FI98123C - Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI98123C FI98123C FI892358A FI892358A FI98123C FI 98123 C FI98123 C FI 98123C FI 892358 A FI892358 A FI 892358A FI 892358 A FI892358 A FI 892358A FI 98123 C FI98123 C FI 98123C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- tpa
- cells
- medium
- aminomethylbenzoic acid
- chain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
Description
98123
Menetelmä ihmisen kudosplasminoqeeniaktivaattorin_yalmis.- tamiseksi Tämän keksinnön kohteena on menetelmä kudosplasminogeeniakti-5 vaattorin (seuraavassa tPA) valmistamiseksi, joka on valmistettu ihmisen normaaleista soluista.
tPA, jota tuotetaan ja eritetään vaskulaaristen endoteli-aalisten solujen ja erilaisten kudossolujen toimesta, liuot-lo taa fibriinihyytyrniä, nimittäin trombeja (veritukkoja) . Siten tPA on tehokas trombolyyttisenä aineena.
tPA: 11a on kaksi molekyylimuotoa, yksiketjuinen tPA ja kaksi-ketjuinen tPA. Kaksiketjuisen tPA:n trombolyyttinen aktiivi-15 suus on suurempi kuin yksiketjuisen tPA:n. Niin kutsuttu tPA on tavanomaisesti kehitetty pelkässä kaksiketjuisessa muodossa tai kaksiketjuisen ja yksiketjuisen muodon seoksena.
Kaksiketjuisella tPA:lla on hyvä fibrinolyyttinen aktiivisuus 20 ja on erittäin mahdollista, että kaksiketjuinen tPA ei aktivoi plasminogeeniä trombeissa, missä fibrinolyyttistä vaikutusta odotetaan, vaan veressä, mikä aiheuttaa usein kliinistä verenvuotoa (japanilainen kuulutusjulkaisu n:0118717/1984).
25 Toisaalta, yksiketjuisella tPA:lla, jota pidetään kaksiket-juisen tPA:n esiasteena, on suuri affiniteetti fibriinin suhteen ja se muunnetaan nopeasti kaksiketjuiseksi tPA:ksi,-kun se kerran on sitoutunut fibriiniin.
30 Näin yksiketjuisella tPA:lla on maksimaalisesti plas-minogeeniaktiivisuus hyytymiskohdissa.
98123 2
Siten yksiketjuisen tPA:n trombolyyttinen aktiivisuus on suhteellisen alhainen eikä sitä esiinny veressä. Tämän johdosta kliinisessä käytössä yksiketjuista tPA:ta tarvitaan enemmän kuin kaksiketjuista tPA:ta ja on erittäin suuri tarve 5 saada aikaan menetelmä yksiketjuisen tPA:n valmistamiseksi.
Kuitenkin valmistettaessa yksiketjuista tPA:ta käyttämällä soluja on olemassa se ongelma, että kasvualustaan sisältyvät tai solujen tuottamat proteolyyttiset entsyymit (useimmiten ίο plasmaini tai trypsiini) muuntavat yksiketjuisen tPA:n kaksiket j ui seksi tPA:ksi valmistusprosessien aikana, mikä häiritsee yksiketjuisen tPA:n tehokasta valmistusta.
Alla on esitetty tunnettuja menetelmiä tällaisen ongelman is ratkaisemiseksi.
On olemassa menetelmä, jossa viljely ja sitä seuraavat vaiheet suoritetaan aprotiniinin läsnäollessa (eurooppalainen patenttijulkaisu n:o 41766), menetelmä, jossa soijapavuilla 20 indusoitua trypsiini-inhibiittoria tai aprotiniinia lisätään viljelyaluetaan tPA:ta tuottavia soluja varten (japanilainen kuulutusjulkaisu n:o 118717/1984), menetelmä, jossa viljely tai induktio suoritetaan alustassa, jota on täydennetty aprotiniinilla tai bentsamidiinilla (japanilainen kuulutus-25 julkaisu n:o 19486/1986) , ja menetelmä, jossa pelkkää yksiket juista tPA:ta tuotetaan lisäämällä aprotiniinia tai 6-aminokapronihappoa puhdistusvaiheessa (Biochem.Biophys.Acta 719 (2) , 318 328, 1982) .
30 Edelleen etenkin siinä tapauksessa, että käytetään adhesiivi- sia soluja, esiintyy se vaikea ongelma, että solut irtoavat astian seinämästä tai helmien pinnasta viljelyn aikana. Tämän i· mm M I li 3 98123 ongelman ratkaisemiseksi on ehdotettu plasmiinin poistamista seerumista ja aprotiniinin lisäämistä {Kaufman, Molecular and Cellular Biology, 5, s. 1750).
5 Kuitenkin esiintyy useita vaikeuksia suoritettaessa käytännössä näitä menetelmiä teollisuusmittakaavassa. Esimerkiksi käytettävä aprotiniini on melko kallista. Plasmiinin poistaminen seerumista vaatii monimukaisia prosesseja.
ίο Yrittäessään ratkaista yllä mainittujen tunnettujen tPA:n valmistusmenetelmien ongelmia tämän keksinnön keksijät ovat todenneet, että valmistettaessa tPA:ta solujen, etenkin adhesiivisten solujen avulla on tehokasta lisätä p-aminome-tyylibentsoehappojohdannaisia alustaan yksiketjuisen tPA:n is tuottavuuden edistämiseksi ja solujen irtoamisen estämiseksi astian seinämästä tai helmien pinnalta.
Edelleen keksijät havaitsivat, että yksiketjuisen tPA:n tuottavuutta voidaan parantaa huomattavasti lisäämällä p-20 aminometyylibentsoehappojohdannaisilla täydennetyn alustan osmoottista painetta vähintään 350 milliosmooliin/1 käyttämällä bikarbonaatti-ionia, ja saivat näin aikaan tämän keksinnön.
25 Tämän keksinnön mukainen tPA:n valmistus voidaan suorittaa joko rinnakkain solukasvun kanssa tai tPA:n valmistusprosessissa erillisenä solukasvusta.
Tämän keksinnön kohteena on siten menetelmä ihmisen kudos-30 plasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi, mikä menetelmä on tunnettu siitä, että p-aminometyylibentsoehappojohdannaista lisätään soluviljelyalustaan ja että p-aminometyylibent- 4 98123 soehappojohdannaista lisätään tPA:ta tuottavaan alustaan, jota on täydennetty ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin indusointlaineella, solujen viljelyn jälkeen yksiketjuisen tPA:n tuottavuuden lisäämiseksi. Edelleen tämän keksinnön 5 kohteena on menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi, mikä menetelmä on tunnettu siitä, että yllä esitettyjen, p-aminometyylibentsoehappojohdannaisella täydennettyjen soluviljelyalustan tai tPA:ta tuottavan alustan osmoottista painetta lisätään vähintään 350 milliosmooliin/1 ίο käyttämällä bikarbonaatti-ionia yksiketjuisen tPA:n tuottavuuden parantamiseksi huomattavassa määrin.
Tämän keksinnön mukaisesti lisäämällä halpoja p-aminometyyli-bentsoehappojohdannaisia tavanomaisesti käytetyn, kalliina is aprotiniinin sijasta soluviljelyalustaan tai tPA:ta tuottavaan alustaan voidaan parantaa yksiketjuisen tPA:n tuottavuutta ja solujen irtoaminen astian seinämistä tai helmien pinnalta voidaan estää. Edelleen bikarbonaatti-ionin ja alustaan lisätyn p-aminometyylibentsoehappojohdannaisen 20 synergistisen vaikutuksen ansiosta yksiketjuisen tPA:n tuottavuutta voidaan parantaa huomattavassa määrin.
Esimerkkeinä tässä keksinnössä käytettävistä p-aminometyyli-bentsoehappojohdannaisista mainittakoon p-aminometyylibent-25 soehappo, 3-metoksi-4-aminometyylibentsoehappo, 3-etoksi-4-aminometyy1ibent soehappo, 3-hydroks i-4-aminometyylibent soe- happo, 3-fluori-4-aminometyylibentsoehappo, 3-kloori-4-amino-metyylibentsoehappo, 3-metyyli-4-aminometyylibentsoehappo ja 2-amino-4-aminometyyl ibent soehappo. Näitä p-aminometyylibent-30 soehappojohdannaisia voidaan käyttää myös esteriyhdisteiden, metalliyhdisteiden, esim. alkalimetallisuolojen, tai niiden suolojen, esim. kloridien muodossa.
5 98123
Esimerkkinä tässä keksinnössä käytettävästä tPA:ta tuottavasta kannasta mainittakoon hT-382-solulinja (japanilainen kuulutusjulkaisu n:o 126978/1987) , joka saadaan transformoimalla hiiren C-127-solut plasmidilla, joka on muodostettu 5 sovittamalla BPV-johdetun plasmidin osa, joka käsittää DNA-sekvenssin, jossa DNA-sekvenssi, joka koodaa normaaleista ihmisen soluista johdettua ihmisen kudosplasminogeeniakti-vaattoria, sidotaan ihmisestä johdettuun metallotioneiinipro-moottoriin, pBR322-plasmidin osa ja DNA-sekvenssi, joka ίο tarvitaan transkription pysäyttämiseksi.
Eräs toinen tPA:ta tuottavan kannan esimerkki on SV-21-M2.5 K7-solulinja (japanilainen kuulutusjulkaisu n:o 126978/1987), joka saadaan transformoimalla CHO (kiinanhamsterin munasarja) is solut plasmidilla, joka käsittää DNA-sekvenssin, jossa DNA-sekvenssi, joka koodaa normaaleista ihmisen soluista muodostettua ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoria, on sidottu SV-40-varhaispromoottoriin ja DNA-sekvenssi, joka koodaa dihydrofolaattireduktaasia, ja edelleen valitsemalla vahvis-20 tettuja geenejä sisältävät solut metotreksaatilla täydenne tyllä kasvualustalla.
Luonnollisesti voidaan käyttää myös muunlaisia tPA:ta tuottavia soluja, esimerkiksi sellaisia, jotka on valmistettu 2S yhdessä muiden menetelmien, kuten mutaation tai adaptaation avulla, tai sellaiset, jotka on transformoitu viruksilla.
Esimerkkinä soluviljelyalustasta, jota voidaan käyttää tässä keksinnössä, mainittakoon peruskasvualusta, jota on täyden-30 netty vasikkasikiön seerumilla sopivana määränä (0- 10 %) ja edelleen haluttaessa aineilla, joita tarvitaan solukasvua varten, kuten pinta-aktiivisilla aineilla, aminohapoilla, 6 98123 sokereilla ja suoloilla.
Edelleen tämän keksinnön tPA:ta tuottava kasvualusta on esimerkiksi peruskasvualusta, jota on täydennetty vasik-5 kasikiön seerumilla sopivana määränä (0 - 10 %) ja tPA:ta indusoivilla aineilla, kuten sinkillä, kadmiumilla ja niiden suoloilla 1-10 /xM:n konsentraatiossa.
Tämän keksinnön peruskasvualusta on kasvualusta, joka käsit-lo tää esimerkiksi aminohappoja, vitamiineja ja epäorgaanisia suoloja. Esimerkkeinä peruskasvualustasta mainittakoon Dul-becco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 199-kasvualusta (Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd.) ja Eagle's Minimaa Essential Medium.
15 Tämän keksinnön mukaisesti p-aminometyylibentsoehappojoh-dannaisia lisätään 10'4 - 10'1 M:n, etenkin ΙΟ-3 - 102 M kon-sentraatioissa joko tPArta tuottavaan kasvualustaan tai vaihtoehtoisesti soluviljelyalustaan silloin, kun ei käytetä 20 tPA:ta tuottavaa kasvualustaa.
Siten yksinkertaisesti lisäämällä p-aminometyylibentsoehappo-johdannaisia kasvualustaan voidaan estää solujen irtoaminen säiliön seinämästä tai helmien pinnasta viljelyn aikana ja 25 voidaan parantaa yksiketjuisen tPA:n tuottavuutta ilman monimutkaisia toimenpiteitä.
Edelleen tämän keksinnön mukaisesti lisäämällä yllä mainittujen, p-aminometyylibentsoehappojohdannaisilla täydennettyjen 30 soluviljelyalustan tai tPA:ta tuottavan kasvualustan osmoottista painetta vähintään 350 milliosmooliin/1 käyttämällä bikarbonaatti-ionia estetään solujen irtoaminen ja siten 7 98123 voidaan parantaa huomattavasti yksiketjuisen tPA:n tuottavuutta .
Biokarbonaatti-ioni, jota käytetään tässä keksinnössä osmoot-5 tisen paineen lisäämiseksi, voidaan järjestää suoloina, esim. natriumbikarbonaattina (NaHC03) tai hiilidioksidikaasuna.
Tämän keksinnön mukaisesti bikarbonaatti-ionia käytetään tavallisesti sellaisena määränä, että lisätyille epäorgaa-lo nisille suoloille, aminohapoille, vitamiineille ja vastaaville kuuluvan osmoottisen paineen ja bikarbonaatti-ionille kuuluvan osmoottisen paineen summa on vähintään 350 millios-moolia/1.
15 Esimerkiksi kun epäorgaanisille suoloille, aminohapoille tai vitamiineille kuuluva osmoottinen paine on 280 milliosmoo-lia/1, bikarbonaatti-ionia lisätään osmoottisen paineen lisäämiseksi vähintään 70 milliosmoolilla/1, niin että osmoottiseksi paineeksi saadaan kaikkiaan vähintään 350 mil-20 liosmoolia/1.
Yllä esitetyn kasvualustan osmoottisen paineen valvomiseksi kasvualustaan lisätään yleensä esimerkiksi natriumbikarbonaattia (NaHC03) konsentraatiossa, joka on vähintään n. 3 25 g/1, etenkin 3-10 g/1.
Bikarbonaatin lisäystapa ja muodot valitaan käytettyjen viljelymenetelmien mukaisesti. Esimerkiksi käytettäessä T-pulloa, sylinteripulloa (roller bottle) tai vastaavaa, nat-30 riumbikarbonaatti lisätään edullisesti alustaan alustan osmoottisen paineen saattamiseksi arvoon 350 - 500 millios-moolia/1.
8 98123
Solujen viljely ja tPA:n tuottaminen suoritetaan etenkin hiilidioksidikaasuinkubaattorissa joko suljetussa tai avoimessa järjestelmässä. Edelleen alustaan liuenneen hiilidioksidikaasun määrä 5 %:n hiilidioksidikaasuatmosfäärissä on 5 korkeintaan n. 0,001 M, mikä vastaa n. 1 milliosmoolia/1. Siten atmosfäärisen hiilidioksidikaasun koko vaikutus on mitättömän pieni alustassa pH-arvossa 6,5 - 7,5, jota käytännössä käytetään viljelyyn.
ίο Edelleen, kun viljely suoritetaan pyörittäjässä tai tölkissä, bikarbonaatti-ioni järjestetään lisäämällä natriumbikar bonaattia kasvualustaan ennen viljelyä ja samanaikaisesti puhalletaan hiilidioksidikaasua järjestelmään järjestelmän koko osmoottisen paineen pitämiseksi arvossa 350 - 500 15 milliosmoolia/1.
Edelleen p-aminometyylibentsoehappojohdannaiset voidaan lisätä peruskasvualustaan valmistuksen aikana tai sen jälkeen, kun kasvualusta on tehty hypertoniseksi bikarbonaatti-20 ionilla.
Soluviljelyä varten voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua menetelmää. Voidaan käyttää esimerkiksi seuraavaa menetelmää.
25 Sopiva määrä soluja inokuloidaan alustassa, jota on täyden netty tPA:n indusointiaineella, haluttaessa Roux-pullossa ja sitten inkuboidaan sopivassa lämpötilassa sopivan pitkään hiilidioksidikaasuinkubaattorissa tPA:n valmistamiseksi samanaikaisesti solukasvun kanssa.
Vaihtoehtoisesti solut inokuloidaan alustaan Roux-pullossa ja sitten niiden annetaan kasvaa sopivassa lämpötilassa sopivan 30 9 98123 pitkään hiilidioksidikaasuinkubaattorissa. Kun solut ovat kasvaneet yhteen, kasvualusta korvataan tPA:ta tuottavalla kasvualustalla ja sitten inkubointia jatketaan hiilidioksidi-kaasuinkubaattorissa sopivassa lämpötilassa sopivan aikajak-5 son ajan tPA:n tuottamiseksi.
Esimerkiksi kun käytetään 75 cm2:n Roux-pulloa, solut inoku-loidaan 0,5 - 2,0 x 105/ml:n konsentraatiossa ja inkuboidaan 37 °C:ssa 3-4 päivän ajan niiden kasvattamiseksi rinnakkain ίο tPA-tuotannon kanssa.
Vaihtoehtoisesti esimerkiksi käytettäessä 75 cm2:n Roux-pulloa solut inokuloidaan 1 - 2 x 10s/ml:n konsentraatiossa jainkuboidaan 37 °C:ssa 3-4 päivän ajan solujen kasvatta-15 miseksi. Sitten alusta korvataan tPA:ta tuottavalla alus-tallaja inkubointia jatketaan 37 °C:ssa 1-3 päivän ajan tPA:n tuotantoa varten.
Esimerkkejä 20 Tätä keksintöä selitetään yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla.
Esimerkki 1 25 tPA:n tuotantoon käytetyt solut olivat yllä mainitusta hT-382-kannasta. 75 cm2:n Roux-pulloihin lisättiin 20 ml Dulbec-co's Modified Eagle Mediumia (DMEM), jota oli täydennetty 10 %:11a lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia ja 10 μΜ:1^ sinkkikloridia. Jokaiseen kasvualustaan lisättiin aprotinii-30 nia, p-aminometyylibentsoehappoa tai 3-metoksi-4-aminometyy-libentsoehappoa taulukossa 1 esitetty määrä. Näin valmistetut viljelyalustat inokuloitiin yllä mainituilla soluilla kon- 10 98123 sentraation ollessa 1,0 x 10-5 solua/ml.
Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 4 päivän ajan. Kun solut olivat kasvaneet yhteen (n. 10 x I0's solua/ml), yksiketjuisen tPA:n 5 ja kaksiketjuisen tPA:n konsentraatiot viljelyssä määritettiin alla esitetyllä analyysillä. Tulokset on esitetty taulukossa 1.
Viljelyn yksiketjuisen tPA:n ja kaksiketjuisen tPA:n ana-lo lyysimenetelmä on seuraava.
I. ELISA-menetelmä (1) Yksiketjuisen tPA:n monoklonaalisia vasta-aineita(PAMI, American Diagonotica Co.) ja yksiketjuisen tPA:n plus kaksi- 15 ketjuisen tPA:n monoklonaalisia vasta-aineita(PAM-2, American
Diagonotica Co.) laimennetaan päällystysliuoksella 10 mikro-grammaan/ml ja kulloinkin 50 mikrolitraa laimennettua liuosta jaetaan ELISA-levyn syvennyksiin (96 syvennystä, Corning Glass Works). Levyn annetaan seistä 2 tunnin ajan huoneen 20 lämpötilassa ja sitten syvennyksissä oleva neste heitetään pois.
(2) Jokainen syvennys pestään pesuliuoksella ja täytetään sitten inaktivointiliuoksella. Levyn annetaan seistä 30 25 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Kulloinkin 50 mikrolitraa 1000- . . . -2000-kertaisesti laimennettua näyteliuosta ja vakioliuosta (0, 1, 2, 4 ja 8 ng/ml) lisätään jokaiseen syvennykseen ja levyn annetaan seistä 2 tunnin ajan.
30 (3) Jokainen syvennys pestään jälleen pesuliuoksella ja sitten anti-tPA kaniinin vasta-ainetta lisätään jokaiseen syvennykseen.
, tn i ·ι«ϋ i.ua . - 11 98123 (4) Jokainen syvennys pestään jälleen pesuliuoksella ja sitten jokaiseen syvennykseen lisätään 50 mikrolitraa 500- ' kertaisesti laimennettua vuohen anti-kaniini IgG:tä ja alka lista fosfataasikonjugaattia (Sigma). Levyn annetaan seistä 5 tunnin aj an.
(5) Jokainen syvennys pestään jälleen pesuliuoksella ja sitten jokaiseen syvennykseen lisätään 50 mikrolitraa subst-raattiliuosta (p-nitrofenyylifosfaattia, 0,6 mg-ml, Sigma).
ίο Levyn annetaan seistä 30 minuutin ajan.
(6) 50 mikrolitraa 3N NaOH-liuosta lisätään jokaiseen syvennykseen entsymaattisen reaktion pysäyttämiseksi.
is (7) Absorptio 405 nm:ssä luetaan kaupallisesti saatavalla ELISA-lukulaitteella.
(8) Piirretään mittausviiva käyttämällä standardien lukemia ja näytteiden tPA-konsentraatiot määritetään.
20 (9) Laskelmat tehdään seuraavasti:
Yksiketjuisen tPa:n pitoisuus (mg/1) = PAMI:n mittaus Kaksiketjuisen tPA:n pitoisuus (mg/1) = 25 PAM2:n mittaus-PAMI:n mittaus • II. Kvalitatiivinen analyysi "immunoblotting"-menetelmällä 3o (1) Jokainen viljelyliuos käsitellään näyteliuoksessa elektroforeesia varten betamerkaptoetanolilla tai ilman sitä. Se pelkistää näytteen proteiinit. Elektroforeesi suoritetaan 12 98123
Laetnmlin menetelmällä (1970) .
(2) Elektroforeesin jälkeen proteiinit siirretään sähköisesti nitroselluloosasuodattimelle (menetelmä: Towbin et ai, 1979) .
5 (3) Ei-spesifiset proteiinia absorboivat paikat kyllästetään naudan seerumialbumiinilla.
(4) Nitroselluloosasuodatin käsitellään primaarisilla vasta-lo aineilla, s.o. anti-tPA-vasta-aineilla (esimerkiksi vuohesta tai kaniinista muodostetuilla polyklonaalisillä vasta-aineilla tai hiirestä muodostetuilla monoklonaalisillä vastaaineil-la) ja annetaan reagoida tPA:n kanssa nitroselluloosasuodat-timellä.
15 (5) Sekundaaristen vasta-aineiden annetaan reagoida anti-tPA-vasta-aineiden kanssa ja sitten annetaan reagoida alkalifos-fataasisidottujen vasta-aineiden kanssa sekundaarisia vasta-aineita vastaan.
20 (6) Värireaktio suoritetaan käyttämällä bromikloori-indo-lyylifosfaattia alkalisen fosfataasin substraattina ja se liuotetaan liuokseen, joka sisältää nitrosinitetratsoriumia, tPA:n tai sen hajaantuneiden fraktioiden tai aggregaattien 25 havaitsemiseksi nitroselluloosasuodattimella.
Suoritettaessa "blotting" yksiketjuisella tPA:lla saadaan suurin kaista kohdassa n. 70 kd sekä pelkistetyissä että pelkistämättömissä näytteissä. Suoritettaessa "blotting" 30 kaksiketjuisella tPA:lla saadaan suurin kaista kohdassa n.70 kd, joka on samanlainen kuin yksiketjuisella tPA:lla saatu pelkistämättömässä näytteessä, kun taas pelkistetyissä näyt- 13 98123 teissä saadaan kaistat kohdissa n. 30 kd ja n. 40 kd eikä kaistaa ole kohdassa n. 70 kd. Kaistoja, jotka havaittiin • kohdissa n. 70 kd, n. 30 kd ja n. 40 kd näiden pelkistettyjen ja pelkistämättornien näytteiden "immunoblotting" -menetelmäs-5 sä, verrataan, niin että voidaan kvalitatiivisesti arvioida yksiketjuisen tPA:n määrä kaksiketjuisen tPA:n suhteen näytteissä.
Vaikkakin "immunoblotting"-analyysi on kvalitatiivinen mit-lo taus, sitä käytettiin kvantitatiivisten arvojen vahvista miseksi, jotka tavanomaisesti saadaan ELISA:11a.
Kuten taulukosta 1 nähdään, p-aminometyylibentsoehapolla tai sen johdannaisella täydennetyssä viljelyssä solujen irto-15 aminen oli suhteellisen merkityksetöntä ja yksiketjuisen tPA:n tuotanto parani.
Etenkin käytettäessä p-aminometyylibentsoehappoa tai sen johdannaista vähintään 10'4 M:n konsentraatiossa, vaikutusta 20 voitiin verrata aprotiniinin vaikutukseen tai se oli parempi kuin tämä.
Taulukko 1 14 98123
Rons. yk-tPA:n* kk-tPA:n** yk-tPA:n Irtoam.
määrä(mg/l) määrä(%) *** 5 ----------------------------------------------------- kontrolli - 1,8 - 52 +++ aprotiniini 80 6,2 0,5 92 + (KIU/ml) 40 6,4 0,4 94 + 20 5,3 0,6 90 + io ----------------------------------------------------- p-aminome tyyli- 10'2 7,2 0,3 96 bentsoehappo 10'4 6,8 0,6 92 (M) IO’6 4,9 1,1 82 + 15 3-metoksi-4 IO'2 6,8 0,5 93 aminometyyli- 10’4 6,4 0,6 92 bentsoehappo IO*6 4,7 1,0 83 + (M)
* = yksiketjuinen tPA ** = kaksiketjuinen tPA
20 *** = havaittu paljain silmin <+<++< +++ = irtoamisen kasvavan asteen mukaisesti
Esimerkki 2 Tässä käytettiin samaa solulinjaa kuin esimerkissä 1. Solut 25 inokuloitiin (konsentraatio 1,0 x 10s solua/ml) 75 cm2:n Roux-pulloissa 20 ml:aan Dulbecco's Modified Eagle Mediumia (DMEM), jota oli täydennetty 10 %:lla lämpöinaktivoitua vasikkasikiön seerumia.
30 Soluja inkuboitiin 37 °C-.ssa 4 päivän ajan. Kun solut olivat kasvaneet yhteen (n. 10 x 10s solua/ml), kasvualusta hylättiin ja korvattiin 20 ml :11a tPA:ta tuottavaa alustaa, jolla oli esitetty koostumus sillä erotuksella, että siihen oli 15 98123 lisätty 10 M sinkkikloridia ja vastaavia taulukossa 2 esitettyjä lisäaineita. Inkubaatiota jatkettiin hiilidioksi-* dikaasuinkubaattorissa 37 °C:Ssa 2 päivän ajan. Viljely yk- siketjuisen tPA:n ja kaksiketjuisen tPA:n konsentraatiot s määritettiin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Tulokset on esitetty taulukossa 2.
Kuten taulukosta 2 nähdään, p-aminometyylibentsoehapolla tai sen johdannaisella täydennetyssä viljelyssä solujen irto-lo aminen oli suhteellisen merkityksetöntä ja yksiketjuisen tPA: n tuotanto parani. Etenkin käytettäessä p- aminometyylibentsoehappoa tai sen johdannaista vähintään 10 4 M:n konsentraatiossa, vaikutus oli parempi kuin aprotiniinin.
is Taulukko 2
Kons. yk-tPA:n* kk-tPA:n** yk-tPA:n Irtoara.
määrä(mg/1) määrä(%) *** 20 kontrolli - 3,0 4,2 42 +++ aprotiniini 80 8,8 1,0 90 + (KIU/ml) 40 8,6 0,5 94 + 20 7,8 1,4 85 ++ 25 p-aminometyyli- 10'2 9,8 0 100 bentsoehappo 10"* 9,4 0,4 96 (M) 10'e 7,8 1,2 86 + 3-metoksi-4-10"2 9,2 0,4 96 30 aminometyyli- 10'* 8,7 1,0 90 + bentsoehappo 10'e 6,8 2,0 77 + + (M)
* = yksiketjuinen tPA ** = kaksiketjuinen tPA
16 98123 *** = havaittu paljain silmin <+<++< +++ = irtoamisen kasvavan asteen mukaisesti 5
Esimerkki 3 tPA-tuotantoon käytetyt solut olivat SV-21-M2.5 K7 solulinjan soluja, jotka saatiin transformoimalla CHO (kiinanhamsterin munasarja)-solut plasmidilla, joka käsittää DNA-sekvenssin, ίο jossa tPA:ta koodaava DNA-sekvenssi oli sidottu SV40-varhais-promoottoriin ja dihydrofolaattireduktaasia koodaavan DNA-sekvenssin, ja edelleen valitsemalla transformoidut solut, joissa oli vahvistetut geenit, metotreksaatilla täydennetyllä alustalla. tPA:n tuotanto suoritettiin esimerkissä 1 esite-15 tyllä tavalla sillä erotuksella, että alustaan ei lisätty sinkkikloridia. Tulokset on esitetty taulukossa 3. Kuten taulukosta 3 nähdään, solujen irtoaminen oli suhteellisen merkityksetöntä ja yksiketjuisen tPA:n tuotanto parani kaikissa tapauksissa. Etenkin käytettäessä p-aminometyylibent-2o soehappoa vaikutus oli huomattava.
Taulukko 3 17 98123
Kons. yk-tPA:n* kktPAin** yk-tPA:n Irtoam.
määrä(mg/1) määrä{%) *** 5 ------------------------------------------------------ kontrolli - 1,2 1,3 49 +++ aprotiniini 80 3,2 0,4 90 + (KIU/ml) 40 3,4 0,3 93 + 20 2,7 0,4 86 ++ io ------------------------------------------------------ p-aminome tyyli 10'2 3,8 0,2 94 bentsoehappo 10'4 3,8 0,3 92 (M) 10'6 3,6 0,7 83 + 15 3-metoksi-4- 10'2 3,5 0,4 90 aminome tyyli- 10'4 3,2 0,5 87 + bentsoehappo I0’e 2,5 0,8 76 ++ (M) 20
* = yksiketjuinen tPA ** = kaksiketjuinen tPA
*** = havaittu paljain silmin <+<++< +++ = irtoamisen kasvavan asteen mukaisesti 25 Esimerkki 4 tPA: n tuotantoon käytetyt solut olivat hT-382-solulinjan soluja, jotka saatiin transformoimalla hiiren C-127-solut plasmidilla, joka oli muodostettu sovittamalla osa BPVjohde-tusta plasmidista, joka käsitti DNA-sekvenssin, jossa tPA:ta 30 koodaava DNA-sekvenssi oli sidottu ihmisestä johdettuun metallotioneiinipromoottoriin, osa pBR322-plasmidista ja DNA- 1 sekvenssi, joka tarvittiin transkription päättämiseksi.
18 98123 75 cm2:n Roux-pulloihin lisättiin 20 ml DMEM-alustaa, jota oli täydennetty 10 %:lla lämpöinaktivoitua vasikkasikiön seerumia ja 10 μΜ:1ΐ3 sinkkikloridia. Jokaiseen kasvualustaan lisättiin aprotiniinia (40 KIU/ml) tai p-aminometyylibent- 5 soehappoa 10'2 M:n konsentraatiossa ja edelleen natriumbikarbonaattia taulukossa 4 esitettyinä määrinä. Näin valmistetut alustat inokuloitiin yllä mainituilla soluilla konsent-raation ollessa 1,0 x 105 solua/ml.
ίο Soluja inkuboitiin 5 % hiilidioksidikaasua sisältävässä inkubaattorissa 37 °C:ssa 4 päivän ajan. Kun solut olivat kasvaneet yhteen (n. 10 x 105 solua/ml), yksittäisten viljelyjen yksiketjuisen tPA:n konsentraatiot määritettiin yllä esitetyllä analyysillä. Tulokset on esitetty taulukossa 4.
15
Osmoottinen paine mitattiin käyttämällä Simazu Osmometer-laitetta sen jälkeen, kun näytteet oli otettu tPA:n määritystä varten.
Kuten taulukosta 4 nähdään, kun alustan osmoottinen paineoli 20 yli 300 milliosmoolia/1, ei ainoastaan yksiketjuisen tPA:n tuotantomäärä, vaan myös koko tPA:n tuotanto parani.Edelleen yksiketjuisen tPA:n tuotanto parani enemmän p-aminometyyli-bentsoehapolla täydennetyssä alustassa kuin aprotiniinilla täydennetyssä alustassa.
25
Taulukko 4 19 98123
NaHC03 Osm. paine Lisäaine yk-tPA* yk-tPA:n määrä 5 (g/1) (milliosm.) (mg/1) (%) 1.0 300 AP** 6,4 90 PAMBA*** 7,2 96 10 5,0 380 AP 10,2 92 PAMBA 26,3 98 7,5 450 AP 14,3 92 PAMBA 28,2 97 15 --------------------------------------------------------- 10.0 520 AP 7,4 90 PAMBA 14,3 98 * yksiketjuinen tPA 20 ** aprotiniini *** p-aminometyylibentsoehappo
Esimerkki 5 25 tPA:n tuotantoon käytetyt solut olivat samaa kantaa kuin esimerkissä 4. Solut inokuloitiin (konsentraatio 1,0 x 105 solua/ml) 75 cm2:n Roux-pulloissa 20 ml:aan DMEM-alustaa, jota oli täydennetty 10 %:lla lämpöinaktivoitua vasikkasikiön seerumia.
30
Soluja inkuboitiin 5 % hiilidioksidikaasua sisältävässä inkubaattorissa 37 °C:ssa 4 päivän ajan. Kun solut olivat 20 98123 kasvaneet yhteen (n. 10 x 10s solua/ml), alusta heitettiin pois ja korvattiin 20 ml:11a alustaa, jolla oli sama koostumus kuin yllä sillä erotuksella, että sitä oli täydennetty sinkkikloridilla (10 μΜ) ja edelleen aprotiniinilla 5 (4 OKIU/ml) ja p-aminometyylibentsoehapolla (10‘2 M) samoin kuin natriumbikarbonaatilla taulukossa 4 esitetyissä konsent-raatioissa. Soluja inkuboitiin jälleen hiilidioksidikaasuin-kubaattorissa 37 °C:ssa 2 päivän ajan tPA:n tuotantoa varten. Yksittäisten viljelyjen tPA:n konsentraatiot määritettiin ίο esimerkissä l esitetyllä tavalla. Tulokset on esitetty taulukossa 5.
Esimerkin 4 mukaisesti yksiketjuisen tPA:n tuottavuuden huomattava parannus havaittiin viljelyssä, johon oli lisätty is p-aminometyylibentsoehappoa, ja osmoottinen paine kasvoi.
Taulukko 5
NaHC03 Osm. paine Lisäaine yk-tPA* yk-tPA:n määrä (g/1) (milliosm.) (mg/1) (%) 20 ---------------------------------------------------------- 1.0 300 AP** 8,6 90 PAMBA*** 9,8 100 5.0 380 AP 24,3 88 25 PAMBA 38,2 95 7,5 450 AP 32,0 92 PAMBA 45,0 96 30 10,0 520 AP 21,0 94 PAMBA 32,0 95
* yksiketjuinen tPA
21 98123 ** aprotiniini > *** p-aminometyylibentsoehappo 5 Esimerkki 6 tPA:n tuotantoon käytetyt solut olivat SV21-M2.5 K7-solulin-jan soluja, jotka saatiin transformoimalla CHO (kiinanhamsterin munasarja) solut plasmidilla, joka käsittää DNA-sekvens-sin, jossa tPA:ta koodaava DNA-sekvenssi oli sidottu SV40 ίο varhaispromoottoriin, ja dihydrofolaattireduktaasia koodaavan DNA-sekvenssin, ja sitten valitsemalla transformoidut solut, joissa oli vahvistetut geenit, metotreksaatilla täydennetyllä alustalla.
is tPA:n tuotanto suoritettiin esimerkissä 4 esitetyllä tavalla sillä erotuksella, että alusta ei sisältänyt sinkkiklori-dia.Tulokset on esitetty taulukossa 6.
Huomattavia vaikutuksia ei havaittu ainoastaan yksiketjuisen 20 tPA:n tuottavuudessa, vaan myös yksiket juisen tPA-.n määrässä.
Taulukko 6
NaHC03 Osm. paine Lisäaine yk-tPA* yk-tPA:n määrä (g/1) (milliosm.) (mg/1) (%) 25 1,0 300 AP** 3,4 93 PAMBA*** 3,8 94 5.0 380 AP 8,2 88 PAMBA 20,3 96 7,5 450 AP 10,4 92 30 PAMBA 26,5 100 10.0 520 AP 7,5 90 PAMBA 22,3 92 22 98123
* yksiketjuinen tPA
** aprotiniini *** p-aminometyylibentsoehappo 5 Esimerkki 7 tPA:n tuotantoon käytetyt solut olivat samaa kantaa kuin esimerkissä 4. Solut (10® solua) inokuloitiin (konsentraatio 1,0 x 10s solua/ml) 1 l:aan DMEM-alustaa, jota oli täydennetty 10 %:11a lämpöinaktivoitua vasikkasikiön seerumia, l l:n ίο pyörityspulloissa (spinner flasks; kokonaiskapasiteetti n.
1,5 1), jotka oli varustettu sekoitussiivillä, pH-elektro-deilla, DO-elektrodeilla ja putkella kaasun puhaltamiseksi. Käytettyjä siemensoluja oli viljelty etukäteen yllä mainitussa kasvualustassa sylinteripullossa (roller bottle). Inkubaa-15 tio suoritettiin 37 °C:ssa 4 päivän kuluessa. Kun solukon-sentraatio oli saavuttanut arvon 10* solua/ml, yllä mainittu alusta heitettiin pois ja korvattiin tPA:n tuotantoa varten 1 1:11a DMEM alustaa, jota oli täydennetty 5 %:lla lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia, aprotiniinilla (40KIU/ml) 20 tai p-aminometyylibentsoehapolla (10'2 M) ja sinkkikloridilla (10 μΜ).
Alustan osmoottisen paineen säilyttämiseksi, kuten taulukossa 7 on esitetty, pulloon puhallettiin satunnaisesti 5%:ista 25 hiilidioksidikaasua. pH-arvo säädettiin NaOH:lla. Edelleen DO säilytettiin 1 ppm:ssä ja lämpötila pidettiin 37 °C:ssa. Alustan vaihdokset suoritettiin kerran päivässä 5 päivän ajan ja siten tPA-fraktiot otettiin talteen kaikkiaan viisi kertaa .
30
Kuten taulukosta 7 nähdään, havaittiin samanlaisia vaikutuksia kuin esimerkissä 4, kun osmoottista painetta valvot- •K kU ! Kill; I I i ill
Claims (5)
- 98123 tiin puhaltamalla alustaan hiilidioksidikaasua. Taulukko 7
- 5 Osmoott. paine Lisäaine Yksiketjuinen tPA (mg/ml) (milliosmoolia) 1 2 3 4 5 yht.
- 300 AP* 4,3 6,2 7,7 4,8 4,0 27,0 (87) (88) (91) (90) (88) ίο PAMBA** 5,2 7,4 10,0 6,2 4,6 33,4 (93) (96) (97) (95) (96)
- 450 AP 10,1 13,4 17,2 16,8 12,2 69,7 (90) (89) (93) (92) (91)
- 15 PAMBA 12,4 28,0 36,2 36,4 38,2 151,2 (96) (98) (98) (97) (98) Yksiketjuisen tPA:n määrät (%) on esitetty suluissa. * aprotiniini 20 ** p-aminometyylibentsoehappo 25
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12264488A JP2648611B2 (ja) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
| JP12264488 | 1988-05-19 | ||
| JP31611888 | 1988-12-16 | ||
| JP63316118A JP2718726B2 (ja) | 1988-12-16 | 1988-12-16 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI892358A0 FI892358A0 (fi) | 1989-05-17 |
| FI892358A FI892358A (fi) | 1989-11-20 |
| FI98123B FI98123B (fi) | 1997-01-15 |
| FI98123C true FI98123C (fi) | 1997-04-25 |
Family
ID=26459739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI892358A FI98123C (fi) | 1988-05-19 | 1989-05-17 | Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5151359A (fi) |
| EP (1) | EP0342931B1 (fi) |
| AT (1) | ATE108825T1 (fi) |
| AU (1) | AU612837B2 (fi) |
| CA (1) | CA1334288C (fi) |
| DE (1) | DE68916857T2 (fi) |
| DK (1) | DK243589A (fi) |
| FI (1) | FI98123C (fi) |
| NO (1) | NO175541C (fi) |
| NZ (1) | NZ229187A (fi) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5183754A (en) * | 1988-10-04 | 1993-02-02 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| WO1995022599A1 (fr) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Teijin Limited | Procede de mise en culture de cellules animales |
| US5856179A (en) | 1994-03-10 | 1999-01-05 | Genentech, Inc. | Polypeptide production in animal cell culture |
| US6656466B1 (en) * | 1995-06-06 | 2003-12-02 | Genetech, Inc. | Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition |
| US5721121A (en) * | 1995-06-06 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein |
| US5705364A (en) | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
| US20030087372A1 (en) * | 2001-06-13 | 2003-05-08 | Genentech, Inc. | Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells |
| EP2686423A4 (en) | 2011-03-14 | 2015-01-28 | Nat Res Council Canada | METHOD FOR PRODUCING VIRUSES IN CELLS |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3732146A (en) * | 1970-12-22 | 1973-05-08 | Behringwerke Ag | Process for the isolation of native, highly purified plasminogen |
| JPS59196824A (ja) * | 1983-04-21 | 1984-11-08 | Kowa Co | 吸着防止剤 |
| FR2548211B1 (fr) * | 1983-06-29 | 1985-10-18 | Choay Sa | Procede de production d'un activateur tissulaire du plasminogene et activateur obtenu par ce procede |
| US4554251A (en) * | 1983-11-07 | 1985-11-19 | The Ohio State University Research Foundation | Process and medium for culturing ant venom gland cells |
| GB8334499D0 (en) * | 1983-12-24 | 1984-02-01 | Beecham Group Plc | Derivatives |
| US4724206A (en) * | 1984-02-13 | 1988-02-09 | Damon Biotech, Inc. | Protein production using hypertonic media |
| EP0163751B1 (en) * | 1984-06-05 | 1989-09-20 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for the preparation of a plasminogen activator |
| US4661453A (en) * | 1984-06-19 | 1987-04-28 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Production of tissue plasminogen activator factor |
| US4661469A (en) * | 1984-08-08 | 1987-04-28 | Survival Technology, Inc. | t-PA composition capable of being absorbed into the blood stream and method of administration |
| JPS624233A (ja) * | 1985-07-01 | 1987-01-10 | Toyobo Co Ltd | 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法 |
| US4960702A (en) * | 1985-09-06 | 1990-10-02 | Codon | Methods for recovery of tissue plasminogen activator |
| US5183754A (en) * | 1988-10-04 | 1993-02-02 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
-
1989
- 1989-05-05 US US07/347,649 patent/US5151359A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-09 CA CA000599119A patent/CA1334288C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-16 DE DE68916857T patent/DE68916857T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-16 EP EP89304944A patent/EP0342931B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-16 AT AT89304944T patent/ATE108825T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-17 FI FI892358A patent/FI98123C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-05-17 AU AU34892/89A patent/AU612837B2/en not_active Ceased
- 1989-05-18 NO NO891995A patent/NO175541C/no unknown
- 1989-05-18 NZ NZ229187A patent/NZ229187A/en unknown
- 1989-05-19 DK DK243589A patent/DK243589A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO891995D0 (no) | 1989-05-18 |
| AU3489289A (en) | 1989-11-23 |
| CA1334288C (en) | 1995-02-07 |
| DK243589D0 (da) | 1989-05-19 |
| FI892358A (fi) | 1989-11-20 |
| EP0342931B1 (en) | 1994-07-20 |
| NO891995L (no) | 1989-11-20 |
| NO175541B (no) | 1994-07-18 |
| EP0342931A1 (en) | 1989-11-23 |
| ATE108825T1 (de) | 1994-08-15 |
| DE68916857T2 (de) | 1994-11-10 |
| US5151359A (en) | 1992-09-29 |
| AU612837B2 (en) | 1991-07-18 |
| FI892358A0 (fi) | 1989-05-17 |
| NO175541C (no) | 1994-10-26 |
| NZ229187A (en) | 1991-12-23 |
| FI98123B (fi) | 1997-01-15 |
| DE68916857D1 (de) | 1994-08-25 |
| DK243589A (da) | 1989-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stern et al. | Interaction of antithrombin III with bovine aortic segments. Role of heparin in binding and enhanced anticoagulant activity. | |
| Suttie et al. | Mechanism of action of vitamin K: Synthesis of y-carboxyglutamic aci | |
| Molla et al. | Degradation of protease inhibitors, immunoglobulins, and other serum proteins by Serratia protease and its toxicity to fibroblast in culture | |
| Esmon et al. | Protein C activation | |
| Wilson et al. | Biosynthesis of coagulation Factor V by a human hepatocellular carcinoma cell line. | |
| De Munk et al. | Acceleration of the thrombin inactivation of single chain urokinase-type plasminogen activator (pro-urokinase) by thrombomodulin. | |
| FI98123C (fi) | Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi | |
| Reinartz et al. | Binding and activation of plasminogen at the surface of human keratinocytes | |
| Morita et al. | Calcium binding to a human factor IXa derivative lacking γ-carboxyglutamic acid: evidence for two high-affinity sites that do not involve β-hydroxyaspartic acid | |
| EP0104194B1 (en) | New fibrinolytic enzymes, methods for their production and pharmaceutical compositions containing them | |
| Weinstein et al. | Species specificity of the fibrinolytic effects of activated protein C | |
| NO173901B (no) | Fremgangsmaate, monoklonalt antistoff og sett for maaling av vevplasminogenaktivator-aktivitet | |
| Chakrabarty | Fibrin solubilizing properties of certain anionic and cationic detergents | |
| Kazama et al. | Modulation of protein C inhibitor activity by histidine-rich glycoprotein and platelet factor 4: role of zinc and calcium ions in the heparin-neutralizing ability of histidine-rich glycoprotein | |
| AU614999B2 (en) | Method for preparing proteins | |
| CA1335188C (en) | Method for production of human tissue type plasminogen activator | |
| EP0247674A1 (en) | Plasminogen activator and thrombolytic composition | |
| JP2718726B2 (ja) | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 | |
| Tözsér et al. | Urokinase-type plasminogen activator in rabbit tears. Comparison with human tears | |
| Hall et al. | Expression of plasminogen receptors on C6 glioma cells | |
| JP2846463B2 (ja) | 抗ストレプトキナーゼ抗体の検出方法 | |
| Thorsen et al. | Differences in the reactivities of human urokinase and the porcine tissue plasminogen activator | |
| ZA200602716B (en) | Plasminogen activators having reduced lysine binding company | |
| JP2825541B2 (ja) | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 | |
| JP2648624B2 (ja) | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: MITSUI CHEMICALS, INC. |
|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT |