JPS624233A - 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法 - Google Patents
組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法Info
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- JPS624233A JPS624233A JP60144368A JP14436885A JPS624233A JP S624233 A JPS624233 A JP S624233A JP 60144368 A JP60144368 A JP 60144368A JP 14436885 A JP14436885 A JP 14436885A JP S624233 A JPS624233 A JP S624233A
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- tpa
- medium
- acid
- trans
- plasminogen activator
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組織性プラスミノーゲン活性化因子の製造法に
関するものである。
関するものである。
組織プラスミノーゲン活性化因子（以下ｔＰＡと略称す
る）は、血栓に対して高い親和性を有し、優れ次血栓溶
解活性を有する。従ってｔＰＡは凝血疾患、特に血栓塞
栓症の治療に使用することができる。
る）は、血栓に対して高い親和性を有し、優れ次血栓溶
解活性を有する。従ってｔＰＡは凝血疾患、特に血栓塞
栓症の治療に使用することができる。
（従来の技術）
プラスミノーゲン活性化因子としては、現在尿から分離
精製されたウロキナーゼおよびストレグトコッカス夙細
菌から分離ｆｆＭされたストレフートキナーゼが血栓溶
解剤として実用に供されている。
精製されたウロキナーゼおよびストレグトコッカス夙細
菌から分離ｆｆＭされたストレフートキナーゼが血栓溶
解剤として実用に供されている。
しかしこれらは血栓に対する親和性が低く、治療に際し
て必要な効果を得るためには大量投与がさけられず、ま
た血中のフィブリノーゲン、プラスミノーゲン等にも作
用して、内出血等の副作用を引き起こすという欠点を有
している。かかる背景において、血栓との親和性が高い
ことに起因して、少量で有効な血栓溶解能を有し、副作
用の少ない新規の血栓溶解剤としてｔＰＡが期待されて
いる。
て必要な効果を得るためには大量投与がさけられず、ま
た血中のフィブリノーゲン、プラスミノーゲン等にも作
用して、内出血等の副作用を引き起こすという欠点を有
している。かかる背景において、血栓との親和性が高い
ことに起因して、少量で有効な血栓溶解能を有し、副作
用の少ない新規の血栓溶解剤としてｔＰＡが期待されて
いる。
ノーマ細胞及び遺伝子組換え技術によってヒトｔＰＡ遺
伝子を持つベクターを挿入された大腸菌、酵母、動物細
胞等の培養液から分１ｌｉｉ精製することにより製造す
ることができる。これら培養液から分離精製されたｔＰ
Ａはその分子形態によって２種類存在することが知られ
ている（ Ｒｌｊｋｅｎ、 Ｄ、ｃ、ら。
伝子を持つベクターを挿入された大腸菌、酵母、動物細
胞等の培養液から分１ｌｉｉ精製することにより製造す
ることができる。これら培養液から分離精製されたｔＰ
Ａはその分子形態によって２種類存在することが知られ
ている（ Ｒｌｊｋｅｎ、 Ｄ、ｃ、ら。
、Ｔ、 ＢｉｏｌＯｈｅｍ、、 Ｖｏｗ ２５６． ｐ
ｐ７０３５−７０４１．４９８１年）。
ｐ７０３５−７０４１．４９８１年）。
たとえば人メラノーマ細胞が分泌する本来のｔＰＡは５
２７個のアミノ酸と若干の糖鎖とから成る一本鎖ｔＰＡ
であるが、培養液中に存在する成る釉のグロテアーゼの
作用を受けて、ポリペプチド鎖中のアミン末端から２７
５番目のアルギニンと２７６番目のインロイシンの結合
部位が切断され、切断された画鋲が１個のジスルフィド
結合によって連なつｋ＝重鎖ｔＰＡに変換される。従っ
て、培養液から通常の方法で精製して得られたｔＰＡは
一本鎖とニー重鎖ｔＰＡは約６９．０００の分子量を有
するが、二本鎖ｔＰＡは３６，０００と３３，０００の
２つの分子量を有することが知られている。
２７個のアミノ酸と若干の糖鎖とから成る一本鎖ｔＰＡ
であるが、培養液中に存在する成る釉のグロテアーゼの
作用を受けて、ポリペプチド鎖中のアミン末端から２７
５番目のアルギニンと２７６番目のインロイシンの結合
部位が切断され、切断された画鋲が１個のジスルフィド
結合によって連なつｋ＝重鎖ｔＰＡに変換される。従っ
て、培養液から通常の方法で精製して得られたｔＰＡは
一本鎖とニー重鎖ｔＰＡは約６９．０００の分子量を有
するが、二本鎖ｔＰＡは３６，０００と３３，０００の
２つの分子量を有することが知られている。
本発明の目的は天然に存在するｔＰＡと同様の一本鎖ｔ
ＰＡを製造し、これを医薬品として治療に供することで
ある。しかしながら、通常の培養法において得られる培
養液中には種々のグロテアーゼが混在するため、産生さ
れ九−重鎖ｔＰＡはその作用を受けて容易に二本鎖ｔＦ
Ａに変換されるため、これらグロテアーゼに対する阻害
剤を培黛前に予め培地中に添加することが必要である。
ＰＡを製造し、これを医薬品として治療に供することで
ある。しかしながら、通常の培養法において得られる培
養液中には種々のグロテアーゼが混在するため、産生さ
れ九−重鎖ｔＰＡはその作用を受けて容易に二本鎖ｔＦ
Ａに変換されるため、これらグロテアーゼに対する阻害
剤を培黛前に予め培地中に添加することが必要である。
この際、該阻害剤の具備すべき条件としては、（イ）阻
害効果が十分大きいこと、（ロ）必要に応じて容易にｔ
ＰＡから除去できること、←１使用に際して安定である
こと、に）工程分析及び製造分子Ｔを阻害しないことが
重要であり、ざらに工業的規模での生産においてμ廉価
であることが必要である。
害効果が十分大きいこと、（ロ）必要に応じて容易にｔ
ＰＡから除去できること、←１使用に際して安定である
こと、に）工程分析及び製造分子Ｔを阻害しないことが
重要であり、ざらに工業的規模での生産においてμ廉価
であることが必要である。
ラ
一本鎖ｔＰＡを得る方法として、Ｃｏ１１０ｎ ｈ （
特開昭５７−２８００９５！ｒ公報）は培地及び精製工
程で使用嘔れるｍ＊液中にグロテアーゼ阻害剤であるア
プロチニン（閤品名トラジロール、バイエル社製）を添
力ｌすることを提唱している。
特開昭５７−２８００９５！ｒ公報）は培地及び精製工
程で使用嘔れるｍ＊液中にグロテアーゼ阻害剤であるア
プロチニン（閤品名トラジロール、バイエル社製）を添
力ｌすることを提唱している。
（発明の解決しようとする問題点）
しかし、現在市販されているアプロチニンは牛企。
肺臓から抽出精製された分子量６５００ベフテドで、人
にとっては異也蛋白であり、これを注射用医薬品として
用いる場合にはしばしばショック症状が認められている
（桑務公報、第１２７１号、１７頁、昭和５９年８月１
１日ン。従ってｔＰＡ’ｉ注射用医薬品として用いる場
合には脩加したアブロチニ／をｔＰＡから完全に除去す
ることが必要であるが、ｔＰＡ全損失することなくアプ
ロチニンを除去することは通常の方法においては困難で
ある。嘔らにアプロチニンは極めて高価であり、工業的
規模でのｔＰＡｉ造工程でアプロチニンを用いることは
経済的に不利である。また、アプロチニンはｔＰＡ活性
の測定において、たとえばＦｉｂｒｉｎ Ｃ１ｏｔ Ｌ
ｙｓｉｓＴｉｍｅ法（Ｒｌｊｋｅｎ、 Ｄ、Ｏ，ら、
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 互功工褐」ユＯｈｅｍ、、 Ｖｏｌ
、 １９３． ｐｐ １４０〜１５３．１９７９年）及
びρ仄 Ｆｉｂｒｉｎ ｐｌａｔｅ法（Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ、
Ｊ、ら、ａａｅｍｏｓｔｏｓｉｓ。
にとっては異也蛋白であり、これを注射用医薬品として
用いる場合にはしばしばショック症状が認められている
（桑務公報、第１２７１号、１７頁、昭和５９年８月１
１日ン。従ってｔＰＡ’ｉ注射用医薬品として用いる場
合には脩加したアブロチニ／をｔＰＡから完全に除去す
ることが必要であるが、ｔＰＡ全損失することなくアプ
ロチニンを除去することは通常の方法においては困難で
ある。嘔らにアプロチニンは極めて高価であり、工業的
規模でのｔＰＡｉ造工程でアプロチニンを用いることは
経済的に不利である。また、アプロチニンはｔＰＡ活性
の測定において、たとえばＦｉｂｒｉｎ Ｃ１ｏｔ Ｌ
ｙｓｉｓＴｉｍｅ法（Ｒｌｊｋｅｎ、 Ｄ、Ｏ，ら、
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 互功工褐」ユＯｈｅｍ、、 Ｖｏｌ
、 １９３． ｐｐ １４０〜１５３．１９７９年）及
びρ仄 Ｆｉｂｒｉｎ ｐｌａｔｅ法（Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ、
Ｊ、ら、ａａｅｍｏｓｔｏｓｉｓ。
Ｐ
Ｔｏｌ、 １３． Ｍ、 ３０１−３１５．１９８３年
）′ｔ−阻害するばかりではなく、Ｌｏｗｒｙ法（ＬＯ
ｗｒｙ、 Ｏ，Ｈ，ら、ｌ１里ｏ１． Ｃｈａｍ、。
）′ｔ−阻害するばかりではなく、Ｌｏｗｒｙ法（ＬＯ
ｗｒｙ、 Ｏ，Ｈ，ら、ｌ１里ｏ１． Ｃｈａｍ、。
ＶＯｌ、 １９３． ｐｐ ２６５−２７５．１９５１
年）及びＡ ２８（ＨａＬにおける吸光度法による蛋白
の測定をも阻害するという欠点を有している。
年）及びＡ ２８（ＨａＬにおける吸光度法による蛋白
の測定をも阻害するという欠点を有している。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らはヒトメラノーマ細胞又は遺伝子組換え技術
によって人ｔＰＡ遺伝子を有するベクターが挿入さｎた
大腸菌、酵母、動物細胞等による培養工程において、培
養液中に混在するプロテアーゼの作用を受けて、一本領
ｔＰＡが二本鎖ｔＰＡ Ｋ変で使用さｎる総ての緩衝液
中に、グロテアーゼ阻害剤の一揮でるる特定の抗プラス
ミン剤を添加して、一本領ｔＰＡを得ることを見出し、
本発明に到達した。
によって人ｔＰＡ遺伝子を有するベクターが挿入さｎた
大腸菌、酵母、動物細胞等による培養工程において、培
養液中に混在するプロテアーゼの作用を受けて、一本領
ｔＰＡが二本鎖ｔＰＡ Ｋ変で使用さｎる総ての緩衝液
中に、グロテアーゼ阻害剤の一揮でるる特定の抗プラス
ミン剤を添加して、一本領ｔＰＡを得ることを見出し、
本発明に到達した。
すなわち本発明はｔＰＡ生産能を有する細胞をε−アミ
ノカプロン酸、トランス−４−アミツメチルシクロヘキ
サンカルボン酸、トランス−４−アミンエチルシクロヘ
キサンカルボン酸およびこれらのエステル、および〔エ
チル４−（６−ゲアニジノヘキサノイルオキシ）ベンゾ
エートコメタンスルホネートからなる群から選ばれた抗
プラスミン剤を添加し次培地で培養し、得られｆ（細胞
あるいは培地からｔＰＡを採取することを特徴とするｔ
ＰＡの製造法である。また本発明ｉｄ ｔＰＡ生産能を
有する細胞を培地中で培養し、得られた細胞あるいは培
地から、ε−アミノカプロン酸、トランス−４−アミツ
メチルシクロヘキサンカルボン酸、トランス−４−アミ
ンエチルシクロヘキサンカルボン酸またはこれらのエス
テルおよび〔エチル４−（６−ゲアニジノヘキサノイル
オキシ）ベンゾエートコメタンスルホネートからなる群
から選ばれた抗プラスミン剤を含有する緩衝ｇを用いて
ｔＰＡ ｉ採取することを特徴とするｔＰＡの製造法で
ある。
ノカプロン酸、トランス−４−アミツメチルシクロヘキ
サンカルボン酸、トランス−４−アミンエチルシクロヘ
キサンカルボン酸およびこれらのエステル、および〔エ
チル４−（６−ゲアニジノヘキサノイルオキシ）ベンゾ
エートコメタンスルホネートからなる群から選ばれた抗
プラスミン剤を添加し次培地で培養し、得られｆ（細胞
あるいは培地からｔＰＡを採取することを特徴とするｔ
ＰＡの製造法である。また本発明ｉｄ ｔＰＡ生産能を
有する細胞を培地中で培養し、得られた細胞あるいは培
地から、ε−アミノカプロン酸、トランス−４−アミツ
メチルシクロヘキサンカルボン酸、トランス−４−アミ
ンエチルシクロヘキサンカルボン酸またはこれらのエス
テルおよび〔エチル４−（６−ゲアニジノヘキサノイル
オキシ）ベンゾエートコメタンスルホネートからなる群
から選ばれた抗プラスミン剤を含有する緩衝ｇを用いて
ｔＰＡ ｉ採取することを特徴とするｔＰＡの製造法で
ある。
本発明において使用するε−アばツカプロ／酸又はこの
エステルとしては、６−アミノカプロン酸又はヘキシル
−ε−アミノカグロエートなどのアルキルエステル、ベ
ンジル−ε−アばツカプロエートなどのアラルキルエス
テルなどがある。
エステルとしては、６−アミノカプロン酸又はヘキシル
−ε−アミノカグロエートなどのアルキルエステル、ベ
ンジル−ε−アばツカプロエートなどのアラルキルエス
テルなどがある。
本発明において使用するトラ／スー４−アばノ。
メチルシクロヘキサンカルボン酸又ハこのエステルとし
ては、トランス−４−アばツメチルシクロヘキサンカル
ボン酸又は、ベンジルートランスーアばツメチルシクロ
ヘキサンカルボキシレートなトノアラルキルエステル、
フェニル−トラ／スーアｉツメチルシクロヘキサンカル
ボキシレート、４−（２−カルボキシエテル）フェニル
ートランスーアばツメチルシクロヘキサンカルボキシレ
ートなどのアリルエステルなどがある。
ては、トランス−４−アばツメチルシクロヘキサンカル
ボン酸又は、ベンジルートランスーアばツメチルシクロ
ヘキサンカルボキシレートなトノアラルキルエステル、
フェニル−トラ／スーアｉツメチルシクロヘキサンカル
ボキシレート、４−（２−カルボキシエテル）フェニル
ートランスーアばツメチルシクロヘキサンカルボキシレ
ートなどのアリルエステルなどがある。
本発明において使用するトランス−４−アばツメチルシ
クロヘキサンカルボン酸またはこのエステルとしては、
トランス−４−アばノエチルシクロヘキサンカルボン酸
又ハベンジルートラ／スー７ξノエチルシクロヘキサン
カルボキシレートなトノアラルキルエステル、フェニル
ートランスーアばノエチルシクロへギサン力ルポキシレ
ート、４−（２−カルボキシエチル）フェニル−トラ／
スーアばツメチルシクロヘキサンカルボキシレートなど
のアリルエステルなどがある。
クロヘキサンカルボン酸またはこのエステルとしては、
トランス−４−アばノエチルシクロヘキサンカルボン酸
又ハベンジルートラ／スー７ξノエチルシクロヘキサン
カルボキシレートなトノアラルキルエステル、フェニル
ートランスーアばノエチルシクロへギサン力ルポキシレ
ート、４−（２−カルボキシエチル）フェニル−トラ／
スーアばツメチルシクロヘキサンカルボキシレートなど
のアリルエステルなどがある。
又、本発明における抗プラスミン剤のうち、遊離の７ミ
ノ基を有する化合物については、塩酸塩の型で使用でき
ることは言うまでもない。
ノ基を有する化合物については、塩酸塩の型で使用でき
ることは言うまでもない。
本発明では〔エチル ４−（６−ゲアニジノヘキサノイ
ルオキシ）ベンゾエート〕メタンスルホネートヲ使用す
ることができる。
ルオキシ）ベンゾエート〕メタンスルホネートヲ使用す
ることができる。
これらの抗プラスミン剤は通常の合成法によって容易に
かつ廉価に製造することができるばかりではなく、必要
に応じて、透析法又は分子量分画法などにより完全に除
去することができる。
かつ廉価に製造することができるばかりではなく、必要
に応じて、透析法又は分子量分画法などにより完全に除
去することができる。
本発明におけるこれら抗プラスミン剤の使用量は培養液
中に混在するプロテアーゼの量によって異なることは当
然であり、培地への添加量は０．０３〜３００厘グ／ｍ
ｉ、さらに好ましくは０．３〜３０ＷＩグ／Ｉｌｌであ
シ、精製工程における緩衝液については０．０３〜３０
０ｍｙ／ｍｌ、さらに好ましくは０．３〜３０Ｊｌ／１
１／である。培養、精製両工程において、その使用量が
０．０３ｍｐ／ｍ１未満の場合は該変換反応の阻止効果
は不完全であシ、他方培養工程において３００ｍｙ／ｍ
ｌを越えるか、又精製工程において３００ｖｒｇ／ｙ＊
ｌを越えて使用することは該変換灰地、を阻止するとい
う目的から見れば不必要である。
中に混在するプロテアーゼの量によって異なることは当
然であり、培地への添加量は０．０３〜３００厘グ／ｍ
ｉ、さらに好ましくは０．３〜３０ＷＩグ／Ｉｌｌであ
シ、精製工程における緩衝液については０．０３〜３０
０ｍｙ／ｍｌ、さらに好ましくは０．３〜３０Ｊｌ／１
１／である。培養、精製両工程において、その使用量が
０．０３ｍｐ／ｍ１未満の場合は該変換反応の阻止効果
は不完全であシ、他方培養工程において３００ｍｙ／ｍ
ｌを越えるか、又精製工程において３００ｖｒｇ／ｙ＊
ｌを越えて使用することは該変換灰地、を阻止するとい
う目的から見れば不必要である。
培養工程における抗プラスミン剤の添加時期は培養前の
培地に添加することが必須であることは当然であシ、培
養後の培養液に添加してもその効米は期待できない。
培地に添加することが必須であることは当然であシ、培
養後の培養液に添加してもその効米は期待できない。
本発明に用い九抗プラスミン剤は必要に応じて、通常の
方法、たとえば透析法又は分子量分画法によシ完全に除
去することができる。
方法、たとえば透析法又は分子量分画法によシ完全に除
去することができる。
本発明において使用されるｔＰＡ 理化細胞としては、
人メラノーマ細胞又は遺伝子組換え技術によって人ｔＰ
Ａ遺伝子を有するベクターを挿入された大腸菌、酵母、
動物単細胞ま７′ｃは入ｔＰＡでインチグレートされた
大腸菌、酵母、あるいは動物細胞などが挙げられる。
人メラノーマ細胞又は遺伝子組換え技術によって人ｔＰ
Ａ遺伝子を有するベクターを挿入された大腸菌、酵母、
動物単細胞ま７′ｃは入ｔＰＡでインチグレートされた
大腸菌、酵母、あるいは動物細胞などが挙げられる。
以下に遺伝子組換え体細胞の作成法について、動物細胞
を例として述べる。
を例として述べる。
人メラノーマ細胞又は入子官組織をグアニジ／チオシア
ネートの如きＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で破砕し次
後、遠心分離操作によシ全ＲＮＡ ’ｉ単離した。得ら
れた全ＲＮＡからオリゴｄＴアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーによシ、メツセンジャーＲＮＡ （ｍＲ
ＮＡ ）を単離し、更に蔗糖密度勾配沈降法によシ該ｍ
ＲＮＡ ｆサイズ分画した。ｔＰＡ特異的ｍＲＮＡを含
む分画の同定はノザンプロット法によって行った。
ネートの如きＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で破砕し次
後、遠心分離操作によシ全ＲＮＡ ’ｉ単離した。得ら
れた全ＲＮＡからオリゴｄＴアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーによシ、メツセンジャーＲＮＡ （ｍＲ
ＮＡ ）を単離し、更に蔗糖密度勾配沈降法によシ該ｍ
ＲＮＡ ｆサイズ分画した。ｔＰＡ特異的ｍＲＮＡを含
む分画の同定はノザンプロット法によって行った。
上記のよう゛にして同定されたｔＰＡ特異的ｍＲＮＡを
含む分画からＲＮＡを回収し、該ＲＮＡに対応する一重
鎮ｃＥＩＮＡを逆転写酵素を用いて作成し、該−重鎖ｃ
ＥＩＮＡからうＮＡポリメラーゼにより二重鎖ｃＥＮＡ
を作成した。
含む分画からＲＮＡを回収し、該ＲＮＡに対応する一重
鎮ｃＥＩＮＡを逆転写酵素を用いて作成し、該−重鎖ｃ
ＥＩＮＡからうＮＡポリメラーゼにより二重鎖ｃＥＮＡ
を作成した。
得られた二重鎖Ｑ：ＤＮＡをＳ１ニユークレアーゼで処
理した後、オリゴｄｏテールを末端に付与し、オリゴミ
Ｃ末端を有するＯＢＭＡを作成した。上記の如くして得
られたオリゴミＣ末端を有するＣＢＮＡ ′ｆｒ：オリ
ゴｄＧ末端を有する直鎖ｐＢＲ３２２グラスミドに挿入
した。得られ次ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、
ｃＥＩＮＡライブラリーを作成した。該ｃＢＮＡライブ
ラリーからコロニーハイブリダイゼイシ四ン法により、
ポジティブなｃＢＮＡクローンを単離した。この単離さ
れたクローンからプラスミドＢＮＡを単離し、該ａＮＡ
の配列を決定し次。
理した後、オリゴｄｏテールを末端に付与し、オリゴミ
Ｃ末端を有するＯＢＭＡを作成した。上記の如くして得
られたオリゴミＣ末端を有するＣＢＮＡ ′ｆｒ：オリ
ゴｄＧ末端を有する直鎖ｐＢＲ３２２グラスミドに挿入
した。得られ次ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、
ｃＥＩＮＡライブラリーを作成した。該ｃＢＮＡライブ
ラリーからコロニーハイブリダイゼイシ四ン法により、
ポジティブなｃＢＮＡクローンを単離した。この単離さ
れたクローンからプラスミドＢＮＡを単離し、該ａＮＡ
の配列を決定し次。
以上の様にして得られ、配列を決定された複数のｃ−Ｄ
ＮＡを適当な制限酵素による切断とＢＮＡ ライゲー
スによる結合を組合せて、全ｔＰＡコーディング部を含
むｔＰＡｃＢＮＡを構築した。この構築されたｔＰＡｃ
（）ＮＡを適当な制限酵素による切断、末端の修飾処理
及び−ＤＮＡライゲースによる結合とｔ組合せて、適当
な発現ベクターに挿入した。
ＮＡを適当な制限酵素による切断とＢＮＡ ライゲー
スによる結合を組合せて、全ｔＰＡコーディング部を含
むｔＰＡｃＢＮＡを構築した。この構築されたｔＰＡｃ
（）ＮＡを適当な制限酵素による切断、末端の修飾処理
及び−ＤＮＡライゲースによる結合とｔ組合せて、適当
な発現ベクターに挿入した。
本発明にかかわる発現ベクターは、下記の＋Ｅ）ＮＡ配
列を含んでいる。すなわち、ｔＰＡｃＤＮＡ以外に牛乳
頭腫ウィルスＤＮＡ配列の全部もしくは一部、ｐＢＲ３
２２７°ラスｉドクＮＡの一部、ｔＰＡｃＤＮＡの発現
に必要な（）ＮＡ配列及び転写停止に必要な−Ｅ）ＮＡ
配列を含み、場合ＶＣよっては発現ベクターによる形質
転換体を選別するのに有効な弔ＮＡ配列を含む。
列を含んでいる。すなわち、ｔＰＡｃＤＮＡ以外に牛乳
頭腫ウィルスＤＮＡ配列の全部もしくは一部、ｐＢＲ３
２２７°ラスｉドクＮＡの一部、ｔＰＡｃＤＮＡの発現
に必要な（）ＮＡ配列及び転写停止に必要な−Ｅ）ＮＡ
配列を含み、場合ＶＣよっては発現ベクターによる形質
転換体を選別するのに有効な弔ＮＡ配列を含む。
このようにして得られた発現ベクターを適当な宿主細胞
、例えばマウス細胞に形質変換する。
、例えばマウス細胞に形質変換する。
得られた形質転換細胞を０．０３〜３００＊ｐ／ｇ／の
本発明の抗プラスミン剤の存在下で培養、増殖せしめる
ことにより、−重鎖ｔＰＡ’ｉｉ−生産することができ
る。
本発明の抗プラスミン剤の存在下で培養、増殖せしめる
ことにより、−重鎖ｔＰＡ’ｉｉ−生産することができ
る。
遺伝子組換え体細胞を培養する培地としては、例えばイ
ーグル必須最少培地（キブコ社）、ダルベツコ変法イー
グル培地（ギブコ社）、１９９培地（ギブコ社） 、Ｒ
ＰＭ工１６４Ｇ培地（ギプコ社）、ノ・ム７１２培地（
ギブコ社）、イスコツ培地（ギブコ社）等が挙げられる
。該細胞の増殖期においては、これら培地中に、これら
培地の５〜２０容量チに和尚する牛胎児血清、新生仔牛
血清等を加えて該細胞を培養する。
ーグル必須最少培地（キブコ社）、ダルベツコ変法イー
グル培地（ギブコ社）、１９９培地（ギブコ社） 、Ｒ
ＰＭ工１６４Ｇ培地（ギプコ社）、ノ・ム７１２培地（
ギブコ社）、イスコツ培地（ギブコ社）等が挙げられる
。該細胞の増殖期においては、これら培地中に、これら
培地の５〜２０容量チに和尚する牛胎児血清、新生仔牛
血清等を加えて該細胞を培養する。
培養条件としては、培養温度を３６°〜３７°Ｃ１培地
のｐＨｔ−６，５〜７．５の範囲に保持することが１璧
である。接種細胞濃度は５ Ｘ １０４〜Ｉ Ｘ １０
５細胞／ｍ／−培地でおり、増殖に費する日数は３〜６
日である。
のｐＨｔ−６，５〜７．５の範囲に保持することが１璧
である。接種細胞濃度は５ Ｘ １０４〜Ｉ Ｘ １０
５細胞／ｍ／−培地でおり、増殖に費する日数は３〜６
日である。
他方ｔＰＡの生産工程における培養日数については特に
制限はない。
制限はない。
このようにして生産された一本鎖ｔＰＡは、０．０３〜
３００震Ｐ／ｇ／の本発明の抗プラスミン剤の存在下で
、通常のｔ＃製法（たとえばＲ１ｊｋ＠ｍ、 Ｂ、Ｏ，
ら。
３００震Ｐ／ｇ／の本発明の抗プラスミン剤の存在下で
、通常のｔ＃製法（たとえばＲ１ｊｋ＠ｍ、 Ｂ、Ｏ，
ら。
！、 Ｉ３１ｏＩＣｈｅｍ、、 Ｖｏｌ、罎ｉ６． ｐ
ｐ ７０３５−７０４１．１９８１年］によって容易に
一本鎖ｔＰＡ ｔ−得ることができる。
ｐ ７０３５−７０４１．１９８１年］によって容易に
一本鎖ｔＰＡ ｔ−得ることができる。
精製工程で使用する緩衝液としては、トリス緩衝液、リ
ン酸塩緩衝液等が挙げられる。アルキルエーテル、ポリ
エチレングリコール系の非イオン性界面活性剤０．０１
〜０．１Ｗ／Ｖチが上記緩衝液と組合わせ−Ｃ用いられ
る。父上記緩衝液と共存せしめる塩類としては塩化ナト
リウム、塩化カリウム等が用いられる。
ン酸塩緩衝液等が挙げられる。アルキルエーテル、ポリ
エチレングリコール系の非イオン性界面活性剤０．０１
〜０．１Ｗ／Ｖチが上記緩衝液と組合わせ−Ｃ用いられ
る。父上記緩衝液と共存せしめる塩類としては塩化ナト
リウム、塩化カリウム等が用いられる。
精製方法としては、公知のイオン変換クロマトド等を有
する樹脂を用いたアフイニテイクロマトグラフイー、及
びゲル濾過等が挙げられるが、これら方法の２つないし
３つの方法を組合せることにより、高純度のｔＰＡを高
収率で得ることができる。
する樹脂を用いたアフイニテイクロマトグラフイー、及
びゲル濾過等が挙げられるが、これら方法の２つないし
３つの方法を組合せることにより、高純度のｔＰＡを高
収率で得ることができる。
（発明の効果）
本発明では培養工程又は精製工程において、特定の抗プ
ラスミン剤を使用することにより、極めて少量で一本鎖
ｔＴＡの二本鎖ｔＰＡへの変換反応を阻止することがで
きる。
ラスミン剤を使用することにより、極めて少量で一本鎖
ｔＴＡの二本鎖ｔＰＡへの変換反応を阻止することがで
きる。
本発明において得られ７’（ｔＰＡ ｔｌ−還元条件下
の５ＥＩＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｗｅ
ｂｏｒ、Ｋ。
の５ＥＩＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｗｅ
ｂｏｒ、Ｋ。
ら、 Ｊ、 Ｂｉｏ’１． Ｏｈｅｍ、、 Ｖｏｗ、
２４４． ｐｐ ４４０６〜４４１２゜１９６９年）で
分析したところ、該電気泳動法の精度の範囲内において
二本鎖ｔＰＡは全く見出されず、一本鎖ｔＰＡのみが検
出された。
２４４． ｐｐ ４４０６〜４４１２゜１９６９年）で
分析したところ、該電気泳動法の精度の範囲内において
二本鎖ｔＰＡは全く見出されず、一本鎖ｔＰＡのみが検
出された。
（実施例〕
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例１
重炭酸ナトリウム（最終濃度０．１９チ）、Ｌ−グルタ
ミン（ｉ＆終濃度０．０６％）及び牛脂児血ｆ＃（最終
濃ｆｌｏチ）を補充したダルベツコ変法イーグル培地（
ギブコ社裂）で人メラノーマ細胞を３７°Ｃで５日間増
殖せしめた後、培養液を除去し、該細胞をダルベツコリ
ン酸緩衝塩類溶液（フロー社製］で十分洗浄した。
ミン（ｉ＆終濃度０．０６％）及び牛脂児血ｆ＃（最終
濃ｆｌｏチ）を補充したダルベツコ変法イーグル培地（
ギブコ社裂）で人メラノーマ細胞を３７°Ｃで５日間増
殖せしめた後、培養液を除去し、該細胞をダルベツコリ
ン酸緩衝塩類溶液（フロー社製］で十分洗浄した。
次いで本発明における抗プラスミン剤（Ａ）の存在又は
非存在下、牛胎児血清を含まない上記の増殖用培地で３
０°Ｃで３日間培養を継続した後、培養液を採用し、７
５００ｘｐで１５分間４°Ｃで遠心分離し、得られた上
澄液は使用時まで−２０’Ｃで保存した。
非存在下、牛胎児血清を含まない上記の増殖用培地で３
０°Ｃで３日間培養を継続した後、培養液を採用し、７
５００ｘｐで１５分間４°Ｃで遠心分離し、得られた上
澄液は使用時まで−２０’Ｃで保存した。
この上澄液を透析後Ｌｏｗｒｙ法で蛋白量を測定したと
ころ、約１５０ｇＦ／／であり、またＦｉｂｒｉｎ Ｃ
１ｏｔＬｙｅｉｓ Ｔｉｍｅ法（以下ＦＣ！Ｉ、Ｔ法と
称す）で測定し九ｔＰＡ活性は５０工Ｕ／ｍ／であった
。該活性の測定に際しては、厚生省の標準ウロキナーゼ
を標準として用いた。
ころ、約１５０ｇＦ／／であり、またＦｉｂｒｉｎ Ｃ
１ｏｔＬｙｅｉｓ Ｔｉｍｅ法（以下ＦＣ！Ｉ、Ｔ法と
称す）で測定し九ｔＰＡ活性は５０工Ｕ／ｍ／であった
。該活性の測定に際しては、厚生省の標準ウロキナーゼ
を標準として用いた。
上記培養液からのｔＰＡの精製は本発明における抗プラ
スミン剤＋Ａ）の存在又は非存在下、Ｒｌｊｋｅｎら（
前掲）の方法に従って実施し次。即ち、該培舎液’ｅ
亜Ｍキレートセファロース（ファルマシア社製）及びコ
ンカナバリンＡセファロース（ファルマシア社製）の順
で処理したのち、セファデックスＧ−１５０（ファルマ
シア社製）を用いて分子量分画し念。
スミン剤＋Ａ）の存在又は非存在下、Ｒｌｊｋｅｎら（
前掲）の方法に従って実施し次。即ち、該培舎液’ｅ
亜Ｍキレートセファロース（ファルマシア社製）及びコ
ンカナバリンＡセファロース（ファルマシア社製）の順
で処理したのち、セファデックスＧ−１５０（ファルマ
シア社製）を用いて分子量分画し念。
セフ１デックスＧ−１５０工程処理液の蛋白濃度は３３
ｐｙ／ｘｉであり、ｔＰＡ活性は２７００工Ｕ／ｍ／で
あった。該処理液の５ａＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析はＷｅｂａｒら（前掲］の方法に主として準
じて実施したが、ゲル濃度は１０チ、泳動装置としては
スラブ式泳動装置（マリンル産業社製）を用いて１０ｍ
Ａの定電流にて４時間室温で泳動した。
ｐｙ／ｘｉであり、ｔＰＡ活性は２７００工Ｕ／ｍ／で
あった。該処理液の５ａＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析はＷｅｂａｒら（前掲］の方法に主として準
じて実施したが、ゲル濃度は１０チ、泳動装置としては
スラブ式泳動装置（マリンル産業社製）を用いて１０ｍ
Ａの定電流にて４時間室温で泳動した。
２５０を用いて蛋白を染色後、１０チ酢酸と１０チメタ
＃ル混合ｇを用いて脱色した。一本鎖及び二本鎖ｔＰＡ
の割合はウルトロスキャン・レーザー・テンシトメータ
ー（ＬＫＢ社製）を用いて定量し次。
＃ル混合ｇを用いて脱色した。一本鎖及び二本鎖ｔＰＡ
の割合はウルトロスキャン・レーザー・テンシトメータ
ー（ＬＫＢ社製）を用いて定量し次。
入メラノーマ細胞由来のｔＰＡのＢＥ）Ｓ−ポリアクリ
ル−アミドゲル電気泳動結果を第１表に示す。
ル−アミドゲル電気泳動結果を第１表に示す。
同様にして、抗プラスミン剤Ａに代えて、抗プラスミン
剤Ｂ ｍ＝！＃又はアプロチニンを使用してｔＰＡを製
造した。その結果を第１表に示す。
剤Ｂ ｍ＝！＃又はアプロチニンを使用してｔＰＡを製
造した。その結果を第１表に示す。
第１衣Ｘ１）
Ｘｉ）培地及び絹製緩衝液両者共に０．２２μフイルタ
ーで無菌化処理後使用し次。
ーで無菌化処理後使用し次。
ｘ２）４−（２−カルボキシエチル）フェニル−ｔ−４
−アミノエテルシクロヘキサンカルボキシレートｘ３）
フェニル−ｔ−４−アミノエテルシクロヘキサンカルボ
キシレート 本発明においては、アプロチニンを使用した場合、と比
較して、少量の抗プラスミン剤を使用した場合でも一本
領ｔＰＡの生産率はアプロチニンの場合よりもはるかに
優れてい次。
−アミノエテルシクロヘキサンカルボキシレートｘ３）
フェニル−ｔ−４−アミノエテルシクロヘキサンカルボ
キシレート 本発明においては、アプロチニンを使用した場合、と比
較して、少量の抗プラスミン剤を使用した場合でも一本
領ｔＰＡの生産率はアプロチニンの場合よりもはるかに
優れてい次。
培地中にのみ抗プラスミン剤を添加し次場合でも、或い
は精製緩衝液中にのみ抗１ラスミン剤を添加した場合で
も、何れの場合においても抗プラスミン剤を全く添加し
ない場合と比較して一本領ｔＰＡを多く与え次。
は精製緩衝液中にのみ抗１ラスミン剤を添加した場合で
も、何れの場合においても抗プラスミン剤を全く添加し
ない場合と比較して一本領ｔＰＡを多く与え次。
しかし、培地と精製緩衝液の両方に抗プラスミン剤を添
加した方がはるかに高い割合で一本領ｔＰＡを与えるこ
とができる。
加した方がはるかに高い割合で一本領ｔＰＡを与えるこ
とができる。
実施例２
実施例１における人メラノーマ細胞の代りに、遺伝子組
換え技術によって人ｔＰＡ遺伝子を持つベクター金挿入
され念マウス細胞を実施例１に記載の方法で培養し、次
いで培養液を精製した。得られた組換え体ｔＰＡの５Ｂ
Ｓ−ボリアクリルアばドゲル電気泳動結果を第２表に示
す。
換え技術によって人ｔＰＡ遺伝子を持つベクター金挿入
され念マウス細胞を実施例１に記載の方法で培養し、次
いで培養液を精製した。得られた組換え体ｔＰＡの５Ｂ
Ｓ−ボリアクリルアばドゲル電気泳動結果を第２表に示
す。
第２表Ｘ□）
ＸＩ）培地及びｆＩ製緩衝液共に０．２２μフイルター
で無菌化処理後使用した。
で無菌化処理後使用した。
＄２）４−（２−カルボキシエチル）フェニルトランス
−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシレート Ｘ３）４−（２−カルボキシエチル）フェニルトランス
−４−アミンエチルシクロヘキサンカルボキシレート 実施例３ 実施例１における培地の無菌済過の代りに１２１°Ｃで
２０分間加熱滅菌した培地を用いてメラノーマ細胞を培
養し、実施例１に記載の方法で培地からｔＴＡを梢製し
友。結果を第３衣に示す。
−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシレート Ｘ３）４−（２−カルボキシエチル）フェニルトランス
−４−アミンエチルシクロヘキサンカルボキシレート 実施例３ 実施例１における培地の無菌済過の代りに１２１°Ｃで
２０分間加熱滅菌した培地を用いてメラノーマ細胞を培
養し、実施例１に記載の方法で培地からｔＴＡを梢製し
友。結果を第３衣に示す。
第３表
Ｘｌ）４−（２−カルポキ７エテルンフエニル−ｔ−４
−アミノエテルシクロヘキサンカルボキシレート、Ｘ２
） ｅ−アばツカプロン酸工業的培養においては、培地
は通常加熱処理によって無菌化される。このような条件
下ではアプロチニンは失活するが、本発明の抗プラスば
ン剤は安定でちゃ、その効力亡失わなかつ次。
−アミノエテルシクロヘキサンカルボキシレート、Ｘ２
） ｅ−アばツカプロン酸工業的培養においては、培地
は通常加熱処理によって無菌化される。このような条件
下ではアプロチニンは失活するが、本発明の抗プラスば
ン剤は安定でちゃ、その効力亡失わなかつ次。
特許出願人 東洋紡績株式会社
手続補正書（自発）
昭和６１年２月１０日
・７つ、を
Claims (2)
- （１）組織性プラスミノーゲン活性化因子生産能を有す
る細胞をε−アミノカプロン酸、トランス−４−アミノ
メチルシクロヘキサンカルボン酸、トランス−４−アミ
ノエチルシクロヘキサンカルボン酸およびこれらのエス
テル、および〔エチル４−（６−グアニジノヘキサノイ
ルオキシ）ベンゾエート〕メタンスルホネートからなる
群から選ばれた抗プラスミン剤を添加した培地中で培養
し、得られた細胞あるいは培地から組織性プラスミノー
ゲン活性化因子を採取することる特徴とする組織性プラ
スミノーゲン活性化因子の製造法。 - （２）組織性プラスミノーゲン活性化因子生産能を有す
る細胞を培地中で培養し、得られた細胞あるいは培地か
ら、ε−アミノカプロン酸、トランス−４−アミノメチ
ルシクロヘキサンカルボン酸、トランス−４−アミノメ
チルシクロヘキサンカルボン酸、トランス−４−アミノ
エチルシクロヘキサンカルボン酸およびこれらのエステ
ル、および〔エチル４−（６−グアニジノヘキサノイル
オキシ）ベンゾエート〕メタンスルホネートからなる群
から選ばれた抗プラスミン剤を含有する緩衝液を用いて
、組織性プラスミノーゲン活性化因子を採取することを
特徴とする組織プラスミノーゲン活性化因子の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60144368A JPS624233A (ja) | 1985-07-01 | 1985-07-01 | 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法 |
| DE8686305020T DE3687721T2 (de) | 1985-07-01 | 1986-06-27 | Verfahren zur herstellung eines plasminogenaktivators fuer gewebe. |
| US06/879,779 US4935368A (en) | 1985-07-01 | 1986-06-27 | Process for producing tissue plasminogen activator |
| EP86305020A EP0208486B1 (en) | 1985-07-01 | 1986-06-27 | Process for producing tissue plasminogen activator |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60144368A JPS624233A (ja) | 1985-07-01 | 1985-07-01 | 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS624233A true JPS624233A (ja) | 1987-01-10 |
Family
ID=15360487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60144368A Pending JPS624233A (ja) | 1985-07-01 | 1985-07-01 | 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4935368A (ja) |
| EP (1) | EP0208486B1 (ja) |
| JP (1) | JPS624233A (ja) |
| DE (1) | DE3687721T2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0297385A (ja) * | 1988-10-04 | 1990-04-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法 |
| JPH02163083A (ja) * | 1988-12-16 | 1990-06-22 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5151359A (en) * | 1988-05-19 | 1992-09-29 | Mitsui Toatsu Chemicals Incorporated | Method for producing of human tissue type plasminogen activator |
| US5183754A (en) * | 1988-10-04 | 1993-02-02 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| US5676947A (en) * | 1989-02-07 | 1997-10-14 | Boehringer Manneheim Gmbh | Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins |
| US9359316B1 (en) * | 2014-11-25 | 2016-06-07 | Concentric Analgesics, Inc. | Prodrugs of phenolic TRPV1 agonists |
| US11634384B2 (en) | 2014-11-25 | 2023-04-25 | Concentric Analgesics, Inc. | Prodrugs of phenolic TRPV1 agonists |
| US10821105B2 (en) | 2016-05-25 | 2020-11-03 | Concentric Analgesics, Inc. | Prodrugs of phenolic TRPV1 agonists in combination with local anesthetics and vasoconstrictors for improved local anesthesia |
| WO2020023794A1 (en) | 2018-07-27 | 2020-01-30 | Concentric Analgesics, Inc. | Pegylated prodrugs of phenolic trpv1 agonists |
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|---|---|---|---|---|
| JPS5728009A (en) * | 1980-06-11 | 1982-02-15 | Leuven Res & Dev Vzw | Novel plasminogen activator and drug having thrombosis dissolving activity |
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|---|---|---|---|---|
| US3998947A (en) * | 1973-11-30 | 1976-12-21 | Pierre Fabre S.A. | Process for obtaining a plasminogen activator |
| JPS5913732A (ja) * | 1982-07-16 | 1984-01-24 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 血栓溶解剤 |
| DE3382389D1 (de) * | 1982-12-14 | 1991-10-02 | South African Inventions | Plasminogenaktivator. |
| FR2548211B1 (fr) * | 1983-06-29 | 1985-10-18 | Choay Sa | Procede de production d'un activateur tissulaire du plasminogene et activateur obtenu par ce procede |
| DE3479520D1 (en) * | 1983-11-21 | 1989-09-28 | Ciba Geigy Ag | Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast |
| EP0151996B1 (en) * | 1984-01-30 | 1991-04-03 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for the preparation of a double-chain plasminogen activator |
| EP0156169B1 (en) * | 1984-02-29 | 1991-12-18 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | An aqueous solution of a tissue plasminogen activator dissolved therein at an increased concentration and a method |
-
1985
- 1985-07-01 JP JP60144368A patent/JPS624233A/ja active Pending
-
1986
- 1986-06-27 DE DE8686305020T patent/DE3687721T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-06-27 EP EP86305020A patent/EP0208486B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-27 US US06/879,779 patent/US4935368A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5728009A (en) * | 1980-06-11 | 1982-02-15 | Leuven Res & Dev Vzw | Novel plasminogen activator and drug having thrombosis dissolving activity |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0297385A (ja) * | 1988-10-04 | 1990-04-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法 |
| JPH02163083A (ja) * | 1988-12-16 | 1990-06-22 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0208486A2 (en) | 1987-01-14 |
| DE3687721T2 (de) | 1993-08-12 |
| EP0208486A3 (en) | 1988-01-20 |
| DE3687721D1 (de) | 1993-03-25 |
| EP0208486B1 (en) | 1993-02-10 |
| US4935368A (en) | 1990-06-19 |
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