NO174778B - Fremgangsmåte ved fremstilling av t-PA - Google Patents

Description

Gjenstand for oppfinnelsen er en fremgangsmåte for økning av produksjonen av t-PA (tissue plasminogen activator)

(og varianter derav i stilling 117 og 270 til 279) i cellekulturer av transformerte CHO-celler.

Plasminogenaktivatorer er en klasse av serinproteaser, som aktiverer proenzymet plasminogen ved spalting av peptidbindingen mellom Arg-560 og Val-561 til det aktive enzymet plasmin. Plasmin er på sin side det siste trinnet i blodbanens fibrinolysesystem, som spalter fibrinnettverket i en trombe til løselige peptider.

Ved patogene forstyrrelser, som koronarsykdom, blir blodavleiringene ikke oppløst raskt nok til å sørge for tilstrekkelig forsyning av vevet med oksygen. Resultatet av lukkingen av koronararteriene med en blodavleiring er et infarkt, som fører til nekrose av det angjeldende vevet på grunn av manglende oksygenforsyning til hjertemuskelen.

En rask rekanalisering av karene kan sikre gjennom-strømmingen av blod i hjertemuskelen på kortest mulig tid, og således forhindre at hele muskelpartier i hjertet vil dø.

I terapien har man i lang tid benyttet streptokinase og urokinase. Egenskapene til t-PA frembyr dog visse fordeler sammenliknet med disse kjente plasminogenaktivatorene: den fibrinspesifikke lokale lyse, ingen systemiske lytiske effekter ved nedbrytning av fibrinogen, høye reperfusjons-hastigheter og ingen dannelse av antistoffer.

t-PA er et glykoprotein med en molekylvekt på ca. 65.000 Dalton, som forekommer som enkjedet og tokjedet enzym og er sammensatt av 527 aminosyrer.

Affiniteten av t-PA for plasminogen er i nærvær av fibrin omlag 100 ganger større enn i dettes fravær. Denne høye affiniteten av t-PA for plasminogen i nærvær av fibrin sikrer å aktivere den effektive aktiveringen uten fritt plasminogen i periferien.

Humant t-PA ble først fremstilt i ren form fra livmor. I andre vev og celler, f.eks. endoteliale celler omfattende arterielle og venøse endoteliale celler, kunne likeså påvises t-PA. De dannete t-PA-mengdene er imidlertid så små at en kommersiell fremstilling er umulig.

Ytterligere en naturlig kilde for t-PA er cellekulturen. Flere cellelinjer ble undersøkt på en mulig t-PA-produksjon (Gronow M. et al., Trends in Biotechnology 1: 26-29, 1983). Fra en human cellelinje, Bowes-melanomcellene, kunne fremstilles større mengder t-PA for begrensete kliniske studier såvel som til oppklaring av strukturen (Wallen et al., European Journal of Biochemistry 132; 681-686, 1983).

For storproduksjon av t-PA for bred klinisk anvendelse er i alle fall disse utbyttene for lave. Først genteknikken gjorde det mulig å fremstille større mengder rekombinant t-PA for terapeutisk innsats. I 1983 ble t-PA klonet og aminosyre-sekvensen klarlagt (Pennica, Nature 301: 214-221, 1983).

Forsøk på å fremstille t-PA fra E. coli, hvori de genetiske informasjonene for t-PA ble integrert fra melanomceller, lyktes ikke, da det resulterende proteinet ikke er glykosylert og dermed ikke tilsvarer den naturlige t-PA.

Av denne grunn har forskjellige forskningsgrupper funnet frem til permanente pattedyrcellelinjer fra forskjellige kilder for produksjon av humant t-PA. Noen av disse celle-linjene er humane cellelinjer med påstått forbedret utbytte av t-PA. En annen cellelinje er den normale kinesiske hamster-ovarcellen.

I det europeiske utlegningsskriftet 0093619 er beskrevet fremstilling av t-PA fra transformerte kinesiske hamsterover-celler (CHO-celler). Det resulterende t-PA (r-tPA) er på ingen måte forskjellig fra naturlig forekommende t-PA.

I flere publikasjoner er beskrevet mutanter av t-PA og deres fremstilling, f.eks. i EP-A 241.208, 241.209, 241.210, 240,334, 234,051, 233,013, 231.624, 225.286, 213.794, 201.153, 199.574, 196.920 og DE-A 3708681.

I den foreliggende søknaden blir alle t-PA-derivater kalt mutanter, uansett om de inneholder én eller flere aminosyrer som adskiller seg fra aminosyren i den samme stillingen i t-PA som forekommer i naturen, eller hvori én eller flere aminosyrer som forekommer i det naturlige t-PA, ikke er tilstede i disse "mutantene". En t-PA, hvori flere aminosyrerester i naturlig forekommende t-PA er fraværende, som f.eks. i EP-A-196.920, blir ofte kalt "degraded species".

I EP-A 199.574 f.eks. er det beskrevet en t-PA-mutant som i stilling 270-279 har bestemte aminosyrer, som imidlertid adskiller seg fra aminosyren i den tilsvarende stillingen i naturlig t-PA.

I DE-A 37 08681 har søkeren beskrevet noen t-PA som i stilling 117 har en aminosyre som adskiller seg fra aminosyren 1 den tilsvarende stillingen ved naturlig t-PA, hvorved den mutante t-PA i motsetning til den naturlige t-PA i denne stillingen ikke er glykosilert.

I mange publikasjoner er beskrevet innflytelsen av forskjellige substanser på produktiviteten av cellekulturer for syntese av proteiner.

Ved forskjellige cellesystemer berettes det om en sammenheng mellom det intracellulære c-AMP-speilet og t-PA-syntesen (se f.eks. Kooistra et al. i Thrombosis and Haemostasis, 54 (1): 192, Abstract P 1133), at dibutyryl c-AMP forhøyer produksjonen av t-PA i humane endoteliale celler med 2 til 3 ganger, men har ingen innflytelse på syntesen av t-PA i Bowes melanomceller. I nyreceller ble t-PA-syntesen øket ved fosfodiesterase-inhibitorer (Journal of Cell Biology 91: 195-200, 1981). På den andre siden hemmer c-AMP t-PA-syntesen i makrofager (Vassalli et al., Cells, 8: 271-281, 1976) og er indifferent i teratokarsinom-celler (Nishimune et al., Experimental Cell Research 146: 439-444, 1983).

Smørsyre induserer syntesen av t-PA i teratokarsinom-celler (Nishimune - se ovenfor), men oppviser en inhiberende virkning i renale tumorceller (Nelson et al. Proe. Am. Ass. for Cancer Research, 26: 35, 1985), og Brouty-Boye et al. Biotechnology 12: 10, 1984 berettet om en indifferent virkning i embryonale lungeceller.

I humane endotelceller kan t-PA-syntesen stimuleres med trombin (Levin et al., Thrombosis and Haemostasis, 56 (2): 115-119, 1986), alkohol (Laug, Jarna, 250 (6): 772-776, 1983 B), vitamin C og vitamin A (Inada et al., Biochemical and Biophysical Communications 130 (1): 182-187, 1985). t-PA-sekresjonen i bovine endotelceller blir dog hemmet av trombin (Loskutoff, Journal of Clinical Investigations, 64: 329-332, 1979) og endotoksin (Crutchley et al., Journal of Biological Chemistry, 261 (1): 154-159, 1986).

t-PA-sekresjonen fra svineendotel formidles med heparin

(Marchwardt et al., Thrombosis Research, 8: 217-223, 1976), i de humane embryonale lungecellene har heparin imidlertid minimal effekt.

t-PA-syntesen ble enn videre påvirket positivt ved Concanavalin A i embryonale lungeceller (Brouty-Boye - se ovenfor) og epitelceller (Electricwala et al., Thrombosis and Haemostasis, 53: 200-203, 1985), 5-azacytidin i epitelceller (Electricwala - se ovenfor) og melanomceller (Silagi et al., Biological Medicine, 57: 418, 1984), tizabrin i melanomceller (Roba et al., Thrombosis and Haemostasis 50 (1): 83, 1983) og afidikolin i hepatomceller (Orfanoudakis et al., Biological Chemistry, Hoppe-Seyler, 336 (9); 832, 1985).

I europeisk utlegningsskrift 0219270 beskrives at en kombinasjon av heparin og endotelial-cellevekstfaktor (ECGF) forhøyer produksjonen av t-PA og enkjedet urokinaseplas-minogenaktivator fra normale humane diploide lungefibro-blastceller i serumfritt medium.

Innflytelsen av smørsyre på kinesiske hamsterovarceller beskrives av Storrie et al., Journal of Cell Physiology, 94: 69-76, 1978, og Wright, Experimental Cell Research, 78: 456-460, 1978. Disse undersøkelsene ble imidlertid gjennomført med ikke-transformerte cellelinjer, og resultatene ble i det store og hele rettet mot forandringene i cellenes morfologi og veksthastighet.

Gjenstand for den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte til å øke produksjonen av t-PA i kulturer av disse transformerte CHO-celler, hvorved man tilsetter en tioglykolsyre, tiodiglykolsyre, L-cystein, glutation, butyrylcholinbromid, butyrylcholinklorid, nonaktinsyre, furanfettsyre, askorbinsyre, affidikolin, 6-hydroksy-4,6-dimetyl-3-hepten-2-on, fusarinsyre, mevalonsyre, trans-anhydromevalonsyre, anhydromevalon-syrelakton, cis-anhydromevalonsyre, anhydromevalonsyrelakton, cis-anhydro-mevalonsyrelakton, D- a-hydroksysubstituert (C3 eller C4) alifatisk mono- eller di-karboksylsyre, C3-C5 alifatisk monokarboksylsyre eller salt derav, til kulturen i en konsentrasjon på 0,005 mM til 500 mM.

Mutante t-PA er derivater av t-PA som har én eller flere aminosyrerester som adskiller seg fra aminosyrerestene i den tilsvarende stillingen i naturlig t-PA, eller ikke forekommer i den ene eller flere aminosyrerester i den naturlige t-PA. Noen slike t-PA-mutanter er beskrevet i litteraturen, spesielt i de ovenfor omtalte patentsøknadene, særlig i EP-A 199.574 og DE-A 3708681.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis gjennomført med transformerte CHO-celler.

Dessuten ble det funnet at de C3-C5 alifatiske monokarboksylsyrene og deres salter kan øke produksjonen av t-PA og deres mutanter i kulturer av transformerte CHO-celler.

Som foretrukne t-PA-produksjonsøkende substanser er tioglykolsyre, nonaktinsyre, smørsyre og propionsyre aktuelle.

Substanser som øker proteinproduksjonen er handelsprodukter eller produkter som er kjent fra litteraturen eller som kan fremstilles ved kjente metoder.

Forbindelsene butyrylcholinbromid og -klorid, fusarinsyre, mavalonsyrelakten er handelsprodukter og kan leveres f.eks. fra firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.

Nonaktinsyre og fremgangsmåter til fremstilling av denne er beskrevet f.eks. i Heiv. Chim. Acta, vol. XLV, (1962), nr. 15-16, s. 129-138; Tetrahedron, vol. 36, nr. 1, s. 46-49 og J. Org. Chem., 1980, 45, s. 4259-4260.

Forskjellige publikasjoner beskriver furanfettsyrene, f.eks. Lipids, 1977, 12 (10), 828-36, J. Chem. Soc. Chem. Ccnmun., 1976, (16), s. 630-1, Lipids, 1975, 10 (11), s. 695-702, og Fette, Seifen, Anstrichmittel, nr. 8-1986, s. 290-292.

Syrer av denne typen som kan benyttes, kan også fremstilles ved omsetning etter følgende reaksjonsskjerna: hvorved m = 2-5, fortrinnsvis 4, n = 7-12, fortrinnsvis 8 eller 10,

Fremstillingen av forbindelsen 2 og 6 er beskrevet i Voss et al., Heiv. Chim. Acta, 1983, 66, 2294.

Fortrinnsvis er m 4 og n 8 eller 10.

Fremstillingen av trans-anhydromevalonsyre er beskrevet av H. Dieckmann i "Die Isolierung und Darstellung von trans-5-hydroksy-3-metylpentan-2-syre", Archiv flir Mikrobiologie, 62, 322-327 (1986). Forbindelsene anhydromevalonsyrelakton og cis-anhydromevalonsyrelakton og deres fremstilling er beskrevet av Keder et al. i "Die Bildung von /2-Anhydromevalonsåurelacton durch verschiedene Pilze", Biochem Zeitschrift, 341. 378-386

(1965).

Forbindelsen 6-hydroksy-4,6-dimetyl-3-hepten-2-on kan fremstilles etter fremgangsmåter ifølge teknikkens stand. Den er også et naturstoff og kan isoleres fra Capiscum annuns var angulosum, som beskrevet i CA. 97; 159552f og Eiyo to Shokuryo 1932, 35 (2) 95-101. Denne forbindelsen er likeledes beskrevet i doktoravhandlingen "Neue Sekundårstoffe aus Streptomycesten: Isolierung und Strukturaufklårung der Colabomycine, Pyrrolame und des Pyridazomycins" von Grote, R., Universitåt Gottingen, 1987, såvel som dens fremstilling ved dyrking av Streptomyces olivaceus (stamme Tii 3082, deponert i der Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen 23. november 1987 ifølge Budapest-avtalen under nr. 4309) og isolering. Den har følgende NMR-spektrum: C9H1602 (152,23)

EI- MS: m/e = 138 (M<*->H20, høyoppløsning, C9HuO, 6%) ; 123 (M<+->

CH50, 8%) ; 98 (høyoppløsning, C6H10, 48%) ; 83 (100%) 1HZNNMR (200 MHz, CDC13) : S 1,27 (s, 7-H3 u. 8-H3) ; 1,43

(s, bred, HO, utslukket med MeOD); 2,21 (s, 1-H3) ;

2,35 (d. J = 1,3 Hz, 9-H3) ; 2,32 (s, bred, 5-H2) ;

6,13 (s, bred, 3-H) ppm

<13>C-NMR (50,3 MHz, CDC13) : S = 22,0 (o, C-9) ; 30,0 (o, 2C, C-7 u. C-8); 32,0 (o, C-l); 54,4 (u, C-5); 71,1 (u, C-6); 127,2 (o. C-3); 155,1 (u, C-4); 198,6 (u, C-2) ppm

Som salter av de nevnte syrene kommer særlig saltene av alkalimetallene, fortrinnsvis natrium- og kaliumsaltene, på tale.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres i serumholdige eller fortrinnsvis i serumfrie medier.

Når fremgangsmåten i serumholdige medier blir gjennom-ført, foretrekkes anvendelsen av f.eks. tioglykolsyre, nonaktinsyre eller furanfettsyre eller deres salter.

Dersom fremgangsmåten gjennomføres i serumfritt medium, vil man fortrinnsvis anvende en C3-C5 alifatisk monokarboksylsyre, særlig smørsyre eller propionsyre, eller deres salter.

Det ble funnet at den forbindelsen som øker t-PA-produksjonen, er virksom ved konsentrasjoner fra 10 mM til 500 mM, f.eks. 1 mM til 10 mM. De (C3-C5) alifatiske monokarboksylsyrene, tioglykolsyre, tiodiglykolsyre, L-cystein og glutation eller deres salter er spesielt virksomme ved 1 mM til 10 mM.

De substansene som øker t-PA-produksjonen kan tilsettes på den tilsvarende dagen for kultiveringen, f.eks. ved dag 0, dvs. ved begynnelsen av kultiveringen, inntil slutten av den tredje dagen av kultiveringen.

Man kan også bruke den t-PA-produksjonsøkende substansen til flere anvendelser. Således kan man kultivere cellene i nærvær av en substans, fjerne cellene fra kulturen, deretter igjen overføre dem til et nytt dyrkingsmedium og kultivere dem i nærvær av en substans som øker t-PA-produksjonen. Ved denne anvendelsen for flere formål viser særlig C3-C5 alifatiske monokarboksyrsyrer eller deres salter, fortrinnsvis smørsyre og tioglykolsyre eller deres salter, en økningseffekt.

Ved anvendelse for flere formål er det ikke nødvendig at man bruker den samme substansen for alle anvendelsene, tvert imot kan man bruke én av substansene ved en anvendelse og en annen for en videre anvendelse. Denne anvendelsen for flere formål viser likeså også en økningseffekt, som spesielt anvendelsen av afidikolin for én anvendelse, og en av de andre substansene, f.eks. smørsyre, propionsyre, butyrylcholinklorid eller butyrylcholinbromid eller deres salter, for en videre anvendelse.

Man kan også anvende kombinasjoner av to eller flere substanser. Fortrinnsvis anvender man ikke mer enn én substans som hemmer celleveksten. Man kan f.eks. anvende en C3-C5 alifatisk monokarboksylsyre, fortrinnsvis smørsyre og tioglykolsyre, eller deres salter, hvorved fortrinnsvis monokarboksyl-syren eller dennes salt blir tilsatt som andre substans til cellekulturen.

Transformerte kinesiske hamsterovarceller vil si CHO-celler som er transformert med en vektor som koder for et ønsket t-PA, hvorved de under dyrkingen kan syntetisere og eksprimere t-PA'et.

Som transformerte kinesiske hamsterovarceller kan man f.eks. anvende de cellene som er beskrevet i de europeiske patentsøknadene 0093 619 og 0199574 og den tyske patentsøknaden 3708681. Ved kultivering av disse transformerte CHO-cellene kan fremstilles t-PA (EP-A 0093619) og bestemte t-PA-mutanter (EP-A 0199574 og DE-A 3708681). Transformeringen av CHO-celler med vektorer, hvorved cellene vil eksprimere andre proteiner, finner sted ved teknikk som er kjent fra litteraturen som f.eks. i de ovenfor nevnte europeiske og tyske patent-søknadene.

Som vertscelle kan man anvende cellen under kjennetegnet CH0-K1, som i 19 57 ble isolert av Puck fra biopsimateriale og som i 1970 ble opptatt av American Type Culture Collection (ATCC) under betegnelsen CCL-61. Denne cellelinjen er på nytt blitt registrert av ATCC 23. desember 1987 ifølge Budapest-avtalen under nr. CRL 9618.

Man kan fremstille den DNA-sekvensen som koder for det ønskete t-PA ved teknikk som allerede er kjent fra litteraturen, som f.eks. i forskjellige av de ovenfor nevnte patent-søknadene. Vektorer som har denne sekvensen og også kontrol-lerende sekvenser, kan konstrueres etter i og for seg kjente fremgangsmåter, f.eks. under anvendelse av E. coli K 12294 (ATCC 31446) og E. coli X 1776 (ATCC 31537), som er blitt registrert på nytt av ATCC den 23. desember 1987 ifølge Budapest-avtalen under nummerne 53704 og 53705, som f.eks. plasmidene pETPER og pETPFR, som er beskrevet i EP-A 093619. CHO-cellene kan transformeres ved fremgangsmåter som er kjent fra EP-A 039619, DE-A 3708681, EP-A 0117059 og EP-A 199574 eller annen litteratur.

Vektoren for t-PA-produksjonen ble integrert i en subklon, CHO-K1-DUX-B11 (Urlaub et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, 77: 4216-4220, 1980). Denne cellelinjen, en dihydrofolat reduktase negativ mutant (DHFR-), er egnet for en DHFR-avhengig seleksjon av de transfekterte celleklonene. Vektoren for det humane c-DNA kan være en kjent plasmidvektor pBR-322 eller dennes avkom fra Escherichia coli. Promotorregionen for det genet som kommer på tale og for DHFR-genet stammer fra SV 40, og terminasjonsregionen for begge genene fra et hepatitt B-overflateantigen. I eksemplene ble anvendt CH0-K1-DUX Bll-celler, som er transformert ved plasmidene pETPER eller pEPEFR (se EP-A 0117059).

Som serumfritt medium står til disposisjon forskjellige kjente produkter (se f.eks. BMFT-statusseminar 12, 13.

november 1985, Bundesministerium fur Forschung und Technologie, 5300 Bonn 2, s. 111-120). I det følgende eksempelet anvendes et etterdissekert DMEM/Ham<s F 12 medium (1:1) (Gibco) som serumfritt medium. Som tilsetning anvendes føtalt kalveserum (FKS) i en konsentrasjon på 7,4% eller 1-2%.

Cellekulturene inkuberes ved 37"C i et Hereaus-rugeskap, og gjennomluftes med en karbondioksyd-luftblanding med 7,5% C02 i en relativ luftfuktighet på 100%. Alt etter fremgangsmåten benyttes forskjellige kulturbeholdere: sentrifugebeholdere på 100-1000 ml medium, Roux-skåler (Nunc) 175 cm<2> (70-100 ml medium), 75 cm<2> (30-50 ml medium), 25 cm<2> (7-10 ml medium) og flerbruks-kulturskåler fra Costar med 2 cm<2> for 1 ml kulturer. For stamkulturen innsettes cellene med en tetthet på 0,2-0,3 x 10<6> celler/ml og subklones hver 2.-3. dag.

De substansene som stimulerer t-PA-produksjonen kan tilsettes på de forskjellige tidspunktene i en fortynning på 1:100, dvs. de løses først i medium, eller, når de er tungt-løselige, løses de først i etylalkohol og tilsettes deretter i medium, og deretter blir mediet som inneholder denne substansen tilsatt til det celleholdige mediet i volumforholdet 1:100.

I de følgende eksemplene ble, for a fremkalle stimuleringen av t-PA-syntesen, celler tatt ut fra en eksponensiell voksende kultur og sentrifugert i små plastrør (Falcon) i 10 min ved 1000 x g i en Beckmann T 3-6 sentrifuge. Etter dekantering av det ovenstående ble cellesentrifugatklumpen resuspendert med friskt medium.

For produksjonen av t-PA i serumholdig medium ble anvendt som friskt medium F12/DMEM + 7,5% FKS + gentamycin. Den resulterende suspensjonen kan påsettes i 2 cm<2> 24 brønners plater ved en celletetthet på 0,2-0,3 x 10<6> celler/ml.

For produksjon av t-PA i serumfritt medium ble cellene først adaptert 3-4 døgn i et medium av 1-2% FKS, igjen sentrifugert fra og cellesentrifugatklumpen resuspendert i serumfritt medium og deretter overført til 2 cm<2> 24 brønners plater i en celletetthet fra 0,4-0,5 x 10<6> celler/ml.

Kvantitative t- PA- bestemmelser

Alikvoter av cellesupernatanter og celleekstrakter ble uttatt til forskjellige tidspunkter henholdsvis fremstilt. Målingen av prøvene fulgte enten straks eller etter opp-bevaring ved -20°C med følgende metoder:

BESTEMMELSESMETODE

1 - Direkte kromogen undersøkelse ( DCA)

Fra det syntetiske peptidsubstratet S-2288 (D-H-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilin) fra firmaet Kabi Diagnostica dannes p-nitroanilin som reaksjonsprodukt ved hjelp av t-PA. Aktiviteten av t-PA er for dannelsen av p-nitroanilin propor-sjonal med aktiviteten målt ved 405 nm, 37°C.

Den spektrofotometriske bestemmelsen av enzymkinetikken ble gjennomført automatisk med et ACP-5010-analyseapparat fra firma Eppendorf.

Enzymets aktivitet ble beregnet ut i fra dettes forut-gitte standarder. En t-PA-standardrekke på 1,15 jig/ml ble fremstilt med en laboratoriestandard, som til 72% består av énkjedet materiale.

Substratløsningen (100 mM Tris/106 mM NaCl) ble anvendt 1 en konsentrasjon på 50 mM.

2 - ELISA

Ved hjelp av en ELISA (Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay) ble t-PA-prøvene fra supernatanten og fra celleekstraktet bestemt kvantitativt. Som standard brukte man en laboratoriestandard i en konsentrasjonsrekke fra 0,038-5 Mg/ml. Prøvene ble forfortynnet 1:100 til 1:1000.

Karakterisering av de transformerte CHO- cellene

Cellevekst

CHO-cellene kodes med 0,2-0,3 x 10<6> celler/ml i kulturskåler (i medium med 7,5% FKS) og formerer seg til å begynne med svært langsomt. Først etter en lag-fase på 24 timer begynner den logaritmiske cellevekst. Ved en celletetthet på 1,3 ± 0,04 x 10<6> celler/ml opptrer på den fjerde dagen i første ikke vitale cellene i kulturen: deres andel av det samlete celletallet er 13,2 ± 1,3%. Den maksimale celletettheten oppnås på den femte dagen med 1,8 ± 0,05 x 10<6> celler/ml (fig. 1).

Antallet levende celler utgjør etter 7 døgn fremdeles 72 3% av den samlede cellemassen.

Den stasjonære fasen, som følger etter den eksponensielle celleveksten, innledes av forskjellige faktorer. Ved en høy populasjonstetthet og forbruk av essensuelle nærings-stoffer deler cellene seg ikke videre. Varigheten av den stasjonære fasen varierer sterkt og er avhengig av medie-komponenter som serum. En opphopning av syrer og toksiske stoffskifteprodukter, såvel som forandringer av miljøfaktorer (sur pH, lavt 02-partialtrykk, manglende gjennomlufting), fører også til celledød.

t- PA- produksion i CHO- celler

Mellom cellevekst og t-PA-syntese består en lineær sammenheng.

Tidsforløpet for t-PA-produksjonen viser to faser. I den første fasen stiger t-PA-konsentrasjonen i supernatanten hele tiden. I den andre fasen kommer enzymsyntesen praktisk talt til stillstand, og t-PA-konsentrasjonen i medium blir til-nærmet konstant (fig. 2A). Den maksimale t-PA-konsentrasjonen på den fjerde dagen utgjør 11,1 § 0,7 ug/ ral i ELISA. De målte t-PA-konsentrasjonene ligger noe høyere ved den kromogene undersøkelsen, hvilket antagelig forårsakes av tokjedet t-PA, med ELISAmetoden forløper imidlertid kurvene parallelle med begge påvisningsmetodene inntil fjerde dagen.

Den intracellulære t-PA-konsentrasjonen forløper likså parallell med celleveksten, og er relativt liten sammenliknet med den samlede syntetiserte t-PA-mengden. På den fjerde dagen utgjør deres andel 7% av den samlede aktiviteten (fig. 2B).

Som fig. 3A viser, stiger t-PA-syntesen forsiktig, i forhold til celletallet, inntil den fjerde dagen; med ELISA-metoden bestemmes et maksimum på 8,1 ± 1,2 /xg t-PA/1 x 10<6 >celler. Cellulært bundet t-PA ble bare bestemt med ELISA-metoden, da disse lave t-PA-konsentrasj onene (< 1 /ug) ikke lar seg bestemme ved hjelp av DCA.

Det intracellulære t-PA-innholdet, i forhold til celletallet, er noe høyere under log-fasen for celleveksten, og ligger mellom 500 og 900 ng t-PA/1 x 10<6> celler, fra den fjerde dagen ligger t-PA-verdien ved ca. 450 ng/1 x 10<6> celler (fig. 3B) .

Innflytelse av serum og serumfaktorer i medium på celleveksten og t- PA- produksjonen i CHO- celler

Cellene ble påsatt med 0,25 x 10<6> celler/ml og forskjellige serumkonsentrasjoner i medium.

En serumkonsentrasjon under 5% i medium påvirker likeså celledelingen negativt, produktiviteten påvirkes derimot bare lite.

Innflytelsen av serumkonsentrasjonen i medium på celleveksten og t-PA-produksjonen etter 48 timers inkubasjon av cellene er fremstilt i tabell 1. Verdiene er angitt i prosent av maksimalverdiene (7,5% FKS i medium). Maksimalverdien for celletallet ligger ved 0,56 ± 0,03 x IO<6> celler og for t-PA-konsentrasjonen 5,7 ±'0,5 iiq/ ml. t-PA-bestemmelsene ble gjennomført ved hjelp av DCA (middelverdi ± SE, n = 4).

Cellekultur i serumfritt medium

Cellene ble påsatt i serumfritt medium i en celletetthet på 0,4-0,5 x 10<6> celler/ml. Cellene deler seg inntil den fjerde dagen, og det høyeste tallet av levende celler oppnås likeså den fjerde dagen med 1,0 ± 0,2 x 10<6> celler/ml (fig. 4).

t- PA- produksjon i serumfritt medium

t-PA-konsentrasjonen i supernatanten stiger stadig inntil den 7. dagen og når et maksimum med ELISA-metoden på 13,6 ± 0,54 jug/ml. t-PA-verdiene bestemt ved hjelp av DCA ligger på den 1.-3. dagen under, og fra den 4. dagen over de t-PA-verdiene som ble bestemt ved hjelp av ELISA (fig. 5).

t-PA-syntesen pr. celler er i serumfritt medium omlag like høy som i medium med serum og ligger mellom 7,2 ± 3,6 og 10,3 ± 2,8 Mg/1 x 10<6> celler (ELISA) (fig. 6).

Den prosentuelle andelen av t-PA i serumfritt medium av den totale proteinmengden i supernatanten ligger mellom 10,9 ± 1,0 og 12,5 ± 1,4%. Resultatene er angitt i tabell 2. t-PA-verdiene ble bestemt ved hjelp av ELISA (middelverdi ± SE,

n = 4) .

Virkningen av alifatiske ntonokarboksylsyrer

Økningen av t-PA-produksjonen i CHO-celler i medium med 7,5% FKS ved forskjellige alifatiske monokarboksylsyrer er angitt i tabell 3. Alle syrene ble anvendt i et konsentrasjonsområde fra 10 mM til 500 mM. Det optimale doseområdet for alle monokarboksylsyrene ligger mellom 1 og 10 mM. Virkningen av syrene er avhengig av kjedelengden.

Alle virksomme monokarboksylsyrer hemmer celleveksten. Propion-, smør-, isosmør- og isovaleriansyre er virksomme i et større konsentrasjonsområde, da den konsentrasjonsavhengige inhibiteringen av primærstoffskiftet, som fører til hemmingen av celleveksten, overlagrer seg med økningen av t-PA-syntesen.

Verdiene i tabell 3 refererer seg til 1 ml cellesupernatant og er angitt i prosent i forhold til kontrollene (0%). t-PA-bestemmelsen ble gjort ved hjelp av DCA (middelverdi SE, n = 3-24). Den maksimale verdien gjelder en enkeltprøve. Data for de enkelte prøvene er angitt i parentes.

Gjennomsnittsverdiene gjelder flere produksjonsganger på 3-4 døgn, hvorved monokarboksylsyrene ble tilsatt på dag 0 til dag 3 av kultiveringen, som fremstilt nedenfor i tabell 3A. Data for de enkelte prøvene er angitt i parentes.

I fig. 7 er fremstilt tidsforløpet for t-PA-produksjons-økningen i medium med 7,5% FKS ved hjelp av C3-C5-monokarboksylsyrer. Allerede etter 24 timer kan påvises en stimulering av t-PA-produksjonen fra 18,1 ± 5,7% (C4) til 24,8 ± 0,5%

(C5). For isosmørsyre viste seg en produksjonsøkning først etter 48 timer. En maksimal økning av t-PA-produksjonen ble oppnådd for C3- og C4-karboksylsyren på den 3. dagen, med 37,2 ± 5,1% for Na-butyrat. Produksjonsøkningen er bare kortvarig for smør- og isosmørsyre, på den 4. dagen kan man ikke lenger observere noen effekt. Den økende virkningen av propionsyre og isovaleriansyre er derimot fremdeles tilstede på den 4. dagen og manifesterer seg ved en økning av t-PA-produksjonen på 31,8% for C3 og 8,5% for C5.

Virkningene er dessuten avhengig av cellens fysiologiske tilstand. Under den eksponensielle veksten er cellene mest ømfintlige for en stimulering.

I tabell 4 er fremstilt økningen av t-PA-produksjonen i CHO-celler i medium med 7,5% FKS ved hjelp av C3-C5-monokarboksylsyrer i avhengighet av tilsetningsdagen for karboksylsyrene etter 48 timers vekst av cellene i medium med 7,5% FKS. Konsentrasjonen var for smørsyre og isovaleriansyre 1 mM og for propionsyre og isovaleriansyre 5 mM. Verdiene gjelder 1 ml cellesupernatant og er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) (middelverdi ± SE, n = 3-5). t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved hjelp av DCA.

Virkningene av smørsyren på t- PA- produksionen i CHO- celler

Stimuleringseffekten skal forfølges ved en økning såvel av den intracellulære t-PA-konsentrasjonen som også av den ekstracellulære t-PA-konsentrasjonen.

Som det fremgår av fig. 8, er økningen av det intracellulære t-PA-innholdet i butyrat-behandlete kulturer størst i forhold til kontrollen (43,8 ± 9,8%) etter 24 timers inkubasjon. I supernatanten kommer den prosentuelle økningen etter 24 timer noe lavere ut med gjennomsnittlig 19,2% (DCA og ELISA) i forhold til kontrollverdiene. Denne effekten holder seg i supernatanten i 72 timer.

I fig. 9A-C er fremstilt t-PA-syntesen i forhold til celletallet, og de viser, at stimuleringen av t-PA-syntesen ved Na-butyrat vedvarer over 7 døgn til tross for hemmingen av celleveksten. I løpet av de første 4 døgnene øker enzymsyntesen pr. celle stadig. t-PA-konsentrasjonen stiger fra 7,5 % 1,1 \ iq til 28,9 ± 5,3 /zg t-PA/1 x 10<6> celler (ELISA) i supernatanten (fig. 8A). Med DCA-metoden bestemmes et maksimalt t-PA-innhold på 47,4 ± 7,4 /zg t-PA/1 x 10<6> celler (fig. 9B). Samtidig avtar det intracellulære t-PA-innholdet og faller fra 1,5 ± 0,2 y. q t-PA/1 x 10<6> celler på den 5. dag (fig. 9C) .

I tabell 5 er angitt stimuleringen av t-PA-syntesen ved Na-butyrat i medium med 7,5% FKS i forhold til celletallet. Na-butyrat ble tilsatt på dag 0 i en konsentrasjon på 1 mM. Verdiene på dagene 1-4 er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) og gjelder 1 x IO<6> celler. t-PA-innholdet i supernatanten og i celleekstraktet ble bestemt ved hjelp av ELISA (middelverdi ± SE, n = 5-10).

En optimal produksjonsøkning ble oppnådd når Na-butyrat ble tilsatt under den eksponensielle celleveksten. Den maksimale virkningen av Na-butyrat opptrer ved et anvendelses-tidsrom fra dag 0 til 2 alltid på den 3. dagen (fig. 10).

Ved anvendelse av Na-butyrat hver 2.-3. dag etter mediumbytte i den samme cellepopulasjon kunne t-Pa-produk-sjdnen holdes på et høyere nivå over lengre tid.

I tabell 6 er gjengitt økningen av t-PA-produksjonen i CHO-celler som ble dyrket i medium med 7,5% FKS. 1 mM Na-butyrat ble tilsatt ved hvert mediumbytte henholdsvis bare på dag 0. Verdiene på 2, 4, 7 henholdsvis 9 døgn etter mediumbytte er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) og gjelder 1 ml cellesupernatant. t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved hjelp av DCA (middelverdi ± SE, n = 3).

Virkningene av smørsyre på t- PA- produksionen i CHO- celler i serumfritt medium

I motsetning til korttidsvirkningen av den butyrat-stimulerte t-PA-syntesen i serumholdig medium holder virkningen seg lenger i serumfritt medium og utgjør 1 døgn etter tilsetning av Na-butyrat 44,1 ± 7,1% i forhold til kontrollen. En maksimal økning ble oppnådd 3 døgn etter tilsetningen av Na-butyrat med 143,3 ± 12,8%. Økningseffekten kan påvises fremdeles 6 døgn etter Na-burytat-tilsetningen med 49,9 ± 7,0%

(fig. 11 og 12).

t-Pa-syntesen fra 1 x IO<6> celler er likeså høyere i serumfritt medium enn i serumholdig medium og stiger til over 50 ixg/1 x IO<6> celler (fig. 13) .

Virkningene av propionsyre

C3-karboksylsyren viser svært liknende virkninger på t-PA-syntesen som smørsyren. Den prosentvise økningen faller dog ut ca. 14% lavere, og for t-PA-stimuleringen er høyere konsentrasjoner (5-10 mM) nødvendig. Dessuten hemmer propionsyre celleveksten i mindre målestokk og fører derfor til en økning av t-PA-syntesen som varer lenger.

En stimulering av t-PA-syntesen ved propionsyre synes, i motsetning til smørsyre, å være svært spesifikk, da det ekstracellulære proteininnholdet i serumfritt medium bare ble lite forhøyet i forhold til kontrollen, og innbyggingen av [<3>H]-leucin økte bare i liten grad.

Virkningene av dikarboksvlsyrer. hydroksykarboksvlsyrer og ketokarboksvls<y>rer på t- PA- produksionen i CHO- celler

Hydroksykarboksylsyrer, som melkesyre, glycerinsyre, eplesyre og vinsyre viser bare en lett økning av t-PA-syntesen, som lå mellom 6 og 10 prosent, hvorved vinsyren i en konsentrasjon på 10 mM stimulerte t-PA-syntesen best (10,3 2,9% i forhold til kontrollen). Celledelingen blir ikke påvirket av hydroksylsyrer, og virkningen på t-PA-syntesen kan påvises fremdeles etter 96 timer.

Virkningene av ascorbinsvre

Virkningen av ascorbinsyrene ved 10 mM på t-PA-produksjonen vedvarer i 72 timer og viser ved tilsetning på dag 0 en 15,2 ± 3,1% økning av t-PA-syntesen etter 24 timer (fig. 14).

Virknin<g>ene av lanqkiedete fettsyrer på t- PA- produksionen i CHO- celler

Det ble funnet at også langkjedete fettsyrer som nonaktinsyre med lOC-atomer og furanfettsyrer kunne fremkalle en økning (tabell 7). I dette eksempelet ble anvendt en furanfettsyre ifølge formel 4, hvori m = 4 og n = 8.

I serumfritt medium kunne dog ikke påvises noen økning av t-PA-syntesen, henholdsvis av proteinsyntesen.

Økningen av t-PA-produksjonen i CHO-celler ved langkjedete fettsyrer er gjengitt i tabell 8. Cellene ble dyrket i medium med 7,5% FKS. Syrene ble undersøkt i et konsentrasjonsområde fra 10 fiVL til 10 mM, hvorved en konsentrasjon på en mM var optimal. Verdiene gjelder 1 ml cellesupernåtant og er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) (middelverdi ± SE, n = 4-9). Den maksimale verdien gjelder en enkelt prøve. t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved hjelp av DCA.

Gjennomsnittsverdiene gjelder flere produksjonsganger på 4 døgn, hvorved syrene ble tilsatt på dag 0, som gjengitt i tabell 8A. Data for enkeltprøvene er angitt i parentes.

Virkninger av tioler og sulfider på t- PA- produksionen i CHO-celler

Fire svovelholdige forbindelser, som utgjør derivater eller substitusjonsprodukter av karboksylsyrer, viste en økning av t-PA-produksjonen mellom 16% og 31,2%, uten å påvirke celleveksten negativt (tabell 8). De substituerte karboksylsyrene viste sin optimale virkning i det samme konsentrasjonsområdet (1-10 mM) som de andre virksomme karboksylsyrene. Bare glutation var effektiv i et lavere konsentrasjonsområde på 1-10 izM. Tioglykolsyre viste seg som foretrukket stimulator for t-PA-syntesen i CHO-celler.

I dette eksempelet ble cellene dyrket i medium med 7,5% FKS. Alle substansene ble undersøkt i en konsentrasjonsområde fra 1 /zM til 10 mM. Verdiene i tabell 9 gjelder 1 ml cellesupernatant og er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) (middelverdi ± SE, n = 6-19).

Den maksimale verdien gjelder en enkeltprøve. t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved hjelp av DCA. Konsentrasjonen for substansen er angitt i parentes.

Gjennomsnittsverdiene gjelder flere produksjonsganger på 3 døgn, hvorved substansene ble tilsatt fra dag 0 til dag 2 som angitt i tabell 9A. Data for enkeltprøvene er gjengitt i parentes.

Fordelene med tiokarboksylsyrer i forhold til monokarboksylsyrer er mangelen på en inhibitorisk effekt på celleproliferasjonen, dog kunne produksjonen av t-PA ikke økes videre med disse substansene enn med smørsyre. Varigheten av økningseffekten er likeså kort, og når maksimumsverdien etter 24 timer for tioglykolsyre og etter 48 timer for cystein. Etter 4 døgns inkubasjon av cellene er virkningen på t-PA-produksjonen fremdeles bare liten (fig. 15).

I serumfritt medium er dog den stimulerende virkningen på t-PA-syntesen mindre enn i medium med serum, da alle substanser hemmer celledelingen mellom 10% og 20%.

Virkningene av tioglykolsyre

t-PA-produksjonen er forhøyet i 78 timer etter behandlingen med tioglykolsyre, og uavhengig av tilsetningsdagen. Den prosentvise økningen av enzymsyntesen er alltid på sitt høyeste etter 24 timer, og faller deretter av kontinuerlig.

I tabell 9 er fremstilt økningen av t-PA-produksjonen i CHO-celler som ble dyrket i 24-96 timer i medium med 7,5% FKS og 1 mM tioglykolsyre, i avhengighet av tilsetningsdagen. Verdiene gjelder 1 ml cellesupernatant og er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) (middelverdi ± SE, n = 4,6). t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved hjelp av DCA.

t-PA-produksjonen kan forhøyes ved en to gangers tilsetning av tioglykolsyre i forhold til den enkelte tilsetningen (fig. 16).

I fig. 17A (DCA) og fig. 17B (ELISA) er fremstilt for-løpet av t-PA-syntesen som gjelder 1 x IO<6> celler. t-PA-syntesen er forhøyet ved 1 mM tioglykolsyre de første 3 døgnende (DCA) i forhold til kontrollen. De oppnådde t-PA-verdiene i ELISA blir derimot forhøyet over hele tidsrommet. Økningshastigheten er på den 4. dagen fremdeles ca. 35%. Det intracellulære t-PA-innholdet pr. celle blir likeså forhøyet med tioglykolsyre. Den maksimale intracellulære t-PA-konsentrasjonen utgjør 1,1 ± 0,1 /zg/1 x IO<6> celler etter 24 timer, og faller i løpet av 96 timer omlag til halvdelen av den opprinnelige konsentrasjonen (fig. 17C).

Den ekstracellulære t-PA-konsentrasjonen er på den 5. dagen øket 10,7% i forhold til kontrollen. Den prosentvise økningen av t-PA-syntesen med tioglykolsyre er noe lavere i serumfritt medium, da celledelingen lett blir hemmet (10-20%).

Virkninger av derivater av monokarboksylsyrer på t- PA-produksionen i CHO- celler

I gruppen av C4-karboksylsyrederivater ble funnet ytterligere substanser som har virkning på t-PA-syntesen i CHO-celler. Til disse substansene hører i første rekke butyrylcholinbromid (BCB) og -klorid (BCC), som øker t-PA-produksjonen mellom 30% og 40%. Disse C4-derivatene viser i enhver henseende de samme virkningene som natriumbutyrat oy er

virksomme i det samme konsentrasjonsområdet.

I tabell 10 er gjengitt økningen av t-PA-produksjonen i CHO-celler med de to ovenfor nevnte derivatene av monokarboksylsyrene. Cellene ble dyrket i medium med 7,5% FKS. Alle substansene ble undersøkt i et konsentras jonsområde fra 10 /iM til 10 mM. Verdiene er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) og gjelder 1 ml cellesupernatant (middelverdi SE, n = 4-15). Verdiene som gjelder enkeltprøvene er angitt i parentes. Den maksimale verdien gjelder en enkeltprøve. t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved hjelp av DCA.

Gjennomsnittsverdiene gjelder flere produksjonsganger på 4 døgn som gjengitt i tabell 10A. Verdier for enkeltprøvene er angitt i parentes.

Kombinerte virkninger av forskjellige stimulatorer for t- PA-syntesen

Ved anvendelse av substanskombinasjoner bør minst én substans ha den egenskapen at den ikke hemmer celleveksten.

Et forhøyet utbytte ble f.eks. oppnådd ved en kombinasjon av tioglykolsyre og smørsyre. En viktig rolle kan tilsetningstidsrommet for de enkelte substansene spille derved, at f.eks. smørsyre alltid ble tilsatt som andre substans, for å redusere den inhibitoriske virkningen på celleveksten.

Ved samtidig tilsetning av substansene på dag 0 blir virkningen av smørsyren ikke forhøyet.

For kombinasjonen smørsyre og tioglykolsyre er effekten additiv. Som økningseffekt kunne maksimalt oppnås 70%.

I serumfritt medium kunne virkningene av smørsyre ikke økes videre ved hjelp av ytterligere en substans.

Økningen av t-PA-produksjonen i CHO-celler, som dyrkes i 3 døgn i medium med 7,5% FKS er gjengitt i tabell 11. 1 ml tioglykolsyre (TG) og 1 mM smørsyre ble tilsatt i kombinasjon til cellene på forskjellige tidspunkter. Verdiene gjelder 1 ml cellesupernatant og er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) (middelverdi ± SE, n = 4-8). t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved hjelp av DCA.

Virkninger av afidikolin

Afidikolin, et diterpen fra Cephalosporium aphidicola, hemmer spesifikt DNA alfa-polymerasen, og stimulerer t-PA-syntesen i CHO-celler i en konsentrasjon på 1-10 j^M, Etter 24 timer er t-PA-utbyttet øket med 44,9 ± 13,9%.

Afidikolin viste en stimulering av t-PA-syntesen i CHO-celler. Det kan hemme DNA-syntesen reversibelt, derved blir RNA- og proteinsyntesen ikke påvirket. Afidikolin egner seg altså på den ene siden til å stimulere t-PA-syntesen, og på den andre siden til å synkronisere cellene. Virkningen av afidikolin på t-PA-syntesen ved lengre inkubasjon av cellene i medium med afidikolin er beskrevet ovenfor. Denne passus omhandler arbeider med CHO-celler som var utsatt for afidikolin i 24 timer, og deretter ble videre kultivert i medium uten afidikolin. Fasene for cellesyklusen og innbyggingen av [<3>H]-tymidin i løpet av den 24 timers markeringen og deretter ble analysert for å forfølge hemmingen av DNA-syntesen og en gjenopptagelse av syntesen etter fjerning av afidikolin. Dessuten ble RNA-, protein- og t-PA-syntesen bestemt.

Cellevekst

Celleveksten ble lett hemmet med afidikolin (1 /xM) etter en 24 timers behandling (5-10%). Ved bytte av medium ble de afidikolinbehandlete kulturene allikevel satt på det samme celletallet som kontrollkulturene.

t- PA- svntese

t-PA-syntesen ble stimulert i 1 jzM afidikolin-synkron-iserte celler. Endog 96 timer etter bytte av medium kunne man observere en virkning.

Økningen av t-PA-produksjonen i l /xM afidikolin— behandlete CHO-celler, som ble kultivert i medium med 7,5% FKS, er angitt i tabell 12. Verdiene gjelder 1 ml cellesupernatant, og er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) (middelverdi ± SE, n = 4). t-PA-bestemmelsen ble gjennom-ført ved hjelp av DCA.

I fig. 18 er fremstilt tidsforløpet for økningen av t-PA-syntesen i serumfritt medium. Virkningen når et maksimum 48 timer etter bytte av medium.

t-PA-konsentrasjonen i serumfritt medium ble bestemt etter 96, 120 og 144 timer også ved hjelp av ELISA, som sammenlignet med kontrollverdiene lå vesentlig høyere enn de verdiene som ble funnet ved hjelp av DCA. Resultatene er angitt i tabell 13. Testen ble gjennomført med 1 ixM afidikolin-behandlete CHO-celler som ble kultivert i serumfritt medium. Verdiene gjelder 1 ml cellesupernatant, og er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) (middelverdi ± SE, n = 4). t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved ELISA.

En forhøyet intracellulær t-PA-konsentrasjon kunne bare observeres under den 24 timers inkubasjonen med afidikolin, og var ca. 30% forhøyet.

I dette systemet kunne smørsyre, propionsyre, butyrylcholinklorid og -bromid ytterligere øke t-PA-produksjonen videre. Stimuleringen var resultatrik såvel i serumfritt som også i serumrikt medium, hvorved ble oppnådd en ytterligere økningseffekt i serumfritt medium bare ved tilsetning av substansene etter en 24 timers tilpasning av cellene til disse mediumbetingelsene.

Tabell 14 viser den prosentvise økningen av t-PA-produksjonen i afidikolin-behandlete kulturer etter tilsetning av Na-butyrat. Na-butyrat øker t-PA-syntesen med ytterligere 14% etter 96 timer.

Testen ble gjennomført med 1 txM af idikolin-behandlete CHO-celler som ble dyrket med og uten Na-butyrat i serumfri kultur. Verdiene gjelder 1 ml cellesupernatant, og er angitt i prosent i forhold til kontrollen (0%) (middelverdi ± SE, n = 4). t-PA-bestemmelsen ble gjennomført ved ELISA.

Virkninger av 6- hydroksy- 4, 6- dimetyl- 3- hepten- 2- on ( DHO)

t-PA-produksjonen økes etter behandlingen med forbindelsen ovenfor etter 144 timer. For stimuleringen av t-PA-syntesen var konsentrasjoner i det mikromolare området virksomme f.eks. 0,005 til 100 /xM.

I fig. 19 er fremstilt økningen av t-PA-produksjonen i CHO-celler som ble dyrket i inntil 168 timer i serumfritt

medium og 7 mM til 7 /zM DHO. Verdiene ble bestemt ved hjelp av DCA. I fig. 20 er angitt de tilsvarende verdiene som ble bestemt ved hjelp av ELISA.

Cellekulturer som ble fremstilt ved den ovenfor beskrevne metoden, kan omarbeides på kjent måte, for å isolere t-PA, f.eks. blir kulturmediet adskilt fra cellemassen etter produksjonsfasen, og cellesupernatanten renset ved ultra-filtrering og kromatografiske skritt.

Den isolerte t-PA kan deretter formuleres til farmasøyt-iske preparater, f.eks. som løsning eller frysetørket.

Man kan gjenta eksemplene ovenfor ved å bytte ut de t-PA-produserte CHO-cellene med transformerte CHO-celler som eksponerer andre proteiner, f.eks. t-PA-mutanter eller andre farmakologisk virksomme proteiner, som f.eks. i de ovenfor nevnte europeiske og tyske patentsøknadene, særlig CHO-cellene i EP-A 199574 og 196920 såvel som i DE-A 3708681.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for økning av t-PA- (eller varianter derav i stilling 117 og 270 til 279)- produksjon hos kulturer av transformerte CHO-celler, karakterisert ved at man tilsetter en tioglykolsyre, tiodiglykolsyre, L-cystein, glutation, butyrylcholinbromid, butyrylcholinklorid, nonaktinsyre, furanfettsyre, askorbinsyre, affidikolin, 6-hydroksy-4,6-dimetyl-3-hepten-2-on, fusarinsyre, mevalonsyre, trans-anhydromevalonsyre, anhydro-mevalon-syrelakton, cis-anhydromevalonsyre, anhydromevalon-syrelakton, cis-anhydromevalonsyrelakton, D-a-hydroksy-substituert (C3 eller C4) alifatisk mono- eller di-karboksylsyre, C3-C5 alifatisk monokarboksylsyre eller salt derav, til kulturen i en konsentrasjon på 0,005 mM til 500 mM.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som t-PA-induserende substans anvender smørsyre eller et salt derav.

3. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 og 2, karakterisert ved at man utfører dyrkingen i serumholdig medium.

4. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-3, karakterisert ved at man utfører dyrkingen i serumholdig medium.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at man tilsetter den C3-C5 alifatiske monokarboksylsyre eller dens salt i en konsentrasjon på ImM til 10 mM.

6. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-5, karakterisert ved at man dyrker cellene i nærvær av én av substansene valgt fra tioglykolsyre, tiodiglykolsyre, L-cystein, glutation, butyrylcholinbromid, butyrylcholinklorid, nonaktinsyre, furanfettsyre, askorbinsyre, afidicolin, 6-hydroksy-4,6-dimetyl-3-hepten-2-on, fusarinsyre, mevalonsyre, trans-anhydromevalonsyre, anhydromevalonsyrere-lakton, cis-anhydromevalonsyrelakton, D-a-hydroksysubstituert (C3 eller C4) alifatisk mono- eller di-karboksylsyre eller salter derav, fjerner cellene fra kulturen og deretter setter dem til et nytt dyrkningsmedium, og dyrker dem i nærvær av en av substans ene C3-C5 alifatiske monokarboksylsyrer eller deres salter.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at afidicolin er den førstnevnte substans, og smørsyre eller propionsyre er den C3-C5 alifatiske monokarboksylsyre, eller salter derav.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man anvender smørsyre og tioglykolsyre eller deres salter.