JP2718726B2 - ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 - Google Patents
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト正常細胞の産する組織型プラスミノー
ゲン活性化因子（以後tPAと略す）の製法に関する。
ゲン活性化因子（以後tPAと略す）の製法に関する。
tPAは、血管内皮細胞および種種の組織細胞から生
産、分泌されるもので、血栓の本体であるフィブリンを
溶解し、血栓症の治療薬として有効である。
産、分泌されるもので、血栓の本体であるフィブリンを
溶解し、血栓症の治療薬として有効である。
tPAは１本鎖のものと２本鎖のものとがあるのが知ら
れている。これらの血栓溶解活性は、２本鎖のものが１
本鎖に比べて大きい。従来、いわゆるtPAと言われるも
のは、２本鎖単独のものまたは２本鎖に１本鎖が混合し
た状態のものが開発されてきた。
れている。これらの血栓溶解活性は、２本鎖のものが１
本鎖に比べて大きい。従来、いわゆるtPAと言われるも
のは、２本鎖単独のものまたは２本鎖に１本鎖が混合し
た状態のものが開発されてきた。
２本鎖tPAは、血栓の溶解活性が大きく、フィブリン
溶解効果を必要とする血栓部分ではなく、血流中でプラ
スミノーゲンを活性化させる可能性が非常に高く、臨床
的に出血傾向が高い（特開昭59−118717号）。
溶解効果を必要とする血栓部分ではなく、血流中でプラ
スミノーゲンを活性化させる可能性が非常に高く、臨床
的に出血傾向が高い（特開昭59−118717号）。
しかしながら、２本鎖tPAの前駆体と考えられる１本
鎖tPAは、フィブリンにはより高い親和性を有し、フィ
ブリンに吸着されると直ちに早い速度で２本鎖tPAに転
換される。
鎖tPAは、フィブリンにはより高い親和性を有し、フィ
ブリンに吸着されると直ちに早い速度で２本鎖tPAに転
換される。
したがって、１本鎖tPAは凝血部分でプラスミノーゲ
ン活性を最大に発揮することができる。
ン活性を最大に発揮することができる。
このように血栓溶解活性が比較的不活性とされていた
１本鎖tPAは、血流中で作用することがないとされ、臨
床的には多く望まれるようになっている状況であり、１
本鎖tPAのみを効率良く生産する方法が強く望まれてい
る。
１本鎖tPAは、血流中で作用することがないとされ、臨
床的には多く望まれるようになっている状況であり、１
本鎖tPAのみを効率良く生産する方法が強く望まれてい
る。
１本鎖tPAのみを生産させる方法としてアプロチニン
の存在下に培養または後処理を行う方法（ヨーロッパ特
許公開公報第41766号）、トリプシン阻害剤またはアプ
ロチニンを使用する方法（特開昭59−118717号）、アプ
ロチニンまたはベンズアミジンを添加した培地で培養も
しくは誘導生産させる方法（特開昭61−19486号）、精
製時にアプロチニン、６−アミノカプロン酸を添加して
１本鎖のみを生産させる方法（Biochem.Biophys.Acta 1
982,719（２）318〜328），または血清由来の高価なア
プロチニンに代えて低分子量の化学物質を添加する方
法、すなわち、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸
などの抗プラスミン剤を培地中に添加する方法（特開昭
62−4233号）、ｐ−アミノメル安息香酸を培地中に添加
する方法（特願昭63−122644号）などが知られている。
の存在下に培養または後処理を行う方法（ヨーロッパ特
許公開公報第41766号）、トリプシン阻害剤またはアプ
ロチニンを使用する方法（特開昭59−118717号）、アプ
ロチニンまたはベンズアミジンを添加した培地で培養も
しくは誘導生産させる方法（特開昭61−19486号）、精
製時にアプロチニン、６−アミノカプロン酸を添加して
１本鎖のみを生産させる方法（Biochem.Biophys.Acta 1
982,719（２）318〜328），または血清由来の高価なア
プロチニンに代えて低分子量の化学物質を添加する方
法、すなわち、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸
などの抗プラスミン剤を培地中に添加する方法（特開昭
62−4233号）、ｐ−アミノメル安息香酸を培地中に添加
する方法（特願昭63−122644号）などが知られている。
しかしながら、アプロチニンを低分子量の抗プラスミ
ン剤またはｐ−アミノメチル安息香酸類に代えても、１
本鎖tPAの大幅な生産性向上は達成することは出来なか
った。
ン剤またはｐ−アミノメチル安息香酸類に代えても、１
本鎖tPAの大幅な生産性向上は達成することは出来なか
った。
本発明の課題は、１本鎖tPAを、その生産性を大幅に
向上させて製造する方法を提供することである。
向上させて製造する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討の
結果、tPA生産においてその培地の浸透圧を重炭酸イオ
ンを用いて350ミリオスモル以上とした培地に低分子量
の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安息香酸を添
加することにより、一本鎖tPAの生産性を大きく向上さ
せることができるの見出し、本発明を完成するに到っ
た。
結果、tPA生産においてその培地の浸透圧を重炭酸イオ
ンを用いて350ミリオスモル以上とした培地に低分子量
の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安息香酸を添
加することにより、一本鎖tPAの生産性を大きく向上さ
せることができるの見出し、本発明を完成するに到っ
た。
すなわち、本発明は、細胞を使ってヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子を製造する方法において、重炭酸
イオンを用いて培地中の浸透圧を350ミリオスモル／
以上とした培地に低分子量の抗プラスミン剤またはＰ−
アミノメチル安息香酸類を加えることを特徴とする１本
鎖tPAの生産性を大幅に向上させる方法である。
ミノーゲン活性化因子を製造する方法において、重炭酸
イオンを用いて培地中の浸透圧を350ミリオスモル／
以上とした培地に低分子量の抗プラスミン剤またはＰ−
アミノメチル安息香酸類を加えることを特徴とする１本
鎖tPAの生産性を大幅に向上させる方法である。
本発明の方法において使用される重炭酸イオンは、重
炭酸ナトリウム（NaHCO3）などの塩酸として、または炭
酸ガスの形態で使用される。
炭酸ナトリウム（NaHCO3）などの塩酸として、または炭
酸ガスの形態で使用される。
本発明の方法において、重炭酸イオンの使用量は、通
常、基本培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタミン
などに起因する浸透圧と重炭酸イオンに起因する浸透圧
の合計が350ミリオスモル／以上となるような量であ
る。
常、基本培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタミン
などに起因する浸透圧と重炭酸イオンに起因する浸透圧
の合計が350ミリオスモル／以上となるような量であ
る。
例えば、培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタミ
ンなどに起因する浸透圧が280ミリオスモル／である
ときはさらに70ミリオスモル／の浸透圧分の炭酸イオ
ンを加え、合計350ミリオスモル／以上となるように
する。
ンなどに起因する浸透圧が280ミリオスモル／である
ときはさらに70ミリオスモル／の浸透圧分の炭酸イオ
ンを加え、合計350ミリオスモル／以上となるように
する。
培地の浸透圧を上記のように調節するには、通常、例
えば、重炭酸ナトリウム（NaHCO3）を約3g/以上、好
ましくは３〜10g/基本培地に添加する。
えば、重炭酸ナトリウム（NaHCO3）を約3g/以上、好
ましくは３〜10g/基本培地に添加する。
重炭酸イオンの供給方法、供給形態については培養方
法により選択されるが、例えば、Ｔ−フラスコ、ローラ
ーボトルなどを使用する場合には、予め培地中に重炭酸
ナトリウムを培地浸透圧が350〜500ミリオスモル／と
なるように加えるのが好ましい。
法により選択されるが、例えば、Ｔ−フラスコ、ローラ
ーボトルなどを使用する場合には、予め培地中に重炭酸
ナトリウムを培地浸透圧が350〜500ミリオスモル／と
なるように加えるのが好ましい。
また細胞の培養、tPAの生産は密閉系もしくは開放系
の場合には、炭酸ガスインキュベーター中で行うのがよ
い。なお、５％炭酸ガス雰囲気中で培地中に溶解する炭
酸ガスの量は、最大でも0.001M程度で浸透圧換算約１ミ
リオスモル／であり、実際の培養pH6.5〜7.5の範囲で
は全体に対する影響は無視できる。
の場合には、炭酸ガスインキュベーター中で行うのがよ
い。なお、５％炭酸ガス雰囲気中で培地中に溶解する炭
酸ガスの量は、最大でも0.001M程度で浸透圧換算約１ミ
リオスモル／であり、実際の培養pH6.5〜7.5の範囲で
は全体に対する影響は無視できる。
さらに、培養方法をスピンナーもしくはジャー形式を
使用する方法の場合では、予め培地中に重炭酸ナトリウ
ムの形で重炭酸イオンを供給するとともに炭酸ガスを系
内に吹き込むことにより、その重炭酸イオンの和によっ
て系内の浸透圧を350〜500ミリオスモル／の間で一定
にすることができる。
使用する方法の場合では、予め培地中に重炭酸ナトリウ
ムの形で重炭酸イオンを供給するとともに炭酸ガスを系
内に吹き込むことにより、その重炭酸イオンの和によっ
て系内の浸透圧を350〜500ミリオスモル／の間で一定
にすることができる。
また、本発明において使用する低分子量の抗プラスミ
ン剤としては、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタ
ン酸、６−アミノヘキサン酸、トランス−４−アミノメ
チルシクロヘキサンカルボン酸等が挙げられる。これら
の化合物はそのアルカリ金属、あるいはエステル、塩酸
塩の形でも使用できる。
ン剤としては、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタ
ン酸、６−アミノヘキサン酸、トランス−４−アミノメ
チルシクロヘキサンカルボン酸等が挙げられる。これら
の化合物はそのアルカリ金属、あるいはエステル、塩酸
塩の形でも使用できる。
本発明における低分子量の抗プラスミン剤の培地への
添加量は、10-4〜10-1Mであり、更に好ましくは、10-3
〜10-2である。
添加量は、10-4〜10-1Mであり、更に好ましくは、10-3
〜10-2である。
本発明において使用するＰ−アミノメチル安息香酸類
としては、Ｐ−アミノメチル安息香酸、３−メトキシ−
４−アミノメチル安息香酸、３−エトキシ−４−アミノ
メチル安息香酸、３−ヒドロキシ−４−アミノメチル安
息香酸、３−フルオロ−４−アミノメチル安息香酸、３
−クロロ−４−アミノメチル安息香酸、３−メチル−４
−アミノメチル安息香酸、２−アミノ−４−アミノメチ
ル安息香酸等が挙げられる。これらのＰ−アミノメチル
安息香酸類は、そのエステル化合物、そのアルカリ金属
塩、あるいは塩酸塩の型で使用できる。
としては、Ｐ−アミノメチル安息香酸、３−メトキシ−
４−アミノメチル安息香酸、３−エトキシ−４−アミノ
メチル安息香酸、３−ヒドロキシ−４−アミノメチル安
息香酸、３−フルオロ−４−アミノメチル安息香酸、３
−クロロ−４−アミノメチル安息香酸、３−メチル−４
−アミノメチル安息香酸、２−アミノ−４−アミノメチ
ル安息香酸等が挙げられる。これらのＰ−アミノメチル
安息香酸類は、そのエステル化合物、そのアルカリ金属
塩、あるいは塩酸塩の型で使用できる。
抗プラスミン剤及びＰ−アミノメチル安息香酸類は、
基本培地調整時または重炭酸イオンで高張化させた後に
添加してもよい。
基本培地調整時または重炭酸イオンで高張化させた後に
添加してもよい。
本発明の方法において、使用されるtPA生産細胞とし
ては、例えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードするDNA配列をヒト由来メタ
ロチオネインのプロモーターに接続し、BPA由来プラス
ミドの一部及びpBR322プラスミドの一部及び転写停止に
必要なDNA配列などを組み込んで構築したプラスミドを
マウスＣ−127細胞に転換して得られたtPA生産株、hT−
382株などが使用できる（特開昭62−126978号）。
ては、例えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードするDNA配列をヒト由来メタ
ロチオネインのプロモーターに接続し、BPA由来プラス
ミドの一部及びpBR322プラスミドの一部及び転写停止に
必要なDNA配列などを組み込んで構築したプラスミドを
マウスＣ−127細胞に転換して得られたtPA生産株、hT−
382株などが使用できる（特開昭62−126978号）。
また、例えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子をコードするDNA配列をSV−40の初
期プロモーターを接続したDNA配列とジヒドロ葉酸還元
酵素をコードするDNA配列からなるプラスミドで、CHO
（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形質転換し、更
にメソロキサートを含む培地で遺伝子の増幅した細胞を
選択して得られたtPA生産株、SV−21−M2.5 K7株などが
使用できる（特開昭62−126978号）。もちろん、突然変
異、馴化などの手段を併用したもの、またはウイルム等
により形質転換された細胞などで、いずれもtPA生産株
であればよい。
ノーゲン活性化因子をコードするDNA配列をSV−40の初
期プロモーターを接続したDNA配列とジヒドロ葉酸還元
酵素をコードするDNA配列からなるプラスミドで、CHO
（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形質転換し、更
にメソロキサートを含む培地で遺伝子の増幅した細胞を
選択して得られたtPA生産株、SV−21−M2.5 K7株などが
使用できる（特開昭62−126978号）。もちろん、突然変
異、馴化などの手段を併用したもの、またはウイルム等
により形質転換された細胞などで、いずれもtPA生産株
であればよい。
使用する培地は、DMEM、EMEM、199培地などに、予め
不活性化させた牛胎児血清（FCSギブコ社製）を10％程
度添加した物が使用されるが、成分濃度などは必要に応
じて変更できる。
不活性化させた牛胎児血清（FCSギブコ社製）を10％程
度添加した物が使用されるが、成分濃度などは必要に応
じて変更できる。
また、必要に応じて界面活性剤などの成分を添加して
もよい。
もよい。
生産培地を使用する場合、tPAの生産を誘導する物質
として亜鉛、カドミウムもしくはその塩を１〜100μg/
である。
として亜鉛、カドミウムもしくはその塩を１〜100μg/
である。
培養方法は、特に限定されるものではなく、例えば、
次のような方法で行われる。
次のような方法で行われる。
すなわち、ルーフラスコに培地及び必要ならばtPA誘
導物質を仕込み、細胞の適切量を植えつけて、適温、適
切な時間、炭酸ガスインキュベーター中で増殖させ、コ
ンフレントに達した後、生産培地と切り換え、同じく炭
酸ガスインキュベーター中で、適時tPAの生産を行う。
導物質を仕込み、細胞の適切量を植えつけて、適温、適
切な時間、炭酸ガスインキュベーター中で増殖させ、コ
ンフレントに達した後、生産培地と切り換え、同じく炭
酸ガスインキュベーター中で、適時tPAの生産を行う。
例えば75cm2ルーフラスコを使用して、細胞を0.5〜2.
0×105ケ/mlを植えつけ、37℃、３〜４日間増殖と同時
にtPA生産を行う。または、例えば、75cm2のルーフラス
コを使用して、細胞を１〜２×105ケ/mlを植付け、37
℃、１〜３日間tPA生産を行う。
0×105ケ/mlを植えつけ、37℃、３〜４日間増殖と同時
にtPA生産を行う。または、例えば、75cm2のルーフラス
コを使用して、細胞を１〜２×105ケ/mlを植付け、37
℃、１〜３日間tPA生産を行う。
このような方法で生産されたtPAの全体に占める１本
鎖の比率は95％以上であった。
鎖の比率は95％以上であった。
〔効果〕 本発明の方法によれば、培地中に添加された炭酸イオ
ンと低分子の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安
息香酸類の相乗的効果により一本鎖tPAの生産量を大幅
に向上させることができる。
ンと低分子の抗プラスミン剤またはＰ−アミノメチル安
息香酸類の相乗的効果により一本鎖tPAの生産量を大幅
に向上させることができる。
以下、本発明により本願発明を具体的に説明する。
なお、実施例において、培地中の１本鎖及び２本鎖tP
Aの分析法は次の方法によった。
Aの分析法は次の方法によった。
ELISA専用プレート（コーニング社96well）を１本鎖t
PAに対するモノクロナール抗体（PAM−１アメリカンダ
イアゴノテイカ社）、１本鎖＋２本鎖tPAに対するモノ
クロナール抗体（PAM−２アメリカンダイアゴノテイカ
社）をコート溶液で希釈して10μg/mlとし、各プレート
のwellに50μずつ加えて室温で２時間放置後、well内
の液を捨てる。
PAに対するモノクロナール抗体（PAM−１アメリカンダ
イアゴノテイカ社）、１本鎖＋２本鎖tPAに対するモノ
クロナール抗体（PAM−２アメリカンダイアゴノテイカ
社）をコート溶液で希釈して10μg/mlとし、各プレート
のwellに50μずつ加えて室温で２時間放置後、well内
の液を捨てる。
洗浄液で洗浄後、各wellをブロッキング溶液で満た
し、室温で30分以上放置する。
し、室温で30分以上放置する。
1000〜2000倍に希釈したサンプル及びスタンダード
（０、１、２、４、8ng/ml）を各50μずつ各wellに加
えて２時間放置する。
（０、１、２、４、8ng/ml）を各50μずつ各wellに加
えて２時間放置する。
洗浄液で洗浄した後、抗tPAウサギ抗体を添加する。
洗浄液で洗浄後、Goat Anti Rabbit IgG,Alkaline Ph
osphate Conjugate（シグマ社）を500倍に希釈して各we
llに50μずつ添加し、１時間放置する。
osphate Conjugate（シグマ社）を500倍に希釈して各we
llに50μずつ添加し、１時間放置する。
洗浄液で洗浄後、基質溶液（Ｐ−Nitrophenylphosuph
ateシグマ社）を各50μずつ加えて30分間放置する。
ateシグマ社）を各50μずつ加えて30分間放置する。
各wellに50μずつ3N NaOHを加えて酵素反応を停止
する。
する。
405nmにおける吸収を市販のELISA READERで読み取
る。
る。
スタンダードより検量線を作成し、サンプル中のtPA
濃度を測定する。
濃度を測定する。
計算法 １本鎖tPA量＝PAM−１測定値（mg/） ２本鎖tPA量＝PMA−２−PAM−１測定値（mg/） また、浸透圧の測定は液をサンプリング後、島津浸透
圧計OSM−１で行った。
圧計OSM−１で行った。
実施例１ tPAの生産に用いた細胞は、ヒトメタロチオネインを
プロモーターとしてBPV由来プラスミドの一部及び転写
停止に必要なDNA配列などを組み込んで構築したプラス
ミドをマウスＣ−127細胞に形質転換して得られたhT−3
82株を使用した。
プロモーターとしてBPV由来プラスミドの一部及び転写
停止に必要なDNA配列などを組み込んで構築したプラス
ミドをマウスＣ−127細胞に形質転換して得られたhT−3
82株を使用した。
75cm2のルーフラスコにDMEMに予め不活性化させた牛
胎児血清を10％、アプロチニンを40KIU添加したもの、
トラネキサム酸を10M添加したもの及びＰ−アミノメチ
ル安息香酸を10-2M添加したものをそれぞれについて20m
l仕込み、塩化亜鉛を10μＭになるように、および表１
に掲げる濃度で重炭酸ナトリウムを添加した培地を作成
し、それぞれに上記細胞を1.0×105ケ/mlとなるように
植付けた。５％炭酸ガスインキュベーター中で37℃、４
日間培養し、コンフレント（細胞数10×105ケ/ml）に達
した時点で培養液中の１本鎖tPA濃度をの分析法で定量
し、表１のような結果を得た。
胎児血清を10％、アプロチニンを40KIU添加したもの、
トラネキサム酸を10M添加したもの及びＰ−アミノメチ
ル安息香酸を10-2M添加したものをそれぞれについて20m
l仕込み、塩化亜鉛を10μＭになるように、および表１
に掲げる濃度で重炭酸ナトリウムを添加した培地を作成
し、それぞれに上記細胞を1.0×105ケ/mlとなるように
植付けた。５％炭酸ガスインキュベーター中で37℃、４
日間培養し、コンフレント（細胞数10×105ケ/ml）に達
した時点で培養液中の１本鎖tPA濃度をの分析法で定量
し、表１のような結果を得た。
実施例２ 実施例１と同じ細胞を使用し、75cm2のルーフラスコ
にDMEMに予め不活性化させた牛胎児血清を10％添加した
ものを20ml仕込み、1.0×105ケ/mlとなるように植え
た。
にDMEMに予め不活性化させた牛胎児血清を10％添加した
ものを20ml仕込み、1.0×105ケ/mlとなるように植え
た。
炭酸ガスインクベータ中で37℃、４日間培養し、コン
フレント（細胞数10×105ケ/ml）に達した時点で培地を
捨て、同一の組成で塩化亜鉛を10μM,アプロチニン40KI
Uとなるように、トラネキサム酸を10-3M,またはＰ−ア
ミノメチル安息香酸を10-2Mを添加して表２に掲げる各
濃度で重炭酸ナトリウムを添加した培地を20mlずつ加え
て炭酸ガスインキュベーター中で37℃、２日間tPAを生
産させ、その時点での生産培地中でのtPA濃度を実施例
と同様に分析し、表２の結果を得た。
フレント（細胞数10×105ケ/ml）に達した時点で培地を
捨て、同一の組成で塩化亜鉛を10μM,アプロチニン40KI
Uとなるように、トラネキサム酸を10-3M,またはＰ−ア
ミノメチル安息香酸を10-2Mを添加して表２に掲げる各
濃度で重炭酸ナトリウムを添加した培地を20mlずつ加え
て炭酸ガスインキュベーター中で37℃、２日間tPAを生
産させ、その時点での生産培地中でのtPA濃度を実施例
と同様に分析し、表２の結果を得た。
実施例３ tPAの生産に用いた細胞は、tPAをコードするDNA配列
をSV−40の初期プロモーターを接続したDNA配列と、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNA配列から成るプラ
スミドでCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を軽
質転換し、更にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の
増幅した細胞を選択して得られたSV−21−M2.5K7株を使
用した。
をSV−40の初期プロモーターを接続したDNA配列と、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNA配列から成るプラ
スミドでCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を軽
質転換し、更にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の
増幅した細胞を選択して得られたSV−21−M2.5K7株を使
用した。
実施例１と同様な培地（ただし塩化亜鉛は添加せず）
で同様な方法で行い、表３の結果を得た。
で同様な方法で行い、表３の結果を得た。
実施例４ tPAの生産に用いた細胞は、実施例１と同様なものを
用いた。PH電極、DO電極及びガス吹き込み管をセットし
た撹拌羽根付きの実容量１（全容量約1.5）のスピ
ンナーフラスコにDMEMに予め不活性化させた牛胎児血清
を10％添加したものを１仕込み、上記と同組成の培地
でローラーボトルに培養した細胞を108細胞（105ケ/m
l）を植付け、37℃で４日間培養後細胞濃度が106ケ/ml
に達した時点で上記培地を抜きだしてDMEMに予め不活性
化させた牛胎児血清を５％、アプロチニン40KIU,または
トラネキサム酸を10-2M,またはＰ−アミノ安息香酸10-2
M及びそれぞれに塩化亜鉛を10μＭ添加した培地１を
仕込みtPAを生産させる。
用いた。PH電極、DO電極及びガス吹き込み管をセットし
た撹拌羽根付きの実容量１（全容量約1.5）のスピ
ンナーフラスコにDMEMに予め不活性化させた牛胎児血清
を10％添加したものを１仕込み、上記と同組成の培地
でローラーボトルに培養した細胞を108細胞（105ケ/m
l）を植付け、37℃で４日間培養後細胞濃度が106ケ/ml
に達した時点で上記培地を抜きだしてDMEMに予め不活性
化させた牛胎児血清を５％、アプロチニン40KIU,または
トラネキサム酸を10-2M,またはＰ−アミノ安息香酸10-2
M及びそれぞれに塩化亜鉛を10μＭ添加した培地１を
仕込みtPAを生産させる。
５％炭酸ガスを適時吹き込み浸透圧が表４のようにな
るようにコントロールした。また、NaOHでPHを7.0に調
整した。更に、DOを1PPM、温度を37℃でコントロールし
た。１日１回培地交換を行い５回まで生産させた。
るようにコントロールした。また、NaOHでPHを7.0に調
整した。更に、DOを1PPM、温度を37℃でコントロールし
た。１日１回培地交換を行い５回まで生産させた。
Claims (4)
- 【請求項１】細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子を製造する方法において、重炭酸イオンを用
いて培地中の浸透圧を350ミリオスモル/l以上とした培
地に低分子量の抗プラスミン剤を加えることを特徴とす
るヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法。 - 【請求項２】細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子を製造する方法において、重炭酸イオンを用
いて培地中の浸透圧を350ミリオスモル/l以上とした培
地にＰ−アミノメチル安息香酸類を加えることを特徴と
するヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法。 - 【請求項３】低分子量の抗プラスミン剤が、４−アミノ
ブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン
酸、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボ
ン酸またはトランス−４−アミノエチルシクロヘキサン
カルボン酸である特許請求の範囲第１項記載の製法。 - 【請求項４】培地中の浸透圧を350〜520ミリオスモル/l
とすることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３
項記載の製法。
Priority Applications (22)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63316118A JP2718726B2 (ja) | 1988-12-16 | 1988-12-16 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
| US07/347,649 US5151359A (en) | 1988-05-19 | 1989-05-05 | Method for producing of human tissue type plasminogen activator |
| CA000599119A CA1334288C (en) | 1988-05-19 | 1989-05-09 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| DE68916857T DE68916857T2 (de) | 1988-05-19 | 1989-05-16 | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator. |
| EP89304944A EP0342931B1 (en) | 1988-05-19 | 1989-05-16 | Method for the production of human tissue type plasminogen activator |
| AT89304944T ATE108825T1 (de) | 1988-05-19 | 1989-05-16 | Verfahren zur herstellung von menschlichem gewebeplasminogenaktivator. |
| AU34892/89A AU612837B2 (en) | 1988-05-19 | 1989-05-17 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| FI892358A FI98123C (fi) | 1988-05-19 | 1989-05-17 | Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi |
| NO891995A NO175541C (no) | 1988-05-19 | 1989-05-18 | Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator |
| NZ229187A NZ229187A (en) | 1988-05-19 | 1989-05-18 | Method of production of t-pa from cell culture |
| DK243589A DK243589A (da) | 1988-05-19 | 1989-05-19 | Fremgangsmaade til fremstilling af human-vaevstypeplasminogenaktivator |
| US07/412,818 US5183754A (en) | 1988-10-04 | 1989-09-27 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| CA000614123A CA1335188C (en) | 1988-10-04 | 1989-09-28 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| FI894657A FI96039C (fi) | 1988-10-04 | 1989-10-02 | Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi |
| NZ230856A NZ230856A (en) | 1988-10-04 | 1989-10-02 | Production of human tissue type plasminogen activator (tpa) under conditions of increased osmotic pressure |
| NO893929A NO175787C (no) | 1988-10-04 | 1989-10-03 | Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator |
| AU42541/89A AU614429B2 (en) | 1988-10-04 | 1989-10-03 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| EP89310134A EP0366285B1 (en) | 1988-10-04 | 1989-10-04 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| KR1019890014230A KR920007398B1 (ko) | 1988-10-04 | 1989-10-04 | 인간 조직형 플라스미노겐 액티베이터(Plasminogen activator)의 제조방법 |
| AT89310134T ATE116363T1 (de) | 1988-10-04 | 1989-10-04 | Verfahren zur herstellung des menschlichen gewebeplasminogenaktivators. |
| DE68920269T DE68920269T2 (de) | 1988-10-04 | 1989-10-04 | Verfahren zur Herstellung des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators. |
| DK488489A DK488489A (da) | 1988-10-04 | 1989-10-04 | Fremgangsmaade til fremstilling af human-plasmino-genaktivator af vaevstype |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63316118A JP2718726B2 (ja) | 1988-12-16 | 1988-12-16 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63316118A Expired - Fee Related JP2718726B2 (ja) | 1988-05-19 | 1988-12-16 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2718726B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19637591A1 (de) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Bayer Ag | Osmokontrolliertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Acarbose |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS624233A (ja) * | 1985-07-01 | 1987-01-10 | Toyobo Co Ltd | 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法 |
-
1988
- 1988-12-16 JP JP63316118A patent/JP2718726B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02163083A (ja) | 1990-06-22 |
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