DK175411B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner - Google Patents

Description

i DK 175411 B1

Plasminogenaktivatorer er en klasse sérinprotea-ser, der aktiverer proenzymet plasminogen til det aktive enzym plasmin ved spaltning af peptidbindingen mellem Arg-560 og Val-561. Plasmin på sin side er det sid-5 ste trin af blodbanens fibrinolysesystem, der spalter en thrombus' fibringitter i opløselige peptider.

Ved patogenetiske forstyrrelser, såsom coronar-sygdom, bliver blodkoagulat ikke opløst hurtigt nok til at sikre en tilstrækkelig forsyning af vævet med oxy-10 gen. Resultatet af lukningen af coronararterierne af et blodkoagulat er en infarkt, hvoraf følger nekrose af det pågældende væv på grund af oxygenunderforsyning af hjertemusklen.

En hurtig rekanalisering af karret kan på kor-15 teste tid sikre blodgennemstrømningen af hjertemusklen og således hindre, at hele muskelpartier i hjertet dør.

Ved terapien er hidtil anvendt streptokinase og urokinase. Egenskaberne af t-PA indebærer imidlertid nogle fordele sammenlignet med nævnte kendte plasmino-20 genaktivatorer, nemlig den fibrinspecifikke lokale lysis, ingen systemiske lytiske effekter som følge af fibrinogennedbrydning, høje reperfusionsrater og ingen antistofdannelse t.PA er et glycoprotein med en molekylvægt på 25 ca. 65.000 Dalton, der forekommer som énkædet eller tokædet enzym og er sammensat af 527 aminosyrer.

Affiniteten af t-PA til plasminogen er i nærværelse af fibrin ca. 100 gange større end i dettes fravær. Denne høje affinitet af t-PA til plasminogen i 30 nærværelse af fibrin sikrer en effektiv aktivering uden at aktivere frit plasminogen i periferien.

Humant t-PA er i ren form først opnået fra uteri. I andre væv og celler, f.eks. endothele celler I DK 175411 B1

I I

I inklusive arterielle og venøse endothele celler, har I

I der også kunnet påvises t-PA. De dannede t-PA-mængder I

I er imidlertid så små, at deres kommercielle udvinding I

I er umulig. I

En yderligere naturlig kilde for t-PA er celle- I

5 kultur. Flere cellelinier er undersøgt for en mulig I

I t-PA-produktion (Gronow M. et al., Trends in Biotech- I

nology 1:26-29, 1983). Fra en human cellelinie, nemlig I

I Bowes-Melanoma-celler, kunne der vindes større mængder I

af t-PA til begrænsede kliniske studier samt til op- I

I 10 klaring af strukturen (Wallen et al., European Journal I

I of Biochemistry 132:681-686, 1983). I

I Til storproduktion af t-PA til bred klinisk I

anvendelse er disse udbytter under alle omstændigheder I

for små. Først genteknik har gjort det muligt at frem- I

15 stille større mængder rekombinant t-PA til terapeutisk I

I anvendelse. I

I 198 3 blev t-PA klonet, og aminosyresekvensen I

bestemt (Pennica, Nature 301:214-221, 1983). I

Forsøg på at opnå t-PA ud fra E. coli, hvori den I

20 genetiske information for t-PA fra melanomaceller blev I

I integreret, var ikke vellykkede, da det resulterende I

I protein ikke er glycolyseret og derfor ikke svarer til I

I det native t-PA. I

I Af denne grund har forskellige forskningsgrupper I

I 25 til produktion af humant t-PA udsøgt permanente patte- I

I dyr-cellelinier fra forskellige kilder. Nogle af disse I

I cellelinier er humane cellelinier med angiveligt for- I

I bedret udbytte af t-PA. En anden cellelinie er den nor- I

I male kinesisk-hamster-ovariecelle. · I

30 i europæisk offentliggørelsesskrift 0093619 er I

I beskrevet fremstillingen af t-PA med transformerede I

I kinesisk-hamster-ovarieceller (CHO-celler). Det resul- I

3 DK 175411 B1 terende t-PA (r-tPA) adskiller sig på ingen måde fra naturligt forekommende t-PA.

I flere publikationer er beskrevet mutanter af t-PA og deres fremstilling, f.eks. i EP-A 241.206, 5 241.209, 241.210, 240,334, 234,051, 233.013, 231,624,

225,286, 213,794, 201,153, 199,574, 196,920 og DE-A

3708681.

I nærværende ansøgning betegnes alle t-PA-deri-vater mutanter, uanset om de indeholder én eller flere 10 aminosyrer, der adskiller sig fra aminosyren i samme stilling i det i naturen forekommende t-PA, eller om én eller flere aminosyrer, der forekommer i det naturlige t-PA, ikke er indeholdt i disse "mutanter", Et t-PA, hvori mange aminosyrerester fra det naturligt forekom-15 mende t-PA er fraværende, såsom f.eks. i europæisk patentpublikation EP-A-196.920, betegnes ofte "degraded species".

I europæisk patentpublikation EP-A 199.574 er for eksempel beskrevet en t-PA-mutant, der i stillingen 20 270 til 279 har visse aminosyrer, der imidlertid er forskellige fra aminosyren i den tilsvarende stilling i det naturlige t-PA.

I tysk patentpublikation DE-A 3708681 har ansøgerne omtalt nogle t-PA'er, der i stilling 117 har en 25 aminosyre, der adskiller sig fra aminosyren i den tilsvarende stilling i naturligt t-PA, hvorhos det mutante t-PA i modsætning til det naturlige t-PA ikke er glyco-syleret i denne stilling.

I mange publikationer er beskrevet indvirkningen j 30 af forskellige stoffer på produktiviteten af cellekul turer til syntesen af proteiner.

Ved de forskellige cellesystemer berettes om en sammenhæng mellem intracellulært c-AMP-spejl og t-PA- I DK 175411 B1

I I

syntesen (se f.eks. Kooistra et alw Thrombosis and I

I Haemostasis, 54(1):192, Abstract P 1133), nemlig at I

I dibutyryl-c-AMP forøger produktionen af t-PA 1 humane I

I endothelceller med 2 til 3 gange, men ikke har nogen I

5 indvirkning på syntesen af t-PA i Bowes-melanoma-cel- I

I ler. I nyreceller blev t-PA-syntesen forøget med phos- I

I phodiesterase-inhibitorer (Journal of Cell Biology 91: I

I 195-200, 1981). På den anden side hæmmer c-AMP t-PA- I

I syntesen i makrophager (Vassalli et al.. Cells, 8:271- I

I 10 281, 1976) og er indifferent i teratocarcinoma-celler I

I (Nishimune et al., Experimental Cell Research 146:439- I

I 444, 1983). I

Smøresyre inducerer syntesen af t-PA i terato- I

carcinoma-celler (Nishimune - se ovenfor), men viser i I

I 15 renale tumorceller en inhibitorisk aktivitet (Nelson et I

I al., Proc. Am. Ass. for Cancer Research, 26:35, 1985), I

I og der er rapporteret om en indifferent aktivitet i em- I

I bryonale lungeceller af Brouty-Boye et al., Biotechno- I

I logy 12:10, 1984. I

20 x humane endothelceller kan t-PA-syntesen sti- I

I muleres med thrombin (Levin et al.. Thrombosis and I

I Haemostasis, 56(2):115-119, 1986), alkohol (Laug, Jama, I

I 250(6):772-776, 1983 D), vitamin C og vitamin A (Inada I

I et al., Bichemical and Biophysical Communications I

I 25 130(1):182-187, 1985). t-PA-Sekretionen i bovine endo- I

I thelceller hæmmes imidlertid af thrombin (Loskutoff, I

I Journal of Clinical Investigations, 64:329-332, 1979) I

I og endotoxin (Crutchley et al., Journal of Biological I

Chemistry, 261(1):154-159, 1986). I

I 30 t-PA-Sekretionen fra svine-endothel formidles af - I

I heparin (Marchwardt et al., Thrombosis Research, 8:217- I

I 223, 1976), men hos de humane embryonale lungeceller I

I har heparin imidlertid en minimal effekt. I

5 DK 175411 B1 t-PA-Syntesen er endvidere blevet positivt påvirket af concanavalin A i embryonale lungeceller (Brouty-Boye, se ovenfor) og epithelceller (electric-wala et al., Thrombosis and Haemostasis 53:200-203, 51985), 5-azacytidin i epithelceller (Electricwala, se ovenfor) og melanomaceller (Silagi et al., Biological Medicine, 57:418, 1984), af tizabrine og melanomaceller (Roba et al.. Thrombosis and Haemostasis 50(1):83, 1983) og af aphidicolin i hepatomaceller (Orfanoudakis 10 et al., Biological Chemistry, Hoppe-Seyler, 336(9):832, 1985).

I europæisk offentliggørelsesskrift 0219270 er beskrevet, at en kombination af heparin og endothel-cellevækstfaktor (ECGF) forøger produktionen af t-PA og 15 énkædet urokinaseplasminogenaktivator fra normale humane diploide lingefibroblastceller i serumfrit medium.

Om indvirkningen af smørsyre på kinesisk-ham-ster-ovarieceller er berettet af Storrie et al., Journal of Cell Physiology, 94:69-76, 1978, og Wright, Ex-20 perimental Cell Research, 78:456-460, 1978. Disse undersøgelser blev imidlertid gennemført med ikke-trans-formerede cellelinier, og resultaterne var i det store og hele rettet på ændringerne af cellernes morfologi og vækstrate.

25 yderligere bliver der i EP-A-0,239,292 beskrevet anvendelse af natriumbutyrat til forøgelse af proteinproduktionen ved dyrkning af genteknologiske forandrede celler eller af hybridomer, hvorved anvendelsen af natriumbutyrat ved expressis vervis antistofproduktion er 30 beskrevet. Den gunstige benyttelse af de alifatiske mo-nocarbonsyrer og deres salte i sammenhæng med CHO-cel-ler kunne på grund af den foranstående udførelsesform ikke forudses, især da Gorman et al. in Nucleic Acids

I DK 175411 51 I

i 6 I

Research, 11: 7631-7648, 1963 kun beskriver anvendelsen I

I af natriumbutyrat til forøgelse af produktionen af CAT I

I i serumholdigt medium. I

I Det har nu vist sig, at tilsætningen af en C3-C4 I

I 5 alifatiske carbonsyre eller dennes salt i en kultur af I

I transformerede CHO celler i serumfrit medium forøger I

I proteinudbyttet. I

Formålet med den foreliggende opfindelse er så- I

I ledes en metode til forøgelse af produktionen af en I

I 10 protein fra kulturer af transformerede CHO-celler, som I

I er kendetegnet ved, at man tilsætter en C3-C4 alifatisk I

I monocarbonsyre eller dennes salt til kulturen og gen- I

I nemfører dyrkningen i et serumfrit medium. I

I Et yderligere mål med den foreliggende opfindel- I

I 15 se er en metode til forøgelse af produktionen af pro- I

I teiner i kulturer af transformerede CHO-celler, som er I

I kendetegnet ved, at man dyrker cellerne i nærvær af I

I thioglycolsyre, thiodiglycolsyre, L-cysteln, gluta- I

I thion, butyrylcholinbromid, butyrylcholinchlorid, I

I 20 nonactinsyre, furanfedtsyre, ascorbinsyre, aphidicolin, I

I 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-on eller D-a-hy- I

I droxysubstitueret aliphatisk (C3 eller C4)-mono- eller I

I -dicarboxylsyre eller salte deraf, idet man fjerner I

I cellerne fra kulturen og dernæst tilfører et nyt serum- I

I 25 frit dyrkningsmedium og dyrker i nærvær af en C3-C4 I

I alifatisk monocarbonsyre eller et salt deraf. I

I Som proteiner kan der fortrinsvis være tale om I

I plasminogenaktivatorer, navnlig rt-PA og mutanter der- I

I af. Fremgangsmådens virkning er imidlertid uafhængig af I

I 30 proteinerne og det for disse proteiner kodende DNA og I

I kan derfor anvendes på CHO-celler, der transformeres I

I til eksprimering af et hvilket som helst fremmed pro- I

I tein. I

7 DK 175411 B1

Mutant rt-PA er derivater af t-PA, der har én eller flere aminosyrerester, der adskiller sig fra amino-syreresterne i den tilsvarende stilling af det naturlige t-PA, eller hvori én eller flere aminosyrerester 5 fra det naturlige t-PA ikke forekommer. Nogle sådanne t-PA-mutanter er beskrevet i litteraturen, navnlig i de ovenfor nævnte patetansøgninger, især i EP-A 199.574 og DE-A 3708681.

Som foretrukne protein-produktionsforøgende 10 stoffer kommer thioglycolsyre, nonactinsyre, smørsyre og propionsyre i betragtning.

De proteinproduktionsforøgende stoffer er han-delsproduktér eller fra litteraturen kendte produkter, eller de kan fremstilles ved kendte metoder.

15 Forbindelserne butyrylcholinbromider og -chlori- der er handelsprodukter og kan f.eks. erhverves fra firmaet Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.

Nonactinsyre og fremgangsmåde til dens fremstilling er f.eks. beskrevet i Helv. Chim. Acta, bind XLV 20 (1962), nr. 15-16, side 129-138; Tetrahedron, bind 36, nr. 1, side 46-49, og J. Org. Chem., 1980, 45, side 4259-4260.

Forskellige publikationer beskriver furanfedtsy-rer, f.eks. Lipids, 1977, 12(10), 828-836, J. Chem.

25 Soc. Chem. Commun., 1976, (16), side 630-631, Lipids, 1975, 10(11), side 695-702, og Fette, Seifen, Anstrich-mittel, nr. 8, 1986, side 290-292.

Anvendelige syrer af denne type kan også fremstilles ved omsætning ifølge nedenstående reaktions-30 skema: I DK 175411 B1 I 8 \

Baa) I

B CH- CH- CH- CK, I - \ / 3·

I K^Cr.jJj^C * er«S(CH2)n- TOA -» CtyCH^^J^CK^-WA

B 5 1 2 3 I “ CH3 CK5

I hydrolysering ^ CH- (CH2)a^_^-(CH2)n-COOH I

I 10 2 ^ I

B hvori m = 2 til 5, fortrinsvis 4, n = 7 til 12, for- I

B trinsvis 8 eller 10, og I

I b > CH- CH- I

I 20 ^_/ I

I k \\ . Hydrolyser ing I

CK5(CH2)c<^>-Li + Br(CH2)nVCA-> 1 --:-> k I

I 6 I

I 25 Fremstillingen af forbindelserne 2 og 6 er beskrevet i I

I Voss et al., Helv. Chim, Acta, 1983, 66, 2294. I

Fortrinsvis er m 4 og n 8 eller 10. I

Forbindelsen 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2- I

30 on kan fremstilles ved fremgangsmåder ifølge den kendte I

teknik. Den er også et naturstof og kan isoleres fra I

Capiscum annuns var angulosum, som beskrevet i C.A.97: I

159552f og Eiyo to Shokuryo 1982, 35(2) 95-101. Denne I

9 DK 175411 B1 forbindelse er ligeledes beskrevet i afhandlingen "Neue SekundSrstoffe aus Streptomycesten: Isolierung und

StrukturaufklSrung der Colabomycine, Pyrrolame und des Pyridazomycins" af Grote, R., Universitet Gdttingen, 5 1987, tillige med dens fremstilling ved dyrkning af Streptomyces olivaceus (stamme TCI 3082, deponeret hos Deutsche Sammlung fQr Mikroorganismen den 23. november 1987 i henhold til Budapesttraktaten under løbenummer 4309) og isolering. Den har følgende NMR-spektrum: 10 CjH1602 (156,23) EI-MSi m/e s 138 (M^HjO, .højopløsning, C9H^4®» 6%); 123 (M+-CH50, 8%); 98 (højopløsning, CAH,n0, 48«); 83 (100%) XH-NMR (200 MHz, CDC13) : 6 = 1,27 (s, 7-H^ .^g 8-H3)? 1,43 (s; bred;* HO, udveksler med MeODf; 2,21 (s, l'Hj); 2,35 (d· J ° 1,3 Hz, 9*Hj) j 20 2,32 (s, bred S-H^) ? 6,13 (s, bred, 3-H) ppm 13C-NMR (50,3 MHz, CDC13) : ^ 22,0 (o, C-9); 30,0 (o, 2C, C-7 og C-8); 32,0 (O, C-l); 54,4 (u, C-5) ? 71,1 (u, C-6)j 127,2 (o, C-3); 155,1 (u, C-4); 25 198, 6 (u, C-2) ppm,·

Som salte af de nævnte syrer kan der navnlig være tale om salte af alkalimetaller, fortrinsvis natrium- og kaliumsalte.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemfø-30 res i serumholdigt eller fortrinsvis serumfrit medium.

Når fremgangsmåden gennemføres i serumholdigt medium, foretrækkes anvendelsen af f.eks. thioglycol-syre, nonactinsyre eller furanfedtsyre eller salte deraf.

I DK 175411 B1 I 10 H Hvis fremgangsmåden gennemføres i serumfrit me- dium, anvendes fortrinsvis en aliphatisk (C3-C5)mono- carboxylsyre, navnlig smørsyre eller propionsyre, eller salte deraf.

5 Det har vist sig, at den proteinproduktions- forøgende forbindelse udviser sin aktivitet ved koncen- I trationer på 10 yM til 500 mM, f.eks. 1 mM til 10 mM.

Den aliphatiske (C3“C5)monocarboxylsyre, thioglycol- syre, thioglycolsyre, L-cystein og glutathion eller de- 10 res salte er navnlig aktive ved 1 mM til 10 mM.

De proteinproduktions-forøgende stoffer kan sæt- tes til dyrkningen på passende dage, f.eks. på dag 0, dvs. ved dyrkningens begyndelse, og indtil afslutningen af den tredie dyrkningsdag.

15 Det proteinproduktions-forøgende stof kan også anvendes ved flere tilsætninger. Det er således muligt at dyrke cellerne i nærværelse af et stof, fjerne cel- lerne fra kulturen, derefter sætte dem til nyt dyrk- ningsmedium og dyrke i nærværelse af et proteinproduk- H 20 tions-forøgende stof. Ved denne flergangs-tilsætning viser navnlig aliphatiske {C3-C5Jmonocarboxylsyrer el- ler deres salte, fortrinsvis smørsyre og thioglycolsyre eller deres salte, en stigningseffekt.

Ved flergangs-tilsætning er det ikke nødvendigt, 25 at der til alle tilsætninger anvendes det samme stof, I men der kan anvendes ét af stofferne ved den ene til- H sætning og et andet ved en senere tilsætning. Denne I flergangs-tilsætning viser ligeledes en stigningsef- I fekt, såsom navnlig anvendelse af aphidicolin ved den I 30 ene tilsætning og et af de andre stoffer, f.eks. smør- syre, propionsyre, butyrylcholinchlorid eller butyry1- cholinbromid eller salte deraf, ved en senere tilsæt- ning.

11 DK 175411 B1

Der kan også anvendes kombinationer af to eller flere stoffer. Det foretrækkes ikke at anvende mere end ét stof, der hæmmer cellevæksten. Der kan for eksempel anvendes en aliphatisk (C3-C5)monocarboxylsyre, for-5 trinsvis smørsyre eller thioglycolsyre, eller salte deraf, hvorhos monocarboxylsyren eller dens salt fortrinsvis sættes til cellekulturen som 2. stof.

Transformerede kinesisk-hamster-ovarieceller betyder CHO-celler, der er transformeret med en for et 10 ønsket protein kodende vektor, hvorved de under dyrkning syntetiserer og eksprimerer proteinet.

Som transformerede kinesisk-hamster-ovarieceller kan der f.eks. anvendes de i de europæiske patentansøgninger 0093619 og 0199574 og i tysk patentansøgning 15 3708681 beskrevne celler. Ved dyrkning af disse transformerede CHO-celler kan der fremstilles rt-PA (EP-A 0093619) og visse rt-PA-mutanter (EP-A 0199574 og DE-A 3708681). Transformationen af CHO-celler med vektorer, hvorved cellerne vil eksprimere andre proteiner, fore-20 går ved fra litteraturen kendt teknik, som f.eks. beskrevet i de ovennævnte europæiske og tyske patentansøgninger.

Som værtscelle kan der anvendes den med kendingsbetegnelsen CHO-Kl-celle, der blev isoleret i 1957 25 af Puck fra biopsi-materiale og i 1970 blev optaget i American Type Culture Collection (ATCC) under betegnelsen» CCL-61. Denne cellelinie er af ATCC påny deponeret 23. december 1987 i henhold til Budapesttraktaten under løbenummer CRL 9618.

30 Den for ønskede protein kodende DNA-sekvens kan fremstilles ved den fra litteraturen allerede kendte teknik, f.eks. som beskrevet i de ovennævnte patentansøgninger. Vektorer, der udviser denne sekvens og I DK 175411 B1

I 12 I

I også styrende sekvenser, kan konstrueres ved i og for I

I sig kendte metoder, f.eks. under anvendelse af E. coll I

I K 12294 (ATCC 31446) og E. Coll X 1776 (ATCC 31537), I

I der af ATCC den 23. december 1987 påny er deponeret i I

I 5 henhold til Budapesttraktaten under løbenumrene 53704 I

I og 53705, såsom plasmiderne pETPER og pETPFR, der er I

I beskrevet i europæisk patentpublikation EP-A 093619. I

I CHO-Cellerne kan transformeres ved de fra patent publi- I

I kationerne EP-A 093619, DE-A 3708681, EP-A 0117059 og I

I 10 EP-A 199574 kendte metoder og andre fra litteraturen I

kendte metoder. I

I Vektoren for rt-PA-produktionen blev integreret I

I i en subklon, CH0-K1-DUX Bil (Urlaub et al., Proceed- I

I ings of the National Academy of Science, USA, 77: I

15 4216-4220, 1980). Denne cellelinie, en dehydrofolat- I

reduktasenegativ mutant (DHFR-), er egnet til en DHFR- I

afhængig selektion af transformerede cellekloner. I

H Vektoren for det humane c-DNA kan være en kendt plas- I

I midvektor pBR322 eller dennes efterkommer fra Escheri- I

20 chia coli. Promotorregionen for det i betragtning kom- I

I mende gen og for DHFR-genet stammer fra SV 40 og termi- I

I nationsregionen for begge gener fra et hepatitis B- I

overfladeantigen. I eksemplerné er anvendt CH0-K1-DUX I

I Bil-celler, der er transformeret med plasmiderne pETPER I

25 eller pEPEFR (se europæisk patentpublikation EP-A I

I 0117059). I

I Som serumfrit medium står forskellige kendte I

produkter til rådighed (se f.eks. BMFT-Statusseminar I

I 12, 13. november 1985, Bundesministerium fCir Forschung I

I ^ und Technologie, 5300 Bonn 2, side 111-120). I det føl- I

I gende eksempel er anvendt et efterdissekeret DMEM/Ham's I

I F 12-medium (1:1) (Gibco) som serumfrit medium. Som I

I tilsætning er anvendt foetalt kalveserum (FKS) i en I

koncentration på 7,5% eller 1-2%. I

13 DK 175411 B1

Cellekulturerne inkuberes ved 37°C i et Hereaus-rugeskab og beluftes med en carbondioxid-luftblanding med 7,5% C02 i en relativ luftfugtighed på 100%. Alt efter fremgangsmådemængden anvendes forskellige kultur-5 beholdere: Rotationsbeholdere for 100-1000 ml medium, Roux-skåle (Nunc) 175 cm2 (70-100 ml medium), 75 cm2 (30-50 ml medium), 25 cm2 (7-10 ml medium) og fler-gangs-kulturskåle fra Costar med 2 cm2 til kulturer på 1 ml. Til stammebevaring bliver cellerne anvendt i en 10 tæthed på 0,2-0,3 x 106 celler/ml og subklonet hver 2-3 dage.

De produktions-stimulerende stoffer kan tilsættes på forskellige tidspunkter i en 1:100 fortynding, dvs. de opløses først i medium eller, når de er tungtopløse-15 lige, først i ethanol og sættes derefter til medium, hvorefter mediet indeholdende dette stof sættes til det celleholdige medium i forholdet 1:100 vol/vol.

I de følgende eksempler blev celler, med henblik på at fremkalde stimulering af rt-PA-syntesen, udtaget 20 fra en eksponentielt voksende kultur og fracentrifugeret i formstofrør (Falcon) 10 minutter ved lOOOxg i en Beckmann T 3-6-centrifuge. Efter dekantering af super-natanten blev cellepelleten gensuspenderet med frisk medium.

25 Til produktion af t-PA i serumholdigt medium anvendtes som frisk medium F12/DMEM + 7,5% FKS + gentamycin. Den resulterende suspension kan tages i brug i 2 cm2, 24 rums-plader ved en celletæthed på 0,2-0,3 x 106 celler/ml.

30 Til produktionen af rt-PA i serumfrit medium blev cellerne forud tilpasset 3-4 dage i et medium af 1-2% FKS, igen fracentrifugeret, og cellepelleten blev gensuspenderet i serumfrit medium og derefter overført til I DK 175411 B1

I 14 I

2 cm2, 24 rums-plader i en celletæthed på 0,4-0,5 x ίο6 I

I celler/ml. I

I Kvantitativ t-PA-bestemmelse I

I 5 Aliquoter af celle-supernatanter og celle- I

I ekstrakter blev udtaget eller fremstillet på forskelli- I

I ge tidspunkter. Målingen af prøverne foregik enten I

I straks eller efter opbevaring ved -20“C ved følgende I

I metoder: I

I 10 I

Bestemmelsesmetode I

I 1) Direkte chromogen bestemmelse (DCA) I

I Af det syntetiske peptidsubstrat S-2288 (D-H-Ile- I

I Pro-Arg-p-nitroanilin) fra firmaet Kabl Diagnostica I

I 15 dannes ved hjælp af t-PA'et p-nitroanilin som I

reaktionsprodukt. Aktiviteten af t-PA er proportional I

I med dannelsen af p-nitroanilin, der måles ved 405 mn, I

I 37°C. I

I Den spektrofotometriske bestemmelse af enzymkine- I

I 20 tikken gennemførtes automatisk med et ACP-5010-analyse- I

I apparat fra firmaet Eppendorf. I

I Aktiviteten af enzymet blev beregnet ved hjælp af I

denne forud givne standard. En t-PA-standardrække på I

I 1-15 pg/ml blev fremstillet med en laboratoriestandard, . I

I 25 der for 72%'s vedkommende består af l-kædet materiale. I

Substratopløsriingen (100 mM Tris/106 mM NaCl) I

I blev anvendt i en koncentration på 50 mM. I

I 2-ELISA I

Ved hjælp af en ELISA ("Enzyme-linked-immuno- I

I 30 sorbent-assay") blev t-PA-prøverne fra supernatanten og I

I fra cellekestrakten bestemt kvantitativt. Som standard I

I tjente en laboratoriestandard i en koncentrationsrække I

på 0,038-5 pg/ml. Prøverne blev fortyndet 1:10 til I

I 1:1000. I

15 DK 175411 B1

Karakterisering af de transformerede CHO-celler Cellevækst CHO-Cellerne podes med 0,2-0,3 x 106 celler/ml i 5 kulturskåle (i medium med 7,5% FKS) og formerer sig til at begynde med meget langsomt. Først efter en lag-fase på 24 timer begynder den logaritmiske cellevækst. Ved en celletæthed på 1,3—0,04 x 106 celler/ml indtræder på dag 4 de første ikke-vitale celler i kulturen. Deres 10 andel i det totale celletal andrager 13,2il,3%. Den maksimale celletæthed nås på dag 5 med 1,8±Ό,05 x 106 celler/ml (fig. l).

Antallet af levende celler udgør efter 7 dage endnu 72i3% af den totale cellemasse.

15

Den stationære fase, der er ansluttet den eksponentielle cellevækst, indledes af forskellige faktorer.

Ved en høj populationstæthed og forbrug af essentielle næringsstoffer deler cellerne sig ikke yderligere. Varigheden af den stationære fase varierer stærkt og er 20 afhængig af mediekomponenter, såsom serum. En ophobning af syrer og toxiske stofskifteprodukter samt ændringer af miljøfaktorer (surt pH, lavere 02-partialtryk, manglende gennemluftning) betinger ligeledes cellernes død.

25 rt-PA-Produktion 1 CHO-celler

Mellem cellevækst og rt-PA-syntese består en lineær afhængighed.

Tidsforløbet af rt-PA-produktionen viser 2 faser.

30 i fase 1 stiger rt-PA-koncentrationen i supernatanten til stadighed. I fase 2 indtræder der praktisk taget I DK 175411 B1

I 16 I

I stilstand i enzymsyntesen, og rt-PA-koncentrationen i I

I mediet forbliver på det nærmeste konstant (fig. 2A). I

I Den maksimale rt-PA-koncentration på dag 4 andrager I

I 11,lio,7 yg/ml ved Elisa. De målte rt-PA-koncentra- I

I 5 tioner ligger ved den chromogene bestemmelse noget hø- I

jere, hvilket formodentligt skyldes 2-kædet rt-PA; I

I med Elisa-metoden forløber kurverne imidlertid paral- I

I lelt med begge bestemmelsesmetoder op til dag 4. I

I Den intracellulære rt-PA-koncentration forløber I

I 10 ligeledes parallelt med cellevæksten og er relativt I

ringe beregnet på den totale syntetiserede rt-PA-mæng- I

I de. På dag 4 andrager dens andel 7% af den totale akti- I

I vitet (fig. 2B). I

I Som vist i fig. 3A stiger rt-PA-syntesen, baseret I

I 15 på celletallet, op til dag 4 let. ved Elisa-metoden be- I

stemmes et maksimum på 8,lil,2 yg t-PA/1 x 106 celler. I

I Cellulært bundet rt-PA blev kun bestemt ved Elisa-me- I

I toden, da disse små rt-PA-koncentrationer (<1 yg) ikke I

I kan bestemmes ved DCA. I

I 20 Det intracellulære rt-PA-indhold, baseret på cel- I

I letallet, er under cellevækstens log-fase noget højere I

og ligger mellem 500 og 900 ng t-PA/1 x 106 celler, og I

I fra dag 4 ligger rt-PA-værdien ved ca. 450 ng/l x ΙΟ6 I

I celler (flg. 3B). I

I 25 I

I Indvirkning af serum og serumfaktorer i mediet på celle- I

I væksten og rt-PA-produktionen 1 CHO-celler I

I Cellerne blev startet med 0,25 x 106 celler/ml og I

I forskellige serumkoncentrationer. I

I 30 En serumkoncentration under 5% i mediet har nega- I

I tiv Indvirkning på celledelingen, hvorimod produktiv!- I

teten kun påvirkes lidt. I

I Indvirkningen af serumkoncentrationen i mediet på I

I cellevæksten og rt-PA-produktionen efter 48 timers in- I

17 DK 175411 B1 kubation af cellerne er vist i tabel I. værdierne er angivet i % af den maksimale værdi (7,5% FKS i mediet). Maksimumværdien for celletallet ligger ved 0,56±0,03 x 106 celler og for rt-PA-koncentrationen 5,7±0,5 5 pg/ml. rt-PA-Bestemmelserne gennemførtes ved DCA (middelværdi i SE, n=4).

_Tabel I_ % FKS_Celletal_t-PA_ 10 40 61,5 + 2,8 59,2 + 3,9 20 79,4 + 3,8 81,2 + 2,4 10 88,6 + 5,3 90,3 + 6,7 7,5 100,0 + 6,4 100,0 + 7,9 15 5 72,4 + 4,9 87,0 + 11,3 1 43,1 + 1,5 79,2 + 6,7 0 37,5 + 1,8 75,4 + 4,6 20 Cellekultur i serumfrit medium

Cellerne blev startet i serumfrit medium i en celletæthed på 0,4-0,5 x 106 celler/ml. Cellerne deler sig op til dag 4, og det højeste antal levende celler nås ligeledes på dag 4 med 1,0±0,2 x lo6 celler/ml 25 (fig. 4).

rt-PA-Produktion 1 serumfrit medium rt-PA-Koncentrationen i supernatanten stiger til stadighed op til dag 7 og når ved Elisa-metoden et mak-30 simum på 13,6—0,54 yg/ml. De ved DCA opnåede t-PA-vær-dier ligger på dag 1-3 under og fra dag 4 over de t-PA-værdier, der blev bestemt ved Elisa (fig. 5).

rt-PA-Syntesen pr. celle er i serumfrit medium omtrent lige så høj som i medium med serum og ligger I DK 175411 B1 I 18 I mellem 7,213,6 og 10,312,8 yg/1 x 105 celler (Elisa) I (fig· 6).

Den procentuelle andel af rt-PA i serumfrit medium af den totale proteinmængde i supernatanten ligger mel- .

5 lem 10,911,0 og 12,511,4%. Resultaterne er vist i Tabel II. t-PA-Værdierne er vist i Tabel II. t-PA-værdierne blev bestemt ved Elisa (middelværdiiSE, n=4).

I _Tabel II_ 10 Dag Protein yg/lxlO6 celler t-PA yg/lxlO** celler I 1 71,0 + 8,0 7,2 +3,6 3 81,8 + 9,4 9,0 + 2,3 I 5 82,0 + 12,2 9,3+0,8 15 ___

Effekt af aliphatiske monocarboxylsyrer

Stigning i rt-PA-produktionen i CHO-cellerne i 20 medium med 7,5% FKS ved hjælp af forskellige aliphati- ske monocarboxylsyrer er vist i tabel III. Alle syrer blev anvendt i et koncentrationsområde fra 10 mM til 500 mM. Det optimale dosisområde for alle monocarboxyl- syrer ligger mellem 1 og 10 mM. Syrernes aktivitet er 25 afhængig af kædelængden.

Alle virksomme monocarboxylsyrer hæmmer celle- I væksten. Propion-, smør-, isosmør- og isovalerianesyre I er virksomme i et større koncentrationsområde, da den I koncentrations-afhængige inhibition af primærstofskif- 30 tet, der fører til hæmning af cellevæksten, overlejrer sig med stigningen i t-PA-syntesen.

Værdierne i tabel III angår 1 ml cellesuperna- I tant og er angivet i % sammenlignet med kontrollen 19 DK 175411 B1 (0%). t-PA-Bestemmelsen foregik ved DCA (middelværdi ±SE, n * 3-24). Den maksimale værdi angår en enkeltprøve. Data for de enkelte prøver er vist i parentes.

5 _Tabel III_

Monocarboxylsyre Optimalt % Stigning i dosisområde rt-PA-syntese _Maksimum Gennemsnit

Myresyre 100 μΜ 7#4 6,5+0,9 10 Propionsyre 5-10 mM (10 mM) 45,5 28,0 + 2,5

Smørsyre 1-5 mM ( 1 mM) 68,3 41,9 + 3,8

Isosmør- 0,6-10 mM (10 mM) 32,9 16.6 + 2,8 sy Γ6 ^ 15 Gennemsnitsværdierne angår flere produktionsfor løb på 3 til 4 dage, hvorhos monocarboxylsyrerne blev tilsat på dag 0 til dag 3 af dyrkningen, som vist i nedenstående tabel IIIA. Data for de enkelte prøver er vist i parentes.

20 ___Tabel IIIA_

Monocarboxylsyre_Tilsætnlnqsdaq Prøvedag n

Myresyre 10 (0) 2-3 (2) 4

Propionsyre (2) 1-4 (3) 24 25 Smørsyre 1 (3) 2-4 (3) 18

Isosmersyre_°~2 (3)_2-4 (3) χχ n « Antal produktionsforløb I fig. 7 er vist det tidsmæssige forløb af rt-30 PA-produktionsstigningen i medium med 7,5% FKS ved hjælp af (C3-C5)monocarboxylsyrer. Efter 24 timer kan der allerede påvises en stimulering af rt-PA-produktio-nen på 18,1 ± 5,7% (C4) til 24,8 ± 0,5% (C5). Ved iso- I DK 175411 B1 I 20

I smørsyre viste en produktionsstigning sig først efter I

48 timer. En maksimal stigning i rt-PA-produktionen I

B blev for C3- og C4-carboxylsyrerne nået på dag 3, med I 37,2 ± 5,1% for Na-butyrat. Produktionsstigningen er B 5 for smør- og isosmørsyre kun kortvarig, · idet der på dag 4 ikke længere kan observeres en effekt. Den forøgede virkning af propionsyre og isovalerianesyre er derimod I stadig til stede på dag 4 og manifesterer sig i en · B stigning i t-PA-produktionen på 31,8% for C3 og 8,5% B 10 for C5.

B Effekterne er endvidere afhængige af den fysio- B logiske tilstand af cellerne. Under den eksponentielle B vækst er cellerne mest følsomme for en stimulering.

B I tabel iv er vist stigningen i rt-PA-produktion B 15 i CHO-celler i medium med 7,5% FKS ved hjælp af (C3- B C5)-monocarboxylsyrer i afhængighed af tilsætningsdag B for carboxylsyrerne efter 48 timers vækst af cellerne i

B medium med 7,5% FKS. Koncentrationen var for smørsyre I

B og isosmørsyre l mM og for proionsyre og isovaleriane- B 20 syre 5 mM. Værdierne angår 1 ml cellesupernatant og er

B angivet i % sammenlignet med kontrollen (0%) (middel- I

B værdi ± SE, n « 3-5). t-PA-Bestemmelsen gennemførtes

B ved DCA. I

fl 25 ____Tabel IV_

fl Tilsæt- I

B ninqsdaq C3_C4_C4-I_ I

I 0 28,7 + 9,3 33,0 + 5,4 20,1 + 10,7 I 1 24,4 + 4,1 40,2 + 12,2 25,3 + 5,1 30 __^_ 21 DK 175411 B1

Effekt af smørsyre på rt-PA-oroduktionen 1 CHO-celler

Stimuleringseffekten skal følges ved stigning både i intracellulær rt-PA-koncentration og i ekstra-5 cellulær rt-PA-koncentration.

Som det fremgår af fig. 8, er stigningen i det intracellulære t-PA-indhold i butyrat-behandlede kulturer størst efter 24 timers inkubation sammenlignet med kontrollen (43,8 ± 9,8%). I supernatanten falder 10 den procentuelle stigning efter 24 timer noget ringere ud med gennemsnitligt 19,2% (DCA og Elisa) sammenlignet med kontrolværdierne. Denne effekt holder sig 72 timer i supernatanten.

I fig. 9A-C er vist rt-PA-syntesen, baseret på 15 celletallet, og de viser, at stimuleringen af t-PA-syn-tesen ved hjælp af Na-butyrat holder sig over 7 dage trods hæmningen af cellevæksten, under de første 4 dage tiltager enzymsyntesen pr. celle til stadighed. rt-PA-Koncentrationen stiger fra 7,5 ± 1,1 yg til 28,9 ± 5,3 20 pg t-PA/l x 106 celler (Elisa) i supernatanten (fig.

8A). Ved DCA-metoden bestemmes et maksimalt rt-PA-indhold på 47,4 ± 7,4 pg t-PA/l x 106 celler (fig. 9B). Samtidigt aftager det intracellulære rt-PA-indhold og falder fra 1,5 ± 0,2 pg t-PA/l x 106 celler på dag 5 25 (fig. 9C).

I tabel V er vist stimuleringen af t-PA-syntesen ved hjælp af Na-butyrat i medium med 7,5% FKS baseret på celletallet. Na-Butyrat blev tilsat på dag 0 i en koncentration på 1 mM. Værdierne på dagene 1-4 er angi-30 vet i % af kontrollen (0%) og angår 1 x 106 celler. rt-PA-Indholdet i supernatanten og i celleekstrakten blev bestemt ved Elisa (middelværdi ± SE, n = 5-10).

I DK 175411 B1 I 22

I _____ Tabel V_ I

I Dag__Intracellulært_Ekstracellulært I

I 1 ’ 90,9 + 9,5 68,5 + 12,4 I

I 2 99,7+26,3 118,8+16,1

I 5 3 93,9 + 31,4 223,4 + 77,4 I

I 4 209,8 + 41,4 280,7 + 85,9 I

I En optimal produktionsstigning blev opnået, når I

Na-butyrat blev tilsat under den eksponentielle vækst I

I af cellerne. Den maksimale effekt af Na-butyrat optræ- I

der, ved et appikationstidsrum fra dag 0 til 2, stadig I

I på dag 3 (fig. 10). I

I ved en tilsætning af Na-butyrat hver 2-3 dage I

I efter mediumudveksling i samme cellepopulation kunne I

I rt-PA-produktionen holdes Isengere tid på et højere ni- I

I veau. I

I I tabel VI er vist stigningen i rt-PA-produktion I

I i CHO-celler, der blev dyrket i medium med 7,5 FKS. 1 I

I 20 mM Na-Butyrat blev tilsat henholdsvis ved hver medium- I

I udveksling eller kun på dag 0. Værdierne på henholdsvis I

I dag 2, 4, 7 og 9 efter mediumudveksling er angivet i % I

I af kontrol (0%) og angår 1 ml cellesupernatant. t-PA- I

I Bestemmelsen blev gennemført ved DCA (middelværdi ± SE, I

I 25 n = 3). I

23 DK 175411 B1 _Tabel VI_

Mediumudveksling Tilsætning _Dag_Dag O, 2, 4, 7 2 33,0 + 5,4 5 4 107,4 + 7,6 7 96,6+5,8 9 62,0+4,8 10 Effekt af smørsyre på rt-PA-produktionen 1 CHO-celler 1 serumfrit medium I modsætning til korttidseffekten af den buty-rat-stimulerede rt-PA-syntese i serumholdigt medium va-15 rer effekten i serumfrit medium længere og andrager l dag efter tilsætning af Na-butyrat 44,1 ± 7,1% sammenlignet med kontrollen. En maksimal stigning blev nået 3 dage efter tilsætning af Na-butyrat med 143,3 ± 12,8%. Stigningseffekten er endnu påviselig 6 dage efter Na-20 butyrat-tilsætning med 49,9 ± 7,0% (fig. 11 og 12).

rt-PA-Syntesen, baseret på 1 x 106 celler, er i serumfrit medium ligeledes højere end i serumholdigt medium og stiger til over 50 pg/l x 106 celler (fig.

13).

25

Effekt af propionsyre C3-Carboxylsyren viser effekter på rt-PA-synte-sen meget lignende smørsyrens. Den pocentuelle stigning 30 ligger imidlertid ca. 14% lavere, og for rt-PA-stimule-ringen er højere koncentrationer nødvendige (5-10 mM). Endvidere hæmmer proionsyre i ringe grad cellevæksten og fører derfor til en længere varende stigning i rt-PA-syntesen.

I DK 175411 B1 I 24

En stimulering af rt-PA-syntesen ved hjælp af I propionsyre synes, i modsætning til smørsyre, at være I meget specifik, da i serumfrit medium det ekstracellu- 5 lære proteinindhold sammenlignet med kontrollen kun blev forøget lidt, og indbygningen af [3H]-leucin kun blev forøget lidt.

I Effekter af ascorsinsyre virkningen af ascorbinsyrer ved 10 mM på rt-PA- produktionen varer 72 timer og viser ved en tilsætning på dag 0 en 15,2 ± 3,1% stigning af t-PA-syntesen efter 24 timer (fig. 14).

Effekter af lanqkædede fedtsyrer på rt-PA-produktionen I af CHO-celler

Det viste sig, at også langkædede fedtsyrer, så- I 2050^ nonactinsyre med 10 Oatomer og furanfedtsyrer, kunne fremkalde en stigning (tabel VII). I dette eks- empel blev der anvendt en furanfedtsyre med formlen IV, hvor m * 4 og n = 8.

I I serumfrit medium kunne der imidlertid ikke på- I 25 vises nogen stigning af rt-PA-syntesen eller af pro- I teinsyntesen.

I Stigningen i rt-PA-produktionen i CHO-celler ved I hjælp af langkædede fedtsyrer er vist i tabel VII.

I Celllerne blev dyrket i medium med 7,5% FKS. Syrerne I 30 blev testet i et koncentrationsområde fra 10 pM til 10 I mM, hvorhos en koncentration på 1 mM var optimal. Vær- I dierne angår 1 ml cellesupernatant og er angivet i % I sammenlignet med kontrollen (0%) (middelværdi ± SE, n = 4-9). Den maksimale værdi angår en enkeltprøve.

25 DK 175411 B1 rt-PA-Bestemmelsen foregik ved DCA.

_ Tabel VII_

Fedtsyre % Stigning i 5 rt-PA-syntese _Maksimum_Gennemsnit

Nonactinsyre 58,3 30,3 +6,5

Furanfedtsyre_± 3,2 10 Gennemsnitsværdierne angår flere produktions forløb på 4 dage, hvorhos syrerne blev tilsat på dag 0, som vist 1 tabel VIIA. Data for enkeltprøverne er angivet i parentes.

15 _Tabel VIIA__

Fedtsyrer_Tilsætningsdag Prøvedag_n

Nonactinsyre 0 (0) 1-4 (2) 4

Furanfedtsyre_0 (0)_(2)_9_ 20 Effekter af thloler og sulfider på rt-PA-produktlonen i CHO-celler

Fire svovlholdige forbindelser, der var derivater eller substitutionsprodukter af carboxylsyrer, vist 25 en stigning i rt-PA-produktionen mellem 16% og 31,2%, uden at påvirke cellevæksten negativt (tabel VIII). De substituerede carboxylsyrer viste deres optimale virkning i samme koncentrationsområde (1-10 mM) som de andre virksomme carboxylsyrer. Kun glutathion var effek- 30 tivt i et lavere koncentrationsområde på 1-10 yM. Thio-glycolsyre viste sig som foretrukket stimulator af t-PA-syntesen i CHO-celler.

I dette eksempel blev cellerne dyrket i medium med 7,5% FKS. Alle stoffer blev testet i et koncentra-

I DK 175411 B1 I

I 26 I

I tionsområde fra 1 μΜ til 10 mM. Værdierne i tabel VIII I

I angår 1 ml cellesupernatant og er angivet i % sammen- I

I lignet med kontrollen (0%) (middelværdi ± SB, η = I

I 6-19). I

I 5 Den maksimale værdi angår en enkeltprøve. t-PA- I

I Bestemmelsen foregik ved DCA. Koncentrationen af stof- I

I fet er angivet i parentes. I

_Tabel VIII I

I 10 Thioler og Optimalt % Stigning i I

I sulfider dosisområde rt-PA-syntese I

_Maksimum Gennemsnit I

I Thioglycolsyre lmM 66,4 31,2+3,2 I

I Thiodlglycolsyre 1 31'° 18,0+3,8 I

I 15 L-Cystein 1~10 inM ( ImM) 41,4 20,9 + 3,4 I

I Glutathlon_1-10 μΜ (10μΜ)_30,6 16,0 + 2,0 I

I Gennemsnitsværdierne angår flere produktionsfor- I

løb på 3 dage, hvorhos stofferne blev tilsat på dag 0 I

I 20 til dag 2, som vist i tabel VIIIA. Data for de enkelte I

prøver er vist i parantes. I

I Tabel VIIIA_

I Fedtsyrer_Tllsætnlnqsdaq_Prøvedag η I

I 25 Thioglycolsyre 0-2 (1) 1-3 (2) 19 I

I Thiodlglycolsyre 1 (1) 2-3 (3) 9 I

I L-Cystein 0-1 (0) 1-3 (2) 11 I Glutathion_0 (0)_2-3 (2)_6 I 30 Fordelene ved thiocarboxylsyrer sammenlignet med monocarboxylsyrer er manglen på en inhibitorisk effekt på celleformeringen, men produktionen af t-PA med disse stoffer kunne ikke hæves mere end med smørsyre. Varig- 27 DK 175411 B1 heden af stigningseffekten er lige så kort og når maksimumværdien efter 24 timer for thioglycolsyre og efter 48 timer for cystein. Efter 4 dages inkubation af cellerne er effekten på rt-PA-produktionen stadig kun rin-5 ge (fig. 15).

I serumfrit medium er den stimulerende virkning på rt-PA-syntesen imidlertid ringere end i medium med serum, da alle stoffer hæmmer celledelingen mellem 10 og 20%.

10 Effekter af thioglycolsyre rt-PA-Produktionen er efter thloglycolsyre-behandlingen forhøjet 72 timer og er uafhængig af tilsætningsdagen. Den procentuelle stigning af enzymsyntesen er imidlertid på det højeste efter 24 timer og 15 falder derefter kontinuerligt.

I tabel IX er stigningen i rt-PA-produktionen i CHO-celler, der blev dyrket 24-96 timer i medium med 7,5% FKS og 1 mM thioglycolsyre, vist i afhængighed af tilsætningsdagen. Værdierne angår 1 ml cellesupernatant 20 0g er angivet i % sammenlignet med kontrollen (0%) (middelværdi + SE, n=4-6). t-PA-Bestemmelsen foregik ved DCA.

_Tabel IX_ 25 Tid (timer)_Tilsætningsdag_ _0_1_2_ 24 27,6 + 5,6 34,7 + 10,9 34,5 + 7,5 48 16,9 + 2,3 17,1+ 3,6 16,3 + 8,6 72 14,7+1,0 10,2+2,7 9,4+1,7 30 96_3,4 + 3,0_2,7 + 0,8_0,5 + 1,0 rt-PA-Produktionen kan ved to ganges tilsætning af thioglycolsyre forøges sammenlignet med en enkelt tilsætning (fig. 16).

I DK 175411 B1 I 28 I fig. 17A (DCA) og fig. 17B (Elisa) er vist forløbet af rt-PA-sybtesen baseret på i x io6 celler.

rt-PA-Syntesen er ved hjælp af 1 mM thioglycolsyre for- H øget de første 3 dage (DCA) sammenlignet med kontrol- 5 len. De ved Elisa opnåede rt-PA-værdier forbliver der- H imod forhøjede over hele tidsrummet. Stigningsraten an- drager på dag 4 endnu ca. 35%. Det intracellulære rt-PA-indhold pr. celle forøges ligeledes med thiogly- colsyre. Den maksimale intracellulære rt-PA-koncentra- 10 tion andrager 1,1±0,1 pg/l x 106 celler efter 24 timer og falder i løbet af 96 timer omtrent til det halve af den oprindelige koncentration (fig. 17C).

Den ekstracellulære rt-PA-koncentration er på I dag 5 steget 10,7% sammenlignet med kontrollen. Den 15 procentuelle stigning af rt-PA-syntesen ved hjælp af thioglycolsyre er i serumfrit medium noget mindre, da celledelingen hæmmes lidt (10-20%).

I Effekter 20 af derivater af monocarboxylsyrer på rt-PA-produktio- nen i CHO-celler I gruppen af C4- carboxylsyrederivater fandtes yderligere stoffer, der viser en virkning på rt-PA-syn- tesen i CHO-celler. Til disse stoffer hører i første 25 række butyrylcholinbromid (BCB) og -chlorid (BCC), der H hæver rt-PA-produktionen mellem 30 og 40%. Disse C4-de- rivater viser i enhver henseende de samme effekter som I Na-butyrat og er aktive i samme koncentrationsområde.

I I tabel X er vist stigningen i rt-PA-produktio- I

30 nen i CHO-celler ved hjælp af to af de ovennævnte deri- I vater af monocarboxylsyrer. Cellerne blev dyrket i me- I dium med 7,5% FKS. Alle stoffer blev testet i et kon- centrationsområde fra 10 μΜ til 10 mM. værdierne er an- 29 DK 175411 B1 givet i % sammenlignet med kontrollen (0%) og angår 1 ml cellesupernatant (middelværdi £ SE, n-4-15). Værdierne, der angår enkeltprøver, er anført i parentes.

Den maksimale værdi angår en enkeltprøve. rt-PA-Bestem-5 melsen foregik ved DCA.

_Tabel x_

Derivat af Optimalt % Stigning i

Monocarboxylsyre dosisområde rt-PA-syntese 10 _Maksimum Gennemsnit n BCC 5-10 mM ( 10 mM) 63,9 38,8 + 4,4 15 BQB 5-10 mM (215 mM) 49,6 29,1 _+ 4,4 9

Gennemsnitsværdierne angår flere produktionsfor-15 løb på 4 dage, som vist i tabel XA. værdier for enkeltprøver er anført i parentes.

_Tabel XA_

Stof_Tilsætninqsdaq_Prøvedag_n 20 BCC 1 (1) 2-4 (4) 15 BCB_1 (1)_2-4 (4) 9

Kombinerede effekter af forskellige rt-PA-syntese-stimulatorer .

25 Ved anvendelse af stofkombinationer skulle i det mindste ét stof have den egenskab, at det ikke hæmmer cellevæksten.

Et forøget udbytte blev f.eks. opnået ved en kombination af thioglycolsyre og smørsyre. En vigtig 30 rolle kan her tilsætningstidsrummet for de enkelte stoffer spille, idet f.eks. smørsyre altid blev tilsat som 2. stof for at nedsætte den inhibitoriske virkning på cellevæksten.

I DK 175411 B1 I 30

I Ved en samtidig tilsætning af stofferne på dag 0 I

I forøges effekten af smørsyre ikke. I

I For kombinationen af smørsyre og thioglycolsyre I

er effekten additiv. Som stigningseffekt kunne der mak- I

5 simalt opnås 70%. I

I I serumfrit medium kunne effekterne af smørsyre I

I ikke forøges yderligere ved hjælp af et yderligere I

stof. I

I Stigningen i rt-PA-produktion i CHO-celler, der I

I 10 dyrkes 3 dage i medium med 7,5% FKS, er vist i tabel I

I XI. 1 mM Thioglycolsyre (TG) og 1 mM smørsyre blev i I

I kombination sat til cellerne på forskellige I

I tidspunkter. Værdierne angår 1 ml cellesupernatant og I

I er angivet i % sammenlignet med kontrollen (0%) I

I 15 (middelværdi i SE, n=4-8). rt-PA-Bestemmelsen foregik I

I ved DCA. I

I _Tabel XI_ I

I Tllsætnlnqsdaq_ I

I 20 TG _Smørsyre__ I

I _g_i_2 _ I

I 0 31,3+1,7 67,9+5,2 30,3+3,2 I

I 1 68,8 + 4,4 31,4 + 5,5 I

I _2_'_41,4 + 5,5 I

I 25 I

I Effekter af aphldicolin I

I Aphldicolin, en diterpen fra Cephalosporium ap- I

I hidicola, hæmmer specifikt DNA-a-polymerasen og stimu- I

I lerer rt-PA-syntesen i CHO-celler i en koncentration I

30 fra 1 til 10 μΜ. Efter 24 timer er rt-PA-udbyttet ste- I

I get med 44,9-13,9%. I

I Aphldicolin viste en stimulering af rt-PA- I

I syntesen i CHO-celler. Det kan hæmme DNA-syntesen re- I

DK 175411 B1 31 versibelt, og derved bliver RNA- og proteinsyntesen ikke påvirket. Aphidicolin egner sig således dels til at stimulere rt-PA-syntesen og dels til at synkronisere cellerne. Aphidicolinets effekt på rt-PA-syntesen ved 5 længere inkubation af cellerne i medium med aphidicolin er beskrevet ovenfor. Denne passus omskriver arbejder med CHO-celler, der i 24 timer var udsat for aphidicolin og derefter blev dyrket videre i medium uden aphidicolin. Cellecyclusens faser og indbygningen af 10 [3H]-thymidin under 24 timers-markeringen og derefter blev analyseret for at følge hæmningen af DNA-syntesen og en genoptagning af syntesen efter fjernelse af aphidicolinet. Endvidere bestemtes RNA-, protein- og rt-PA-syntesen.

15

Cellevækst

Cellevæksten var let hæmmet (5-10%) af aphidicolin (1 μΜ) efter en 24 timers behandling. Ved mediumudveksling blev de aphidicolin-behandlede kulturer imid-20 lertid atter sat på det samme celletal som kontrolkulturerne .

rt-PA-Syntese rt-PA-Syntesen var stimuleret i 1 μΜ aphidico-25 linsynkroniserede celler. En effekt kunne stadigt ob-serberes 96 timer efter mediumudveksling.

Stigningen i t-PA-produktion i 1 μΜ aphidicolin-behandlede CHO-celler, der blev dyrket i medium med 7,5% FKS, er vist i tabel XII. Værdierne angår 1 ml 30 cellesupernatant og er angivet i % sammenlignet med kontrollen (0%) (middelværdi i SE, n=4). rt-PA-Bestem-melsen foregik ved DCA.

I DK 175411 B1 I

I 32 I

I Tabel XII_ I

I Tid (timer efter % Stigning i t-PA-syn- I

I mediumud veksling_tese_ I

I 24 40/2 + 6,7 I

I 5 48 59/9 + 11/1 I

I 72 32,8 + 6,4 I

I 96_14,7 + 1,3 I

I I fig. 18 er vist det tidsmæssige forløb af rt- I

I 10 PA-syntesestigningen i serumfrit medium. Effekten når I

I et maksimum 48 timer efter mediumudveksling. I

I rt-PA-Koncentrationen i serumfrit medium blev ef- I

I ter 96, 120 og 144 timer også bestemt ved Elisa, der I

I sammenlignet med kontrolværdierne lå væsentligt højere I

I 15 end de ved DCA fundne værdier. Resultaterne er vist i I

I tabel XIII. Testen blev gennemført med l μΜ aphidico- I

I lin-behandlede CHO-celler, der blev dyrket i serumfrit I

I medium. Værdierne angår 1 ml cellesupernatant og er an- I

I givet i % sammenlignet med kontrollen (0%) (middelværdi I

I 20 1 SE, n=4). rt-PA-Bestemmelsen foregik ved Elisa. I

I Tabel XIII_ I

I Tid (timer efter % Stigning i rt-PA-syn- I

I mediumud veksling_tese_ I

I 25 I

I 96 36,7 +6,2 I

I 120 42,0 + 8,8 I

I 144 51,3 + 10,2 I

I 30 eq forhøjet intracellulær rt-PA-koncentration I

I kunne kun observeres under den 24 timers inkubation med I

I aphidicolin og var forhøjet ca. 30%. I

I Smørsyre, propionsyre, butyrylcholinchlorid og I

I -bromid kunne i dette system ikke hæve rt-PA-produktio- I

33 DK 175411 B1 nen yderligere- Stimuleringen var vellykket både i serumfrit og i serumrigt medium, hvorhos en yderligere stigningseffekt i serumfrit medium kun blev opnået ved tilsætning af stofferne efter en 24 timers tilpasning 5 af cellerne til denne mediumbetingelse.

Tabel XIV viser den procentuelle stigning i t-PA-produktionen i aphidicolin-behandlede kulturer efter tilsætning af Na-butyrat. Na-Butyrat hæver rt-PA-synte-sen med yderligere 14% efter 96 timer.

10 Testen blev gennemført i serumfri kultur med 1 μΜ aphidicolin-behandlede CHO-celler, der blev dyrket med og uden Na-butyrat. Værdierne angår 1 ml cellesu-pernatant og er angivet i % sammenlignet med kontrollen (0%) (middelværdi - SE, n=4). rt-PA-Bestemmelsen foregik 15 ved Elisa.

._Tabel XIV_

Tid (timer efter Aphidicolin +Na-butyrat mediumudveksling Tilsætningstidspunkt 20 __(timer)_ _0_24 96 36,7 + 6,2 34,1 + 9,7· 50,6 + 11,0 120 42,0 + 8,8 31,8 + 10,2 49,7 + 4,3 1 2 3 4 5 6 2

Effekter af 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-on (DHO) 3 rt-PA-Produktionen er efter behandlingen med 4 ovennævnte forbindelse forhøjet efter 144 timer. Til 5 stimuleringen af rt-PA-syntesen var koncentrationer i 6 det mikromolære område virksomme, f.eks. 0,005 til 100 μΜ.

I fig. 19 er vist stigningen i rt-PA-produktio-nen i CHO-celler, der op til 168 timer blev dyrket i I DK 175411 B1

I serumfrit medium og 7 mM til 7 μΜ DHO. værdierne fand- I

I tes ved DCA. I fig. 20 er vist de tilsvarende værdier, I

der blev bestemt ved Elisa. I

Cellekulturer, der blev fremstillet ved den I

I 5 ovenfor beskrevne metode, kunne på kendt måde omarbej- I

des for at isolere rt-PA'et, f.eks. bliver efter pro- I

duktionsfasen kulturmediet skilt fra cellemassen, og I

I cellesupernatanten renses ved ultrafiltrering og chro- I

matografiske trin. I

10 Det isolerede rt-PA kan derefter forarbejdes til I

farmaceutiske præparater, f.eks. som opløsning eller I

lyofilisat. I

I Ovennævnte eksempler kan gentages under udskift- I

ning af de rt-PA-producerende CHO-celler med transfor- I

I 15 merede CHO-celler, der eksponerer andre proteiner, I

I f.eks. rt-PA-mutanter eller andre farmakologisk aktive I

I proteiner, som for eksempel i de ovennævnte europæiske I

I og tyske patentansøgninger, navnlig CHO-cellerne i EP-A I

I 199574 og 196920 samt i DE-A 3708681. I

Claims (7)

35 DK 175411 B1

1. Fremgangsmåde til at forøge produktionen af et protein fra kulturer af transformerede CHO celler, kendetegnet ved, at en C3-C4 alifatisk mo- 5 nocarboxylsyre eller et salt deraf tilsættes til kulturen og dyrkningen udføres i et serumfrit medium.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at proteinet er rt-PA eller en mutant deraf.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, ken detegnet ved, at smørsyre eller et salt deraf anvendes som den protein-inducerende substans.

4. Fremgangsmåde ifølge kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at den C3-4 alifatiske monocar- 15 boxylsyre eller et salt deraf tilsættes i en koncentration fra 1 mM til 10 mM.

5. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at cellerne dyrkes ved tilstedeværelse af en substans valgt fra thioglycol- 20 syre, thiodiglycolsyre, L-cystein, glutathion, buty-tylcholinbromid, butytylcholinchlorid, nonactin syre, furanfedtsyre, ascorbinsyre, aphidicolin, 6-hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-on, D-a-hydroxysubstitueret (C3 eller C40 alifatisk mono- eller dicarboxylsyre og 25 saltene deraf, cellerne fjernes fra kulturen og placeres herefter i et nyt serumfrit kulturmedium og dyrkes ved tilstedeværelse af en C3.4 alifatisk mono-carboxylsyre eller et salt deraf.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg- 30. e t ved, at aphidicolin er den førstnævnte substans, og C3.4 alifatisk monocarboxylsyren er smørsyre, propionsyre eller saltene deraf. I DK 175411 B1 I I -36 I

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5,kendeteg- I I net ved, at smørsyre og thioglycolsyre eller sal- I I tene deraf anvendes. I