JPS63294791A

JPS63294791A - ベクタ−、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現方法

Info

Publication number: JPS63294791A
Application number: JP62130800A
Authority: JP
Inventors: Tomomasa Kanda; 智正神田; Kaoru Saigo; 薫西郷; Ichiro Shibuya; 一郎渋谷
Original assignee: NIKKA UISUKII KK; Nikka Whisky Distilling Co Ltd
Current assignee: NIKKA UISUKII KK; Nikka Whisky Distilling Co Ltd
Priority date: 1987-05-27
Filing date: 1987-05-27
Publication date: 1988-12-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はベクター、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現
方法に関する。

ここでいう蛋白質とは、アミノ酸を複数個含むポリペプ
チドを指すものである。

［従来の技術］遺伝子工学的手法による蛋白質の発現や、蛋白工学等の
バイオテクノロジー利用技術の開発が盛んに行なわれる
ようになってきた今日、より優れた技術開発が大いに期
待されている。以上の蛋白工学の中でも、蛋白質（酵素
）の改良や解析は重要な役割を有しており、今後益々の
発展が期待されている。

従来、外来遺伝子のクローニングおよび蛋白質の発現用
として、大腸菌を宿主とするｐＵＣベクターが市販され
ている。このｐＵＣベクターは第２図に示すように、複
製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクトースプロ
モーター、オペレーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ＪＬａｃＺ’）およびマルチクローニングサイトより
構成されている。このｐＵＣベクターは、ジデオキシ法
によるＤＮＡシークエンシングに適したプラスミドベク
ターであり、１ａｃＺ’領域内にマルチクローニングサ
イトを持っており、イソプロピルβ−チオ−ガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＯ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−ガラクトサイド（Ｘ−ｇａ文）を含むプレ
ート上で、外来ＤＮＡ　（目的とするＤＮＡ）の挿入の
有無を容易に色の変化（青→白）によって判別すること
ができるものである。また、ラクトースプロモーターを
利用して外来遺伝子を発現することもできるものである
。

［発明が解決しようとする問題点］しかしながら、従来はクローニングサイトがＥｃｏＲＩ
　、ＨｉｎｄＩ［［，５ｅａｌ　、Ｂａｎ旧、Ｓａｌ　
Ｔ、Ａｃｃｌ、Ｈｉｎｃ　ＩＩ　。

Ｐｓｔｌ　（フレームを考えないものでは５ａｃｌ、Ｘ
ｂａｌ。

５ｐｈｌ、Ｋｐｎｌ　）であったが、制限酵素の種類が
増えてきた今日、クローニングサイトのマルチ化の確立
が必要となってきた。

そこで、本発明では、そのための新しいポリリンカー作
製の一つとして全く新規なポリリンカーを有するベクタ
ー及びベクターシリーズの作製を行った。

［問題点を解決するための手段］本発明は上記従来における問題点を解決した、新規なベ
クター、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現方法を提供
することを目的とする。そして、その目的は、本発明に
よれば、複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラク
トースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子及び制限酵素ＥｃｏＲＩ、５ａｃｋ、　Ｅｃ
ｏＲＶ、Ｎｃｏｌ、　Ｂａｎ　ＩＩ　、Ｋｐｎｌ、（：
ｌａｌ、Ｍｌｕｌ、Ｘｈｏｌ、Ｈｉｎｄ　ｍの各切断部
位を持つマルチクローニングサイトを有してなるベクタ
ー（第１発明）、複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝
子、ラクトースプロモーター、オペレーター、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子及び制限酵素ＥｃｏＲＩ　。

５ａｃｌ、　ＥｃｏＲＶ、ＮｃｏＩ、　ＢａｆＬＩＩ　
、Ｋｐｎｌ、Ｃ１ａｌ、Ｍｌｕｌ、Ｘｈｏｌ、旧ｎｄ　
ｍの各切断部位を持つマルチクローニングサイトを有し
てなるベクター３種類からなるベクターシリーズであっ
て、該ベクターシリーズは前記切断部位のアミノ酸に対
応するフレームを３種類すべて有するものであるベクタ
ーシリーズ（第２発明）、複製開始信号、アンピシリン
耐性遺伝子、ラクトースプロモーター、オペレーター、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素ＥｃｏＲＩ　
、５ａｃｌ、　ＥｃｏＲＶ、Ｎｃｏｌ、　Ｒａｎ　ＩＩ
　、Ｋｐｎｌ、Ｃ１ａｌ、Ｍｌｕｌ、Ｘｈｏｌ、Ｈｉｎ
ｄ　ｍの各切断部位を持つマルチクローニングサイトを
有してなるベクター３種類からなるベクターシリーズて
あって、該ベクターシリーズは前記切断部位のアミノ酸
に対応するフレームを３種類すべて有するものであるベ
クターシリーズの中から所望のベクターを選択し、その
ベクターおよび蛋白質をコードしている遺伝子を所定の
制限酵素にて切り出した後両者を結合することにより、
色の変化を判別して蛋白質をコードしている遺伝子を検
出することを特徴とする特定遺伝子の検出方法（第３発
明）、および複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、
ラクトースプロモーター、オペレーター、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子及び制限酵素ＥｃｏＲＩ、５ａｃｌ、　
ＥｃｏＲＶ、Ｎｃｏｌ、　Ｒａ１ＩＩ　、Ｋｐｎｌ、Ｃ
１ａｌ、Ｍｌｕｌ、Ｘｈｏｌ、旧ｎｄ　ｍの各切断部位
を持つマルチクローニングサイトを有してなるベクター
３種類からなるベクターシリーズであって、該ベクター
シリーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレーム
を３種類すべて有するものであるベクターシリーズの中
から蛋白質をコードしている遺伝子の５′末端のフレー
ムの合うベクターを選択し、所定の制限酵素にて切り出
した後両者を結合し、大腸菌に導入し、蛋白質を発現す
ることを特徴とする特定蛋白質の発現方法（第４発明）
、により達成することがてきる。

本発明のベクターの特徴は、クローニングサイトとして
制限酵素ＥｃｏＲＩ、５ａｃＩ、　ＥｃｏＲＶ、Ｎｃｏ
ｌ、　ＢａｎＵ　、Ｋｐｎｌ、Ｃ１ａｌ、Ｍｌｕｌ、Ｘ
ｈｏｌ、Ｈｉｎｄ　ｍの各切断部位の塩基配列を有して
いることである。

このベクターの一例は、第１図に示す如く、複製開始信
号、アンピシリン耐性遺伝子（Ａ■ｐつ、ラクトースプ
ロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝
子（ＪＬａｃＺ’）及びクローニングサイトとしての制
限酵素ＥｃｏＲＩ、５ａｃｌ、　ＥｃｏＲＶ、Ｎｃｏｒ
、　ＢａｎＵ、Ｋｐｎｌ、Ｃ１ａｌ、ＭｌｕＩ、Ｘｈｏ
ｌ、旧ｎｄ　ＩＩＩの各切断部位の塩基配列から構成さ
れているものであり、また他の例としては、さらにＭ１
３ファージＤＮＡの遺伝子開領域（１０）を有してなる
ものもあり、Ｍ１３ファージＤＮＡのＩＧを有するベク
ターの場合、−末鎖ブラスミドが直接回収でき、ジデオ
キシ法によるＤＮＡシーケンシング及び部位特異的突然
変異体作成が容易になるという利点かある。

本発明のベクターは、従来公知のｐＵｃ１１８／ｐＵｃ
ｌ１９ベクター及びｐＵＣ８／ｐＵＣ９ベクターくいず
れも宝酒造■販売）のマルチクローニングサイトを、新
規のマルチクローニングサイトに置換したもの、および
そのマルチクロニングサイトのアミノ酸のフレームを１
塩基（−１）ずらしたもの、さらに２塩基（−２）ずら
したものである。これらベクターのマルチクローニング
サイトを第１表に示す。

本発明のベクターは、前記の通り、マルチクローニング
サイトとして制限酵素ＥｃｏＲＩ、５ａｃｌ、　Ｅｃｏ
ＲＶ、Ｎｃｏｌ、　Ｂａｉ■、にｐｎｌ、Ｃ１ａＩ、Ｍ
ｌｕｌ、Ｘｈｏｌ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩの各切断部位の塩
基配列を有しており、また、前記切断部位のアミノ酸に
対応するフレームを３種類すべて取り揃えてベクターシ
リーズとし、且ついずれのベクターにおいてもマルチク
ローニングサイト内に終止コドンを有しないことを特徴
としている。

［発明の効果］このベクターシリーズを用いることにより、蛋白質をコ
ードしている遺伝子を検出することができる。すなわら
、ベクターシリーズの中から所望のベクターを選択し、
そのベクター及び目的の蛋白質をコードする遺伝子を所
定の制限酵素により切断し、ＤＮＡリガーゼ等の連結酵
素により結合すると、色の変化を判別すること１例えば
白←青により蛋白質をコードしている遺伝子を検出する
ことができる。

さらに、本発明のベクターシリーズによれば、蛋白質を
コードしている遺伝子の５′末端のフレームの合うベク
ターを前記ベクターシリーズから選択し、所定の制限酵
素にて切り出した後、両者を結合し、大腸菌に導入する
ことにより蛋白質を発現させることか可能になるという
利点を有する。

［実施例］以下、本発明を実施例に基いて、詳細に説明する。

まず、本発明のベクターの作成方法から説明する。

■ｐＵｃ１０９０の作成 ■）プラスミドｐＵＣ９（１０弘ｇ）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄｍ（５０単位）を用い
て３７°Ｃにて１時間反応させた後、分解産物を０．７
％アガロース電気泳動を用いて分離しＥｃｏＲ１切断部
位から旧ｎｄｍ切断部位までのポリリンカー断片（３０
塩基対）をゲルより切り出し、フェノール処理を行なう
ことにより精製した。

２）プラスミドｐＵｃ１１９　（１０ＩＬｇ）を制限酵
素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄｍ（５０単位
）を用いて３７℃にて１時間反応させた後、分解産物を
０．７％アガロース電気泳動を用いて分離しＥｃｏＲｒ
切断部位から旧ｎｄＩＩＩ切断部位までのポリリンカ一
部分を含まない断片（約：ｌ、１００塩基対）をゲルよ
り切り出し、フェノール処理を行なうことにより精製し
た。

３）１）で得られたポリリンカー断片ｏ、ｏｔＪＬｇと
２）で得られたポリリンカーを含まない断片０．ｌＩＬ
ｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて４
°Ｃ１１２時間連結反応を行なった。

４）３）て得られた反応生成物を、大腸菌ＪＭ８３株（
ａｒａ、Δ（Ｉａｃ−ｐｒｏＡＢ）、ｒｐｓＬ、φ８０
．ＩａｃＺΔ緬１５）を用いて形質転換を行なった後、
受容菌を寒天１．５％及びアンピシリンを１ｍ５Ｌ当り
１００ルｇを含むＬ寒天培地（組成：ｌ見当りトリプト
ンｌｏｇ、イーストエキス５ｇ、食塩ｔｏｇ、ｐＨ７，
５）に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を行ないいくつか
のコロニー（形質転換体）を得た。

５）コロニーの一つをアンピシリンを１ｍＭあたりｌｏ
ｏｇｇ含むＬ液体培地１０ｍＪｌｌに移植し、３７°Ｃ
にて１２時間振どう培養を行ない、アルカリ＝ＳＤＳ法
によりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドＰＵＣ１
０９０を得た。

■ＰＵＣ１０８０の作成 ■ｐＵｃ１０９０の作成方法のうち、ｌ）のプラスミド
ＤＮＡとしてｐｕｃｓを、又２）のプラスミドＤＮＡと
してｐＵｃ１１８を用いることにより、同様の操作を経
て、プラスミドｐＵｃ１０８０を作成した。

次いで、ｐＵｃ１０９１の作成方法を説明するが、まず
ｐＵｃ１０９０とｐＵｃ１０９１．ｐＵＣ１０９２の関
係をいうと、ｐＵｃ１０９０のポリリンカ一部分をはさ
んで、前部で１塩基、後部で２塩基欠失させたものがｐ
Ｕｃ１０９１で、ｐＵＣ１０９０のポリリンカ一部分を
はさんで、前部で２塩基、後部で１塩基欠失させたもの
がｐＵＣ１０９２である。また、ｐＵｃ１０８０とｐｕ
Ｃ１０８１，ＰＵＣ１０８２の関係も、上記と同様であ
る。

■ｐＵｃ１０９１の作成ｐＵｃ１０９１は次の段階にわけて作成した。

１）ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成２）ポリリ
ンカ一部位の前部より一塩基欠いたオリゴヌクレオチド
の合成３）　　１）２）を用いた突然変異体の作成４）突然変
異体より一本鎖ＤＮＡの作成５）ポリリンカ一部位の後
部より２塩基欠いたオリゴヌクレオチドの合成６）　　４）５）を用いた再突然変異体の作成（ｐＵｃ
■−１）ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成■ｐＵｃ１０９
０を大腸菌ＭＶ１１８４株（ａｒａ。

Δ（Ｉａｃ−ｐｒｏ）　、５ｔｒＡ、ｔｈｉ、（φ８０
　、１ａｃＺ△Ｍ１５）、Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０
６：：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ’）、Ｆ’　　：ｔｒａＤ３６
．ｐｒｏＡＢ。

１ａｃＩｑＺ△Ｍ１５）を用いて形質転換を行なった。

■形質転換体を、アンピシリンを１　ｍ　ｌ当り１００
ｇｇ含む２ｘＹＴ液体培地（組成：ｌｉ当りトリプトン
１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、ｐＨ７，６
）１０ｍＭに植菌し、３７℃にて１２時間振どう培養を
行なった。

■　■で得られた培養液１ＯＯＪＬ！ｌに、Ｍ１３に０
７由来のへルバーファージ液（１０”ｐｆｕ／ｍ　１）
を加え、３７°Ｃで３０分間静匿した後、アンピシリン
をｌ　ｍ　ｌ当り１５０．ｇ、カナマイシンを１ｍｇ、
当り７０．ｇ、チアミンを０．０１％含む２ＸＹＴ液体
培地１０　ｍ　ｌに加え、３７℃にて２４時間振どう培
養を行なった。

■培養液１ｍＪＬを取り、遠心分離により菌体を除いた
後、２０％ＰＥＧ６０００及び２．５ＭＮａＣ１混合溶
液を２００１Ｌｉ加え遠心分離を行なうことにより、フ
ァージ粒子を沈殿させた。以下、フェノール処理、クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿処理を行なうことにより
、１本鎖ＤＮＡを分離精製し、最終的に５０μ文のＴＥ
溶液（１０ｍＭ　　）リス塩酸、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、
ｐＨ８，０の溶液）に溶解させた。

収量は約２〜ｌＯＩＬｇ程度であった。

■−２）部　を含む合成りＮＡの作ＤＮＡ合成機を用いて第２表に示すＮｏ、９−１−５な
る配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Ｔ４ＤＮ
Ａキナーゼ（２単位）を用いて３７℃にて１時間反応を
行ない、５′末端部分をリン酸化させ、ブライマーＤＮ
Ａとした。

■−３）ポリリンカー１部に　　な　　る　１．　　　の１虞 ■−１）で得られた一本銀ＤＮＡＩ終ｇと、■−２）で
得られたブライマーＤＮＡ　　２０ｐｍｏ文を混合して
６０℃で３０分間、引続き３７℃で３０分間保温し、ア
ニーリングさせた後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びＴＴＰを最終濃度か各々０．５ｍＭとなるように加え
、およびＡＴＰを２５　ｐ　ｍ　ｏ　ｎ加え、クレノー
（ＫＬＥＮＯＷ）酵素（４単位）及びＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（１単位）を用いて３７℃にて３時間反応を行ない、
突然変異部分を含む２本鎖ＤＮＡを合成した。

次に１反応生成物の一部（約０．１ｇｇ）を大腸菌ＪＭ
８３株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を１．５
％寒天、アンピシリンをｌ　ｍ　ｌ当りｌ１００ＪＬ及
びＸ−ｇａｌを０．００５％含むし寒天培地に塗布し、
３７℃にて一昼夜培養を行ない、出現したコロニーの内
、白色コロニーを選択した。白色コロニーの出現率は５
〜１０％程度であった。

次いで、白色コロニーを、アンピシリンをｉｎ見当り１
１００ＩＬ含むＬ液体培地１０　ｍ　４１に移植し、３
７℃にて１２時間振どう培養を行ない、常法によりプラ
スミドＤＮＡを回収した０回収したプラスミドＤＮＡを
再び大腸菌ＭＶ１１８４株を用いて形質転換を行なった
後、受容菌を寒天１５％、アンピシリンを１ｍｊＬ当り
１００ｇｇ、Ｘ−ｇａｌ−をｏ、ｏｏｓ％及びＩ　ＰＴ
Ｇを１ｍＭ含むし寒天培地に塗布し、３７℃にて二昼夜
培養を行ない、白色コロニーを選択し、アンピシリンを
１ｍＪＬ当り１００＃Ｌｇ含むＬ液体培地Ｉｏｎ見に移
植し、３７℃にて一昼夜振どう培養を行ない、常法によ
りプラスミドＤＮＡを分離した。

■−４）−−ＤＮＡの作 ■−３）で得られた突然変異体プラスミドを有する大腸
菌ＭＶ１１８４株より、■−１）と全く同じ方法を用い
て突然変異を有する一本鎖ＤＮＡを得た。

■−２）と同じ方法を用いて第２表のＮｏ、９−２−５
なる塩基配列を有する合成りＮＡを作成し、リン酸化を
行ないブライマーＤＮＡを作成した。

■−６）再−然変異　の作成 ■−３）と同じ方法を用いて、■−４）で得られた一本
鎖ＤＮＡ及び■−５）で得られたブライマーＤＮＡより
二本＃１ＤＮＡを合成、大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質
転換を行なうことにより青色コロニーを得た。これより
プラスミドＤＮＡを回収し、再び大腸菌ＭＶ１１８４株
を用いて形質転換を行なうことにより青色コロニーを出
現させた。これよりプラスミドＤＮＡを回収することに
より、ポリリンカ一部分の前後２個所に合計３塩基対欠
失したプラスミドｐＵｃ１０９１を得た。

■ｐＵｃ１０９２の作成プラスミドｐＵｃ１０９２の作成は、前記■のプラスミ
ドｐＵｃ１０９１の作成例に準じて行なった。変更点は
次の通りである。

（１）■−２）の塩基配列を第２表のＮｏ、９−１−３
とする。

（２）■−５）の塩基配列を第２表のＮｏ、９−１−５
とする。

これによりプラスミドｐＵｃ１０９０よりポリリンカ一
部分の前部を２塩基、後部を１塩基、合計３塩基欠いた
突然変異プラスミドｐＵｃ１０９２を得た。

■ｐＵｃ１０８１．ｐＵｃ１０８２の作成前記■■■と
同様に、プラスミドｐＵｃ１０８０を基本としてポリリ
ンカ一部分を１塩基および２塩基ずらした突然変異プラ
スミドｐＵｃ１０８１、ｐＵｃ１０８２を作成した。

変更点は次の通りである。

（１）ｐＵｃ１０８１．ｐＵｃ１０８２共に、■−１）
のプラスミドとしてｐｕｃ　１０８０を用いた。

（２）■−２）の合成りＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
おいては第２表のＮｏ、８−１−５、ｐＵＣ１０８２に
おいてはＮｏ、８−２−５を用いた。

（３）■−５）の合成りＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
おいては第２表のＮｏ、８−１−３、ｐＵＣ１０８２に
おいてはＮｏ、８−１−５を用いた。

以上、基本となるプラスミドＰＵＣ１０９０、ｐＵｃ１
０８０及び作成した突然変異プラスミドｐＵｃ１０９１
．ｐＵｃ１０９２、ｐＵｃ１０８１及びＰＵＣ１０８２
の間の関係についてまとめると、第３表のとおりとなる
。

（以下、余白）第　　２　　表合成りＮＡの塩基配列表変異部分を含むＤＮＡ塩基配列５’　ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣ３’
５’　ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
５’　ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
第　　３　　表つぎに、本発明に係るｐＵｃＡの作成例を説明する。

■ｐＵｃＡ１０９０の作成１）プラスミドｐＵｃ１０９０　１０ＩＬｇを制限酵素
ＥｃｏＲＩ　　（１０単位）及び旧ｎｄＩ［Ｉ（１０単
位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応を行ない、分解産
物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離し、ポリ
リンカ一部分を含まないＥｃｏＲＩ切断部位及び旧ｎｄ
ＩＩＩ切断部位を含むＤＮＡ断片（約３１００塩基対）
をゲルより切り出し、フェノール処理を行なうことによ
り精製した。

２）ＤＮＡ合成機を用いて第４表に示した塩基配列を有
するポリリンカーの玉鎖、下調を合成し、各々ｌＪＬｇ
づつを混合し、７０℃に３０分間保温し、その後室温に
て徐々に冷却することによりアニーリングを行なった。

３）１）で得られたＤＮＡ断片ｏ、ｉＩＬｇと、２）で
得られたポリリンカ一部分０．ＯＩＪＬｇを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて４℃にて１２時間
連結反応を行なった。反応液を大腸菌ＭＶ１１８４株を
用いて形質転換を行なった後、受容菌を寒天１．５％、
アンピシリンを１ｍＪＬ当りｌｏｏｓｔｇ含むＬ寒天培
地に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜培養を行なうことによ
り形質転換体コロニーを得た。次いで該コロニーをアン
ピシリンを１ｍ文当り１００μｇ含むし液体培地１０ｍ
文に植菌し、３７°Ｃにて１２時時間上う培養を行ない
、常法によりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐ
ＵｃＡ１０９０を得た。

■以下、同様の操作を行なうことにより、ｐＵＣ１０９
１よりｐＵｃＡ１０９１、ｐＵｃ１０９２よりｐＵｃＡ
１０９２．ｐｕｃｔｏｓｏよりｐｕＣＡ１０８０．ｐＵ
ｃ１０８１よりｐＵｃＡｌ。

８１、ｐＵｃ１０８２よりｐＵｃＡ１０８２を作成した
。

■　　ＵＣＡ９０、　Ａ９１．　　Ａ９２、　Ａ８０、
　ＡＩ）プラスミドｐＵＣ９ｓＪＬｇを制限酵素Ｐｖｕ
■（２４単位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応を行な
った後、分解産物を０．７％アガロース電気泳動を用い
て分離し、ポリリンカ一部分を含まないＤＮＡ断片（約
２３００ｋＭ、Ｍ対）をゲルより切り出し、精製した。

２）プラスミドｐＵｃＡ１０９０　５川ｇを同じく制限
酵素ＰｖｕＩＩ（２４単位）を用いて３７°Ｃにて１時
間反応を行なった後、分解産物を０．７％アガロース電
気泳動を用いて分離し、ポリリンカ一部分を含むＤＮＡ
断片（約３００塩基対）をゲルより切り出し、精製した
。

３）１）で得られたｐＵＣ９由来のＤＮＡ断片０．２終
ｇ及び２）で得られたｐ　Ｕ　Ｃ−Ａ　１０９０由来の
ＤＮＡ［ｉ片０．０５７ｔｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（２単位）を用いて４℃、１２時間連結反応を行な
った後、大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転換を行ない、
受容菌を寒天１．５％、アンピシリンを１ｍ４１当り１
１００ＪＬ含むＬ寒天培地に塗布し、３７°Ｃにて一昼
夜培養を行ない形質転換体コロニーを得た。コロニーを
、アンピシリンを１ｍＭ当り１００．ｇ含むＬ液体培地
に植菌し、３７°Ｃにて１２時間振どう培養を行ない、
常法によりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＵ
ＣＡ９０を得た。

４）２）においてｐＵｃＡ１０９０の代りにｐＵＣＡ１
０９１を用いることにより、同様の操作を経てｐＵｃＡ
９１を作成、以下、ｐＵｃＡ１０９２よりｐＵＣＡ９２
．ｐＵｃＡ１０８０よりｐＵＣＡ８０、ｐＵｃＡ１０８
１よりｐＵｃＡ８１、ｐＵｃＡ１０８２よりｐＵＣＡ８
２を各々作成した。

次に、本発明のｐＵＣＡベクターシリーズを用いて大腸
菌のテトラサイクリン耐性遺伝子のサブクローン化を行
なった。

（実施例）１）大腸菌のテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラ
スミドｐＢＲ３２２（宝酒造■販売）１０ＪＬｇを、制
限酵素ＥｃｏＲＶ　　（１０単位）及びＡｃｃ　ｍ（１
０単位）を用いて、３７°Ｃにて１時間反応を行なった
後、分解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分
離し、ゲルより制限酵素ＥｃｏＲＶサイト及びＡｃｃ　
ｍサイトを有する大腸菌のテトラサイクリン耐性遺伝子
のＤＮＡ断片（約１５００塩基対）を切り出し、フェノ
ール処理を行なうことにより精製した。

２）プラスミドｐＵｃＡ１０９０　１０ｐｇを制限酵素
ＥｃｏＲＶ　　（１０単位）及びＡｃｃＩＩＩ（１０単
位）を用いて、３７℃にて１時間反応を行なった後、分
解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離し、
ゲルより制限酵素ＥｃｏＲＶサイトよりＡｃｅ　ｍサイ
トまでを有する大きい方のＤＮＡ断片（約１５００塩基
対）を切り出し、フェノール処理を行なうことにより精
製した。

３）次に、ｌ）て得られたＤＮＡＰＦｒ片０．１ｇｇと
２）で得られたＤＮＡ断片０．１ｇｇを混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（２単位）を用いて４℃、１２時間連結反
応を行なった後、反応液を大腸菌Ｃ５Ｈ１６株を用いて
形質転換を行なった。受容菌を１．５％寒天及びアンピ
シリンをｌ　ｍ　ｌ　Ｓ　’）１００ＪＬｇ含むＬ寒天
培地に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜培養を行ない、形質
転換体コロニーを得た。

木形質転換体コロニーは、プラスミドｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＶサイト及びＡｃｃ　ｍサイトに大腸菌のテトラ
サイクリン耐性遺伝子のＥｃｏＲＶサイトからＡｃｃ　
ｍサイトまでのＤＮＡｌｔＪ片がクローン化されたプラ
スミドを有している。

以上の実施例の結果より、大腸菌のテトラサイクリン耐
性遺伝子のクローン化を容易に行なうことができること
がわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係るベクターの一例の遺伝子地図、第
２図は従来のベクターの遺伝子地図、を夫々示すもので
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクト
ースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子及び制限酵素ＥｃｏＲ I 、Ｓａｃ I 、Ｅｃｏ
ＲＶ、Ｎｃｏ I 、ＢａｌII、Ｋｐｎ I 、Ｃｌａ I 、
Ｍｌｕ I 、Ｘｈｏ I 、ＨｉｎｄIIIの各切断部位を持
つマルチクローニングサイトを有してなるベクター。
（２）さらにＭ１３ファージＤＮＡのＩＧを含んでなる
特許請求の範囲第１項記載のベクター。
（３）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクト
ースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子及び制限酵素ＥｃｏＲ I 、Ｓａｃ I 、Ｅｃｏ
ＲＶ、Ｎｃｏ I 、ＢａｌII、Ｋｐｎ I 、Ｃｌａ I 、
Ｍｌｕ I 、Ｘｈｏ I 、ＨｉｎｄIIIの各切断部位を持
つマルチクローニングサイトを有してなるベクター３種
類からなるベクターシリーズであって、該ベクターシリ
ーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３
種類すべて有するものであるベクターシリーズ。
（４）各ベクターは、さらにＭ１３ファージＤＮＡのＩ
Ｇを含むものである特許請求の範囲第３項記載のベクタ
ーシリーズ。
（５）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクト
ースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子及び制限酵素ＥｃｏＲ I 、Ｓａｃ I 、Ｅｃｏ
ＲＶ、Ｎｃｏ I 、ＢａｌII、Ｋｐｎ I 、Ｃｌａ I 、
Ｍｌｕ I 、Ｘｈｏ I 、ＨｉｎｄIIIの各切断部位を持
つマルチクローニングサイトを有してなるベクター３種
類からなるベクターシリーズであって、該ベクターシリ
ーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３
種類すべて有するものであるベクターシリーズの中から
所望のベクターを選択し、そのベクターおよび蛋白質を
コードしている遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した
後両者を結合することにより、色の変化を判別して蛋白
質をコードしている遺伝子を検出することを特徴とする
特定遺伝子の検出方法。
（６）各ベクターは、さらにＭ１３ファージＤＮＡのＩ
Ｇを含むものである特許請求の範囲第５項記載の特定遺
伝子の検出方法。
（７）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクト
ースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子及び制限酵素ＥｃｏＲ I 、Ｓａｃ I 、Ｅｃｏ
ＲＶ、Ｎｃｏ I 、ＢａｌII、Ｋｐｎ I 、Ｃｌａ I 、
Ｍｌｕ I 、Ｘｈｏ I 、ＨｉｎｄIIIの各切断部位を持
つマルチクローニングサイトを有してなるベクター３種
類からなるベクターシリーズであって、該ベクターシリ
ーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３
種類すべて有するものであるベクターシリーズの中から
蛋白質をコードしている遺伝子の５′末端のフレームの
合うベクターを選択し、所定の制限酵素にて切り出した
後両者を結合し、大腸菌に導入し、蛋白質を発現するこ
とを特徴とする特定蛋白質の発現方法。
（８）各ベクターは、さらにＭ１３ファージＤＮＡのＩ
Ｇを含むものである特許請求の範囲第７項記載の特定蛋
白質の発現方法。