらず、プロモーターが
機能するために必要な調節因子をコードする遺伝子がＳ
Ｋ９２株染色体ＤＮＡ上のどこかに存在するのではない
かと考えた。探索の結果、ニトリラーゼ構造遺伝子の上
流にその存在を見い出し、ロドコカッス属細菌組換え体
においてニトリラーゼ活性を発現させ、本発明を完成す
るに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、ニトリラーゼ遺伝子
プロモーターを活性化する作用を有し、配列番号１のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号２のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドの２成分より構成され
る調節因子およびそれらをコードする遺伝子ＤＮＡ、で
ある。

【０００６】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
は、下記の工程により実施されるものである。 (1) ＳＫ９２株染色体ＤＮＡの調製 ロドコッカス エリスロポリス ＳＫ９２株より染色体
ＤＮＡを分離、調製する。

【０００７】(2) ＤＮＡライブラリーの作製 染色体ＤＮＡを制限酵素で切断後、サザンハイブリダイ
ゼーション法により目的遺伝子を含有するＤＮＡ断片画
分をＳＫ９２株ニトリラーゼ遺伝子をプローブとして用
いて検出する。この画分を大腸菌およびロドコッカス属
細菌の細胞内で複製増殖可能な複合プラスミドベクター
に挿入しライブラリーとする。

【０００８】(3) 大腸菌形質転換体の作製および組換え
体ＤＮＡの選別 工程(2) で作製された組換え体ライブラリーによる大腸
菌形質転換体を作製し、その中から工程(2) で作製した
プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法に
より目的の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体を選別す
る。

【０００９】(4) 組換え体プラスミドの調製 工程(3) で作製された組換え体よりプラスミドを調製す
る。

【００１０】(5) ロドコッカス属細菌の形質転換および
形質転換体のニトリラーゼ活性 得られたプラスミドによりロドコッカス属細菌を形質転
換し、ニトリラーゼ活性を測定する。

【００１１】(6) 欠失プラスミドとニトリラーゼ活性 工程(4) で得られたプラスミドから種々の領域を除いた
プラスミドを作製し、ニトリラーゼ構造遺伝子領域以外
の部分で発現に必須な領域を特定する。ここで作製する
プラスミドは必ずしも大腸菌細胞内で複製増殖可能であ
る必要はなく、ロドコッカス属に属する細菌細胞内で複
製増殖可能なＤＮＡ領域を含んでいればよい。

【００１２】(7) 塩基配列の決定 工程(6) で特定された領域について塩基配列を決定す
る。

【００１３】なお、複合プラスミドベクターとしては、
ｐＫ１、ｐＫ２、ｐＫ３およびｐＫ４が挙げられる。こ
れらのプラスミドはロドコッカス ロドクロウス ＡＴ
ＣＣ１２６７４に導入され、R. rhodochrous ATCC 1267
4/pK1 （ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２８）、R. rhodochrous
ATCC 12674/pK2 （ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２９）、R. r
hodochrous ATCC 12674/pK3 （ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３
０）およびR. rhodochrous ATCC 12674/pK4 （ＦＥＲＭ
ＢＰ−３７３１）として工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている（特開平5-68556 号公報参
照）。

【００１４】また、ロドコッカス属に属する細菌細胞内
で複製増殖可能なＤＮＡ領域としては、プラスミドｐＲ
Ｃ００１、ｐＲＣ００２、ｐＲＣ００３およびｐＲＣ０
０４から選ばれるプラスミド由来のものが用いられ、こ
れらはプラスミド全体であってもよく、或いは一断片で
もよい。上記プラスミドはそれぞれロドコッカス ロド
クロウス ＡＴＣＣ ４２７６、ＡＴＣＣ １４３４
９、ＡＴＣＣ １４３４８およびＩＦＯ ３３３８株由
来である（特開平5-68556 号公報参照）。

【００１５】ロドコッカス エリスロポリス ＳＫ９２
株はＦＥＲＭ ＢＰ−３３２４として、また、ニトリラ
ーゼ遺伝子および調節遺伝子を含むプラスミドｐＳＫ１
０８は、これを含有する形質転換体 ＪＭ１０９／ｐＳ
Ｋ１０８（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５６９）として工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている。ＳＫ９２
株はその菌学的性質よりロドコッカス属と同定されてい
たが（特開平3-280889号公報参照）、さらに、以下の詳
細な菌学的な性質より、ロドコッカス エリスロポリス
と同定された。

【００１６】 試験項目 試験結果 アデニン分解 ＋ チロシン分解 ＋ 尿素分解 ＋ 資化性 イノシトール ＋ マルトース − マンニトール ＋ ラムノース − ソルビトール ＋ m-ヒドロキシ−安息香酸ナトリウム − 安息香酸ナトリウム ＋ クエン酸ナトリウム ＋ 乳酸ナトリウム ＋ テストステロン ＋ アセトアミド ＋ ピルビン酸ナトリウム ＋ 0.02% アジ化ナトリウム存在下での生育 ＋ １０℃での生育 ＋ ４０℃での生育 − 0.001%クリスタルバイオレット存在下での生育 − 0.3%フェニルエタノール存在下での生育 − 5%NaCl存在下での生育 ＋ 7%NaCl存在下での生育 ＋

【００１７】以下、実施例により詳細に説明する。ただ
し、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。なお、参考例として、ＳＫ９２株ニトリラーゼ遺
伝子のクローニングと大腸菌およびロドコッカス細菌に
おける発現についても明記する。

【００１８】

【実施例】

(1) ＳＫ９２株染色体ＤＮＡの調製 ＳＫ９２株を１００ｍｌのＭＹ培地（０．５％ポリペプ
トン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクト
モルトエキス）中、３０℃にて７２時間振盪培養した後
集菌し、この菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．
１ＭＥＤＴＡ、０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）４ｍ
ｌに懸濁しリゾチーム８ｍｇを加えて３７℃で１〜２時
間振盪した後凍結した。次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−Ｓ
ＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１ＭＮａＣｌ、０．１ＭＴｒ
ｉｓ（ｐＨ９．０）を穏やかに振盪しながら加え、さら
にプロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度０．１ｍｇ）
を加え３７℃で１時間振盪後、さらに６０℃で振盪し
た。次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加え撹拌後（Ｔ
Ｅ：１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０））遠心し、上層をとり２倍量のエタノールを加えた
後、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％、８０％、７
０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。次
に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌク
レアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の加熱処理済）を
１０μｇ／ｍｌになるよう加え３７℃で３０分間振盪し
た。さらにプロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振
盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加え遠心し上層
と下層に分離させた。上層についてこの操作を２回繰り
返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコ
ール含有）を加え同様の抽出操作を繰り返した（以後、
この操作をフェノール処理と呼ぶ）。その後、上層に２
倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻きとり回
収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。

【００１９】(2) ＤＮＡライブラリーの作製 ＳＫ９２株ニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片がｐＵ
Ｃ１１８ベクターに組み込まれたプラスミドｐＳＫ００
２（参考例参照）を制限酵素ＳａｌＩで切断後、１．１
ｋｂのＳａｌＩ断片を０．７％アガロース電気泳動によ
り分離し、ゲルより切り出し回収した。制限酵素による
切断は以下のように行った。ｐＳＫ００２１０μｌに対
し１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７８μ
ｌ、制限酵素ＳａｌＩ２μｌを加え３７℃にて２時間反
応させた。ＳＫ９２株染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩにより
切断した標品についてアガロース電気泳動を行った。
１．１ｋｂＳａｌＩ断片をDIG DNA Labeling Kit（ベー
リンガー・マンハイム株式会社）を用いて標識し、これ
をプローブとしてサザンハイブリダイゼーション法（So
uthern E.M.,Mol.Bionl.98 503(1975)）により約１４ｋ
ｂのＤＮＡ断片を検出した。プローブとハイブリダイズ
した１４ｋｂ断片を含むＤＮＡ断片分画分をアガロース
ゲルより切り出し、ＥｃｏＲＩで切断した複合プラスミ
ドベクターｐＫ４〔ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３１：ロドコ
ッカス属プラスミドｐＲＣ００４と大腸菌ベクターｐＨ
ＳＧ２９９を連結させたもの（特開平5-64589 号および
同5-68566 号公報参照）〕へ挿入した。ベクターに用い
たｐＫ４断片は次のように作製した。ｐＫ４１０μｌに
対し１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７７μ
ｌ、制限酵素ＥｃｏＲＩ２μｌを加え３７℃で２時間反
応後、フェノール処理、エタノール沈澱させた後乾燥し
て５０μｌの滅菌水に溶解した。さらにアルカリフォス
タファーゼ（宝酒造株式会社）１μｌ、１０倍濃度緩衝
液１０μｌ、滅菌水３９μｌを加え６５℃で反応後、フ
ェノール処理、エタノール沈澱を行い乾燥して滅菌水に
溶解した。１４ｋｂ断片を含むＤＮＡ断片画分１μｌ
を、上記のように調製したＥｃｏＲＩ切断ｐＫ４とライ
ゲーションキット（宝酒造株式会社）を用いて４℃で一
晩反応させることによりｐＫ４への挿入を行い、ＤＮＡ
ライブラリーとした。

【００２０】(3) 形質転換体の作製および組換え体ＤＮ
Ａの選別 大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％バクトトリプト
ン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣ
ｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間前培養し、この培養
物１００μｌをＳＯＢ培地（２％バクトトリプトン、
０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭＮａＣｌ、
２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄ 、１ｍＭＭｇＣｌ
₂ ）５０ｍｌに加え、１８℃で２０時間培養した。遠心
により集菌した後、冷１３ｍｌＴＦ溶液（２０ｍＭＰＩ
ＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭＫＣｌ、１
０ｍＭＣａＣｌ₂ 、４０ｍＭＭｎＣｌ₂ ）を１３ｍｌ加
え、０℃で１０分放置後、再度遠心した。上澄を除いた
後、沈澱した大腸菌に冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し
０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え０℃で１０
分間放置した。こうして作製したコンピテントセル２０
０μｌに工程(2) で作製した組換え体プラスミドを含有
する溶液（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃
で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与
え０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、２０ｍＭグルコ
ース、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭ
ｇＳＯ₄ 、１ｍＭＭｇＣｌ₂ ）を０．８ｍｌ加え３７℃
にて６０分間振盪培養した。これを２００μｌずつアン
ピシリン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天培地にまき、
３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コ
ロニーについてコロニーハイブリダイゼーション法にて
ニトリラーゼ遺伝子をもつ形質転換体を選別した。すな
わち、寒天培地上に生育した形質転換体をナイロンメン
ブレン（バイオダインＡ：日本ポール株式会社）上に移
し、菌体を溶かしてＤＮＡを固定した後、これを工程
(2) で作製したプローブ（１．１ｋｂ断片）で処理し、
DIG Luminescent Detection Kit （ベーリンガー・マン
ハイム株式会社）を用い、目的の組換え体ＤＮＡを含む
コロニーを選択した。

【００２１】(4) 組換え体プラスミドの調製 工程(3) で選択した形質転換体を１００ｍｌのＬＢ培地
にて３７℃で一晩培養し、集菌後、滅菌水により洗浄
し、溶液I （２ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ、２
５ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を５ｍｌ、リゾ
チームを２５ｍｇ加え、０℃で３０分間放置した。溶液
II（１ＮＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を１０ｍｌ加え０℃で
５分間放置し、溶液III （３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．８）を７．５ｍｌ加え０℃で３０分間放置した。こ
れを遠心し、その上澄みに５０ｍｌのエタノールを加
え、さらに遠心し上清を取り除き５ｍｌの溶液IV（１０
ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）とリボヌクレアーゼＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）
を２．５μｌ加え室温で２０分間放置した。これに１２
ｍｌのエタノールを加え遠心後乾燥し滅菌水で溶解し
た。

【００２２】(5) ロドコッカス属細菌の形質転換および
形質転換体のニトリラーゼ活性 ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ １２６７４株
の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した
滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。工程(4) の
プラスミドｐＳＫ１０４１μｌと菌体懸濁液１０μｌを
混合し、氷冷した。チャンバーにＤＮＡと菌体の混合液
を入れ、遺伝子導入装置ＣＥＴ−２００型（日本分光）
により電場強度３．８ｋＶ／ｃｍ、パルス幅１ｍｓ、パ
ルス回数２０回で電気パルス処理を行った。電気パルス
処理液を氷冷下１０分間静置し、３７℃で１０分間ヒー
トショックを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプト
ン、０．３％バクトモルトエキス、０．３％バクトイー
ストエキス、０．２％ＫＨ₂ＰＯ₄ 、０．２％Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ （ｐＨ７．０））５００μｌを加え、２６℃、３時
間振盪培養した後、７５μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭ
ＹＫ寒天培地に塗布し２６℃、３日間培養した。こうし
て作製したロドコッカス属細菌組換え体をＭＹＫ培地
（５０μg/mlカナマイシン含有）１０ｍｌに接種し、３
０℃で２４時間前培養した。この培養物１ｍｌをＧＧＰ
培地（１．５％グルコース、０．１％バクトイーストエ
キス、１．０％グルタミン酸ナトリウム、０．０５％Ｋ
Ｈ₂ ＰＯ₄ 、０．０５％Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 、０．０５％Ｍｇ
ＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ（ｐＨ７．２））１００ｍｌ（７５μ
g/mlカナマイシン含有）に加え、誘導物質としてエチレ
ンシアンヒドリン（ＥＣＨ）１．５％を添加し、３０℃
で４８時間培養した。集菌後、この菌体を５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．７）に懸濁し、その一部を１００ｍ
Ｍアクリロニトリルを含有する同緩衝液中で３０℃、２
０分反応させた。１Ｎ塩酸の添加により反応を止め、反
応液中の生成アクリル酸を高速液体クロマトグラフィー
を用いて測定した。その結果、ロドコッカス属細菌組換
え体ＡＴＣＣ １２６７４／ｐＳＫ１０４において、８
ｍＭのアクリル酸生成が認められた。このことにより、
ニトリラーゼ発現に必要な調節因子をコードする遺伝子
がニトリラーゼ構造遺伝子の上流あるいは下流域に存在
することが明かになった。

【００２３】(6) 欠失プラスミドとニトリラーゼ活性 ｐＳＫ１０４には、ニトリラーゼ発現に必要ない領域が
まだ多く残っていると考えられたため、様々な欠失プラ
スミドを作製しニトリラーゼ活性を測定した。（表１、
図１）

【００２４】

【００２５】その結果、ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＫ１
０８（６．２ｋｂ HindIII-EcoRV断片）（図２）におい
て高いニトリラーゼ活性が認められた。さらに、欠失プ
ラスミドを作製し位置を探索した結果、調節因子をコー
ドする遺伝子はニトリラーゼ構造遺伝子のかなり上流域
（約３ｋｂ BamHI-EcoRV断片）内に存在することがわか
った。

【００２６】(7) 塩基配列の決定 工程(6) で明かになったニトリラーゼ発現に必須である
調節因子をコードする遺伝子の塩基配列をファルマシア
社蛍光シーケンサーＡＬＦI I を用いて決定した。その
結果、配列番号５に示される塩基配列が得られ、配列番
号１および２に示されるアミノ酸配列を持つ２つのオー
プンリーディングフレームが見い出された。アミノ酸配
列データーベースＮＢＲＦ（National Biomedical Rese
arch Fo-undation）との比較より調節因子は二成分系調
節系のファミリーに属することが推定された。また、こ
れらのオープンリーディングフレームの塩基配列を配列
番号３および４に示した。

【００２７】参考例 (1) ＳＫ９２株染色体ＤＮＡの調製 実施例工程(1) 同様、ＳＫ９２株染色体ＤＮＡの調製を
行い、染色体ＤＮＡ標品を得た。

【００２８】(2) プローブの調製およびＤＮＡライブラ
リーの作製 基質ＤＮＡ１０μｌ（１／２０希釈）、１０倍濃度の反
応緩衝液１０μｌ、５ｍＭｄＮＴＰ４μｌ、プライマー
＃１として、５’-AACTGCTGGGA(AG)CACTTCCA-３’（２
０ヌクレオチド、対応するアミノ酸配列ＮＣＷＥＨＦ
Ｑ）、プライマー＃２として、５’-GA(AG)TA(AG)TG(A
G)CC(CG)AC(ACTG)GG(AG)TC-３’（２０ヌクレオチド、
対応するアミノ酸配列ＤＰＶＧＨＹＳ）各５μｌ（５０
０ｐｍｏｌ濃度相当）、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東
洋紡績株式会社）１μｌを加えて１００μｌとした。プ
ライマーはいずれもすでに公知されている各種ニトリラ
ーゼのホモロジーの高いアミノ酸配列をもとに作成し
た。反応は９３℃、３０秒間（変性ステップ）、４５
℃、３０秒間（アニーリングステップ）、７２℃、２分
間（伸長ステップ）のインキュベーションを５０サイク
ル行い反応を終了した。得られた反応液からＳＫ９２株
ニトリラーゼ遺伝子をコードする４１０ｂｐＤＮＡ断片
を得た。こうして得られたＤＮＡ断片をDIG DNA Labeli
ng Kit（ベーリンガー・マンハイム株式会社）を用いて
標識し、プローブとした。ＳＫ９２株染色体ＤＮＡ５０
μｌに１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水３７
μｌ、制限酵素ＳａｌＩ３μｌを加え３７℃にて２時間
反応させた後、エタノール沈澱を行い、アガロース電気
泳動を行い分離した。そして、１．１ｋｂ付近のＤＮＡ
断片をＤＮＡＰＲＥＰ（株式会社ダイアヤトロン）を用
いて回収した。このＤＮＡ断片をライゲーションキット
（宝酒造株式会社）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１
８のＳａｌＩ部位に挿入し、組換え体ＤＮＡライブラリ
ーを作製した。ライゲーションに用いたｐＵＣ１１８断
片は次のように作製した。ｐＵＣ１１８１０μｌに対し
１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７７μｌ、
制限酵素ＳａｌＩ２μｌを加え３７℃で２時間反応後、
フェノール処理、エタノール沈澱させた後乾燥して５０
μｌの滅菌水に溶解した。さらに、アルカリフォスタフ
ァーゼ（宝酒造株式会社）１μｌ、１０倍濃度緩衝液１
０μｌ、滅菌水３９μｌを加え６５℃で反応後フェノー
ル処理、エタノール沈澱を行い乾燥して滅菌水に溶解し
た。

【００２９】(3) 形質転換体の作製及び組換え体ＤＮＡ
の選別 実施例工程(3) 同様、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテン
トセルを作製した。このコンピテントセル２００μｌに
工程(2) で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液
（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃で３０分
放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え０℃で
２分間冷却後、ＳＯＣ培地を０．８ｍｌ加え３７℃にて
６０分間振盪培養した。これを２００μｌずつアンピシ
リン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天培地にまき、３７
℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニ
ーについてコロニーハイブリダイゼーション法にてニト
リラーゼ遺伝子を持つ形質転換体を選別した。すなわ
ち、寒天培地上に生育した形質転換体をナイロンメンブ
レン（バイオダインＡ：ポール社）上に移し、菌体を溶
かしてＤＮＡを固定した後、これを工程(2) で作製した
プローブ（４１０ｂｐ断片）で処理し、DIG Luminescen
t Detection Kit （ベーリンガー・マンハイム株式会
社）を用い、目的の組換え体ＤＮＡを含むコロニーを選
択した。

【００３０】(4) 組換え体プラスミドの調製と制限酵素
地図の作製 工程(3) で選択した形質転換体を実施例工程(4) 同様、
調製を行った。こうして得られた組換え体プラスミドｐ
ＳＫ００２を数種の制限酵素を用いて切断し制限酵素地
図を作製した。

【００３１】(5) 組換え体大腸菌を用いたニトリラーゼ
生産とニトリル類の酸類への変換 ＪＭ１０９／ｐＳＫ００２株を２×ＹＴ培地（１．６％
バクトトリプトン、１．０％バクトイーストエキス、
０．５％ＮａＣｌ）（５０μg/mlアンピシリン含有）１
ｍｌに接種し３７℃で８時間前培養し、この培養物１ｍ
ｌを２×ＹＴ培地１００ｍｌ（５０μg/mlアンピシリ
ン、１ｍＭＩＰＴＧ含有）に加え、３７℃で１４時間培
養した。集菌後、この菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．７）に懸濁し、その一部を１００ｍＭアクリロニ
トリルを含有する同緩衝液中で３０℃、２０分間反応さ
せた。１Ｎ塩酸の添加により反応を止め、反応液中の生
成アクリル酸を高速液体クロマトグラフィーを用いて測
定した。なお、対照試験としＪＭ１０９株のみを用いて
行った。その結果、宿主ＪＭ１０９株ではアクリル酸が
検出されなかったが、形質転換体ＪＭ１０９／ｐＳＫ０
０２では１８ｍＭのアクリル酸生成が認められた。

【００３２】(6) ニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
の複合プラスミドベクターへの挿入 工程(4) で得られたＳＫ９２株ニトリラーゼ遺伝子およ
び、そのプロモーターと考えられる領域を含むＤＮＡ断
片（５．８ｋｂ BglII-HindIII断片）を染色体ＤＮＡよ
り切り出し、複合プラスミドベクターｐＫ４に挿入しプ
ラスミドｐＳＫ１２０を作製した。

【００３３】(7) ロドコッカス属細菌の形質転換および
形質転換体のニトリラーゼ活性 ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ １２６７４株
の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した
滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。工程(6) の
プラスミドｐＳＫ１２０１μｌと菌体懸濁液１０μｌを
混合し、氷冷した。チャンバーにＤＮＡと菌体の混合液
を入れ、遺伝子導入装置ＣＥＴ−２００型（日本分光）
により電場強度３．８ｋＶ／ｃｍ、パルス幅１ｍｓ、パ
ルス回数２０回で電気パルス処理を行った。電気パルス
処理液を氷冷下１０分間静置し、３７℃で、１０分間ヒ
ートショックを行い、ＭＹＫ培地５００μｌを加え、２
６℃、３時間振盪した。７５μｇ／ｍｌカナマイシン入
りＭＹＫ寒天培地に塗布し２６℃、３日間培養した。こ
うして作製したロドコッカス属細菌組換え体をＭＹＫ培
地（５０μg/mlカナマイシン含有）１０ｍｌに接種し３
０℃で２４時間前培養し、この培養物１ｍｌをＧＧＰ培
地１００ｍｌ（７５μg/mlカナマイシン含有）に加え、
誘導物質としてＥＣＨ１．５％を添加し、３０℃で４８
時間培養した。集菌後、この菌体を５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．７）に懸濁し、工程(5) に記したようにニ
トリラーゼ活性を調べたところ、活性は認められなかっ
た。

【００３４】

【効果】本調節因子をコードする遺伝子を、プロモータ
ー領域を含むニトリラーゼ遺伝子とロドコッカス属菌体
内に共存させることにより、ニトリラーゼの生産が可能
となる。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２ 配列： 15 MetAlaGlyAlaAspValHisAlaGlnGlyGlyThrAsnArgArg 30 AlaArgIleLeuValValAspAspGluLysHisValArgThrMet 45 ValThrTrpGlnLeuGluSerGluAsnPheAspValValAlaAla 60 AlaAspGlyAspAlaAlaLeuArgGlnValThrGluSerAlaPro 75 AspLeuMetValLeuAspLeuSerLeuProGlyLysGlyGlyLeu 90 GluValLeuAlaThrValArgArgThrAspAlaLeuProIleVal 105 ValLeuThrAlaArgArgAspGluThrGluArgIleValAlaLeu 120 AspLeuGlyAlaAspAspTyrValIleLysProPheSerProArg 135 GluLeuAlaAlaArgIleArgAlaValLeuArgArgThrThrAla 150 GluProProHisGluAlaAlaValGlnArgPheGlyAspLeuGlu 165 IleAspThrAlaAlaArgGluValArgLeuHisGlyIleProLeu 180 GluPheThrThrLysGluPheAspLeuLeuAlaTyrMetAlaAla 195 SerProMetGlnValPheSerArgArgArgLeuLeuLeuGluVal 210 TrpArgSerSerProAspTrpGlnGlnAspAlaThrValThrGlu 225 HisValHisArgIleArgArgLysIleGluGluAspProThrLys 240 ProThrIleLeuGlnThrValArgGlyAlaGlyTyrArgPheAsp 244 GlyGluArgAla

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：５３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２ 配列： 15 MetMetThrAspThrLeuProSerSerSerArgTrpThrLeuGlu 30 GlyProHisLeuGlnProLeuGlnGlyGluAlaLeuAlaAspLeu 45 HisAlaArgThrLeuGluMetIleThrSerGlyArgGluLeuHis 60 GluThrLeuGluValValAlaArgGlyIleGluGluLeuMetPro 75 GlyLysArgCysAlaIleLeuLeuLeuAspAsnThrGlyProVal 90 LeuArgCysGlyAlaAlaProThrMetSerAlaProTrpArgArg 105 TrpIleAspSerLeuValProGlyProMetSerGlyGlyCysGly 120 ThrAlaValHisLeuGlyGluProValIleSerTyrAspValAla 135 AspAspProLysPheArgGlyProPheArgAlaAlaAlaLeuHis 150 GluGlyIleArgAlaCysTrpSerThrProValThrSerGlyAsp 165 GlyThrIleLeuGlyThrPheAlaIleTyrGlySerValProAla 180 PheProAlaGlnGlnAspValAlaLeuValThrGlnCysThrAsp 195 LeuThrAlaAlaValIleThrThrHisLysLeuHisGlnAspLeu 210 SerMetSerGluGluArgPheArgArgAlaPheAspSerAsnVal 225 ValGlyMetAlaLeuLeuAspGluSerGlySerSerIleArgVal 240 AsnAspThrLeuCysAlaLeuThrAlaAlaProProArgArgLeu 255 LeuGlyHisProMetGlnGluIleLeuThrAlaAspSerArgGlu 270 ProPheAlaAsnGlnLeuSerSerIleArgGluGlyLeuThrAsp 285 GlyGlyGlnLeuAspGlyArgIleGlnThrThrGlyGlyArgTrp 300 IleProValHisLeuSerIleSerGlyMetTrpThrThrGluArg 315 GluPheMetGlyPheSerValHisValLeuAspIleSerGluArg 330 LeuAlaAlaGluArgAlaArgGluGluGlnLeuGluAlaGluVal 345 AlaArgHisThrAlaGluGluAlaSerArgAlaLysSerThrPhe 360 LeuSerGlyMetThrHisGluValGlnThrProMetAlaValIle 375 ValGlyPheSerGluLeuLeuGluThrLeuAspLeuAspGluGlu 390 ArgArgGlnCysAlaTyrArgLysIleGlyGluAlaAlaLysHis 405 ValIleSerLeuValAspAspValLeuAspIleAlaLysIleGlu 420 AlaGlyAlaIleThrLeuGlnAspGluAspIleAspLeuSerGlu 435 GluValAlaThrIleValGluMetLeuGluProIleAlaArgAsp 450 ArgAspArgAspValCysLeuArgTyrValProProGlnThrPro 465 ValHisValCysSerAspArgArgArgValArgGluValLeuLeu 480 AsnIleValSerAsnGlyIleLysTyrAsnArgLeuGlyGlyVal 495 ValAspProProThrGlySerGlyAlaAlaArgProArgGlnThr 510 ArgAlaProAspTyrProAlaThrProThrThrAsnSerSerSer 525 ProSerThrGlyTrpGluSerArgProArgGlyCysLysGlyArg 534 GlySerValLeuArgSerProAlaArg

【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：７３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２ 配列： ATG GCC GGA GCG GAC GTC CAC GCC CAG GGT GGC ACG AAT CGA CGT 45 GCA CGC ATC CTC GTC GTC GAC GAC GAA AAA CAC GTG CGC ACG ATG 90 GTG ACG TGG CAA CTC GAA TCG GAG AAT TTC GAT GTT GTC GCT GCG 135 GCA GAC GGA GAT GCG GCA CTG CGT CAG GTC ACT GAG AGC GCA CCC 180 GAT TTG ATG GTG CTC GAT CTG TCG CTC CCG GGG AAA GGT GGG TTG 225 GAA GTG CTC GCT ACG GTC CGC AGA ACC GAT GCA CTG CCT ATC GTC 270 GTG CTC ACA GCA CGC CGC GAT GAA ACC GAA CGG ATC GTC GCG CTG 315 GAT CTC GGC GCC GAT GAC TAC GTC ATC AAA CCG TTC TCC CCG CGG 360 GAA TTG GCC GCC CGT ATC CGG GCA GTG CTT CGT CGA ACC ACA GCT 405 GAA CCC CCA CAC GAG GCG GCG GTT CAG CGA TTC GGT GAC CTA GAG 450 ATC GAC ACC GCT GCG CGC GAG GTT CGG CTC CAC GGG ATA CCG CTC 495 GAG TTC ACC ACC AAG GAG TTC GAT CTG CTG GCC TAT ATG GCC GCA 540 TCA CCG ATG CAG GTC TTC AGC CGA CGC AGA TTG TTG CTC GAG GTG 585 TGG CGA TCG TCG CCC GAC TGG CAG CAG GAC GCC ACC GTG ACC GAG 630 CAC GTG CAC CGC ATT CGC CGC AAG ATC GAA GAA GAT CCC ACC AAA 675 CCG ACG ATC CTG CAG ACA GTG CGG GGA GCC GGT TAC CGT TTC GAC 720 GGA GAG CGT GCA TGA 735

【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：１６０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２ 配列： ATG ATG ACC GAC ACA CTG CCC TCC TCG TCC CGT TGG ACC CTT GAA 45 GGC CCG CAT CTC CAG CCG CTG CAG GGT GAG GCC CTG GCG GAT CTC 90 CAC GCC CGT ACG CTC GAG ATG ATC ACT TCC GGG AGA GAA TTG CAC 135 GAG ACA CTC GAG GTG GTC GCC CGC GGC ATC GAG GAA CTG ATG CCG 180 GGC AAA CGT TGC GCA ATT CTG TTG CTC GAC AAC ACC GGA CCG GTA 225 TTG CGC TGC GGC GCG GCC CCA ACA ATG AGC GCG CCG TGG CGC CGG 270 TGG ATC GAC AGC CTC GTC CCT GGT CCG ATG TCG GGT GGC TGC GGC 315 ACA GCG GTT CAC CTC GGC GAG CCG GTT ATT TCC TAT GAC GTG GCC 360 GAT GAC CCG AAA TTC CGC GGC CCC TTC CGC GCC GCA GCC CTC CAC 405 GAG GGC ATA CGT GCC TGC TGG TCC ACC CCC GTC ACA AGC GGA GAC 450 GGC ACG ATC CTC GGC ACT TTC GCG ATC TAC GGA TCC GTG CCG GCG 495 TTC CCC GCA CAA CAG GAC GTT GCC CTG GTC ACC CAA TGC ACC GAC 540 CTG ACC GCT GCC GTC ATC ACC ACC CAC AAA CTT CAT CAA GAT CTG 585 AGC ATG AGC GAG GAG CGG TTC CGA CGC GCC TTC GAT TCC AAT GTC 630 GTC GGC ATG GCA CTT CTC GAC GAA TCC GGC TCC AGC ATC CGC GTC 675 AAC GAC ACC CTG TGC GCG TTG ACC GCA GCT CCG CCA CGG CGC CTC 720 CTC GGC CAC CCC ATG CAG GAG ATA CTC ACC GCC GAC TCC CGG GAA 765 CCG TTC GCC AAT CAG TTG TCC TCC ATC CGT GAG GGA TTG ACC GAC 810 GGC GGA CAG CTC GAC GGA CGA ATC CAA ACC ACC GGA GGT CGG TGG 855 ATT CCG GTG CAC CTG TCC ATC AGC GGT ATG TGG ACC ACG GAG CGG 900 GAG TTC ATG GGA TTC AGC GTC CAT GTC CTG GAC ATC TCC GAG CGC 945 CTG GCC GCC GAA CGC GCC CGC GAG GAA CAA CTC GAG GCC GAG GTT 990 GCC CGC CAT ACC GCG GAG GAA GCC AGT CGC GCC AAG TCC ACG TTC 1035 CTG TCC GGC ATG ACG CAC GAG GTC CAA ACG CCC ATG GCC GTT ATC 1080 GTC GGA TTC AGT GAG CTA CTC GAG ACG CTG GAC CTG GAT GAA GAA 1125 CGT CGT CAG TGC GCC TAC CGC AAG ATC GGC GAA GCC GCG AAA CAC 1170 GTG ATC TCC CTG GTC GAC GAC GTT CTC GAT ATA GCC AAG ATC GAA 1215 GCC GGC GCT ATC ACT CTG CAG GAC GAA GAC ATC GAC CTG TCC GAA 1260 GAA GTT GCC ACC ATC GTG GAG ATG CTC GAG CCC ATC GCC CGT GAC 1305 CGT GAC CGT GAC GTC TGC CTG CGG TAC GTC CCG CCG CAG ACA CCG 1350 GTG CAC GTG TGC TCG GAC CGG CGG CGG GTG CGG GAA GTG CTG CTC 1395 AAC ATC GTC TCC AAC GGG ATC AAG TAC AAT CGG CTC GGT GGT GTC 1440 GTC GAC CCC CCA ACA GGA TCA GGG GCT GCT CGT CCG CGT CAG ACG 1485 AGG GCC CCG GAC TAC CCA GCG ACG CCG ACG ACG AAC TCT TCG AGC 1530 CCT TCA ACC GGC TGG GAG TCG AGG CCA CGG GGG TGC AAG GGT CGG 1575 GGC TCG GTC TTG CGC TCT CCC GCG CGC TGA 1605

【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：２３３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２ 配列： ATGGCCGGAG CGGACGTCCA CGCCCAGGGT GGCACGAATC GACGTGCACG 50 CATCCTCGTC GTCGACGACG AAAAACACGT GCGCACGATG GTGACGTGGC 100 AACTCGAATC GGAGAATTTC GATGTTGTCG CTGCGGCAGA CGGAGATGCG 150 GCACTGCGTC AGGTCACTGA GAGCGCACCC GATTTGATGG TGCTCGATCT 200 GTCGCTCCCG GGGAAAGGTG GGTTGGAAGT GCTCGCTACG GTCCGCAGAA 250 CCGATGCACT GCCTATCGTC GTGCTCACAG CACGCCGCGA TGAAACCGAA 300 CGGATCGTCG CGCTGGATCT CGGCGCCGAT GACTACGTCA TCAAACCGTT 350 CTCCCCGCGG GAATTGGCCG CCCGTATCCG GGCAGTGCTT CGTCGAACCA 400 CAGCTGAACC CCCACACGAG GCGGCGGTTC AGCGATTCGG TGACCTAGAG 450 ATCGACACCG CTGCGCGCGA GGTTCGGCTC CACGGGATAC CGCTCGAGTT 500 CACCACCAAG GAGTTCGATC TGCTGGCCTA TATGGCCGCA TCACCGATGC 550 AGGTCTTCAG CCGACGCAGA TTGTTGCTCG AGGTGTGGCG ATCGTCGCCC 600 GACTGGCAGC AGGACGCCAC CGTGACCGAG CACGTGCACC GCATTCGCCG 650 CAAGATCGAA GAAGATCCCA CCAAACCGAC GATCCTGCAG ACAGTGCGGG 700 GAGCCGGTTA CCGTTTCGAC GGAGAGCGTG CATGATGACC GACACACTGC 750 CCTCCTCGTC CCGTTGGACC CTTGAAGGCC CGCATCTCCA GCCGCTGCAG 800 GGTGAGGCCC TGGCGGATCT CCACGCCCGT ACGCTCGAGA TGATCACTTC 850 CGGGAGAGAA TTGCACGAGA CACTCGAGGT GGTCGCCCGC GGCATCGAGG 900 AACTGATGCC GGGCAAACGT TGCGCAATTC TGTTGCTCGA CAACACCGGA 950 CCGGTATTGC GCTGCGGCGC GGCCCCAACA ATGAGCGCGC CGTGGCGCCG 1000 GTGGATCGAC AGCCTCGTCC CTGGTCCGAT GTCGGGTGGC TGCGGCACAG 1050 CGGTTCACCT CGGCGAGCCG GTTATTTCCT ATGACGTGGC CGATGACCCG 1100 AAATTCCGCG GCCCCTTCCG CGCCGCAGCC CTCCACGAGG GCATACGTGC 1150 CTGCTGGTCC ACCCCCGTCA CAAGCGGAGA CGGCACGATC CTCGGCACTT 1200 TCGCGATCTA CGGATCCGTG CCGGCGTTCC CCGCACAACA GGACGTTGCC 1250 CTGGTCACCC AATGCACCGA CCTGACCGCT GCCGTCATCA CCACCCACAA 1300 ACTTCATCAA GATCTGAGCA TGAGCGAGGA GCGGTTCCGA CGCGCCTTCG 1350 ATTCCAATGT CGTCGGCATG GCACTTCTCG ACGAATCCGG CTCCAGCATC 1400 CGCGTCAACG ACACCCTGTG CGCGTTGACC GCAGCTCCGC CACGGCGCCT 1450 CCTCGGCCAC CCCATGCAGG AGATACTCAC CGCCGACTCC CGGGAACCGT 1500 TCGCCAATCA GTTGTCCTCC ATCCGTGAGG GATTGACCGA CGGCGGACAG 1550 CTCGACGGAC GAATCCAAAC CACCGGAGGT CGGTGGATTC CGGTGCACCT 1600 GTCCATCAGC GGTATGTGGA CCACGGAGCG GGAGTTCATG GGATTCAGCG 1650 TCCATGTCCT GGACATCTCC GAGCGCCTGG CCGCCGAACG CGCCCGCGAG 1700 GAACAACTCG AGGCCGAGGT TGCCCGCCAT ACCGCGGAGG AAGCCAGTCG 1750 CGCCAAGTCC ACGTTCCTGT CCGGCATGAC GCACGAGGTC CAAACGCCCA 1800 TGGCCGTTAT CGTCGGATTC AGTGAGCTAC TCGAGACGCT GGACCTGGAT 1850 GAAGAACGTC GTCAGTGCGC CTACCGCAAG ATCGGCGAAG CCGCGAAACA 1900 CGTGATCTCC CTGGTCGACG ACGTTCTCGA TATAGCCAAG ATCGAAGCCG 1950 GCGCTATCAC TCTGCAGGAC GAAGACATCG ACCTGTCCGA AGAAGTTGCC 2000 ACCATCGTGG AGATGCTCGA GCCCATCGCC CGTGACCGTG ACCGTGACGT 2050 CTGCCTGCGG TACGTCCCGC CGCAGACACC GGTGCACGTG TGCTCGGACC 2100 GGCGGCGGGT GCGGGAAGTG CTGCTCAACA TCGTCTCCAA CGGGATCAAG 2150 TACAATCGGC TCGGTGGTGT CGTCGACCCC CCAACAGGAT CAGGGGCTGC 2200 TCGTCCGCGT CAGACGAGGG CCCCGGACTA CCCAGCGACG CCGACGACGA 2250 ACTCTTCGAG CCCTTCAACC GGCTGGGAGT CGAGGCCACG GGGGTGCAAG 2300 GGTCGGGGCT CGGTCTTGCG CTCTCCCGCG CGCTGA 2336

【００４０】

【図面の簡単な説明】

【図１】欠失プラスミドの模式図ＳＫ９２株ＤＮＡ断片
上における矢印は、本発明において見いだされた調節因
子をコードする遺伝子およびニトリラーゼ遺伝子の位置
と方向を示した。

【図２】組換え体プラスミドｐＳＫ１０８の制限酵素地
図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性
   化する作用を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有する
   ポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する
   ポリペプチドの２成分より構成される調節因子およびそ
   れらをコードする遺伝子ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ポリペプチドをコードする遺伝子が配列
   番号３および配列番号４の塩基配列を有する請求項１記
   載の調節因子および遺伝子ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ニトリル類の存在により、ニトリラーゼ
   遺伝子プロモーターを活性化する作用が増強される請求
   項１または請求項２記載の調節因子および遺伝子ＤＮ
   Ａ。
4. 【請求項４】 請求項１、２または３記載の調節因子を
   コードするＤＮＡ、プロモーター領域を含むニトリラー
   ゼ遺伝子およびロドコッカス属に属する細菌細胞内で複
   製増殖可能なＤＮＡ領域を含む組換え体プラスミド。
5. 【請求項５】 ロドコッカス属に属する細菌細胞内で増
   殖可能なＤＮＡ領域がプラスミドｐＲＣ００１、ｐＲＣ
   ００２、ｐＲＣ００３またはｐＲＣ００４から選ばれた
   ものであることを特徴とする請求項４記載の組換え体プ
   ラスミド。
6. 【請求項６】 請求項４または５記載の組換え体プラス
   ミドにより形質転換されたロドコッカス属に属する微生
   物。