JPH1175858A - 新規核酸及びそれを用いた病原性キサントモナス・カンペストリスの検出方法 - Google Patents
新規核酸及びそれを用いた病原性キサントモナス・カンペストリスの検出方法Info
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- JPH1175858A JPH1175858A JP9257513A JP25751397A JPH1175858A JP H1175858 A JPH1175858 A JP H1175858A JP 9257513 A JP9257513 A JP 9257513A JP 25751397 A JP25751397 A JP 25751397A JP H1175858 A JPH1175858 A JP H1175858A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 環境中に存在する様々な試料から、イネ科植
物に病原性を示すキサントモナス・カンペストリスを効
率良く、かつ、迅速に検出する手段を提供すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有する核酸断片、この断片を標識した病原性キサント
モナス・カンペストリス検出用プローブ及びこの断片中
の連続する１５〜５０塩基から成る塩基配列を有する核
酸から成る、病原性キサントモナス・カンペストリス検
出用プライマーを提供した。
物に病原性を示すキサントモナス・カンペストリスを効
率良く、かつ、迅速に検出する手段を提供すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有する核酸断片、この断片を標識した病原性キサント
モナス・カンペストリス検出用プローブ及びこの断片中
の連続する１５〜５０塩基から成る塩基配列を有する核
酸から成る、病原性キサントモナス・カンペストリス検
出用プライマーを提供した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規核酸及びそれ
を用いた病原性キサントモナス・カンペストリスの検出
又は同定方法並びに該方法に用いられるプローブ及びプ
ライマーに関する。
を用いた病原性キサントモナス・カンペストリスの検出
又は同定方法並びに該方法に用いられるプローブ及びプ
ライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、細菌（ここでは植物病原細菌を含
めたすべての細菌を指す）の同定には糖・有機酸の資化
性等の生化学的検査（細菌学的性質の検査）が主に用い
られている。しかし、この方法は迅速・簡便な方法とは
いえず、煩雑で時間を要し、さらには熟練を必要とする
ものであった。また、簡易同定・迅速な検出方法とし
て、１６ＳリボゾームＲＮＡの塩基配列の違いによる同
定方法が従来技術として知られているが、この方法によ
って細菌の種以下の分類項（パソバーなど）を判定する
ことは困難であった。
めたすべての細菌を指す）の同定には糖・有機酸の資化
性等の生化学的検査（細菌学的性質の検査）が主に用い
られている。しかし、この方法は迅速・簡便な方法とは
いえず、煩雑で時間を要し、さらには熟練を必要とする
ものであった。また、簡易同定・迅速な検出方法とし
て、１６ＳリボゾームＲＮＡの塩基配列の違いによる同
定方法が従来技術として知られているが、この方法によ
って細菌の種以下の分類項（パソバーなど）を判定する
ことは困難であった。
【０００３】また、キサントモナス・カンペストリスに
属する細菌の簡易同定方法としては、菌体構成脂肪酸あ
るいは菌体構成タンパク質を分析する方法が知られてい
るが、これらの方法は再現性を得ることが難しく、特に
イネ科植物に対して病原性を示すキサントモナス・カン
ペストリスを区別することは困難であった。
属する細菌の簡易同定方法としては、菌体構成脂肪酸あ
るいは菌体構成タンパク質を分析する方法が知られてい
るが、これらの方法は再現性を得ることが難しく、特に
イネ科植物に対して病原性を示すキサントモナス・カン
ペストリスを区別することは困難であった。
【０００４】さらに、イネ科植物に対して病原性を示す
キサントモナス・カンペストリスが植物中、土壌中、水
中などの自然環境中に存在するか否かを検出するために
は、自然環境中の試料（植物、土壌、河川水など）を寒
天培地上に塗抹した後に培養し、単コロニーを得、得ら
れた単コロニーが目的とするキサントモナス・カンペス
トリスであるか否かを上記の従来技術等を用いて確かめ
る必要があった。
キサントモナス・カンペストリスが植物中、土壌中、水
中などの自然環境中に存在するか否かを検出するために
は、自然環境中の試料（植物、土壌、河川水など）を寒
天培地上に塗抹した後に培養し、単コロニーを得、得ら
れた単コロニーが目的とするキサントモナス・カンペス
トリスであるか否かを上記の従来技術等を用いて確かめ
る必要があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、環境
中に存在する様々な試料から、イネ科植物に病原性を示
すキサントモナス・カンペストリスを効率良く、かつ、
迅速に検出する手段を提供することである。さらにま
た、本発明の目的は、検出したキサントモナス・カンペ
ストリスをパソバー又は菌株のレベルで区別・同定する
手段を提供することである。
中に存在する様々な試料から、イネ科植物に病原性を示
すキサントモナス・カンペストリスを効率良く、かつ、
迅速に検出する手段を提供することである。さらにま
た、本発明の目的は、検出したキサントモナス・カンペ
ストリスをパソバー又は菌株のレベルで区別・同定する
手段を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者は、後述する
方法により、イネ科植物に病原性を示すキサントモナス
・カンペストリスの染色体ＤＮＡ中に存在するが、イネ
科植物に病原性を示さないキサントモナス・カンペスト
リスや他の細菌には存在しない、病原性キサントモナス
・カンペストリスに特異的な染色体ＤＮＡの領域を同定
することに成功し、本発明を完成した。
方法により、イネ科植物に病原性を示すキサントモナス
・カンペストリスの染色体ＤＮＡ中に存在するが、イネ
科植物に病原性を示さないキサントモナス・カンペスト
リスや他の細菌には存在しない、病原性キサントモナス
・カンペストリスに特異的な染色体ＤＮＡの領域を同定
することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
に示される塩基配列、又は該塩基配列において１若しく
は複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された
塩基配列であってイネ科植物に対する病原性を有するキ
サントモナス・カンペストリスの検出能を有する塩基配
列を有する核酸断片を提供する。また、本発明は、該本
発明の核酸断片を標識して成る、イネ科植物に対する病
原性を有するキサントモナス・カンペストリスの検出又
は同定用プローブを提供する。さらに、本発明は、上記
本発明の核酸断片の塩基配列を検出することから成る、
イネ科植物に対する病原性を有するキサントモナス・カ
ンペストリスの検出方法を提供する。さらに、本発明
は、検体ＤＮＡを制限酵素で切断し、切断断片を電気泳
動により分離した後、上記本発明のプローブとハイブリ
ダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブを検出するこ
とから成る、イネ科植物に対する病原性を有するキサン
トモナス・カンペストリスの検出又は同定方法を提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明の核酸断片中の連続
する１５〜５０塩基から成る塩基配列を有する核酸から
成る、イネ科植物に対する病原性を有するキサントモナ
ス・カンペストリス検出用プライマーを提供する。
に示される塩基配列、又は該塩基配列において１若しく
は複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された
塩基配列であってイネ科植物に対する病原性を有するキ
サントモナス・カンペストリスの検出能を有する塩基配
列を有する核酸断片を提供する。また、本発明は、該本
発明の核酸断片を標識して成る、イネ科植物に対する病
原性を有するキサントモナス・カンペストリスの検出又
は同定用プローブを提供する。さらに、本発明は、上記
本発明の核酸断片の塩基配列を検出することから成る、
イネ科植物に対する病原性を有するキサントモナス・カ
ンペストリスの検出方法を提供する。さらに、本発明
は、検体ＤＮＡを制限酵素で切断し、切断断片を電気泳
動により分離した後、上記本発明のプローブとハイブリ
ダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブを検出するこ
とから成る、イネ科植物に対する病原性を有するキサン
トモナス・カンペストリスの検出又は同定方法を提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明の核酸断片中の連続
する１５〜５０塩基から成る塩基配列を有する核酸から
成る、イネ科植物に対する病原性を有するキサントモナ
ス・カンペストリス検出用プライマーを提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本願発明者はイネ科植物に対して
病原性を示すキサントモナス・カンペストリス（本明細
書において、単に「病原性キサントモナス・カンペスト
リス」ということがある）に特異的な塩基配列を発見す
るために、キサントモナス・カンペストリス・パソバー
・ポアＭＢ２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）の染色
体の制限酵素断片を多数クローニングした。そして、キ
サントモナスおよびプセウドモナスに属する細菌の染色
体ＤＮＡに対して、クローニングした染色体ＤＮＡ断片
をプローブとしてサザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンを繰り返し行った。その結果、本発明者はキサント
モナス・カンペストリス・パソバー・ポアＭＢ２１８株
（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）の染色体より、制限酵素Ｓ
ａｌＩで切り出すことができる１２２０ｂｐの塩基配列
（以後Ｓ７断片と呼ぶ）を見いだすに至った。なお、キ
サントモナス・カンペストリス・パソバー・ポアＭＢ２
１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）は、米国ＮＲＲＬに
ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８の受託番号で寄託されており、
自由に分譲されるものである。
病原性を示すキサントモナス・カンペストリス（本明細
書において、単に「病原性キサントモナス・カンペスト
リス」ということがある）に特異的な塩基配列を発見す
るために、キサントモナス・カンペストリス・パソバー
・ポアＭＢ２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）の染色
体の制限酵素断片を多数クローニングした。そして、キ
サントモナスおよびプセウドモナスに属する細菌の染色
体ＤＮＡに対して、クローニングした染色体ＤＮＡ断片
をプローブとしてサザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンを繰り返し行った。その結果、本発明者はキサント
モナス・カンペストリス・パソバー・ポアＭＢ２１８株
（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）の染色体より、制限酵素Ｓ
ａｌＩで切り出すことができる１２２０ｂｐの塩基配列
（以後Ｓ７断片と呼ぶ）を見いだすに至った。なお、キ
サントモナス・カンペストリス・パソバー・ポアＭＢ２
１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）は、米国ＮＲＲＬに
ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８の受託番号で寄託されており、
自由に分譲されるものである。
【０００９】本発明者が見出したＳ７断片はイネ科植物
に対して病原性を示すキサントモナス・カンペストリス
であるキサントモナス・カンペストリス・パソバー・ポ
ア、キサントモナス・カンペストリス・パソバー・グラ
ミニス（Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、キサント
モナス・カンペストリス・パソバー・フレイ（Ｘ．ｃ．
ｐｖ．ｐｈｌｅｉ）、キサントモナス・カンペストリ
ス・パソバー・アルヘナセリ（Ｘ．ｃ．ｐｖ．ａｒｒｈ
ｅｎａｔｈｅｒｉ）、キサントモナス・カンペストリス
・パソバー・トランスルーセンス（Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｔｒ
ａｎｓｌｕｃｅｎｓ）、キサントモナス・カンペストリ
ス・パソバー・ウンドゥロサ（Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｕｎｄｕ
ｌｏｓａ）、キサントモナス・カンペストリス・パソバ
ー・ホルデイ（Ｘ． ｃ．ｐｖ．ｈｏｒｄｅｉ）の染色
体ＤＮＡに対しては相同性を有しているが、他のイネ科
植物に対し非病原性のキサントモナス属細菌およびプセ
ウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌の染色体
ＤＮＡに対しては相同性を有していない。
に対して病原性を示すキサントモナス・カンペストリス
であるキサントモナス・カンペストリス・パソバー・ポ
ア、キサントモナス・カンペストリス・パソバー・グラ
ミニス（Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、キサント
モナス・カンペストリス・パソバー・フレイ（Ｘ．ｃ．
ｐｖ．ｐｈｌｅｉ）、キサントモナス・カンペストリ
ス・パソバー・アルヘナセリ（Ｘ．ｃ．ｐｖ．ａｒｒｈ
ｅｎａｔｈｅｒｉ）、キサントモナス・カンペストリス
・パソバー・トランスルーセンス（Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｔｒ
ａｎｓｌｕｃｅｎｓ）、キサントモナス・カンペストリ
ス・パソバー・ウンドゥロサ（Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｕｎｄｕ
ｌｏｓａ）、キサントモナス・カンペストリス・パソバ
ー・ホルデイ（Ｘ． ｃ．ｐｖ．ｈｏｒｄｅｉ）の染色
体ＤＮＡに対しては相同性を有しているが、他のイネ科
植物に対し非病原性のキサントモナス属細菌およびプセ
ウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌の染色体
ＤＮＡに対しては相同性を有していない。
【００１０】Ｓ７断片の塩基配列を配列表の配列番号１
に示す。なお、本発明の核酸は、後で詳しく述べるよう
に、病原性キサントモナス・カンペストリスの検出及び
／又は同定に用いることができるものであるが、Ｓ７断
片の塩基配列、すなわち、配列番号１に示される塩基配
列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、付加
若しくは挿入された塩基配列であってイネ科植物に対す
る病原性を有するキサントモナス・カンペストリスの検
出能を有するものも本発明に含まれる。ここで、「イネ
科植物に対する病原性を有するキサントモナス・カンペ
ストリスの検出能を有する」とは、病原性キサントモナ
ス・カンペストリスの染色体ＤＮＡ中の領域とハイブリ
ダイズするが、イネ科植物に対する非病原性キサントモ
ナス・カンペストリス及び他の細菌その他の生物の染色
体ＤＮＡとはハイブリダイズしないことを意味する。ハ
イブリダイゼーションを達成するためには、配列番号１
で示される塩基配列と６０％以上、さらに好ましくは８
０％以上、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを
有していることが好ましい。また、ハイブリダイゼーシ
ョンを達成するために配列番号１で示される塩基配列の
全領域が不要であることは明らかであり、該塩基配列の
一部であって、イネ科植物に対する非病原性キサントモ
ナス・カンペストリスや他の生物のＤＮＡとハイブリダ
イズしないものも当然本発明の範囲に含まれる。さら
に、配列表に示されている塩基配列は、規則により一本
の鎖の塩基配列だけを記載するが、本発明の核酸には、
記載された一本鎖に加え、この一本鎖の相補鎖及び二本
鎖並びにこれらの塩基配列において１若しくは複数個の
塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列で
あって病原性キサントモナス・カンペストリスの検出能
を有するものも包含される。なぜなら、これらの核酸も
病原性キサントモナス・カンペストリスの染色体ＤＮＡ
とハイブリダイズするから、病原性キサントモナス・カ
ンペストリスの検出及び／又は同定に用いることができ
るからである。また、本発明の核酸は、ＤＮＡでもＲＮ
Ａでもよいが、ＤＮＡの方が安定性が高いので好まし
い。
に示す。なお、本発明の核酸は、後で詳しく述べるよう
に、病原性キサントモナス・カンペストリスの検出及び
／又は同定に用いることができるものであるが、Ｓ７断
片の塩基配列、すなわち、配列番号１に示される塩基配
列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、付加
若しくは挿入された塩基配列であってイネ科植物に対す
る病原性を有するキサントモナス・カンペストリスの検
出能を有するものも本発明に含まれる。ここで、「イネ
科植物に対する病原性を有するキサントモナス・カンペ
ストリスの検出能を有する」とは、病原性キサントモナ
ス・カンペストリスの染色体ＤＮＡ中の領域とハイブリ
ダイズするが、イネ科植物に対する非病原性キサントモ
ナス・カンペストリス及び他の細菌その他の生物の染色
体ＤＮＡとはハイブリダイズしないことを意味する。ハ
イブリダイゼーションを達成するためには、配列番号１
で示される塩基配列と６０％以上、さらに好ましくは８
０％以上、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを
有していることが好ましい。また、ハイブリダイゼーシ
ョンを達成するために配列番号１で示される塩基配列の
全領域が不要であることは明らかであり、該塩基配列の
一部であって、イネ科植物に対する非病原性キサントモ
ナス・カンペストリスや他の生物のＤＮＡとハイブリダ
イズしないものも当然本発明の範囲に含まれる。さら
に、配列表に示されている塩基配列は、規則により一本
の鎖の塩基配列だけを記載するが、本発明の核酸には、
記載された一本鎖に加え、この一本鎖の相補鎖及び二本
鎖並びにこれらの塩基配列において１若しくは複数個の
塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列で
あって病原性キサントモナス・カンペストリスの検出能
を有するものも包含される。なぜなら、これらの核酸も
病原性キサントモナス・カンペストリスの染色体ＤＮＡ
とハイブリダイズするから、病原性キサントモナス・カ
ンペストリスの検出及び／又は同定に用いることができ
るからである。また、本発明の核酸は、ＤＮＡでもＲＮ
Ａでもよいが、ＤＮＡの方が安定性が高いので好まし
い。
【００１１】本発明の核酸は、キサントモナス・カンペ
ストリス・パソバー・ポアＭＢ２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−
１８０７８）の染色体ＤＮＡをSalIで消化し、常法によ
りクローニングすることにより得ることができる。ま
た、本発明によりＳ７断片の塩基配列が明らかにされた
ので、キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ポ
アＭＢ２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型とするＰＣＲにより容易に調製することもで
きる。
ストリス・パソバー・ポアＭＢ２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−
１８０７８）の染色体ＤＮＡをSalIで消化し、常法によ
りクローニングすることにより得ることができる。ま
た、本発明によりＳ７断片の塩基配列が明らかにされた
ので、キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ポ
アＭＢ２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型とするＰＣＲにより容易に調製することもで
きる。
【００１２】上記した、本発明の核酸は、病原性キサン
トモナス・カンペストリスに特異的なものであるので、
該核酸を検出することにより、病原性キサントモナス・
カンペストリスを検出することができる。
トモナス・カンペストリスに特異的なものであるので、
該核酸を検出することにより、病原性キサントモナス・
カンペストリスを検出することができる。
【００１３】このような方法により病原性キサントモナ
ス・カンペストリスを検出する方法として、本発明の核
酸を標識したプローブを用いる方法がある。核酸を標識
してプローブとする方法は、この分野において周知であ
り、そのためのキットも市販されている。本発明の核酸
を標識して得られる本発明のプローブと検体ＤＮＡとを
アニーリングしてハイブリダイズするか否かを調べるこ
とにより、病原性キサントモナス・カンペストリスを検
出することができる。
ス・カンペストリスを検出する方法として、本発明の核
酸を標識したプローブを用いる方法がある。核酸を標識
してプローブとする方法は、この分野において周知であ
り、そのためのキットも市販されている。本発明の核酸
を標識して得られる本発明のプローブと検体ＤＮＡとを
アニーリングしてハイブリダイズするか否かを調べるこ
とにより、病原性キサントモナス・カンペストリスを検
出することができる。
【００１４】この場合、検体ＤＮＡを先ず制限酵素で切
断し、電気泳動後、プローブとハイブリダイズさせる
と、後述の実施例に具体的に示されるように、病原性キ
サントモナス・カンペストリスの各パソバー間で、プロ
ーブとハイブリダイズする断片の長さが異なっている
（制限酵素断片長多型）。従って、本発明のプローブを
用いて制限酵素断片長多型解析（以下「ＲＦＬＰ解析」
と呼ぶ）を行うことにより、病原性キサントモナス・カ
ンペストリスのパソバーを簡便かつ迅速に区別、すなわ
ち同定することが可能になる。
断し、電気泳動後、プローブとハイブリダイズさせる
と、後述の実施例に具体的に示されるように、病原性キ
サントモナス・カンペストリスの各パソバー間で、プロ
ーブとハイブリダイズする断片の長さが異なっている
（制限酵素断片長多型）。従って、本発明のプローブを
用いて制限酵素断片長多型解析（以下「ＲＦＬＰ解析」
と呼ぶ）を行うことにより、病原性キサントモナス・カ
ンペストリスのパソバーを簡便かつ迅速に区別、すなわ
ち同定することが可能になる。
【００１５】ＲＦＬＰ解析に供試される細菌から染色体
ＤＮＡが抽出され、制限酵素で切断される。染色体ＤＮ
Ａの抽出方法は既知のいずれの方法を用いても構わな
い。抽出された染色体ＤＮＡの切断に使用する制限酵素
は多数用いるのが理想であるが、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩの４種類を主に使用する。
ＤＮＡが抽出され、制限酵素で切断される。染色体ＤＮ
Ａの抽出方法は既知のいずれの方法を用いても構わな
い。抽出された染色体ＤＮＡの切断に使用する制限酵素
は多数用いるのが理想であるが、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩの４種類を主に使用する。
【００１６】切断された染色体ＤＮＡのＤＮＡ断片は、
例えばアガロースゲル電気泳動等の電気泳動により分離
された後、本発明のプローブとサザンブロット・ハイブ
リダイゼーションが行われる。アガロースゲル電気泳動
を採用する場合、分離に使用されるアガロースゲルのア
ガロース濃度は0.4 ％から2.0 ％まで使用可能である
が、0.7 ％が最も好ましい。転写に使用される膜はＤＮ
Ａを確実に結合させうる性能を有しているものであれ
ば、特にこれを限定しない。ハイブリダイゼーション反
応の条件は、一般によく用いられる条件で構わないが、
ホルムアミドを含まない反応溶液を用いて例えば６８℃
で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行うことが好
ましい。
例えばアガロースゲル電気泳動等の電気泳動により分離
された後、本発明のプローブとサザンブロット・ハイブ
リダイゼーションが行われる。アガロースゲル電気泳動
を採用する場合、分離に使用されるアガロースゲルのア
ガロース濃度は0.4 ％から2.0 ％まで使用可能である
が、0.7 ％が最も好ましい。転写に使用される膜はＤＮ
Ａを確実に結合させうる性能を有しているものであれ
ば、特にこれを限定しない。ハイブリダイゼーション反
応の条件は、一般によく用いられる条件で構わないが、
ホルムアミドを含まない反応溶液を用いて例えば６８℃
で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行うことが好
ましい。
【００１７】本発明により、病原性キサントモナス・カ
ンペストリスに特異的な染色体ＤＮＡ領域の塩基配列が
明らかになったので、この領域を特異的に増幅させるＰ
ＣＲ等の核酸増幅法によっても病原性キサントモナス・
カンペストリスを検出することができる。すなわち、自
然環境中の試料（植物、土壌、河川水など）に対して、
本発明の核酸断片上の塩基配列をプライマーとして用い
てＰＣＲ反応を行うことにより、病原性キサントモナス
・カンペストリスが自然環境中に存在するか否かを迅速
かつ簡便に調査することができる。ＰＣＲを行う方法は
この分野において周知であり、そのためのキット及び装
置も市販されている。本発明は、この核酸増幅法に用い
られるプライマーを提供する。
ンペストリスに特異的な染色体ＤＮＡ領域の塩基配列が
明らかになったので、この領域を特異的に増幅させるＰ
ＣＲ等の核酸増幅法によっても病原性キサントモナス・
カンペストリスを検出することができる。すなわち、自
然環境中の試料（植物、土壌、河川水など）に対して、
本発明の核酸断片上の塩基配列をプライマーとして用い
てＰＣＲ反応を行うことにより、病原性キサントモナス
・カンペストリスが自然環境中に存在するか否かを迅速
かつ簡便に調査することができる。ＰＣＲを行う方法は
この分野において周知であり、そのためのキット及び装
置も市販されている。本発明は、この核酸増幅法に用い
られるプライマーを提供する。
【００１８】本発明のプライマーは、上記した本発明の
核酸断片中の連続する１５〜５０塩基から成る塩基配列
を有する核酸から成る。塩基数は好ましくは２０〜３０
である。プライマーは、本発明の核酸断片上のいずれの
領域にあるものであってもよい。好ましいフォワード側
プライマーとして配列表の配列番号２に示される塩基配
列を有する、２５塩基から成るもの（以下、「Ｓ７−１
１プライマー」）、好ましいリバース側プライマーとし
て配列番号３に示される塩基配列を有する、２５塩基か
ら成るもの（以下、Ｓ７−１２プライマー」）を挙げる
ことができるが、これらに限定されるものではない。Ｓ
７断片を鋳型ＤＮＡとし、Ｓ７−１１プライマー及びＳ
７−１２プライマーのセットを用いてＰＣＲを行うと、
３０９塩基から成る領域が増幅される。本発明のプライ
マーは、化学合成により容易に調製することができる。
核酸断片中の連続する１５〜５０塩基から成る塩基配列
を有する核酸から成る。塩基数は好ましくは２０〜３０
である。プライマーは、本発明の核酸断片上のいずれの
領域にあるものであってもよい。好ましいフォワード側
プライマーとして配列表の配列番号２に示される塩基配
列を有する、２５塩基から成るもの（以下、「Ｓ７−１
１プライマー」）、好ましいリバース側プライマーとし
て配列番号３に示される塩基配列を有する、２５塩基か
ら成るもの（以下、Ｓ７−１２プライマー」）を挙げる
ことができるが、これらに限定されるものではない。Ｓ
７断片を鋳型ＤＮＡとし、Ｓ７−１１プライマー及びＳ
７−１２プライマーのセットを用いてＰＣＲを行うと、
３０９塩基から成る領域が増幅される。本発明のプライ
マーは、化学合成により容易に調製することができる。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２０】実施例１ Ｓ７断片の単離及び塩基配列決
定並びに病原性キサントモナス・カンペストリスのＲＦ
ＬＰ キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ポアＭＢ
２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）の染色体ＤＮＡを
常法により抽出し、ＳａｌＩで切断した。得られた各断
片をクローニングし、市販のキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製の「ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ」）を用いて各断片を標識した。
定並びに病原性キサントモナス・カンペストリスのＲＦ
ＬＰ キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ポアＭＢ
２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０７８）の染色体ＤＮＡを
常法により抽出し、ＳａｌＩで切断した。得られた各断
片をクローニングし、市販のキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製の「ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ」）を用いて各断片を標識した。
【００２１】一方、キサントモナス・カンペストリス・
パソバー・ポア、キサントモナス・カンペストリス・パ
ソバー・グラミニス、キサントモナス・カンペストリス
・パソバー・フレイ、キサントモナス・カンペストリス
・パソバー・アルヘナセリ、キサントモナス・カンペス
トリス・パソバー・トランスルーセンス、キサントモナ
ス・カンペストリス・パソバー・ウンドゥロサ、キサン
トモナス・カンペストリス・パソバー・ホルデイ、キサ
ントモナス・カンペストリス・パソバー・カンペストリ
ス、プセウドモナス・グルメからＤＮＡを抽出し、抽出
したＤＮＡを４種類の制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩで別々に切断した。３マイクロ
グラムの切断されたＤＮＡ断片を、0.7%濃度のアガロー
スを用いたアガロースゲル電気泳動法により分離した
後、標識した上記の各断片をプローブとしてサザンブロ
ットハイブリダイゼーションを行った。ブロティング・
メンブレンには、ＰＡＬＬ社製のバイオダインＡを用
い、シグナルの検出にはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ社製の「ＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ」を使用した。また、ハイブリダイゼーシ
ョン反応は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
社の説明書である「Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕ
ｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」に従い６８℃下、１６時間行
った。なお、上記細菌のうち、イネ科植物に対する非病
原性キサントモナス・カンペストリスはキサントモナス
・カンペストリス・パソバー・カンペストリスであり、
その他のキサントモナス・カンペストリスは病原性キサ
ントモナス・カンペストリスである。
パソバー・ポア、キサントモナス・カンペストリス・パ
ソバー・グラミニス、キサントモナス・カンペストリス
・パソバー・フレイ、キサントモナス・カンペストリス
・パソバー・アルヘナセリ、キサントモナス・カンペス
トリス・パソバー・トランスルーセンス、キサントモナ
ス・カンペストリス・パソバー・ウンドゥロサ、キサン
トモナス・カンペストリス・パソバー・ホルデイ、キサ
ントモナス・カンペストリス・パソバー・カンペストリ
ス、プセウドモナス・グルメからＤＮＡを抽出し、抽出
したＤＮＡを４種類の制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩで別々に切断した。３マイクロ
グラムの切断されたＤＮＡ断片を、0.7%濃度のアガロー
スを用いたアガロースゲル電気泳動法により分離した
後、標識した上記の各断片をプローブとしてサザンブロ
ットハイブリダイゼーションを行った。ブロティング・
メンブレンには、ＰＡＬＬ社製のバイオダインＡを用
い、シグナルの検出にはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ社製の「ＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ」を使用した。また、ハイブリダイゼーシ
ョン反応は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
社の説明書である「Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕ
ｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」に従い６８℃下、１６時間行
った。なお、上記細菌のうち、イネ科植物に対する非病
原性キサントモナス・カンペストリスはキサントモナス
・カンペストリス・パソバー・カンペストリスであり、
その他のキサントモナス・カンペストリスは病原性キサ
ントモナス・カンペストリスである。
【００２２】その結果、キサントモナス・カンペストリ
ス・パソバー・ポアＭＢ２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０
７８）の染色体より、制限酵素ＳａｌＩで切り出された
Ｓ７断片をプローブとした場合は、全ての病原性キサン
トモナス・カンペストリスのＤＮＡとハイブリダイズし
たがイネ科植物に対する非病原性キサントモナス・カン
ペストリス及びプセウドモナス・グルメのＤＮＡとはハ
イブリダイズしなかった。これにより、病原性キサント
モナス・カンペストリスに特異的なＤＮＡ断片であるＳ
７断片が得られた。Ｓ７断片の塩基配列を市販のＤＮＡ
シーケンサーで決定した。その塩基配列が上記のように
配列番号１に示されている。
ス・パソバー・ポアＭＢ２１８株（ＮＲＲ−Ｂ−１８０
７８）の染色体より、制限酵素ＳａｌＩで切り出された
Ｓ７断片をプローブとした場合は、全ての病原性キサン
トモナス・カンペストリスのＤＮＡとハイブリダイズし
たがイネ科植物に対する非病原性キサントモナス・カン
ペストリス及びプセウドモナス・グルメのＤＮＡとはハ
イブリダイズしなかった。これにより、病原性キサント
モナス・カンペストリスに特異的なＤＮＡ断片であるＳ
７断片が得られた。Ｓ７断片の塩基配列を市販のＤＮＡ
シーケンサーで決定した。その塩基配列が上記のように
配列番号１に示されている。
【００２３】Ｓ７断片をプローブとして用いた場合の、
各制限酵素で切断したときのサザンブロットの結果を図
１ないし図４に示す。図１は、ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮ
Ａを切断したときのＲＦＬＰパターン、図２は、Ｅｃｏ
ＲＶで染色体ＤＮＡを切断したときのＲＦＬＰパター
ン、図３は、ＳａｌＩで染色体ＤＮＡを切断したときの
ＲＦＬＰパターン、図４は、ＰｓｔＩで染色体ＤＮＡを
切断したときのＲＦＬＰパターンである。図１〜４中の
各レーンの細菌は下記表１に示す通りである。図１〜４
に示されるように、病原性キサントモナス・カンペスト
リスはパソバーのレベルで全て異なったＲＦＬＰパター
ンを示した。以上の結果から、Ｓ７断片をＤＮＡプロー
ブとして用いてＲＦＬＰ解析を行うことにより、病原性
キサントモナス・カンペストリスをパソバーあるいは菌
株のレベルで区別・同定することが可能であった。
各制限酵素で切断したときのサザンブロットの結果を図
１ないし図４に示す。図１は、ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮ
Ａを切断したときのＲＦＬＰパターン、図２は、Ｅｃｏ
ＲＶで染色体ＤＮＡを切断したときのＲＦＬＰパター
ン、図３は、ＳａｌＩで染色体ＤＮＡを切断したときの
ＲＦＬＰパターン、図４は、ＰｓｔＩで染色体ＤＮＡを
切断したときのＲＦＬＰパターンである。図１〜４中の
各レーンの細菌は下記表１に示す通りである。図１〜４
に示されるように、病原性キサントモナス・カンペスト
リスはパソバーのレベルで全て異なったＲＦＬＰパター
ンを示した。以上の結果から、Ｓ７断片をＤＮＡプロー
ブとして用いてＲＦＬＰ解析を行うことにより、病原性
キサントモナス・カンペストリスをパソバーあるいは菌
株のレベルで区別・同定することが可能であった。
【００２４】
【表１】
【００２５】実施例２ 病原性キサントモナス・カンペ
ストリス・パソバー・ポアＪＴ−Ｐ４８２株の環境中か
らの検出 ＪＴ−Ｐ４８２株の懸濁液（２．０×１０4 、２．０×
１０3 、２．０×１０2 コロニー・フォーミング・ユニ
ット／ミリリットル；ｃｆｕ／ｍｌ）、河川水、池水、
殺菌蒸留水に対して上記Ｓ７−１１プライマー及びＳ７
−１２プライマーを用いたＰＣＲ反応を行い、イネ科に
属し芝地の雑草であるスズメノカタビラに対して病原性
を示すＪＴ−Ｐ４８２株を特異的に検出できるか否かを
調査した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製の「ＩｎｓｔａＧｅｎｅ
（登録商標）ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａ
ｔｒｉｘ」を用いて０．１ｍｌのサンプルからＤＮＡを
抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
得られたＤＮＡに対して表２に示した条件でＰＣＲ反応
を行った後、０．０１ｍｌの反応溶液を２．０％濃度の
アガロースゲルに対して電気泳動を行った。
ストリス・パソバー・ポアＪＴ−Ｐ４８２株の環境中か
らの検出 ＪＴ−Ｐ４８２株の懸濁液（２．０×１０4 、２．０×
１０3 、２．０×１０2 コロニー・フォーミング・ユニ
ット／ミリリットル；ｃｆｕ／ｍｌ）、河川水、池水、
殺菌蒸留水に対して上記Ｓ７−１１プライマー及びＳ７
−１２プライマーを用いたＰＣＲ反応を行い、イネ科に
属し芝地の雑草であるスズメノカタビラに対して病原性
を示すＪＴ−Ｐ４８２株を特異的に検出できるか否かを
調査した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製の「ＩｎｓｔａＧｅｎｅ
（登録商標）ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａ
ｔｒｉｘ」を用いて０．１ｍｌのサンプルからＤＮＡを
抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
得られたＤＮＡに対して表２に示した条件でＰＣＲ反応
を行った後、０．０１ｍｌの反応溶液を２．０％濃度の
アガロースゲルに対して電気泳動を行った。
【００２６】
【表２】 *;宝酒造株式会社製LA PCR Kit Ver. 2 を使用。
【００２７】その結果を図５に示した。図５中の各レー
ンは、表３に示す細菌についての結果を示すものであ
る。
ンは、表３に示す細菌についての結果を示すものであ
る。
【００２８】
【表３】
【００２９】このようにイネ科に病原性を示す植物病原
細菌であるキサントモナス・カンペストリス・パソバー
・ポアＪＴ−Ｐ４８２株を予め加えておいたサンプルか
らのみ特異的な約３００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅され、
イネ科に病原性を示す植物病原細菌であるキサントモナ
ス・カンペストリスが存在している可能性の低い河川
水、池水、殺菌蒸留水からは特異的な約３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片は増幅されなかった。以上の結果から、本発明
のＳ７断片上の塩基配列をプライマーとするＰＣＲ反応
を行うことによって、自然環境中に存在するイネ科に病
原性を示す植物病原細菌であるキサントモナス・カンペ
ストリスを迅速に検出することが可能である。
細菌であるキサントモナス・カンペストリス・パソバー
・ポアＪＴ−Ｐ４８２株を予め加えておいたサンプルか
らのみ特異的な約３００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅され、
イネ科に病原性を示す植物病原細菌であるキサントモナ
ス・カンペストリスが存在している可能性の低い河川
水、池水、殺菌蒸留水からは特異的な約３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片は増幅されなかった。以上の結果から、本発明
のＳ７断片上の塩基配列をプライマーとするＰＣＲ反応
を行うことによって、自然環境中に存在するイネ科に病
原性を示す植物病原細菌であるキサントモナス・カンペ
ストリスを迅速に検出することが可能である。
【００３０】
【発明の効果】本発明により、イネ科植物に対して病原
性を示すキサントモナス・カンペストリスを迅速かつ簡
便に高い精度で区別・同定することが可能となる。例え
ば、本発明はイネ科植物の病気の診断に利用することが
できる。迅速に病気の診断が行えるということは、すな
わち早期の治療が可能となる。また、自然環境のような
複雑な微生物叢から、特定の細菌（イネ科植物に対して
病原性を示す細菌）の消長を追うことが可能である。す
なわち、病原細菌の環境中における密度を知ることによ
り、イネ科植物の病気の予防が可能である。
性を示すキサントモナス・カンペストリスを迅速かつ簡
便に高い精度で区別・同定することが可能となる。例え
ば、本発明はイネ科植物の病気の診断に利用することが
できる。迅速に病気の診断が行えるということは、すな
わち早期の治療が可能となる。また、自然環境のような
複雑な微生物叢から、特定の細菌（イネ科植物に対して
病原性を示す細菌）の消長を追うことが可能である。す
なわち、病原細菌の環境中における密度を知ることによ
り、イネ科植物の病気の予防が可能である。
【００３１】また、本発明により、イネ科植物に対して
病原性を示す、日本には存在しない植物病原細菌が種
子、苗等に付着し、日本国内に侵入することを未然に発
見し、これを防ぐことが可能となる。本明細書で記載し
たキサントモナス・カンペストリスに属する植物病原細
菌の中で、キサントモナス・カンペストリス・パソバー
・カンペストリス、キサントモナス・カンペストリス・
パソバー・ポアエ、キサントモナス・カンペストリス・
パソバー・ホルデイ、キサントモナス・カンペストリス
・パソバー・トランスルーセンスを除く植物病原細菌
は、日本国内ではその存在が確認されていない。また、
キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ホルデイ
及びキサントモナス・カンペストリス・パソバー・トラ
ンスルーセンスにおいても牧草であるオーチャードグラ
ス及びプロムグラスの病原菌として報告があるのみで、
主要作物であるオオムギの病原菌としての報告は日本で
はない。従って、上記のイネ科植物に対して病原性を示
すキサントモナス・カンペストリスを、本発明により迅
速に検出、同定することは植物防疫上、重要である。
病原性を示す、日本には存在しない植物病原細菌が種
子、苗等に付着し、日本国内に侵入することを未然に発
見し、これを防ぐことが可能となる。本明細書で記載し
たキサントモナス・カンペストリスに属する植物病原細
菌の中で、キサントモナス・カンペストリス・パソバー
・カンペストリス、キサントモナス・カンペストリス・
パソバー・ポアエ、キサントモナス・カンペストリス・
パソバー・ホルデイ、キサントモナス・カンペストリス
・パソバー・トランスルーセンスを除く植物病原細菌
は、日本国内ではその存在が確認されていない。また、
キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ホルデイ
及びキサントモナス・カンペストリス・パソバー・トラ
ンスルーセンスにおいても牧草であるオーチャードグラ
ス及びプロムグラスの病原菌として報告があるのみで、
主要作物であるオオムギの病原菌としての報告は日本で
はない。従って、上記のイネ科植物に対して病原性を示
すキサントモナス・カンペストリスを、本発明により迅
速に検出、同定することは植物防疫上、重要である。
【００３２】
配列番号：１ 配列の長さ：１２２０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列 GTCGACAGGC GCTTGGCGCA ATACATGGCA TCGTCGGCAT GCGCCAGCAA GGCCTCGGCG 60 CTGTCGGCAT GCTCCGGATA CAGGCTGATG CCGATGCTCA CGCCGAGCCG CAGCGTGTCC 120 TCACCGGCGA TCGCGGGCCG TTCGAAGGCT TCGATCAGCG CCGTGGCGGT CGCCGCGGCA 180 TAGGCGTCGC TGCTCAATCC GGTCAGCACC GCCACGAACT CGTCGCCGCC GTAACGCGCC 240 ACCGTGACGT GCGCATCGAC GATCTCGCCG ATGCGTTCGG CGGCCAGGCG CAGGAAGCGG 300 TCGCCGGTGG CGTGTCCGAG CAGATCGTTG ATCTGCTTGA ACTCGTTGAG ATCCAGGAAC 360 AGCACGGCGA TGCGGTGGTG TTGCGCGTGC GCGGTGGTGA TCGCCAGATT GAGCCGTTCG 420 AACAGCAGTT CGCGGTTCGG CAGGCCGGTC AACGGGTCGC GCTTGGCCTG GCGGTTGGCG 480 TCGTCCAGCG CCAGTTGGTA GGTGACCACC TGCGCCTGGG CGCGCAGCGT GGTCAACACC 540 AGGCGTTCGT TGGCCGCTTT CAGGTCGGTG GCAAGCCCGT GCAATCCATT GTCCTTCAGT 600 GCGATCAGAT CCGTCTGCAG CCGGTCCAGT TCCAGCCGCG CAAGCAGCGA CTGGCGGCGC 660 AGCTGCGACA GCTCGAGCCT GGCCGCGTCG ATGGTGGGTT GTTCGGGGGG CGTATGCATG 720 CCGGCTCAAC CCGTGTCGAG GATGTCGTGC GTGCCGGCCT TGCGCATCGG CCGGCCGCCG 780 AGCAGGCCTT CCTGCTGCGG CAGCGCCGCG CCGATGCGGA TGCCGTCGTC GTCGATCCGG 840 AACTCGCGCA GCGCATCCGA ATGCGCGCTG GCGCGGACCT TGACCACCGC CATCACCCGG 900 CGCAAGCGGC TGTCCACCTC GATATAGCGT TGCACGATGA TCGCATCGGT CATGAACGCA 960 GTGCCGTAGG GACTGAAGCG TAGATCGGTG TAGCGGTCCT CCAGCTCGGA GGTCATCAGC 1020 ACGGTGACGC CGGTCGCGCC CAATGCCACC ACCATGCGCG ACAGCGATTC GCGGAAGTCC 1080 TCGCGGAACG TCGGCGCCAA CGCCAGCTCG AACGCCGACA GCGAATCGAT CACCACGCGG 1140 GTGGCGTCGA GCCGCCCGAT TTCCGCGACC AGCAGCAGCA AGATCTCGTC GATCGACAGG 1200 TCCGGCGCGC GGCTGTCGAC 1220
【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAATCCGGTC AGCACCGCCA CGAAC 25
【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACCTACCAAC TGGCGCTGGA CGACG 25
【図１】ＥｃｏＲＩで各種細菌の染色体ＤＮＡを切断
し、Ｓ７断片をプローブとしてサザンブロットハイブリ
ダイゼーションを行ったときのＲＦＬＰパターンを示す
図である。
し、Ｓ７断片をプローブとしてサザンブロットハイブリ
ダイゼーションを行ったときのＲＦＬＰパターンを示す
図である。
【図２】ＥｃｏＲＶで各種細菌の染色体ＤＮＡを切断
し、Ｓ７断片をプローブとしてサザンブロットハイブリ
ダイゼーションを行ったときのＲＦＬＰパターンを示す
図である。
し、Ｓ７断片をプローブとしてサザンブロットハイブリ
ダイゼーションを行ったときのＲＦＬＰパターンを示す
図である。
【図３】ＳａｌＩで各種細菌の染色体ＤＮＡを切断し、
Ｓ７断片をプローブとしてサザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行ったときのＲＦＬＰパターンを示す図で
ある。
Ｓ７断片をプローブとしてサザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行ったときのＲＦＬＰパターンを示す図で
ある。
【図４】ＰｓｔＩで各種細菌の染色体ＤＮＡを切断し、
Ｓ７断片をプローブとしてサザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行ったときのＲＦＬＰパターンを示す図で
ある。
Ｓ７断片をプローブとしてサザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行ったときのＲＦＬＰパターンを示す図で
ある。
【図５】本発明のプライマーを用いて、環境中の各種検
体をＰＣＲにかけて得られた増幅産物の電気泳動図の模
式図である。
体をＰＣＲにかけて得られた増幅産物の電気泳動図の模
式図である。
Claims (16)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示される塩基配
列、又は該塩基配列において１若しくは複数個の塩基が
欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であって
イネ科植物に対する病原性を有するキサントモナス・カ
ンペストリスの検出能を有する塩基配列を有する核酸断
片。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
又は該配列の一部であって、イネ科植物に対する病原性
を有するキサントモナス・カンペストリスの検出能を有
する塩基配列を有する請求項１記載の核酸断片。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
を有する請求項２記載の核酸断片。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の核酸断片を標識して成る、イネ科植物に対する病原性
を有するキサントモナス・カンペストリスの検出又は同
定用プローブ。 - 【請求項５】 前記核酸断片は、請求項２記載の核酸断
片である請求項４記載のプローブ。 - 【請求項６】 前記核酸断片は、請求項３記載の核酸断
片である請求項５記載のプローブ。 - 【請求項７】 イネ科植物に対する病原性を有するキサ
ントモナス・カンペストリスは、キサントモナス・カン
ペストリス・パソバー・ポア、キサントモナス・カンペ
ストリス・パソバー・グラミニス、キサントモナス・カ
ンペストリス・パソバー・フレイ、キサントモナス・カ
ンペストリス・パソバー・アルヘナセリ、キサントモナ
ス・カンペストリス・パソバー・トランスルーセンス、
キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ウンドゥ
ロサ又はキサントモナス・カンペストリス・パソバー・
ホルデイである請求項４ないし６のいずれか１項に記載
のプローブ。 - 【請求項８】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の核酸断片の塩基配列を検出することから成る、イネ科
植物に対する病原性を有するキサントモナス・カンペス
トリスの検出方法。 - 【請求項９】 検体ＤＮＡを制限酵素で切断し、切断断
片を電気泳動により分離した後、請求項４ないし７のい
ずれか１項に記載のプローブとハイブリダイズさせ、ハ
イブリダイズしたプローブを検出することから成る、イ
ネ科植物に対する病原性を有するキサントモナス・カン
ペストリスの検出又は同定方法。 - 【請求項１０】 前記制限酵素はＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＳａｌＩ又はＰｓｔＩである請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項１ないし３のいずれか１項に記
載の核酸断片中の連続する１５〜５０塩基から成る塩基
配列を有する核酸から成る、イネ科植物に対する病原性
を有するキサントモナス・カンペストリス検出用プライ
マー。 - 【請求項１２】 前記核酸断片は、請求項２記載の核酸
断片である請求項１１記載のプライマー。 - 【請求項１３】 前記核酸断片は、請求項３記載の核酸
断片である請求項１２記載のプライマー。 - 【請求項１４】 塩基数が２０〜３０である請求項１１
ないし１３のいずれか１項記載のプライマー。 - 【請求項１５】 配列表の配列番号２に示される塩基配
列を有する請求項１４記載のプライマー。 - 【請求項１６】 配列表の配列番号３に示される塩基配
列を有する請求項１４記載のプライマー。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9257513A JPH1175858A (ja) | 1997-09-05 | 1997-09-05 | 新規核酸及びそれを用いた病原性キサントモナス・カンペストリスの検出方法 |
| US09/148,801 US6143500A (en) | 1997-09-05 | 1998-09-04 | Nucleic acids and methods for detecting pathogenic xanthomonas campestris using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9257513A JPH1175858A (ja) | 1997-09-05 | 1997-09-05 | 新規核酸及びそれを用いた病原性キサントモナス・カンペストリスの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1175858A true JPH1175858A (ja) | 1999-03-23 |
Family
ID=17307354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9257513A Pending JPH1175858A (ja) | 1997-09-05 | 1997-09-05 | 新規核酸及びそれを用いた病原性キサントモナス・カンペストリスの検出方法 |
Country Status (2)
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|---|---|
| US (1) | US6143500A (ja) |
| JP (1) | JPH1175858A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101367996B1 (ko) * | 2011-11-25 | 2014-02-28 | 대한민국 | 곡류세균병균 검출용 프라이머 세트 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3154633B2 (ja) * | 1994-12-28 | 2001-04-09 | 三菱レイヨン株式会社 | ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子 |
-
1997
- 1997-09-05 JP JP9257513A patent/JPH1175858A/ja active Pending
-
1998
- 1998-09-04 US US09/148,801 patent/US6143500A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6143500A (en) | 2000-11-07 |
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