JP2648624B2 - ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法 - Google Patents
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法Info
- Publication number
- JP2648624B2 JP2648624B2 JP63249081A JP24908188A JP2648624B2 JP 2648624 B2 JP2648624 B2 JP 2648624B2 JP 63249081 A JP63249081 A JP 63249081A JP 24908188 A JP24908188 A JP 24908188A JP 2648624 B2 JP2648624 B2 JP 2648624B2
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- Japan
- Prior art keywords
- medium
- cells
- tpa
- plasminogen activator
- producing
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト正常細胞の産する組織型プラスミノー
ゲン活性化因子（以後tPAと略す）の製法に関する。
ゲン活性化因子（以後tPAと略す）の製法に関する。
tPAは、血管内皮細胞および種々の組織細胞から生
産、分泌され、血栓の本体であるフィブリンを溶解し、
血栓症の治療薬として有効である。
産、分泌され、血栓の本体であるフィブリンを溶解し、
血栓症の治療薬として有効である。
tPAを製造する方法は、既に、種々の方法が提案され
ている。その代表的方法としては、例えば、tPAのDNA配
列を適当なプロモーターに接続し、この配列を発現ベク
ターに組み込んで宿主細胞を形質転換した組み換え産生
細胞を適切な培地で培養しtPA生産を行い培地中に蓄積
されたtPAをアフィニテイカラムおよびゲル濾過カラム
等で精製してtPAを得ている。
ている。その代表的方法としては、例えば、tPAのDNA配
列を適当なプロモーターに接続し、この配列を発現ベク
ターに組み込んで宿主細胞を形質転換した組み換え産生
細胞を適切な培地で培養しtPA生産を行い培地中に蓄積
されたtPAをアフィニテイカラムおよびゲル濾過カラム
等で精製してtPAを得ている。
このような方法において、tPAを産生させる培地は、
通常、無機塩、アミノ酸、ビタミンなどを添加した例え
ばイーグルの基本培地（EBM）、イーグルの最小必須培
地（EMEM）、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、RP
MI 1640培地を基本として、Ｌ−グルタミンサン及び牛
胎児血清（FCS）を10％、ならびに重炭酸ソーダを１〜2
g/を加えてpHを6.5〜7.5に調整したものが用いられ
る。
通常、無機塩、アミノ酸、ビタミンなどを添加した例え
ばイーグルの基本培地（EBM）、イーグルの最小必須培
地（EMEM）、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、RP
MI 1640培地を基本として、Ｌ−グルタミンサン及び牛
胎児血清（FCS）を10％、ならびに重炭酸ソーダを１〜2
g/を加えてpHを6.5〜7.5に調整したものが用いられ
る。
例えば、変法イーグル培地を用いて牛胎児血清を10
％、重炭酸ソーダを1.2g/及びＬ−グルタミンを適量
添加して培養せしめる方法（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカルケミストリー25巻、p.7035）や、DMEM、EMEMま
たはPRMI1640などの基本培地を用いて、これらを重炭酸
ソーダ2.0g/以下でpHを6.5〜7.5に調整して培養せし
める方法（特開昭62−4233）等が知られている。
％、重炭酸ソーダを1.2g/及びＬ−グルタミンを適量
添加して培養せしめる方法（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカルケミストリー25巻、p.7035）や、DMEM、EMEMま
たはPRMI1640などの基本培地を用いて、これらを重炭酸
ソーダ2.0g/以下でpHを6.5〜7.5に調整して培養せし
める方法（特開昭62−4233）等が知られている。
上記のような従来技術によれば、単位細胞あたりのtP
A生産量はいずれにおいても極めて少なく、生産生が劣
り、市場に安定に供給する方法としては製造コストの高
いものとなっていた。
A生産量はいずれにおいても極めて少なく、生産生が劣
り、市場に安定に供給する方法としては製造コストの高
いものとなっていた。
通常、動物細胞培養を利用しての有用物質生産過程に
おいては、浸透圧、pH、温度など極めて精密な範囲で調
節される。特に浸透圧については、通常、培地組成の工
夫により人の血液・体液と同等のほぼ280〜300ミリオス
モルとなる様に工夫されている。
おいては、浸透圧、pH、温度など極めて精密な範囲で調
節される。特に浸透圧については、通常、培地組成の工
夫により人の血液・体液と同等のほぼ280〜300ミリオス
モルとなる様に工夫されている。
しかしながら、最近、培地中の浸透圧が通常よりも高
いと、細胞の生育は若干阻害されるが、蛋白質合成は促
進される可能性が見出されている。
いと、細胞の生育は若干阻害されるが、蛋白質合成は促
進される可能性が見出されている。
例えば、抗体生産において、培地中のアミノ酸組成を
増加させて実質的に340ミリオスモル以上の高張液とす
る数倍の生産能力増加を示すことが報告されている（特
開昭60−188062）。
増加させて実質的に340ミリオスモル以上の高張液とす
る数倍の生産能力増加を示すことが報告されている（特
開昭60−188062）。
しかしながら、アミノ酸を用いて高張化を行うことは
細胞の代謝系に大きな影響を与える可能性があり、目的
タンパクによってはその生産性が逆に減少することが懸
念される。
細胞の代謝系に大きな影響を与える可能性があり、目的
タンパクによってはその生産性が逆に減少することが懸
念される。
本発明の課題は、単位細胞当たりの生産能力が高める
tPAの生産方法を提供することである。
tPAの生産方法を提供することである。
このような発明の課題を解決するために、本発明者等
は鋭意検討した結果、tPA生産においてその培地の浸透
圧を重炭酸イオンを用いて350ミリオスモル／以上と
することにより、その生産性が大きく向上させることが
できるのを見出し、本発明を完成するに到った。
は鋭意検討した結果、tPA生産においてその培地の浸透
圧を重炭酸イオンを用いて350ミリオスモル／以上と
することにより、その生産性が大きく向上させることが
できるのを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、細胞を使ってヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子を製造する方法において、重炭酸
イオンを用いて培地中の浸透圧を、350ミリオスモル／
以上とすることを特徴とするヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子の製造方法である。
ミノーゲン活性化因子を製造する方法において、重炭酸
イオンを用いて培地中の浸透圧を、350ミリオスモル／
以上とすることを特徴とするヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子の製造方法である。
本発明の方法において、tPAを生産させる培地は、重
炭酸イオンを用いて浸透圧を350ミリオスモル／以
上、好ましくは、350〜1000ミリオスモル／、より好
ましくは、350〜500ミリオスモル／に調整する。
炭酸イオンを用いて浸透圧を350ミリオスモル／以
上、好ましくは、350〜1000ミリオスモル／、より好
ましくは、350〜500ミリオスモル／に調整する。
本発明の方法において使用される重炭酸イオンは、重
炭酸ナトリウム（NaHCO3）などの塩類として、または炭
酸ガスの形態で使用される。
炭酸ナトリウム（NaHCO3）などの塩類として、または炭
酸ガスの形態で使用される。
本発明の方法において、重炭酸イオンの使用量は、通
常、基本培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタミン
などに基因する浸透圧と重炭酸イオンに基因する浸透圧
の合計が350ミリオスモル／以上となるような量であ
る。例えば、培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタ
ミンなどに基因する浸透圧が280ミリオスモル／であ
るときは、さらに70ミリオスモル／の浸透圧分を加え
合計350ミリオスモル／以上となるように加える必要
がある。
常、基本培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタミン
などに基因する浸透圧と重炭酸イオンに基因する浸透圧
の合計が350ミリオスモル／以上となるような量であ
る。例えば、培地に添加される無機塩、アミノ酸、ビタ
ミンなどに基因する浸透圧が280ミリオスモル／であ
るときは、さらに70ミリオスモル／の浸透圧分を加え
合計350ミリオスモル／以上となるように加える必要
がある。
培地の浸透圧を上記のように調整するには、通常、例
えば、基本培地に重炭酸ナトリウム（NaHCO3）を約3g/
以上、好ましくは３〜12g/を培地中に供給する。
えば、基本培地に重炭酸ナトリウム（NaHCO3）を約3g/
以上、好ましくは３〜12g/を培地中に供給する。
重炭酸イオンの供給方法、供給形態については培養方
法により選択されるが、例えば、Ｔ−フラスコ、ローラ
ーボトルなどを使用する場合には、予め培地中に重炭酸
ナトリウムを培地浸透圧が350〜500ミリオスモル／
（重炭酸ナトリウムとして約３〜12g/）となるように
加えるのが好ましい。また培養、生産は密閉系もしくは
開放系の場合には、炭酸ガスインキュベーター中で行う
のがよい。なお、５％炭酸ガス雰囲気中で培地中に溶解
する炭酸ガスの量は、最大でも0.001M程度で、浸透圧換
算約１ミリオスモル／であり、実際の培養pH6.5〜7.5
の範囲では全体に対する影響は無視できる。また、細胞
が発生する炭酸ガス量は微量であり無視できる。さら
に、培養方法をスピンナーもしくはジャー形式を使用す
る方法の場合では、予め培地中に重炭酸ナトリウムの形
で重炭酸イオンを供給するとともに炭酸ガスを系内に吹
き込むことにより、その重炭酸イオンの和によって系内
の浸透圧を350〜500ミリオスモル／の間で一定にする
ことができる。
法により選択されるが、例えば、Ｔ−フラスコ、ローラ
ーボトルなどを使用する場合には、予め培地中に重炭酸
ナトリウムを培地浸透圧が350〜500ミリオスモル／
（重炭酸ナトリウムとして約３〜12g/）となるように
加えるのが好ましい。また培養、生産は密閉系もしくは
開放系の場合には、炭酸ガスインキュベーター中で行う
のがよい。なお、５％炭酸ガス雰囲気中で培地中に溶解
する炭酸ガスの量は、最大でも0.001M程度で、浸透圧換
算約１ミリオスモル／であり、実際の培養pH6.5〜7.5
の範囲では全体に対する影響は無視できる。また、細胞
が発生する炭酸ガス量は微量であり無視できる。さら
に、培養方法をスピンナーもしくはジャー形式を使用す
る方法の場合では、予め培地中に重炭酸ナトリウムの形
で重炭酸イオンを供給するとともに炭酸ガスを系内に吹
き込むことにより、その重炭酸イオンの和によって系内
の浸透圧を350〜500ミリオスモル／の間で一定にする
ことができる。
本発明において使用されるtPA生産細胞としては、例
えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子をコードするDNA配列をヒト由来メタロチオネ
インのプロモーターに接続し、BPA由来プラスミドの一
部及びpBR322プラスミドの一部及び転写停止に必要なDN
A配列などを組み込んで構築したプラスミドをマウスＣ
−127細胞に形質転換して得られたtPA生産株、hT−382
株などが使用できる（特開昭62−126978）。
えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子をコードするDNA配列をヒト由来メタロチオネ
インのプロモーターに接続し、BPA由来プラスミドの一
部及びpBR322プラスミドの一部及び転写停止に必要なDN
A配列などを組み込んで構築したプラスミドをマウスＣ
−127細胞に形質転換して得られたtPA生産株、hT−382
株などが使用できる（特開昭62−126978）。
また、例えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子をコードするDNA配列をSV−40の初
期プロモーターを接続したDNA配列とジヒドロ葉酸還元
酵素をコードするDNA配列から成るプラスミドで、CHO
（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形質転換し、更
にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の増幅した細胞
を選択して得られたtPA生産株、SV−21−M2.5K7株など
が使用できる（特開昭62−126978）。もちろん、突然変
異、馴化など手段を併用したもの、またはウイルス等に
より形質転換された細胞などいずれもtPA生産株であれ
ば使用できる。
ノーゲン活性化因子をコードするDNA配列をSV−40の初
期プロモーターを接続したDNA配列とジヒドロ葉酸還元
酵素をコードするDNA配列から成るプラスミドで、CHO
（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形質転換し、更
にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の増幅した細胞
を選択して得られたtPA生産株、SV−21−M2.5K7株など
が使用できる（特開昭62−126978）。もちろん、突然変
異、馴化など手段を併用したもの、またはウイルス等に
より形質転換された細胞などいずれもtPA生産株であれ
ば使用できる。
使用する培地は、DMEM、EMEM、199培地などに、予め
不活性化させた牛胎児血清（FCSギブコ社製）を10％程
度添加した物が使用されるが、成分濃度などは必要に応
じて変更できる。
不活性化させた牛胎児血清（FCSギブコ社製）を10％程
度添加した物が使用されるが、成分濃度などは必要に応
じて変更できる。
また、必要に応じて界面活性剤など第３成分を添加し
てもよい。
てもよい。
生産培地を使用する場合、tPAの生産を誘導する物質
として亜鉛、アドミウム、もしくはその塩を添加する。
添加量は１〜100μg/である。
として亜鉛、アドミウム、もしくはその塩を添加する。
添加量は１〜100μg/である。
培養方法は、特に限定されるものではなく、例えば、
次のような方法で行われる。
次のような方法で行われる。
すなわち、ルーフラスコに培地及び必要ならばtPA誘
導物質を仕込み、細胞の適切量を植え付け、適温、適切
な時間、炭酸ガスインキュベーター中で増殖と同時にtP
Aの生産を行う。
導物質を仕込み、細胞の適切量を植え付け、適温、適切
な時間、炭酸ガスインキュベーター中で増殖と同時にtP
Aの生産を行う。
または、ルーフラスコに培地を仕込み、細胞の適切量
を植え付けて、適温、適切な時間、炭酸ガスインキュベ
ーター中で増殖させ、コンフレントに達した後、生産培
地と切り換え、同じく炭酸ガスインキュベーターで適
温、適時tPAの生産を行う。
を植え付けて、適温、適切な時間、炭酸ガスインキュベ
ーター中で増殖させ、コンフレントに達した後、生産培
地と切り換え、同じく炭酸ガスインキュベーターで適
温、適時tPAの生産を行う。
例えば、75cm2のルーフラスコを使用して、細胞を0.5
〜2.0×105ケ/mlを植え付け、37℃、３〜４日間増殖と
同時にtPA生産を行う。
〜2.0×105ケ/mlを植え付け、37℃、３〜４日間増殖と
同時にtPA生産を行う。
または、例えば、75cm2のルーフラスコを使用して、
細胞を１〜２×105ケ/mlを植え付え、37℃、１〜３日間
tPA生産を行う。この方法で、tPAの生産量は分析の結
果、１本鎖tPAが20〜30mg/、２本鎖tPAが０〜2mg/
であり、全体に占める１本鎖の比率は95％以上であっ
た。
細胞を１〜２×105ケ/mlを植え付え、37℃、１〜３日間
tPA生産を行う。この方法で、tPAの生産量は分析の結
果、１本鎖tPAが20〜30mg/、２本鎖tPAが０〜2mg/
であり、全体に占める１本鎖の比率は95％以上であっ
た。
本発明の方法によれば、培地中の浸透圧を炭酸イオン
を用いて350ミリオスモル／以上とすることによりtPA
の生産量を大幅に向上させることができる。
を用いて350ミリオスモル／以上とすることによりtPA
の生産量を大幅に向上させることができる。
以下、実施例により本願発明を具体的に説明する。
なお、実施例における、培地中の１本鎖tPAの分析方
法（ELISA法）を以下に示す。
法（ELISA法）を以下に示す。
ELISA専用プレート（コーニング社96well）を１本鎖t
PAに対するモノクロナール抗体（PAM−１アメリカンダ
イアゴノテイカ社）をコート溶液で希釈して10μg/mlと
し、各プレートのwellに50μずつ加え、室温で２時間
放置後、well内の液を捨てる。
PAに対するモノクロナール抗体（PAM−１アメリカンダ
イアゴノテイカ社）をコート溶液で希釈して10μg/mlと
し、各プレートのwellに50μずつ加え、室温で２時間
放置後、well内の液を捨てる。
洗浄液で洗浄後、各wellをブロッキング溶液で満た
し、室温で30分以上放置する。1000〜2000倍に希釈した
サンプル及びスタンダード（０、１、２、４、8ng/ml）
を各50μずつ各wellに加えて２時間放置する。
し、室温で30分以上放置する。1000〜2000倍に希釈した
サンプル及びスタンダード（０、１、２、４、8ng/ml）
を各50μずつ各wellに加えて２時間放置する。
洗浄液で洗浄した後、抗tPAウサギ抗体を添加する。
洗浄液で洗浄後、Goat anti Rabbit IgG,Alkaline Ph
osphate Conjugate（シグマ社）を500倍に希釈して各we
llに50μずつ添加し、１時間放置する。
osphate Conjugate（シグマ社）を500倍に希釈して各we
llに50μずつ添加し、１時間放置する。
洗浄液で洗浄後、基質溶液（ｐ−Nitrophenylphosuph
ate シグマ社）を各wellに50μずつ加えて30分間放置
する。
ate シグマ社）を各wellに50μずつ加えて30分間放置
する。
各wellに50μずつ3N NaOHを加えて酵素反応を停止
する。
する。
405nmにおける吸収を市販のELISA READERで読み取
る。
る。
スタンダードより検量線を作成し、サンプル中のtPA
濃度を測定する。
濃度を測定する。
計算法 １本鎖 tPA量＝PAM−測定値（mg/） 実施例１ tPAの生産に用いた細胞は、ヒトメタロチオネインを
プロモーターとしてBPV由来プラスミドの一部および転
写停止に必要なDNA配列などを組み込んで構築したプラ
スミドをマウスＣ−127細胞に形質転換して得られたhT
−382株を使用した。
プロモーターとしてBPV由来プラスミドの一部および転
写停止に必要なDNA配列などを組み込んで構築したプラ
スミドをマウスＣ−127細胞に形質転換して得られたhT
−382株を使用した。
75cm2のルーフラスコにDMEMに予め不活性化させた牛
胎児血清を10％、アプロチニンを40KIU添加したものを2
0ml仕込み、塩化亜鉛を10μＭになるようにおよび表１
に示す濃度で重炭酸ナトリウムを添加した培地を作成
し、それぞれに上記細胞を1.0×105ケ/mlとなるように
植えつけた。
胎児血清を10％、アプロチニンを40KIU添加したものを2
0ml仕込み、塩化亜鉛を10μＭになるようにおよび表１
に示す濃度で重炭酸ナトリウムを添加した培地を作成
し、それぞれに上記細胞を1.0×105ケ/mlとなるように
植えつけた。
５％炭酸ガスインキュベーター中で37℃、４日間培養
し、コンフレント（細胞数10×105ケ/ml）に達した時点
で培養液中の１本鎖tPA濃度を以下の分析法で定量し表
１のような結果を得た。
し、コンフレント（細胞数10×105ケ/ml）に達した時点
で培養液中の１本鎖tPA濃度を以下の分析法で定量し表
１のような結果を得た。
重炭酸ナトリウムがほぼ完全に電離したときの浸透圧
（以下同様）。
（以下同様）。
実施例２ 実施例１と同じ細胞を使用し、75cm2のルーフラスコ
にDMEMに予め不活性化させた牛胎児血清を10％添加した
ものを20ml仕込み、1.0×105ケ/mlとなるように植え
た。
にDMEMに予め不活性化させた牛胎児血清を10％添加した
ものを20ml仕込み、1.0×105ケ/mlとなるように植え
た。
炭酸ガスインキュベーター中で37℃、４日間培養し、
コンフレント（細胞数10×105ケ/ml）に達した時点で培
地を捨て、同一の組成で塩化亜鉛を10μＭ、アプロチニ
ン40KIUとなるように、及び表２に示す各濃度で重炭酸
ナトリウムを添加した培地を20mlずつ加えて炭酸ガスイ
ンキュベーター中で37℃、２日間tPAを生産させ、その
時点で生産培地中でのtPA濃度を実施例１と同様に分析
し、表２のような結果を得た。
コンフレント（細胞数10×105ケ/ml）に達した時点で培
地を捨て、同一の組成で塩化亜鉛を10μＭ、アプロチニ
ン40KIUとなるように、及び表２に示す各濃度で重炭酸
ナトリウムを添加した培地を20mlずつ加えて炭酸ガスイ
ンキュベーター中で37℃、２日間tPAを生産させ、その
時点で生産培地中でのtPA濃度を実施例１と同様に分析
し、表２のような結果を得た。
実施例３ tPAの生産に用いた細胞は、tPAをコードするDNA配列
をSV−40の初期プロモーターを接続したDNA配列と、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNA配列から成るプラ
スミドでCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形
質転換し、更にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の
増幅した細胞を選択して得られたSV−21−M2.5K7株を使
用した。
をSV−40の初期プロモーターを接続したDNA配列と、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNA配列から成るプラ
スミドでCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形
質転換し、更にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の
増幅した細胞を選択して得られたSV−21−M2.5K7株を使
用した。
実施例１と同様な培地（ただし塩化亜鉛は添加せず）
で同様な方法で行い、表３のような結果を得た。
で同様な方法で行い、表３のような結果を得た。
実施例４ tPAの生産に用いた細胞は、実施例１と同様なものを
用いた。pH電極、DO電極及びガス吹き込み管をセットし
た撹拌羽根付き実容量１（全容量約1.5）のスピン
ナーフラスコにDMEMに予め不活性化させた牛胎児血清を
10％添加したものを１仕込み、上記と同組成の培地で
ローラーボトルに培養した種細胞を108細胞数（105ケ/m
l）を植え付け、37℃で４日間培養後細胞濃度が106ケ/m
lに達した時点で上記培地を抜きだしてDMEMに予め不活
性化させた牛胎児血清を５％、アプロチニン40KIU及び
塩化亜鉛を10μＭ添加した培地１を仕込みtPAを生産
させる。
用いた。pH電極、DO電極及びガス吹き込み管をセットし
た撹拌羽根付き実容量１（全容量約1.5）のスピン
ナーフラスコにDMEMに予め不活性化させた牛胎児血清を
10％添加したものを１仕込み、上記と同組成の培地で
ローラーボトルに培養した種細胞を108細胞数（105ケ/m
l）を植え付け、37℃で４日間培養後細胞濃度が106ケ/m
lに達した時点で上記培地を抜きだしてDMEMに予め不活
性化させた牛胎児血清を５％、アプロチニン40KIU及び
塩化亜鉛を10μＭ添加した培地１を仕込みtPAを生産
させる。
５％炭酸ガスを適時吹き込み浸透圧が表４に示す値に
なるように調整した。またNaOHでpHを7.0に調整した。
更にDOを1PPM、温度を37℃で調整した。
なるように調整した。またNaOHでpHを7.0に調整した。
更にDOを1PPM、温度を37℃で調整した。
１日１回培地交換を行い五回まで生産させた。
Claims (4)
- 【請求項１】細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子を製造する方法において、重炭酸イオンを用
いて培地中の浸透圧を350ミリオスモル/1以上とするこ
とを特徴とするヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
の製造方法。 - 【請求項２】培地中の浸透圧を350〜1000ミリオスモル/
1とすることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
製造方法。 - 【請求項３】細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子を製造する方法において、重炭酸ナトリウム
を用いて培地中の重炭酸ナトリウム濃度を3g/1以上とす
ることを特徴とするヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子の製造方法。 - 【請求項４】培地中の重炭酸ナトリウム濃度を３〜12g/
1とすることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の
製造方法。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63249081A JP2648624B2 (ja) | 1988-10-04 | 1988-10-04 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法 |
| US07/412,818 US5183754A (en) | 1988-10-04 | 1989-09-27 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| CA000614123A CA1335188C (en) | 1988-10-04 | 1989-09-28 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| NZ230856A NZ230856A (en) | 1988-10-04 | 1989-10-02 | Production of human tissue type plasminogen activator (tpa) under conditions of increased osmotic pressure |
| FI894657A FI96039C (fi) | 1988-10-04 | 1989-10-02 | Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi |
| AU42541/89A AU614429B2 (en) | 1988-10-04 | 1989-10-03 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| NO893929A NO175787C (no) | 1988-10-04 | 1989-10-03 | Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator |
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