JPH02163083A - ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 - Google Patents
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法Info
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- JPH02163083A JPH02163083A JP63316118A JP31611888A JPH02163083A JP H02163083 A JPH02163083 A JP H02163083A JP 63316118 A JP63316118 A JP 63316118A JP 31611888 A JP31611888 A JP 31611888A JP H02163083 A JPH02163083 A JP H02163083A
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト正常細胞の産する組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子（以後ｔＰＡと略す）の製法に関する。
ン活性化因子（以後ｔＰＡと略す）の製法に関する。
ｔＰＡは、血管内皮細胞および種種の組繊細胞がら生産
、分泌されるもので、血栓の本体であるフィブリンを溶
解し、血栓症の治療薬として有効である。
、分泌されるもので、血栓の本体であるフィブリンを溶
解し、血栓症の治療薬として有効である。
〔従来の技術］
ｔＰＡは１本鎖のものと２本鎖のものとがあるのが知ら
れている。これらの血栓溶解活性は、２本鎖のものが１
本鎖に比べて大きい。従来、いわゆるｔＰＡ と言われ
るものは、２木鎖単独のものまたは２本鎖に１本鎖が混
合した状態のものが開発されてきた。
れている。これらの血栓溶解活性は、２本鎖のものが１
本鎖に比べて大きい。従来、いわゆるｔＰＡ と言われ
るものは、２木鎖単独のものまたは２本鎖に１本鎖が混
合した状態のものが開発されてきた。
２木鎖ｔＰＡは、血栓の溶解活性が大きく、フィブリン
溶解効果を必要とする血栓部分ではなく、血流中でプラ
スミノーゲンを活性化させる可能性が非常に高く、臨床
的に出血傾向が高い（特開昭５９−１１８７１７号）。
溶解効果を必要とする血栓部分ではなく、血流中でプラ
スミノーゲンを活性化させる可能性が非常に高く、臨床
的に出血傾向が高い（特開昭５９−１１８７１７号）。
しかしながら、２木鎖ｔＰＡの前駆体と考えられる１木
鎖ｔＰＡは、フィブリンにはより高い親和性を有し、フ
ィブリンに吸着されると直ちに早い速度で２木鎖ｔＰＡ
に転換される。
鎖ｔＰＡは、フィブリンにはより高い親和性を有し、フ
ィブリンに吸着されると直ちに早い速度で２木鎖ｔＰＡ
に転換される。
したがって、１本鎖ｔｐへは凝血部分でプラスミノーゲ
ン活性を最大に発揮することができる。
ン活性を最大に発揮することができる。
このように血栓熔解活性が比較的不活性とされていた１
本ｔＸｔＰＡは、血流中で作用することがないとされ、
臨床的には多く望まれるようになっている状況であり、
１木鎖ｔＰＡのみを効率良く生産する方法が強く望まれ
ている。
本ｔＸｔＰＡは、血流中で作用することがないとされ、
臨床的には多く望まれるようになっている状況であり、
１木鎖ｔＰＡのみを効率良く生産する方法が強く望まれ
ている。
１本積ｔｐ＾のみを生産させる方法としてアプロチニン
の存在下に培養または後処理を行う方法（ヨーロッパ特
許公開公報第４１７６６号）、トリプシン阻害剤または
アプロチニンを使用する方法（特開昭５９−１１８Ｔｌ
Ｔ号）、アプロチニンまたはベンズアミジンを添加した
培地で培養もしくは誘導生産させる方法（特開昭６１−
１９４８６号）、精製時にアプロチニン、６−アミノカ
プロン酸を添加して１本鎖のみを生産させる方法（Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋ａ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ１９８２．７
１９（２） ３１８〜３２Ｂ） 、また血清由来の高価
なアプロチニンに代えて低分子量の化学物質を添加する
方法、すなわち、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム
酸なとの抗プラスミン剤を培地中に添加する方法（特開
昭６２−４２３３号）、ｐ−アミノメル安息香酸類を培
地中に添加する方法（特願昭６３−１２２６４４号）な
どが知られている。
の存在下に培養または後処理を行う方法（ヨーロッパ特
許公開公報第４１７６６号）、トリプシン阻害剤または
アプロチニンを使用する方法（特開昭５９−１１８Ｔｌ
Ｔ号）、アプロチニンまたはベンズアミジンを添加した
培地で培養もしくは誘導生産させる方法（特開昭６１−
１９４８６号）、精製時にアプロチニン、６−アミノカ
プロン酸を添加して１本鎖のみを生産させる方法（Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋ａ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ１９８２．７
１９（２） ３１８〜３２Ｂ） 、また血清由来の高価
なアプロチニンに代えて低分子量の化学物質を添加する
方法、すなわち、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム
酸なとの抗プラスミン剤を培地中に添加する方法（特開
昭６２−４２３３号）、ｐ−アミノメル安息香酸類を培
地中に添加する方法（特願昭６３−１２２６４４号）な
どが知られている。
しかしながら、アプロチニンを低分子量の抗プラスミン
剤またはｐ−アミノメチル安息香酸類に代えても、１木
鎖ｔＰＡの大幅な生産性向上は達成することは出来なか
った。
剤またはｐ−アミノメチル安息香酸類に代えても、１木
鎖ｔＰＡの大幅な生産性向上は達成することは出来なか
った。
本発明の課題は、１木鎖ｔＰＡを、その生産性を大幅に
向上させて製造する方法を提供することである。
向上させて製造する方法を提供することである。
〔課題を解決するための手段］
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討の結
果、ｔＰＡ生産においてその培地の浸透圧を重炭酸イオ
ンを用いて３５０ ミリオスモル以上とした培地に低分
子量の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安息香酸
類を添加することにより、−本積ｔＰＡの生産性を大き
く向上させることができるの見出し、本発明を完成する
に到った。
果、ｔＰＡ生産においてその培地の浸透圧を重炭酸イオ
ンを用いて３５０ ミリオスモル以上とした培地に低分
子量の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安息香酸
類を添加することにより、−本積ｔＰＡの生産性を大き
く向上させることができるの見出し、本発明を完成する
に到った。
すなわち、本発明は、細胞を使ってヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子を製造する方法において、重炭酸イ
オンを用いて培地中の浸透圧を３５０ミリオスモル／Ｉ
！、以上とした培地に低分子量の抗プラスミン剤または
Ｐ−アミノメチル安息香酸類を加えることを特徴とする
１木鎖ｔＰＡの生産性を大幅に向上させる方法である。
ノーゲン活性化因子を製造する方法において、重炭酸イ
オンを用いて培地中の浸透圧を３５０ミリオスモル／Ｉ
！、以上とした培地に低分子量の抗プラスミン剤または
Ｐ−アミノメチル安息香酸類を加えることを特徴とする
１木鎖ｔＰＡの生産性を大幅に向上させる方法である。
本発明の方法において使用される重炭酸イオンは、重炭
酸ナトリウム（ＮａｌｌＣＯｓ）などの塩類として、ま
たは炭酸ガスの形態で使用される。
酸ナトリウム（ＮａｌｌＣＯｓ）などの塩類として、ま
たは炭酸ガスの形態で使用される。
本発明の方法において、重炭酸イオンの使用量は、通常
、基本培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタミンな
どに起因する浸透圧と重炭酸イオンに起因する浸透圧の
合計が３５０ ミリオスモル／ｌ以上となるような量で
ある。
、基本培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタミンな
どに起因する浸透圧と重炭酸イオンに起因する浸透圧の
合計が３５０ ミリオスモル／ｌ以上となるような量で
ある。
例えば、培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタミン
などに起因する浸透圧が２８０ ミリオスモル／ｌであ
るときはさらに７０ミリオスモル／２の浸透正分の炭酸
イオンを加え、合計３５０ ミリオスモル／ｌ以上とな
るようにする。
などに起因する浸透圧が２８０ ミリオスモル／ｌであ
るときはさらに７０ミリオスモル／２の浸透正分の炭酸
イオンを加え、合計３５０ ミリオスモル／ｌ以上とな
るようにする。
培地の浸透圧を上記のように調節するには、通常、例え
ば、重炭酸ナトリウム（ＮａｌｌＣＯｓ）を約３ｇ／２
以上、好ましくは３〜１０ｇ／ １基本培地に添加する
。
ば、重炭酸ナトリウム（ＮａｌｌＣＯｓ）を約３ｇ／２
以上、好ましくは３〜１０ｇ／ １基本培地に添加する
。
重炭酸イオンの供給方法、供給形態については培養方法
により選択されるが、例えば、Ｔ−フラスコ、ローラー
ボトルなどを使用する場合には、予め培地中に重炭酸ナ
トリウムを培地浸透圧が３５０〜５００ ミリオスモル
／ｌとなるように加えるのが好ましい。
により選択されるが、例えば、Ｔ−フラスコ、ローラー
ボトルなどを使用する場合には、予め培地中に重炭酸ナ
トリウムを培地浸透圧が３５０〜５００ ミリオスモル
／ｌとなるように加えるのが好ましい。
また細胞の培養、ｔＰＡの生産は密閉系もしくは開放系
の場合には、炭酸ガスインキュベーター中で行うのがよ
い。なお、５χ炭酸ガス雰囲気中で培地中に溶解する炭
酸ガスの量は、最大でも０．００１？１程度で浸透圧換
算約１ミリオスモル／ｌであり、実際の培養ｐＨ６，５
〜７．５の範囲では全体に対する影響は無視できる。
の場合には、炭酸ガスインキュベーター中で行うのがよ
い。なお、５χ炭酸ガス雰囲気中で培地中に溶解する炭
酸ガスの量は、最大でも０．００１？１程度で浸透圧換
算約１ミリオスモル／ｌであり、実際の培養ｐＨ６，５
〜７．５の範囲では全体に対する影響は無視できる。
さらに、培養方法をスピンナーもしくはジャー形式を使
用する方法の場合では、予め培地中に重炭酸ナトリムの
形で重炭酸イオンを供給するとともに炭酸ガスを系内に
吹き込むことにより、その重炭酸イオンの和によって系
内の浸透圧を３５０〜５００ ミリオスモル／ｌの間で
一定にすることができる。
用する方法の場合では、予め培地中に重炭酸ナトリムの
形で重炭酸イオンを供給するとともに炭酸ガスを系内に
吹き込むことにより、その重炭酸イオンの和によって系
内の浸透圧を３５０〜５００ ミリオスモル／ｌの間で
一定にすることができる。
また、本発明において使用する低分子量の坑プラスミン
剤としては、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン
酸、６−アミノヘキサン酸、トランス−４７ミノメチル
シクロヘキサンカルボン酸等が挙げられる。これらの化
合物はそのアルカリ金属、あるいはエステル、塩酸塩の
形でも使用できる。
剤としては、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン
酸、６−アミノヘキサン酸、トランス−４７ミノメチル
シクロヘキサンカルボン酸等が挙げられる。これらの化
合物はそのアルカリ金属、あるいはエステル、塩酸塩の
形でも使用できる。
本発明における低分子量の抗プラスミン剤の培地への添
加量は、１０−４〜１０− ’ Ｍであり、更に好まし
くは、１０４〜１０−２である。
加量は、１０−４〜１０− ’ Ｍであり、更に好まし
くは、１０４〜１０−２である。
本発明において使用するＰ−アミノメチル安息香酸類と
しては、Ｐ−アミノメチル安息香酸、３−メトキシ−４
−アミノメチル安息香酸、３−エトキシ−４−アミノメ
チル安息香酸、３−ヒドロキシ−４−アミノメチル安息
香酸、３−フルオロ−４−アミノメチル安息香酸、３−
クロロ−４−アミノメチル安息香酸、３メチル−４−ア
ミノメチル安息香酸、２−アミノ−４−アミノメチル安
息香酸らが挙げられる。これらのＰ−アミノメチル安息
香酸類は、そのエステル化合物、そのアルカリ金属塩、
あるいは塩酸塩の型で使用できる 抗プラスミン剤及びＰ−アミノメチル安息香酸類は、基
本培地調整時または重炭酸イオンで高張化させた後に添
加してもよい。
しては、Ｐ−アミノメチル安息香酸、３−メトキシ−４
−アミノメチル安息香酸、３−エトキシ−４−アミノメ
チル安息香酸、３−ヒドロキシ−４−アミノメチル安息
香酸、３−フルオロ−４−アミノメチル安息香酸、３−
クロロ−４−アミノメチル安息香酸、３メチル−４−ア
ミノメチル安息香酸、２−アミノ−４−アミノメチル安
息香酸らが挙げられる。これらのＰ−アミノメチル安息
香酸類は、そのエステル化合物、そのアルカリ金属塩、
あるいは塩酸塩の型で使用できる 抗プラスミン剤及びＰ−アミノメチル安息香酸類は、基
本培地調整時または重炭酸イオンで高張化させた後に添
加してもよい。
本発明の方法において、使用されるｔＰＡ生産細胞とし
ては、例えば、ヒト正常細胞由来ヒ）＆Ｉ［４ａ型プラ
スミノーゲン活性化因子をコードするＤＮＡ配列をヒト
由来メタロチオネインのプロモーターに接続し、ＩＩＩ
ＰＡ由来プラスミドの一部及びｐＢｌｌ ３２２プラス
ミドの一部及び転写停止に必要なりＮＡ配列などを組み
込んで構築したプラスミドをマウスＣ−１２７細胞に転
換して得られたｔＰＡ生産株、ｈＴ−３８２株などが使
用できる（特開昭６２−１２６９７８号）。
ては、例えば、ヒト正常細胞由来ヒ）＆Ｉ［４ａ型プラ
スミノーゲン活性化因子をコードするＤＮＡ配列をヒト
由来メタロチオネインのプロモーターに接続し、ＩＩＩ
ＰＡ由来プラスミドの一部及びｐＢｌｌ ３２２プラス
ミドの一部及び転写停止に必要なりＮＡ配列などを組み
込んで構築したプラスミドをマウスＣ−１２７細胞に転
換して得られたｔＰＡ生産株、ｈＴ−３８２株などが使
用できる（特開昭６２−１２６９７８号）。
また、例えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードするＤＮＡ配列を５Ｖ−４０
の初期プロモーターを接続した［１１４Ａ配列とジヒド
ロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ配列からなるプラス
ミドで、Ｃｌｌ０（チャイニーズハムスター卵巣）細胞
を形質転換し、更にメソロキサートを含む培地で遺伝子
の増幅した細胞を選択して得られたｔＰＡ生産株、ＳＶ
−２１−Ｍ２．５ Ｋ７株などが使用できる（特開昭６
２−１２６９７８号）。もちろん、突然変異、馴化など
の手段を併用したもの、またはウィルス等により形質転
換された細胞などで、いずれもｔＰＡ生産株であればよ
い。
ーゲン活性化因子をコードするＤＮＡ配列を５Ｖ−４０
の初期プロモーターを接続した［１１４Ａ配列とジヒド
ロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ配列からなるプラス
ミドで、Ｃｌｌ０（チャイニーズハムスター卵巣）細胞
を形質転換し、更にメソロキサートを含む培地で遺伝子
の増幅した細胞を選択して得られたｔＰＡ生産株、ＳＶ
−２１−Ｍ２．５ Ｋ７株などが使用できる（特開昭６
２−１２６９７８号）。もちろん、突然変異、馴化など
の手段を併用したもの、またはウィルス等により形質転
換された細胞などで、いずれもｔＰＡ生産株であればよ
い。
使用する培地は、ＤＭＩＥＭ、Ｅ？ＩＥＭ、１９９培地
などに、予め不活性化させた牛胎児血清（ＦＣＳギブコ
社製）を１０％程度添加した物が使用されるが、成分濃
度などは必要に応じて変更できる。
などに、予め不活性化させた牛胎児血清（ＦＣＳギブコ
社製）を１０％程度添加した物が使用されるが、成分濃
度などは必要に応じて変更できる。
また、必要に応じて界面活性剤などの成分を添加しても
よい。
よい。
生産培地を使用する場合、ｔＰＡの生産を誘導する物質
として亜鉛、カドミウムもしくはその塩を１〜１００μ
ｇｅｌである。
として亜鉛、カドミウムもしくはその塩を１〜１００μ
ｇｅｌである。
培養方法は、特に限定されるものではなく、例えば、次
のような方法で行われる。
のような方法で行われる。
すなわち、ルーフラスコに培地及び必要ならばｔＰＡ誘
導物質を仕込み、細胞の適切量を植えつけて、適温、適
切な時間、炭酸ガスインキュベーター中で増殖させ、コ
ンフレンドに達した後、生産培地と切り換え、同じく炭
酸ガスインキュベーター中で、適時ＬＰＡの生産を行う
。
導物質を仕込み、細胞の適切量を植えつけて、適温、適
切な時間、炭酸ガスインキュベーター中で増殖させ、コ
ンフレンドに達した後、生産培地と切り換え、同じく炭
酸ガスインキュベーター中で、適時ＬＰＡの生産を行う
。
例えば、７５ｃ４ルーフラスコを使用して、細胞を０．
５〜２．ＯｘｌＯ”ｒ／ｍｌ＠植えツケ、３７°Ｃ１３
〜４日間増殖と同時にｔＰＡ生産を行う。または、例え
ば、７５ｃ＋ｆｌのルーフラスコを使用して、細胞を１
〜２×１０Ｓケ／ｒｄを植付け、３７℃、１〜３日間ｔ
ＰＡ生産を行う。
５〜２．ＯｘｌＯ”ｒ／ｍｌ＠植えツケ、３７°Ｃ１３
〜４日間増殖と同時にｔＰＡ生産を行う。または、例え
ば、７５ｃ＋ｆｌのルーフラスコを使用して、細胞を１
〜２×１０Ｓケ／ｒｄを植付け、３７℃、１〜３日間ｔ
ＰＡ生産を行う。
このような方法で生産されたｔＰＡの全体に占める１本
鎖の比率は９５％以上であった。
鎖の比率は９５％以上であった。
（効果〕
本発明の方法によれば、培地中に添加された炭酸イオン
と低分子の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安息
香酸類の相乗的効果により一本鎖ｔｐへの生産量を大幅
に向上させることができる。
と低分子の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安息
香酸類の相乗的効果により一本鎖ｔｐへの生産量を大幅
に向上させることができる。
以下、実施例により本願発明を具体的に説明すなお、実
施例において、培地中の１木鎖及び２末鎖ｔＰＡの分析
法は次の方法によった。
施例において、培地中の１木鎖及び２末鎖ｔＰＡの分析
法は次の方法によった。
■ＥＩｊＳＡ専用プレート（コーニング社９６ｈｅ ｌ
Ｉ ）を１本ｔｉｔＰＡに対するモノクロナール抗体
（ＰＡＭ−１アメリ力ンダイアゴノテイカ社）、１末鎖
＋２本１ｉｔＰＡに対するモノクロナール抗体（ＰＡＭ
−２アメリ力ンダイアゴノテイカ社）をコート溶液で希
釈して１０μｇ／ｍｌ！とじ、各プレートのｗｅｌｌに
５０μ２ずつ加えて室温で２時間放置後、ｗｅｌｌ内の
液を捨てる。
Ｉ ）を１本ｔｉｔＰＡに対するモノクロナール抗体
（ＰＡＭ−１アメリ力ンダイアゴノテイカ社）、１末鎖
＋２本１ｉｔＰＡに対するモノクロナール抗体（ＰＡＭ
−２アメリ力ンダイアゴノテイカ社）をコート溶液で希
釈して１０μｇ／ｍｌ！とじ、各プレートのｗｅｌｌに
５０μ２ずつ加えて室温で２時間放置後、ｗｅｌｌ内の
液を捨てる。
■洗浄液で洗浄後、各−ｅｌｌをブロッキング？８液で
満たし、室温で３０分以上放置する。
満たし、室温で３０分以上放置する。
１０００〜２０００倍に希釈したサンプル及びスタンダ
ード（０、ｌ、２．４．８ ｎｇ／ ｒｒｒｌ ）を各
５０μ２ずつ各−ｅｌｌに加えて２時間放置する。
ード（０、ｌ、２．４．８ ｎｇ／ ｒｒｒｌ ）を各
５０μ２ずつ各−ｅｌｌに加えて２時間放置する。
■洗浄液で洗浄した後、抗ｔＰＡウサギ抗体を添加する
。
。
■洗浄液で洗浄後、Ｇｏａｔ Ａｎｔｊ Ｒａｂｂｉｔ
ＩｇＧ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ（シグマ社）を５００倍に希釈して各
ｗｅｌｌに５０μ２ずつ添加し、１時間放置する。
ＩｇＧ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ（シグマ社）を５００倍に希釈して各
ｗｅｌｌに５０μ２ずつ添加し、１時間放置する。
■洗浄液で洗浄後、基′ｆｔ溶液（Ｐ−Ｎｉ ｔｒｏｐ
ｈｅｎｙｌｐｈ。
ｈｅｎｙｌｐｈ。
５ｕｐｈａｔｅ シグマ社）を各５０μβずつ加えて３
０分間放置する。
０分間放置する。
■各−ｅｌｌに５０μ２ずつ３Ｎ Ｎａ０ｌｌを加えて
酵素反応を停止する。
酵素反応を停止する。
■４０５ｎｍにおける吸収を市販のＥｔ、ｌＳＡ ＲＥ
ＡＤＥＲで読み取る。
ＡＤＥＲで読み取る。
■スタンダードより検量線を作成し、サンプル中のｔＰ
Ａ濃度を測定する。
Ａ濃度を測定する。
■計算法
１末鎖ｔｐＡｌ＝ｐＡｑ−ｔ ＩＩＩ定値（ｍｇ／ １
）２末鎖ｔＰＡ ｌ＝ＰＡＭ−２−ＰＡＭ−１測定Ｉ
ｌｆｆ（ｍｇ／ ＩＶ、）また、浸透圧の測定は液をサ
ンプリング後、島津浸透圧計ＯＳト１で行った。
）２末鎖ｔＰＡ ｌ＝ＰＡＭ−２−ＰＡＭ−１測定Ｉ
ｌｆｆ（ｍｇ／ ＩＶ、）また、浸透圧の測定は液をサ
ンプリング後、島津浸透圧計ＯＳト１で行った。
実施例１
ｔＰＡの生産に用いた細胞は、ヒトメタロチオネインを
プロモーターとしてＢＰＶ由来プラスミドの一部及び転
写停止に必要なりＮＡ配列などを組み込んで構築したプ
ラスミドをマウスＣ−１２７細胞に形質転換して得られ
たｈＴ−３８２株を使用した。
プロモーターとしてＢＰＶ由来プラスミドの一部及び転
写停止に必要なりＮＡ配列などを組み込んで構築したプ
ラスミドをマウスＣ−１２７細胞に形質転換して得られ
たｈＴ−３８２株を使用した。
７５ｃ＋ｊのルーフラスコにＤＭＥＨに予め不活性化さ
せた牛胎児血清を１０％、アプロチニンを４０ＫＩＵ添
加したもの、トラネキサム酸を１０Ｍ添加したもの及び
Ｐ−アミノメチル安息香酸を１０−”Ｍ添加したものを
それぞれについて２０ｍ２仕込み、塩化亜鉛を１０μＭ
になるように、および表１に掲げる濃度で重炭酸ナトリ
ウムを添加した培地を作成し、それぞれに上記細胞を１
．ＯＸＩＯ’ケ／ｍｌとなるように植付けた。５％炭酸
ガスインキュベーター中で３７°Ｃ１４日間培養し、コ
ンフレンド（細胞数１０ＸＩＯ’ケ／ｍｌ）に達した時
点で培養液中の１本１ｉｔＰＡ濃度をの分析法で定量し
、表１のような結果を得た。
せた牛胎児血清を１０％、アプロチニンを４０ＫＩＵ添
加したもの、トラネキサム酸を１０Ｍ添加したもの及び
Ｐ−アミノメチル安息香酸を１０−”Ｍ添加したものを
それぞれについて２０ｍ２仕込み、塩化亜鉛を１０μＭ
になるように、および表１に掲げる濃度で重炭酸ナトリ
ウムを添加した培地を作成し、それぞれに上記細胞を１
．ＯＸＩＯ’ケ／ｍｌとなるように植付けた。５％炭酸
ガスインキュベーター中で３７°Ｃ１４日間培養し、コ
ンフレンド（細胞数１０ＸＩＯ’ケ／ｍｌ）に達した時
点で培養液中の１本１ｉｔＰＡ濃度をの分析法で定量し
、表１のような結果を得た。
（以下余白）
表−１
実施例２
実施例１と同し細胞を使用し、７５ｃ己のルーフラスコ
にＤＭＥＭに予め不活性化させた牛胎児血清を１０％添
加したものを２０ｍ ｌ仕込み、１．ＯＸＩＯ’ケ／ｎ
＋Ｉｌとなるように植えた。
にＤＭＥＭに予め不活性化させた牛胎児血清を１０％添
加したものを２０ｍ ｌ仕込み、１．ＯＸＩＯ’ケ／ｎ
＋Ｉｌとなるように植えた。
炭酸ガスインクベータ中で３７°Ｃ１４日間培養し、コ
ンフレンド（細胞数１０ Ｘ １０’ケ／ｉｆ）に達し
た時点で培地を捨て、同一の組成で塩化亜鉛を１０μＭ
、アプロチニン４０ＫＩＩＩとなるように、トラネキサ
ム酸１０−”Ｍ、またはＰ−アミノメチル安息香酸１０
− ” Ｍを添加して表２に掲げる各濃度で重炭酸ナト
リウムを添加した培地を２０ｍ ｌずつ加えて炭酸ガス
インキュベーター中で３７°Ｃ１２日間ｔｐ八を生産さ
へ、その時点での生産培地中でのｔｌ’Ａ ４度を実施
例と同様に分析し、表２の結果を得た。
ンフレンド（細胞数１０ Ｘ １０’ケ／ｉｆ）に達し
た時点で培地を捨て、同一の組成で塩化亜鉛を１０μＭ
、アプロチニン４０ＫＩＩＩとなるように、トラネキサ
ム酸１０−”Ｍ、またはＰ−アミノメチル安息香酸１０
− ” Ｍを添加して表２に掲げる各濃度で重炭酸ナト
リウムを添加した培地を２０ｍ ｌずつ加えて炭酸ガス
インキュベーター中で３７°Ｃ１２日間ｔｐ八を生産さ
へ、その時点での生産培地中でのｔｌ’Ａ ４度を実施
例と同様に分析し、表２の結果を得た。
（以下余白）
実施例３
ｔｐ＾の生産に用いた細胞は、ｔＰＡをコードするＤＮ
Ａ配列を５Ｖ−４０の初期プロモーターを接続したＤＮ
Ａ配列と、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ配
列から成るプラスミドでＣｌｌ０（チャイニーズハムス
ター卵巣）細胞を形質転換し、更にメソトロキサートを
含む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択して得られたＳ
Ｖ−２１−Ｍ２．５に７株を使用した。
Ａ配列を５Ｖ−４０の初期プロモーターを接続したＤＮ
Ａ配列と、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ配
列から成るプラスミドでＣｌｌ０（チャイニーズハムス
ター卵巣）細胞を形質転換し、更にメソトロキサートを
含む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択して得られたＳ
Ｖ−２１−Ｍ２．５に７株を使用した。
実施例１と同様な培地（ただし塩化亜鉛は添加せず）で
同様な方法で行い、表３の結果を得た。
同様な方法で行い、表３の結果を得た。
（以下余白）
表−２
表−３
γミノメナル玄恩査飯
実施例４
ｔＰＡの生産に用いた細胞は、実施例１と同様なものを
用いた。Ｐｌ＋電極、ＤＯ電極及びガス吹き込み管をセ
ットした攪拌羽根付きの実容Ｎ１１（全容量的１．！Ｍ
）のスピンナーフラスコに［１ＭＥＭに予め不活性化さ
せた牛胎児血清を１０％添加したものを１ｊ！仕込み、
上記と同組成の培地でローラーボトルに培養した種細胞
を１０”細胞数（１０５ケ／ｎｕ）を植付け、３７°Ｃ
で４日間培養後細胞濃度が１０６ケ／ｗｒｌに達した時
点で上記培地を抜きだして［１ＭＥＨに予め不活性化さ
せた牛胎児血清を５％、アプロチニン４０ＫＩＵ 、ま
たはトラネキサム酸１０−”Ｍ、またはＰ−アミノ安息
香酸１０４Ｍ及びそれぞれに塩化亜鉛を１０μＭ添加し
た培地１Ｎを仕込みｔＰＡを生産させる。
用いた。Ｐｌ＋電極、ＤＯ電極及びガス吹き込み管をセ
ットした攪拌羽根付きの実容Ｎ１１（全容量的１．！Ｍ
）のスピンナーフラスコに［１ＭＥＭに予め不活性化さ
せた牛胎児血清を１０％添加したものを１ｊ！仕込み、
上記と同組成の培地でローラーボトルに培養した種細胞
を１０”細胞数（１０５ケ／ｎｕ）を植付け、３７°Ｃ
で４日間培養後細胞濃度が１０６ケ／ｗｒｌに達した時
点で上記培地を抜きだして［１ＭＥＨに予め不活性化さ
せた牛胎児血清を５％、アプロチニン４０ＫＩＵ 、ま
たはトラネキサム酸１０−”Ｍ、またはＰ−アミノ安息
香酸１０４Ｍ及びそれぞれに塩化亜鉛を１０μＭ添加し
た培地１Ｎを仕込みｔＰＡを生産させる。
５％炭酸ガスを適時吹き込み浸透圧が表４のようになる
ようにコントロールした。また、Ｎ ａ ＯＩＩでＰＩ
（を７．０に調整した。更に、ＤＯをＩＰＰＭ、温度を
３７゛Ｃでコントロールした。１日１回培地交換を行い
５回まで生産させた。
ようにコントロールした。また、Ｎ ａ ＯＩＩでＰＩ
（を７．０に調整した。更に、ＤＯをＩＰＰＭ、温度を
３７゛Ｃでコントロールした。１日１回培地交換を行い
５回まで生産させた。
Claims (2)
- （１）細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子を製造する方法において、重炭酸イオンを用いて培
地中の浸透圧を３５０ミリオスモル／ｌ以上とした培地
に低分子量の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安
息香酸類を加えることを特徴とするヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子の製法。 - （２）抗プラスミン剤が、４−アミノブタン酸、５−ア
ミンペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、トランス−４
−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸またはトラン
ス−４−アミノエチルシクロヘキサンカルボン酸である
請求項第１項記載の製法。
Priority Applications (22)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63316118A JP2718726B2 (ja) | 1988-12-16 | 1988-12-16 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
| US07/347,649 US5151359A (en) | 1988-05-19 | 1989-05-05 | Method for producing of human tissue type plasminogen activator |
| CA000599119A CA1334288C (en) | 1988-05-19 | 1989-05-09 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| AT89304944T ATE108825T1 (de) | 1988-05-19 | 1989-05-16 | Verfahren zur herstellung von menschlichem gewebeplasminogenaktivator. |
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