JP2002501374A

JP2002501374A - 強化されたタンパク産生のための細胞培養培地

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Publication number: JP2002501374A
Application number: JP54212698A
Authority: JP
Inventors: チュア、フローレンス; ウエング、スティーブ・オー・カー
Original assignee: ナショナル・ユニバーシティ・オブ・シンガポール
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2002-01-15
Also published as: CA2286323A1; US7601535B1; EP0973867A1; US20020012991A1; WO1998045411A1; US20100093039A1; CA2286323C; EP0973867A4

Abstract

(57)【要約】細胞の生育を強制し、抗体産生を強化する細胞培養培地を提供する。本発明の高グルコース培地は、好ましくは４０℃で必須アミノ酸で飽和している。

Description

【発明の詳細な説明】強化されたタンパク産生のための細胞培養培地本願は、１９９７年４月７日に出願された米国出願第０８／８３３,５００号の継続出願である。発明の分野本発明は、タンパク産生を改良し、細胞生育を強制し、インビトロ培養での細胞の寿命を拡張する細胞培養培地、及びこのような培地の製造及び使用の方法に関する。発明の背景研究、診断、治療及び精製の目的のためのモノクローナル抗体（ＭＡＢｓ）の需要の増大は、産生技術の最適化の必要性を生み出している。先行技術としては、栄養供給により養物の寿命又は細胞密度を増大させるための改良されたバイオリアクターの設計及びバイオリアクターの操作が挙げられる。バイオリアクターは、フェド−バッチ(fed-batch)、固定化、灌流及び連続モードで操作されてきた。マウス腹膜因子、成長阻害剤、オートクリン因子又は環状モノヌクレオチドの添加及び浸透圧ストレスによる高刺激を含め、温度の使用、培地の製剤化のような代替的な戦略が、タンパク産生を強化するために用いられてきた。これらのアプローチは、わずかな成功のみを示していた。一般に用いられる基本細胞培養培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ(ダルベッコ改変イーグル培地)、ＨａｍのＦ１２及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＦ）である。Ｍｕｒａｋａｍｉ（１９８９）(１)¹は、ＲＤＦ（ＰＲＭＩ：ＤＭＥＭ：Ｆ１２＝２：１：１）からアミノ酸、グルコース及びビタミンの富化によって調製された改変された培地、ｅＲＤＦを記載している。Ｍｕｒａｋａｍｉは、総アミノ酸 ¹ 引用文献は、請求の範囲の前にある又はグルコースを単独で２倍にすることだけでは、細胞密度が増大されないが、アミノ酸及びグルコースの同時の上昇により細胞成長が３倍に最大化されることを示した。ｅＲＤＦ培地中での高浸透圧ストレスによるモノクローナル抗体産生の高刺激は、Ｃｈｕａら（１９９４）(２)及び（１９９４）(３)によって記載されている。しかし、達成された最大ＩｇＧ濃度は、約３５０〜４００ｍＯｓｍの培地浸透圧で、ＨＧ１１及びＴＢＣ３細胞についてそれぞれ約３００μｇ／ｍｌ及び２７０μｇ／ｍｌであった。ＮａＣｌを用いた浸透圧の更なる増大は、抗体産生の悪化を引き起こした。Ｏｈら（１９９５）(４)は、浸透圧的に上昇した外部環境を補正するためのＮａ＋依存性共輸送を介してハイブリドーマが代謝活性及びアミノ酸取り込みを増大したことを報告している。Ｏｈら（１９９６）(５)は、環境ストレスを与えられたハイブリドーマの総細胞モノクローナル抗体含量、細胞サイズ、及び細胞周期分布の間の関係を試験することにおけるフローサイトメトリーの適用を記載している。発明の概要本発明は、タンパク産生を強化し、インビトロ細胞生存性を長くする細胞栄養培地を提供する。このような培地を使用する細胞培養法は、本発明の重要な側面である。本発明の培地及び方法は、すべての種類のバイオリアクターにおける任意のタイプの細胞の培養に適用可能である。図面の詳細な説明図１―ＢＴＣ−２８１０１及び対照ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地におけるハイブリドーマ２ＨＧ１１及びＴＢＣ３の生育。図２ａ〜２ｄは、ＢＴＣ−２８１０１を用いた中空ファイバーバイオリアクター実験の結果を反映する。図２ａは、産生された抗体のレベルを表す。図２ｂは、培地のｐＨデータを示す。図２ｃは、グルコースの利用を報告する。図２ｄは、細胞生存率を報告する。図３ａ―無血清ＢＴＣ−２８１０１及びＧｉｂｃｏから入手可能な市販培地Ｈｂ及びＰＦＨＭ中でのハイブリドーマ２ＨＧ１１の生育。図３ｂ―無血清ＢＴＣ−２８１０１及びＧｉｂｃｏから入手可能な市販培地Ｈｂ及びＰＦＨＭ中でのＩｇＧ濃度。図４―ＢＴＣ−２８１０２及び対照ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中でのハイブリドーマ２ＨＧ１１及びＴＢＣ３の生育。図５―ＢＴＣ−２８１０３及び対照ＩＭＤＭ培地中でのＣＨＯ細胞の生育。ＩＭＤＭは、イスコーブ改変ダルベッコ培地を指す。図６は、培地成分中のアミノ酸の乾燥重量％とＭＡＢ産生（μｇ／ｍｌ）との相関を表す。図は、培地中のアミノ酸含量％が約２０％を超えた場合の、ＭＡＢ濃度の予期しなかった増大を説明する。図中、Ｄ／Ｆは、ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２、１：１混合物を指す。定義細胞培養培地―任意のタイプの細胞を培養しうる任意の培地。バイオリアクター―細胞を培養しうる任意の装置。静置フラスコ、スピナーフラスコ及び中空ファイバーバイオリアクターを含む。基本培地―細胞の代謝に必須のすべての成分、例えばアミノ酸、脂質、炭水化物、ビタミン及び無機塩類を含有する細胞培養培地。ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍの１２及びＲＤＦは、基本培地の例である。必須アミノ酸―Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌ。非必須アミノ酸―Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ。発明の詳細な説明本発明は、タンパク産生細胞の培養においてタンパク産生を改良する方法を提供する。特に、本発明は、ハイブリドーマ、抗体産生細胞を、高濃度のアミノ酸、特に必須アミノ酸、及びグルコース又はスクロースのようなエネルギー源を含む高浸透圧水性培地中で培養することを含む。培地は、４０℃程度でアミの酸又は培養細胞の代謝に必須のアミノ酸で実質的に飽和する。本発明の培地は、溶液又は懸濁液中の５.５０〜２０ｇ／ｌの総又はグロスアミノ酸及び溶液中の５.５０〜２０ｇ／ｌの炭水化物エネルギー源、好ましくはグルコースを含有する。グロスアミノ酸は、培地成分の総乾燥重量の少なくとも２０％、好ましくは約２５％〜約５０％を構成する。細胞は、継代によって本発明の高浸透圧培地に適宜適合させてもよい。培地の浸透圧は、３２０〜４５０である。塩化ナトリウムは好ましいオスモライト（osmolyte）である。本発明の培地及び方法は、すべての形態のバイオリアクターにおいて有用である。本発明の利点は、静置、バッチ、シェーカーフラスコ、及びスピナー及び中空ファイバーバイオリアクター培養手順において実現される。すべての種類の細胞を、任意の本発明の方法において培養することができる。組換えタンパク発現哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞の培養は、本発明の重要な側面である。組換えタンパク含有発現ベクターを含む多くのタイプの哺乳類細胞が公知である。例えば、Ａｃｋｌｉｎ，Ｃ．ｅｔａｌ．(組換えヒト脳由来ニューロトロピックファクター(ｒＨｕＢＨＤＮＦ)。ＣＨＯ細胞において発現されたＢＤＮＦのジスルフィド構造及び特徴づけ)、Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ． (１９９３)４１：５４８―５２；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔａｌ. ，(ＣＨＯ細胞により産生された組換えヒトリンフォトキシンのＮ−結合糖鎖構造；そのレクチン様特徴及びクリアランス速度に関する炭水化物の機能的役割) 、ＡＢＢ（１９９３）３０４：１４４―５３；Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔ．ｅｔａｌ．(ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞及びＣ１２７細胞により産生された組換えヒトエリスロポエチンアナログのインビトロ生物学的活性)、Ｂｉｏｌｏｉｃａｌｓ（１９９２）２０：２５３−７；Ｉｓｒａｅｌ，Ｄ．Ｉ.，ｅｔａｌ．(チャイニーズハムスター卵巣細胞における骨形態形成性プロテイン２の発現及び特徴づけ)、ＧＦ（１９９２）７：１３９−５０；Ｌａｎｇｌｅｙ，Ｋ．Ｅ.，ｅｔａｌ．(組換えにより大腸菌及びチャイニーズハムスター卵巣細胞により発現されたヒト及びラット幹細胞因子の可溶性形態の精製及び特徴づけ)、ＡＢＢ(１９９２)２９５：２１―８；Ｌｕ，Ｈ．Ｓ．ｅｔａｌ．(チャイニーズハムスター卵巣細胞により発現された膜結合組換えヒト幹細胞因子の翻訳後プロセッシング)、２９８：１５０―８；Ｍａｌｉｋ，Ｎ.，ｅｔａｌ．(チャイニーズハムスター卵巣細胞における非相同オンコスタチンＭの発現及び増幅)、ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．(１９９２)１１：４５３―９；Ｎａｇａｏ，Ｍ，ｅｔａｌ．(マウスエリスロポエチンレセプターの可溶性形態の産生及びリガンド結合特性)、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． (１９９２)１８８：８８８―９７；Ｒｉｃｅ，Ｋ．Ｇ.，ｅｔａｌ．(組換えエリスロポエチンのｎ―結合シアルオリゴサッカリドの定量的マッピング；直接高速アニオン交換クロマトグラフィ及び２−アミノピリジン誘導化の組合わせ)、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０６：２７８―８７；Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ，Ｃ.Ｈ.，ｅｔａｌ．(組換えヒト分化刺激因子の精製及び部分的特徴づけ)、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｖｒｉｆ．( １９９０)１：５４―６２；Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ，Ｃ．Ｈ．ｅｔａｌ．(ヒト神経成長因子の生化学的特徴づけ)、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．(１９９２)５９：１６７５―８３；Ｓｉｍａ，Ｎ.，ｅｔａｌ．(ヒト線維芽細胞からの腫瘍細胞傷害因子／肝細胞成長因子；そのｃＤＮＡのクローニング、組換えタンパクの精製及び特徴づけ)、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．(１９９２)１８０：１１５１―８；Ｓｕｎ，Ｘ．Ｊ.，ｅｔａｌ．(インシュリンシグナル伝達におけるＩＲＳ−１の発現及び機能)、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．( １９９２)、２６７：２２６６２―７２；Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ.，ｅｔａｌ.，(ＣＨＯ細胞において発現された両生類骨形態形成性プロテイン４の生化学的特性) 、ＢＪ(１９９３)２９１：４１３―７；Ｔｒｅｓｓｅｌ，Ｔ．Ｊ.，ｅｔａｌ．(チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現されたヒト組換えインシュリン様成長因子結合タンパク３の精製及び特徴づけ)、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． (１９９１)１７８：６２５−３３を参照されたい。また、Ｌｕｃａｓ，Ｂ．Ｋ.，ｅｔａｌ．(ジシストロン性ＤＨＦＲイントロン発現ベクターを用いるＣＨＯ細胞における組換えタンパクの高レベル産生)、（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：１７７４−９も参照されたい。実施例１培地ＢＴＣ−２８１０１培地ＢＴＣ−２８１０１の乾燥粉末形態を、表Ｉに揚げた２つの別個の成分（Ａ）及び（Ｂ）から調製した。成分を、使用前に細かい粉末に粉砕した。培地を調製するために、成分（Ａ）を９０容量％の発熱物質無含有の水に溶解した。この混合物を、約４０℃に温め、１時間攪拌して粉末を充分に溶かし、次に室温に冷却した。成分（Ｂ）を添加し、更なる時間攪拌して溶かした。ｐＨを、ＮａＯＨの添加によって７.０に調整した。水を添加して所望の容量にした。培地の浸透圧は、３３０〜３３５ｍＯｓｍ／Ｋｇの範囲内であった。表Ｉ：ｍｇ／ｌで表した培地ＢＴＣ−２８１０１の組成培地ＢＴＣ−２８１０１の組成は以下のとおりである：グルコース（ｍｇ／ｌ）６.８４６アミノ酸（ｍｇ／ｌ）６.２５１アミノ酸（％乾燥重量^*）２４.８^* 培地成分の乾燥重量。実施例２シェーカーフラスコ培養におけるハイブリドーマのＩｇＧ産生に対する培地ＢＴＣ−２８１０１の効果この実施例は、血清を添加した実施例１の培地ＢＴＣ−２８１０１対ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地：ＨａｍのＦ１２＝１：１）中での２つのハイブリドーマ細胞株２ＨＧ１１（抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）及びＴＢＣ３（抗ヒトＩｇＧ）における細胞生育及びモノクローナル抗体産生を比較する。実験は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加した１００ｍｌの培地を含むシェーカーフラスコ中にセットした。接種細胞は、少なくとも１週間、それぞれの新鮮培地を用いて２×１０⁵／ｍｌで毎日継代することにより適合させ、維持した。使用前、各接種培養物の生存率は９０％を超えていた。それぞれの培地に２ ×１０⁵／ｍｌを接種することによって、バッチ培養を開始した。毎日試料を採取し、トリパンブルー染色及び血球計数板によるカウントによって細胞生育を追跡した。培養上清中のモノクローナル抗体濃度は、ＥＬＩＳＡ解析によって決定した。細胞生育に対する効果を図１に示す。培養の最後でのＩｇの最大濃度を、表IIにまとめる。表II：ＢＴＣ−２８１０１及び対照ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いた培養物における最大Ｉｇ濃度実施例３ハイブリドーマ細胞株ＴＨ１２（抗テオフィリン）を、実施例１のＢＴＣ−２８１０１培地又はＤＭＥＭ処方中で培養した。２５０ｍｌのスピナーフラスコ中の１００ｍｌのＢＴＣ−２８１０１又は対照培地ＤＭＥＭ（両培地とも１０％ＦＢＳを添加した）に、２×１０⁵／ｍｌで細胞を接種した。接種培養物の調製及びバッチの監視については、実施例２に述べたのと同様の手順にしたがった。ＴＨ１２は、ＢＴＣ−２８１０１においてＤＭＥＭ処方中でよりも高い濃度の抗体を産生した。表IIIに示すように、細胞数及び細胞生存率もまた、２８１０１においての方が高かった。表III ＴＨ１２バッチ培養：細胞カウント及び生存率両培地における生存率は＜５％であった。全培地容量を分析のために回収した。表IVは、ＢＴＣ−２８１０１を用いた場合に、Ｉｇ産生及び特異的抗体力価が強化されることを明らかにする。表IV ＴＨ１２バッチ培養：Ｉｇ濃度及び特異的抗体力価実施例４ハイブリドーマ細胞株ＤＩ１６（抗Dirofilaria immitis）を、ＢＴＣ−２８１０１又はＤＭＥＭ中で培養した。ＤＩ１６は、ＢＴＣ−２８１０１においてＤＭＥＭの内部処方におけるよりも高い濃度の抗体を産生した。表Ｖは、細胞数及び細胞生存率もまた、ＢＴＣ−２８１０１においての方が高かったことを示す。表ＶＤＩ１６バッチ培養：細胞カウント及び生存率表VIは、比較のＩｇ力価及び濃度を報告する。表VI ＤＩ１６バッチ培養：Ｉｇ力価及び濃度実施例５ハイブリドーマ細胞株ＮＰ１１（抗Ｎ−アセチルプロカインアミド）を、ＢＴＣ−２８１０１又はＤＭＥＭ中で培養した。この細胞株は、強化された抗体産生レベルについてＢＴＣ−２８１０１に応答するのが他の細胞株よりもやや遅かった；異なる細胞株についての変動は驚異的ではない。ＤＭＥＭ中の培養物がもはや生存可能でない場合に、ＢＴＣ−２８１０１培養物が実質的なレベルの抗体を産生したことは有意である。培養物に長い時間産生させ続ける能力は、ＢＴＣ− ２８１０１の有意な利点である。表VIIを参照されたい。表VII ＮＰ１１バッチ培養：細胞カウント及び生存率実施例６中空ファイバー培養におけるＩｇＧの産生に対するＢＴＣ−２８１０１の効果ＦＢＳ添加ＢＴＣ−２８１０１を供給した「ミニ」中空ファイバーバイオリアクター（UniSyn Technologies，Inc.の「ＭｉｎｉＭｏｕｓｅ」バイオリアクター）中のハイブリドーマの性能を、対照ＦＢＳ添加ＤＭＥＭと比較した。結果を、表VIIIに示す。このハイブリドーマによって、対照ＤＭＥＭ中及びＢＴＣ− ２８１０１中で同等のレベルの抗体が産生された。しかし、対照培養は、生存率が＜１０％となった第１３日に終了させた。これに対し、ＢＴＣ−２８１０１中の細胞は高度に生存可能なままであり、この培養は培地供給の不足によってのみ終了させた。表VIII：ＢＴＣ−２８１０１及び対照ＤＭＥＭ培地における中空ファイバーのＩｇ力価比較実施例７中空ファイバーバイオリアクター―２８１０１培地この中空ファイバーバイオリアクター実験は、従来の方法で通常２００〜３００μｇ／ｍｌ程度のＭＡＢ抗体を産生する特定の細胞株を含んでいた。図２ａは、この細胞株がＢＴＣ−２８１０１中で実質的によりよく機能したことを示す。培地のｐＨ(図２ｂ)、グルコース利用(図２ｃ)、及び細胞生存率（図２ｄ）についてのデータを提示する。中空ファイバーバイオリアクターにおいてＢＴＣ−２８１０１中で生育する細胞は、従来の培地について通常見られる速度で培地からグルコースを利用するようには見えない。グルコース利用の監視は、中空ファイバーバイオリアクター中の細胞の進行を監視する標準的手段であり、グルコース利用のレベルが高いほど、細胞がよく生育している。実施例８ＢＴＣ−２８１０１培地を用いたスピナーフラスコ実験抗テオフィリンハイブリドーマ細胞を、５００ｍｌのスピナーフラスコ中の２５０ｍｌのＢＴＣ−２８１０１又はＤＭＥＭのＤｉｆｃｏの調製物に２×１０⁵ 細胞／ｍｌで接種した。両培地とも、１０％ＦＢＳ、２％Ｌ−グルタミン、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（pen-strep）を添加されていた。５ｍｌの試料を、示した日に各フラスコから集めた。細胞生存率を、試料を集めた各日に決定し、抗体濃度を、すべての試料が集められた後に、放射免疫拡散法（radi al immunodifusion;RID）によってすべての試料について決定した。その時まで、試料（細胞物質を遠心によって除去したもの）を−２０℃に保存した。ＲＩＤによって決定した抗体濃度及び細胞生存率を表IXに記載する。表IX 記載した条件下で用いた細胞株が１ｍｇ／ｍｌを産生したことは、有意である。具体的には、スピナーフラスコは、理想的な培養条件を提供しなかった。いったん実験をセットしたら、培地は、決して交換又は補充しなかった。結果として、代謝産物及び死細胞が蓄積し続けた。実施例９抗テオフィリンハイブリドーマ細胞を、２５０ｍｌのスピナーフラスコ中の１００ｍｌのＢＴＣ−２８１０１又は内部培地（ＤＭＥＭ）のＤｉｆｃｏの調製物に２×１０⁵細胞／ｍｌで接種した。他のすべてのパラメーターは、実施例８に記載したとおりであった。ＲＩＤによって決定した抗体濃度及び細胞生存率を、表Ｘに記載する。表Ｘ実施例９における培養容量は実施例８での半分であったことに注目されたい。結果として、栄養分は、より迅速に涸渇し、阻害的な濃度の代謝産物又は他の物質がより迅速に蓄積してしまっていた可能性がある。実施例１０無血清培養におけるＩｇＧ産生に対するＢＴＣ−２８１０１この実施例は、無血清ＢＴＣ−２８１０１及びＧｉｂｃｏから入手可能な他の市販の無血清培地中でのハイブリドーマ細胞株（２ＨＧ１１）における細胞生育及びモノクローナル抗体産生を比較する。ハイブリドーマ２ＨＧ１１を、それぞれの培地中で無血清条件に適合させた。すべての培地には、インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン及びセレナイト（亜セレン酸塩）を添加した。細胞を、２５０ｍｌのシェーカーフラスコ中の１００ｍｌのＢＴＣ−２８１０１又は対照培地に２×１０⁵／ｍｌで接種した。生育及びＩｇＧ産生に関する結果を、図３ａ及び３ｂに示す。実施例１１培養ハイブリドーマに対するＢＴＣ−２８１０２の調製及び使用培地ＢＴＣ−２８１０１の栄養分含量を更に強化して、培地２８１０２を処方した。この培地を調製するために、表ＸＩの組成にしたがって成分（Ｃ）を調製し、乾燥した細かい粉末に粉砕した。この粉末を、ガンマ線照射によって滅菌し、１００ｍｌの培地ＢＴＣ−２８１０１に添加して培地ＢＴＣ−２８１０２を構成した。この培地の浸透圧は、４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ程度であった。表XI：ＢＴＣ−２８１０２を作るための培地ＢＴＣ−２８１０１に対する補充物の組成高濃度では細胞に対して有害なシステインの代わりに、シスチンを用いた。培地ＢＴＣ−２８１０２の組成は以下のとおりである：グルコース１０.２６９ｇ／ｌアミノ酸１５.６２８ｇ／ｌアミノ酸（％培地成分の乾燥重量）４１.１接種細胞は、実施例２に述べたプロトコールにしたがって培地ＢＴＣ−２８１０１に適合させ、１００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の対照細胞とともに、シェーカーバッチを開始する時に２×１０⁵／ｍｌで接種した。細胞生育に対する効果を、図４に示す。培養物中の最大Ｉｇ濃度を表ＸIIにまとめる。表XII：ＢＴＣ−２８１０２及び対照ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いた培養物における最大Ｉｇ濃度実施例１２培養ＣＨＯ細胞に対するＢＴＣ−２８１０３の調製及び使用この発明は、天然又は組換えタンパクを発現する哺乳類細胞を培養するための本発明の使用を説明する。ＢＴＣ−２８１０１におけるようにＢＴＣ−２８１０３を調製したが、ＨＥＰＥＳ及びＮａＨＣＯの緩衝剤含量は、それぞれ８３３０ｍｇ／ｌ及び２６５０ｍｇ／ｌに増大させた。結果として、この培地の浸透圧は、３６０ｍＯｓｍ／Ｋｇに上昇した。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を、懸濁液中で生育するよう適合させ、シェーカーフラスコ中の１００ｍｌのＢＴＣ−２８１０３及び対照ＩＭＤＭ（ともに１０％ＦＢＳ、チミジン及びヒポキサンチンを添加したもの）中で培養した。培養物の生育を、血球計数板によるカウントによって毎日追跡し、図５に表した。本発明の培地は、利用可能な種々の形態のバイオリアクターにおいてタンパク発現細胞株を培養するために有用である。特に、この発明の培地は、組換えタンパクを発現するＣＨＯ細胞の中空ファイバーバイオリアクター培養におけるキャピラリ内培地として用いてもよい。実施例１３表ＸIIIは、市販の培地ＲＰＭＩ、Ｄ／Ｆ及びｅＲＤＦ、及び本発明の２８１０１（実施例１）及び２８１０２（実施例１１）培地の組成を示す。表ＸIII 培地中のアミノ酸含量（％）とＭＡＢ産生との相関を、図６に示す。組換えタンパクベクターを発現する哺乳類細胞を含むすべてのタイプの細胞によるタンパク産生を改良する新規な細胞培養培地を開示した。本発明は、一般にモノクローナル抗体の産生を含む細胞培養手順のコスト効率を実質的に強化する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウエング、スティーブ・オー・カーシンガポール共和国、シンガポール 521119、タンパインズ・ストリート 11、ナンバー 06―184、ビー１ケイ 119

Claims

【特許請求の範囲】 1．培地中で培養される細胞のためのアミノ酸及び炭水化物エネルギー源の水性溶液を含む細胞培養培地において、上記水性溶液が、 (i) ３０℃〜５０℃の温度で上記アミノ酸で実質的に飽和しており； (ii) ３２０〜４５０ｍＯｓｍの浸透圧を有し； (iii) ５.５０〜２０ｇ／ｌのアミノ酸及び５.５０〜１５ｇ／ｌの上記炭水化物エネルギー源を含有すること及び上記培地における溶液中のアミノ酸の乾燥重量が、上記培地に存在するすべての固形成分の総乾燥重量の少なくとも２０％を構成することを特徴とする改良。 2．上記炭水化物エネルギー源が、グルコースである、請求項１記載の細胞培養培地。 3．３２０〜４５０ｍＯｓｍの上記浸透圧が、少なくとも一部はナトリウム塩によって提供される、請求項１記載の細胞培養培地。 4．３２０〜４５０ｍＯｓｍの上記浸透圧が、少なくとも一部は塩化ナトリウムオスモライトによって提供される、請求項１又は請求項２記載の細胞培養培地。 5．アミノ酸で実質的に飽和した上記水性溶液中に溶解していないアミノ酸の懸濁液を更に含み、上記実質的な飽和が、上記水性培地において溶液中のアミノ酸を細胞生育が消費するにつれて維持される、請求項１記載の細胞培養培地。 6．水性基本細胞培養培地において、上記基本培地に、 (i) ある濃度の、５.５０〜２０ｇ／ｌの総アミノ酸濃度を提供するための細胞輸送系Ａと反応性の１又は２以上のアミノ酸； (ii) ３２０〜４５０ｍＯｓｍの、ナトリウム塩オスモライトによって提供される浸透圧；を提供することを含む改良。 7．オスモライト（ii）が、塩化ナトリウムである、請求項６記載の細胞培養培地。 8．上記細胞輸送系Ａと反応性の１又は２以上のアミノ酸が、両性イオンのアミノ酸である、請求項６記載の細胞培養培地。 9．上記細胞輸送系Ａと反応性の１又は２以上のアミノ酸が、アラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、プロリン及びセリンからなる群から選択される、請求項６記載の細胞培養培地。 10.上記基本細胞培養培地が、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ＨａｍのＦ１２、ＲＤＦ又はｅＲＤＦである、請求項６又は請求項７又は請求項８記載の細胞培養培地。 11.細胞培養培地２８１０１、２８１０２又は２８１０３。 12.請求項１、請求項２、又は請求項３、又は請求項１１記載の培養培地において細胞を培養することを含む方法。 13.以下の工程： (i) 請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項１１記載の細胞培養培地を用意し； (ii) 工程（i）で用意した培地中で組換え発現ベクターを含むＣＨＯ細胞を培養し；そして (iii) 上記ＣＨＯ細胞によって発現された組換えタンパクを回収する工程を含む方法。 14.組換え発現ベクターを含むＣＨＯ細胞が、ジシストロン性ＤＨＦＲイントロン発現ベクターである、請求項１３記載の方法。 15.培養培地２８１０３中でＣＨＯ細胞を培養することを含む方法。 16.上記培養培地中で培養される細胞が、ハイブリドーマである、請求項１３記載の方法。 17.請求項１、請求項２又は請求項３又は請求項１１記載の培養培地中で哺乳類細胞を培養することを含む方法。 18.請求項１、又は請求項２又は請求項３又は請求項１１記載の培養培地中で組換えタンパクのための発現ベクターを有する哺乳類細胞を培養することを含む方法。 19.請求項１、請求項２、請求項３又は請求項１１記載の培養培地中で組換えタンパクのための発現ベクターを有するＣＨＯ細胞又はＢＨＫ細胞又はＣＯＳ細胞又はＮａｍａｌｉｖａ細胞を培養することを含む方法。 20.請求項６又は請求項７又は請求項８又は請求項９記載の培養培地中で細胞を培養することを含む方法。 21.請求項７又は請求項８又は請求項９記載の培養培地中で哺乳類細胞を培養することを含む方法。 22.請求項７又は請求項８又は請求項９記載の培養培地中で組換えタンパクのための発現ベクターを有する哺乳類細胞を培養することを含む方法。 23.請求項７又は請求項８又は請求項９記載の培養培地中で組換えタンパクのための発現ベクターを有するＣＨＯ細胞又はＢＨＫ細胞又はＣＯＳ細胞又はＮａｍａｌｉｖａ細胞を培養することを含む方法。 24.アミノ酸、炭水化物及びビタミンを含む細胞培養培地成分の乾燥混合物であって、上記アミノ酸成分が、上記混合物の乾燥重量の少なくとも２０％を構成する混合物。 25.上記アミノ酸成分が、上記混合物の乾燥重量の３０％〜５０％を構成する、請求項２４記載の混合物。