PT88751B

PT88751B - Processo para a preparacao de proteinas

Info

Publication number: PT88751B
Application number: PT88751A
Authority: PT
Inventors: Axel Zeeck; Rolf-Gunter Werner; Hans Zahner; Andrea Stecher-Schilling; William Werz
Original assignee: Thomae Gmbh Dr K
Priority date: 1987-10-13
Filing date: 1988-10-13
Publication date: 1995-03-01
Also published as: NO884549D0; HU205381B; KR890006671A; NZ226521A; HUT48306A; IL88001A; PT88751A; FI94963C; JP2688222B2; ES2064336T3; NO174778C; ATE112308T1; JPH01231887A; NO884549L; DK567888A; IE883079L; DE3851685D1; CA1341400C; FI884652A0; EP0315782B1

Description

Descrição da patente de invenção de LR.KARL THOMAE GESELLSCHAPT MIT BESCHRÀNKTER HAPTUNG, alemã, industrial e comercial, com sede em D-7950 Biberach an der Riss, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Andrea Stecher-Schiling, Dr. Rolf-Gunter Warner, Dr. William Werz, Prof.Dr. Hans Zahner e Prof.Dr. Axel Zeeck, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA 0 AUMENTO D.A PRODUTIVIDADE DE CULTURAS DE CÉLULAS PARA A SlNTESE DE QUAISQUER PROTEÍNAS

Descrição

GSP objectivo da presente invenção é um processo para a preparação de proteínas, especialmente de activadores de plasminogénio, como por exemplo t-PA (activador de plasminogénio de tecido tissue plasminogen activator) e os seus mutantes, especialmente um método para a elevação da produtividade de culturas de células (por exemplo de células CHO) para síntese de proteínas.

Os activadores de plasminogéneo consti· tuem uma classe de proteases de serina que activam a proenzima plasminogénio por cisão da ligação peptídica entre a Arg-560 e a Val-561 dando origem à enzima plasmina activa.A

plasmina, por seu lado, representa a última fase do sistema de fibrinólise da via sanguínea que provoca a cisão da efetrutura de fibrina de um trombo em peptídeos solúveis.

Quando se verificam perturbações patogénicas, como nas doenças coronárias, os coágulos sanguíneos não se dissolvem com rapidez suficiente para garantir um fornecimento suficiente de omigénio aos tecidos. A consequência da obturaç3o das artérias coronárias por um coágulo sanguíneo é um infarto, verificando-se em virtude da insuficiência de fornecimento de oxigénio do músculo cardíaco a necrose do tecido afectado.

Utna recanalização rápida dos vasos pode assegurar o abastecimento de sangue do músculo cardíaco num período muito curto e deste modo evitar a morte de regiões inteiras do coração.

Até agora na terapia tem sido utilizadas a estreptoquinase e a uroquinase. A_s propriedades do t-PA apresentam no entanto algumas vantagens em comparação com os açtivadores de plasminogénio conhecidos; a lise local específica da fibrina, a ausência de efeitos de lise sistémica por degradação da fibrina, uma alta velocidade de reperfusão e ausência de formação de anticorpos.

O t-PA é uma glicoproteína com um peso molecular de cerca de 65 000 Dalton que ocorre sob a forma de uma enzima de cadeia simples ou de cadeia dupla e que é consti tuida por 527 ácidos aminados.

A afinidade do t-PA para o plasminogénio é cerca de 100 vezes superior na presenÇa de fibnina do qu na ausência desta. Esta alta afinidade do tPA para o plasminogénio na presença de fibrina assegura a activação eficaz sem que o plasminogénio livre na periferia seja activado.

O t-PA humano foi obtido em primeiro lugar por Uteri sob forma pura. Também se detectou igualmente t-PA em outros tecidos e células, por exemplo em células endoteliais, incluindo células endoteliais arteriais e venosas.

As quantidades de t-PA formado são no entanto tão baixas que a sua obtenção comercial é impossível.

Uma outra fonte natural de t-PA é constituída por culturas de células. Foram investigadas várias linhas de células para a possibilidade de produção de t-PA (Gronow M. et al., Trends in Biotechnology 1 : 26-29, 1983).

A partir duma linha de células humanas, a linha de células de melonoma de Bowes, foi possível obter quantidadês mais elevadas de t-PA para estudos clínicos limitados bem como para esclarecimento da sua estrutura (Wallen et al., European Journal of Biochemistry 132 : 681-686, 1983),

Para a produção em massa de t-PA para utilização clínica alargada estes rendimentos são no entanto demasiadamente reduzidos. Apenas por manipulação genética foi possível preparar maiores quantidades de t-PA recombinante para a utilização terapêutica.

Em 1983 procedeu-se à clonagem do t-PA e averiguou-se a respectiva sequência de ácidos aminados (Pennica, Nature 301 : 214-221, 1983).

As investigações com o objectivo de obter t-PA a partir de E.coli por integração da informação genética para o t-PA a partir de células de mieloma tado uma vez que a proteína resultante não não tiveram bom res é glicosilada e íl portanto não corresponde ao t-FA nativo.

Por esta razão vários grupos de investigação escolheram para a produção de t-PA humano linhas de células permanentes de mamíferos de diferentes origens. Algumas destas linhas de células são linhas de células humanas com

um alegado rendimento melhorado de t-PA. Outra linha de células é constituída pelas células normais do ovários de hamster chinês.

Na publicação de pedido de Patente Europeia 009 3619 descreve-se a preparaçao de t-FA por células transformadas de ovário de hamster chinês (células CHO). O t-E resultante (r-tPA) não se diferencia de modo algum do t-FA de ocorrência natural.

Em várias publicações descrevem-se mutantes de t-PA e a respectiva preparação, por exemplo em EP-A 241 208, 241 209, 241 210, 240 334, 234 051, 233 013, 231 624, 225 286, 213 794, 201 153, 199 574, 196 920 e DE-A 3 708 681.

Nos referidos pedidos de patentes são mencionados todos os derivados mutantes de t-PA indiferenteaen te de conterem um ou vários ácidos aminados diferentes dos ácidos aminados nas mesmas posições de t-PA que ocrrre na natureza ou de um ou vários ácidos aminados não existirem nestes mutantes. Nm t-PA no qual vários resíduos de ácidos aminados do t-PA de ocrrrência natural estão ausentes, como na EP-A-1969 20, .é muitas vezes designado por espécie degradada.

No pedido de patente EP-A 199 574, por exemplo, descreve-se um mutante de t-PA que nas posições 270 a 279 possui ácidos aminados diferentes dos ácidos aminados nas posições correspondentes do t-FA natural.

No pedido de Patente DE-A 3 708 681 o requerente apresenta alguns t-PA’s que possuem na posição 177 um ácido aminado que é diferente do ácido aminado da posição correspondente no t-PA natural não sendo o t-PA mutante glicosilado nessa posição eo contrário do t-PA natural.

Em muitas publicações foi descrita a influência de diferentes substâncias sobre a produtividade de

culturas de células para a síntese de proteínas.

Em vários sistemas de células foi referida uma dependência entre o nível de c-AMP intracelular e a síntese de t-PA (ver por exemplo Kooistra et al. em Tbrombosis and Haemostasis, 54(1): 192, Abstract Ρ 1 133), verificando-se que a produção de t-PA em células endoteliais humanas é elevada 2 ou 3 vezes por dibutirilo-c-AMP mas não se verèfica qualquer influência sobre a síntese de t-PA em células de melanoma de Bowes. Em células renais a síntese de t-PA é aumentada por inibidores de fosfodiesterase (Journal of C_ell Biology 91 : 195-200, 1981). Por outro lado, o c-AMP inibe a síntese de t-PA em matrófagos (Vassalli et al., Cells, 8 x 271-281, 1976) e é indiferente em células de teratocarcinoma (Nishimune et al., Experimental Cell Research 146 : 439-444, 1983).

O ácido butírico induz a síntese de t-FA em células de teratocarcinoma (Nishimune - ver acima) mas tem uma acção inibidora em células de tumor renal (Nelson et al. Proc. Am. Ass. for Câncer Research, 26 x 35, 1985) e Brouty-Boye et al. Biotecbnology 12 x 10, 1984 relata uma actividade indiferente em células de pulmão embrionárias.

Em células endoteliais humanas a síntese de t-PA pode ser estimulada por trombina (Levin et al., Trombosis and Haemostasis, 56 (2) : 115-119, 1986), pelo álcool (Lang, Jgma. 250(6) x 772-776, 1983 B), pela vitamina C e pela vitamina A (Inada et al., Biochemical and Biophysical Communications 130 (1)x 182-187, 1985). A secreção do t—PA em células endoteliais de bovino, no entanto, é segregada pela trombina (Loskutoff, Journal of Clinicai Investigations, x 329-332, 1979) e por endotoxina (Crutchley et al., Journal of Biological Chemistry, 261(1): 154-159, 1986).

A secreção de t-PA a partir do endotélio de suíno é Imedida pela heparina (Marchwarct et al.,

Trombosis Research, 8 : 217-223) mas no entanto nas células embrionais de pulmão humano e heparina tem um efeito mínimo.

A síntese do t-PA foi, para além disso, influenciada de modo positivo pela concanavalina A em células embrionais de pulmão (Bronty-Boye - ver acima) e em cél las epiteliais (Electricwala et al., Thrombosis and Haemostasis, 53 : 200-203, 1985), pela 5-azacdtidina em células epiteliais (Electricwala - ver acima) e em células de melanoma (Silagi et al., Biological Medicine, 57 s 418, 1984), pela tiazabrina em células de melanoma (Roba et al., Thrombosis and Haemostasis 50(1): 83, 1983) e pela afidicolina em células de hepatoma (Orfanoudakis et al., Biological Chemistry, Hoppe-Seyler, 336(9): 832, 1985).

N_a publicação de pedido de Patente Europeia 0219270 descreve-se que uma combinação de heparina e de factor de crescimento de células epiteliais (ECGF) aumenta a produção de t-PA e de activador de plasminogénio de uroquinase de cadeia simples a partir de células diploides de fibroblastos de pulmão.

A influência de ácido butírico sobre as células de ovário de hamster chinês é relatada por von Storrie et al., Journal of Cell Physiology, 94 : 69-76,

1978, e Wright, Experimental Cell Research, 78 : 456-460, 1978. As investigações no entanto foram levadas a efeito com linhas de células não transformadas e os resultados referem-se em geral e em pormenor às alterações da morfologia e da velocidade de crescimento das células.

A presente invenção refere-se a um processo para aumentar a produção de proteínas em culturas de células que produzem estas proteínas adicionando à cultura de células uma substância que induza a produção da proteína caracterizado por a substância indutora da produção de proteína utilizada ser ácido tioglicólico, ácido tiodiglicólico.

L-cisteína, glutatião, brometo de butirilcolina, cloreto de butirilcolina, ábido nonactínio, um ácido furânico gordo, ácido ascórbico, afidicolina, N-hidroxi-4,6-dimetil-3-heptano-2-ona, ácido fusarínico, ácido mevalónico, ácido transanidromevalónico, lactona do ácido anidromevalónico, lactona do ácido cis-amidromevalónico ou outro ácido monocarboxílico ou dicarboxílico alifático (C^ ou C^) substituido por um grupo D-a-hidroxilo ou os respectivos sais.

As proteínas consideradas são de preferencia os activadores de plasminogénio especialmente o t-PA e os seus mutantes. As vantagens do processo da presente invenção são no entanto independentes das proteínas e dos ADN que codificam para estas proteínas e o processo e por consequência aplicável a células CHO transformadas para expressarem qualquer proteína estranha.

Os t-PA mutantes são derivados de t-PA que apresentam um ou vários ácidos aminados que são diferente dos ácidos aminados nas posições correspondentes do t-PA natural ou em que um ou vários dos ácidos aminados do t-PA natural não existem. Alguns destes mutantes de t-PA são descritos na literatura, especialmente em EP-A 199 574 e DE-A 3 708 581).

O processo da presente invenção é de pre ferência levado a efeito com células de CHO transformadas.

Para além disso verificou-se que os ácidos monocarboxílicos alifáticos C^ - C^ e os seus sais podem fazer aumentar a produção de t-PA e dos respectivos mutantes em culturas de transformantes de células de CHO.

Ag substâncias preferidas que promovem o aumento da produção de proteínas são ácidos tioglicólico, ácido monactínico, ácido butírico e ácido propiónico.

As substâncias que promovem o aumento de produção de proteínas são produtos comerciais ou produtos conhecidos da literatura ou podem ser preparados por métodos conhecidos.

Os compostos de brometo de butirilcolina e cloreto de butirilcolina, ácido fusarínico e lactonas de ácido mevalónico são produtos comerciais e podem ser obtidos por exemplo na sociedade Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA.

O ácido nonactínico e um processo para a sua preparação são descritos por exemplo em Helv. Chim.

Acta, Vol. XLV, (1982), N^fl 15-16, pág, 129-138? Tetrahedron, Vol. 36, Na 1, pág. 46-49 e J. 0_rg. Chem., 1980 45, pág. 4259-4260.

Diversas publicações descrevem os ácidos furânicos gordos, por exemplo, Lipido, 1977, 12(10), 828-36, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1976, (16), pág. 630-1,

Lipido, 1975, 10(11), pág. 695-702 e Fette, S_eifen, Austrichmittel, NS 8, 1986, pág. 290-292.

Os ácidos deste tipo podem também ser preparados por síntese de acordo com o seguinte esquema reaccional:

a)

CH.

CH

CH.

ch₃ (ch₂)

H

O + BrMg(CH₂)_n-TOA-f CH₃(CH₂)

A\ (CH₂)_n-T0A

Hidrólise

CH_(CH„, z m

(CH-) -COOH 2 n em que m = 2 a 5, de preferência 4, n = 7 a 12, de preferên-

b)

-TOA n

Hidrólise

A preparaçSo dos compostos 2 e 6 é descrita por Voss et al., Ηθίν. Chim. Acta, 1983, 66, 2294.

De preferencia m e 4 e n é 8 ou IO.

A preparaçSo de ácido trans-anidromeva iónico é descrita por H. Dieckmann em O Isolamento e a Preparação de ácido trans-3-hidroxi-3-metil-pentano-2-carboxílico, Arcbiv fúr Mikrobiologie, 62, 322-327 (1986). Os compostos lactona do ácido anidromevaiónico e lactona do ácido cis-anidromevalónico e a respectiva preparação são descritos por Keder et al., em Die Bildung von /2 - Arihydronmavalonsãurelacten durch verschiedene Pilze, Biochem Zeitschrift, 341, 378-386 (1965).

composto 6-hidroxi-4,6-dimetil-3-hepteno-2-ona pode ser preparado por processos de acordo com o estado da técnica, Este composto é também uma substância natural e pode ser isolado a partir de CaPlscum :annus var. angulosum, conforme se descreve em C.A. 97 : 159552f e Eiyo to Shokuryo 1982, 35(2) 95-101. Este composto é igualmente descrito na Tese Neue Sekundarstoffe aus Streptomiceten: Isolierung und StrukturanfklSrung der Colabomycine, Pyrrolame und des Pyridazomycins de Grote, R., Universidade de Gottingen, 1987, bem como a respectiva preparação por cultura de Streptomyces olivaceus (estirpe Tu 3082, depositado na D_eutscben Sammlung fur Mikroorganismen em 23 de Novembro de 1987 de acordo com o Tratado de Budapeste sob o ns 4309) e por isolamento. E_ste composto tem o seguinte espectro de NMR:

^C9^H16°₂ (156, 23)

EI-MS : m/e = 138 (M⁺ - H₂0, Soluç3o diluída, CgR^O, 6%);

123 (M⁺ - CH₅0, 8 %)? 98 (SoluçSo diluída, Ο^θΟ, 48 %) ; 83 (100 %) ¹H—NMR : (200 MHz, CDC1₃): £ = 1,27 (_s. 7-H₃ e 8-H₃) 1,43 (s, longo, HO, por permuta com MeOD) ? 2.21 (s, 1-H₃

2,35 (a. J » 1,3 Hz, 9-H₃); 2,3 2 (s, largo, 5-H₂);

6,13 (s, largo 3-H) ppm ¹³C-NMR : (50,3 MHz, CDCl-j) : £= 22,0 (o, C-9); 30,0 (o, 2C,

C-7 e C-8) 32,0 (o-Cl); 54,4 (u, C-5); 71,1 (u, C-6) _} 127,2 (o, C—3) y 155,1 (u, C-4); 198,6
(u.	C-2) ppm.

Os sais considerados dos ácidos referidos são especialmente sais de metais alcalinos, de preferência sais de sódio e de potássio.

O processo da presente invenção pode ser levado a efeito em meio contendo soro ou de preferência em meio isento de soro.

Quando o processo e efectuado em meio contendo soro é preferido utilizar por exemplo ácido tioglicólico, ácido nonactínico ou um ácido furânico gordo ou os respectivos sais.

S_e o processo e efectuado em meio isento de soro utiliza-se de p referencia um ácido monocarboxílico alifático Cg-Cj-, especialmente ácido butírico ou ácido propiónico ou os respectivos sais.

Verificou-se que os compostos que aumentam a produção de proteínas apresentam esta actividade a concentrações entre 10 uM e 500 mM, por exemplo entre 1 mM e 10 mM. Os ácidos modocarboxílicos alifáticos (C--C,.), o ácido tioglicólico, o ácido tiodiglieólico, a L-cisteina e glutatião ou os respectivos sais apresentam actividade especialmente entre 1 mM e 10 mM.

As substâncias que aumentam a produção de proteínas podem ser addéionadas à cultura em determinados momentos, por exemplo, no dia 0, isto é, no início da cultura, até ao fim do terceiro dia da cultura.

Também se podem utilizar as substâncias que aumentam a produção de proteínas em várias aplicações. T_ambém se podem cultivar as células na presença destas substâncias, separar as células da cultura e adiciona-las nesse momento a um novo meio de cultura e cultivar de novo na presença de uma substância que aumenta a produção de proteínas

Neste método de aplicação em várias adições os ácidos monocarboxílicos alifáticos C3-C5 apresentam especialmente um efeito de aumento de produção, de preferencia o ácido butírico, o ácido tioglicólico e os seus sais.

No método de aplicação em várias adições não é necessário utilizar a mesma substância para todas as aplicações, sendo possível utilizar uma substância numa aplicação e outra substância na aplicação seguinte. E_ste método de aplicação em várias adições mostra igualmente também um efeito de aumento de produção, como mostra por exemplo a utilização de afidicolina numa aplicação e de uma das outras substancias, por exemplo ácido butirtco, ácido propionico, cloreto de butirilcolina ou brometo de butirilcolina ou os seus sais, numa outra aplicação.

Também se podem utilizar combinações de duas ou mais substâncias. D_e preferencia não se utiliza mais do que uma substância que iniba o crescimento celular. Pode utilizar-se um ácido monocarboxílico alifático C^-C^, de preferêacia ácido butirico ou ácido tioglicólico ou os seus sais, sendo de preferência adicionado o ácido monocarboxilico ou um seu sal como segunda substância à cultura celular.

células do ovário de hamster chinês transformadas significam células CHO que foram transformadas crm um vector que codifica para a proteína pretendida, podendo as células em crescimento sintetizar e exprimir a proteina.

As células de ovário de hâimster chinês transformadas podem ser, por exemplo, as células que se encon tram descritas nos pedidos de Patentes Europeias 0093619 e 0199574 e no pedido de P_atente Alemã 3708681. Por cultura destas células CHO transformadas é possivel preparar t-PA (EP-A 0093619) e os referidos mutantes de t-PA (EP-A 0199574 e DE-A 3708681). A transformação de células CHO com

vectores de modo a que as células possam expressar outras proteínas é efectuada pela técnica conhecida da literatura como por exemplo nos pedidos referidos de patentes europeias e alemã.

A_s células hospedeiras utilizadas podem ser as células designadas por CHO-Kl que foram isoladas em 1957 por Puck a partir de material de biópsia e as células depositadas em 1970 na American Type Culture Collection (ATCC) sob a designação CCL-61. E_sta linha de células foi novamente depositada na ATCC em 23 de D_ezembro de 1987 de acordocom o Tratado de Budapeste sob o ns CRL 9618.

É possível preparar a sequência de ADN que codifica para a proteína pretendida por meio de técnicas já conhecidas da literatura, por exemplo em vários dos pedidos de Patentes referidos anteriormente. Os vectores que apresentam esta sequência e também as sequências de regulação podem ser construidos de acordo com métodos conhecidos em si, por exemplo usando Ξ. coli K 12294 (ATCC 31446) e E. coli X 1776 (ATCC 31537) que foram depositados de novo na ATCC em 23 de Dezembro de 1987 de acordo com o Tratado de Budapeste sob os números 53704 e 53705 como, por exemplo, es plasmídeos pETPER e pETPFR, que são descritos na EP-A 093619. Ag células CHO podem ser transformadas pelos métodos descritos nas EP-A 093619, DE-A 3708681, EP-A 0117059 e EP-A 199574 ou por outros métodos conhecidos da literatura.

vector para a produção de t-PA foi integrado num subclone, CHO-Kl-DUX Bll, (Urlaub et al., Proceedings of the N_ational Abademy of Science, USA, 77: :4216-4220, 1980). E_gta linha de células, um mutante negativo em relação da redutase de di-hidro folato (DHFR ), é apropriada para a selecção dependente de DHFR do clone celular transfectado. O vector para o ADN-c humano pode ser um vector plasmídico conhecido pBR-322 ou os seus descendentes de Escherichia coli. A região do promdcor para o gene considerado

e para o gene de DHFR é originário em SV 40 e a região de terminação para os dois genes de um antigene de superfície da hepatite B. Nos exemplos usaram-se células CHO-Kl-DUX Bll que foram transformados pelos plasmídeos pETPER ou pEPEFR (ver EP-A 0117059).

Na composição dos meios isentos de soro entram diferentes produtos conhecidos (ver por exemplo BMFT - Statusseminar 12, 13 Novembro de 1985, Bundesministerium fur Forschung and Technologie, 5300 Bonn 2, pags. 111-120). No exemplo que se segue utiliza-se um meio após secreção DMEM/Ham's F 12 (1 : 1) (Gibco). Utilizou-se como aditivo soro fetal de vitela (SFV) numa concentração de 7,5% ou de 1 a 2%.

As culturas celulares foram incubadas a 37° numa estufa de incubação Hereaus e foram arejadas com uma mistura de dióxido de carbono e ar com 7,5% e uma humidade relativa de 100%. Conforme a fase do processo utilizam-se diferentes recipientes de cultura s balões cónicos para 100 a 1000 ml de meio, garaffas de Roux (Nunc) de 175 cm² (70 a 100 ml de meio), de 75 cm² (30 a 50 ml de meio) e de 25 cm (7a 10 ml de meio) e recipientes de cultura múltipla de Costar com 2 cm para culturas de 1 ml. Para a conservação da estirpe utilizaram-se as células numa densidade de 0,2 a 0,3 x 10⁶ células/ml e subclonaram-se de 2 em 2 ou de 3 em 3 dias.

As substâncias que estimulam a produção de proteína podem ser mencionadas em diferentes momentos sempre numa diluição de 1 : 100, isto e, devem ser primeiramer te dissolvidas numa quantidade de meio ou, se são pouco solúveis, devem ser dissolvidas em etílico e em seguida adicionadas sendo em seguida o meio contendo numa proporção de 1 : 100 v/v ao primeiro lugar em álcool a uma quantidade de meio, esta substância adicionado meio que contém as células.

Nos exemplos que se seguem, a fim de suscitar a estimulação da síntese de t-PA, tomaram-se as células numa cultura em fase de crescimento exponencial e separaram-se por centrifugação em tubos de plástico (Falcon) durante 10 minutos a 1000 x g numa centrifuga Beckmann T 3-6. Após decantação do sobrenadante ressuspendeu-se o agregado celular em meio fresco.

Para a produção de t-PA em meio contendo soro utilizou-se para meio fresco um meio F12/DMEM com 7,5% de SFV e gentamicina. A suspensão resultante pode ser depositada em placas de 24 alvéolos de 2 cm a uma densidade celular de 0,2 a 0,3 χ 10 ⁶ células/ml.

Para a produção de t-PA em meio isento de soro as células foram adaptadas previamenté durante 3 a 4 dias num meio de 1 a 2 % de SFV, em seguida foram novamente separadas por centrifugação e o agregado celular foi ressuspenso em meio isento de soro, sendo finalmente transferidas em placas de 24 alvéolos de 2 cm a uma densidade celular de 0,4 a 0,5 x 10θ células/ml.

Determinação quantitativa de t-PA

Colheram-se ou prepararam-se aliquotas do sobrenadante celular e extractos celulares a diferentes momentos. A análise das amostras foi efectuada imediatamente ou após conservação a -20°C com o seguinte método:

MÉTODO DE DETERMINAÇÃO

- Análise cromoqénica directa (ACD)

A partir do substrato peptídico sintético S-2288 (D-H-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilina) da companhia Kabi Diagnostica obteve-se p-nitroanilina como produto da reacção com t-PA. A actividade do t-PA é proporcional à for15 mação de p-nitroanilina medida a 405 nm a 37°C.

A determinação espectrofotomética da cinética enzimática foi realizada automaticamente com um aparelho de análise ACP-5010 da companhia Eppendorf.

A actividade da enzima foi calculada por meio do padrão previamente preparado. Preparou-se uma série padrão de t-PA de 1 a 15 ^ug/ml com um padrão de laboratório formado em 72 % de material de cadeia simples.

A solução de substrato (Tris 100 nM/NaCl 106 mM) foi utilizada numa concentração de 50 mM.

- Elisa

A_s amostras de t-PA do sobrenadante e dos extractos celulares foram analisados quantitativamente por meio de uma técnica de ELISA (Enzyme-linked-imuno-sorbent-assay). O padrão utilizado foi um padrão de laboratório numa série padrão de concentrações de 0,038 a 5 ug/ml.

Ag amostras foram previamente diluídas de 1 : 10 a 1 : 1000.

Caracterização das células CHO transformadas

Crescimento celular

Inocularam-se as células CHO em recipientes de cultura com 0,2 a 0,3 χ 10 θ células/ml (em meio com 7,5% de SFV) e de início verificou-se um crescimento muito lento. Logo após uma fase latente de 24 horas iniciou-se o crescimento celular exponencial. A uma densidade celular de 1,3 - 0,04 x 10 células/ml as prineiras células não vitais em cultura apareceram ao 4s dia; a proporção destas células em relação à quantidade total de células era de

13,2 * 1,3 %. Atingiu-se a densidade celular máxima ao 52 dia com 1,8 - 0,05 x 10^ células/ml (Fig. 1).

O número de células vivas era após 7 dias ainda de 72 - 3 % da massa celular total.

A fase estacionária, que se segue à faee exponencial, é iniciada por diferentes factores. A uma alta densidade populacional e com o esgotamento de nutrientes essenciais as células deixam de se dividir. A duração da fase estacionária varia fortemente e depende dos componentes do meio, como por exemplo da presença de soro. Uma acumulação de ácidos e de metabolitos tóxicos bem como modificações do meio (pH mais ácido, pressão parcial de 0₂ mais baixa, arejamento escasso) implicam igualmente a morte das células.

Produção de t-PA em células CHO

Existe uma relação linear entre o crescimento celular e a síntese de t-PA.

Durante o decurso da produção de t-PA verifica-se e ocorrência de 2 fases. Na 1« fase a concentração de t-PA no sobrenadante aumenta continuamente. Na 2« fase a síntes enzimática torna-se praticamente estacionária e a concentração de t-PA no meio conserva-se quase constante (Figura 2A). A concentração máxima de t-PA no 4® dia atingiu 11.1 - 0,7 /ig/ml por Elisa. As concentrações determinadas de t-PA com a análise cromogénica são um pouco superiores, o que pode ser resultante da ocorrência de t-PA de cadeia dupla, mas as curvas dos dois métodos de determinação mantem-se paralelas até ao 4s dia.

A concentração intracelular de t-PA varia igualmente de forma paralela ao crescimento celular e é relativamente reduzida em relação a quantidade global de t-PA sintetizado. Ao 4s dia esta quantidade é de cerca de 7 % da actividade total (Figura 2B).

Como se verifica na Figura 3A a síntese de t-PA aumenta ligeiramente em relação ao número de célulse até ao 42 dia; com o método de E^isa determina-se 8,1 - 1,2 zug de t-PA/1 x 10° células. O t-PA ligado às células foi determinado apenas com o método de Elisa, uma vez que estas concentrações reduzidas de t-PA ( 1 ^g) não pode ser detectado por meio de ACD.

O conteúdo intracelular de t-PA, calculado em relação ao número de células, durante a fase exponencial é utn pouco mais elevado e situa-se entre 500 e 900 ng de t-PA / 1 x 10^ células e a partir do 42 dia o valor de t-PA situa-se em cerca de 450 ng / 1 x 10θ células (Figura 3B).

Influência do soro e dos factores de soro sobre o crescimento celular e sobre a produção de t-PA em células CHO

As células foram cultivadas em meio /

com O,25 x 10 celulas/ml a diferentes concentrações de soro.

Uma concentração de soro inferior a 5% no meio tem uma acção negativa sobre a divisão celular mas a produtividade é pouco influenciada.

A influencia da concentração de soro no meio sobre o crescimento celular e sobre a produção de t-PA após uma incubação de 48 h das células é apresentada no Quadro 1. Os valores são dados em % do valor máximo (7,5 % de Sfv no meio). O valor máximo para o número de células é de 0,56 - 0,03 x 10 células e para a concentração de t-PA de 5,7 í 0,5 ug/ml. As determinações de t-PA foram efectuadas por meio de ACD (valor médio í DP, n = 4) .

Quadro 1

% de SFV	Numero de células	t-PA
40	61,5 í 2,8	59, 2 - ^3,9
20	79,4 + 3,8	81, 2 + 2,4
10	88,6 + 5,3	90,3 + 6, 7
7,5	100,0 + 6,4	100,0 + 7,9
5	72,4 + 4,9	87,0 + 11,3
1	43,1 + 1,S	79,2 + 6,7
0	37,5 +1,8	75,4 + 4, 6
Cultura celular	em meio isento de soro
	A_g células foram cultivadas em meio
isento de soro	a uma densidade celular de 0	,4 a 0, 5 x 10
células/ml. As	células dividiram-se até ao	42 dia e 0 número

de células vivas mais elevado foi atingido igualmente no 4s dia com 1,0 + 0, 2 χ 10 θ células/ml (Figura 4).

Produção de t-PA em meio isento de soro

A concentraçSo de t-PA no sobrenadante aumenta continuamente até ao 72 dia e atinge com o método de Ejisa um máximo de 13, 6+0,54 ^ug/ml. Os valores de t-FA determinados por meio de ACD situam-se do is ao 32 dia abaixo dos valores determinados por Elisa e a partir do 42 dia acima destes (Figura 5).

A síntese de t-PA por célula em meio isento de soro atinge valores aproximadamente tão elevados como em meio com soro e situa-se entre 7, 2 + 3, 6 e 10,3 +2,8

/ig / 1 χ 10 θ células (Elisa) (Figura 6).

A fracção t-PA em percentagem em meio isento de soro sobre a quantidade total de proteína de sobrenadante situa-se entre 10,9 + 1,0 e 12,5 + 1,4 %. Os resultados são apresentados no Quadro 2. Os valores de t-PA foram determinados por meio de Elisa (valor médio + DP, ns 4).

QUADRO 2

Dia	Proteína ( jug / 1 x 10⁶ células)	t-PA ( >ug / 1 χ 10⁶ células)
1	71,0 + 8,0	7, 2 +	3,6
3	81,8 +9,4	9,0 +	2, 3
5	82,0 + 12, 2	9,3 +	0,8
Efeito	dos ácidos monocarboxílicos	alifáticos

aumento da produção de t-PA em células CHO em meio com 7,5 % de SFV por diferentes ácidos monocarboxílicos alifáticos é dada no Quadro 3. Todos os ácidos foram usados numa gama de concentração de 10 mM a 500 mM. A gama óptima de dosagem para todos os ácidos monocarboxílicos situa-se entre 1 a 10 mM. A actividade dos ácidos depende do comprimento da cadeia.

T_odos os ácidos monocarboxílicos aetivos inibem a crescimento celular. Os ácidos propiónicos, butírico, isobutírico e isovalérico são aetivos numa gama de concentração mais alargada, uma vez que a inibição dependente da concen tração do metabolismo primário, que provoca a inibição do crescimento celular, se sobreprõe ao aumento da síntese de t-PA. Os valores do Q_uadro 3 estão referidos a 1 ml de sobre20

nadante celular e são dados em % em relação aos ensaios de comparação (0 %). A determinação de t-PA foi efectuada por meio de ACD (valor médio + DP, n=3 a 24). Os valores máximo refere-se a um único ensaio. Os dados de ensaios isolados são dados entre parêntesis.

QUADRO 3

Ácido Gama óptima % de aumento da monocarboxilico de dosagem síntese de t-PA

Máximo Medio

Ácido	fórmico	100 àiM	7,4	6,5	+ 0, 9
Ácido	propiónico	5-10 mM (10 mM)	45,5	28,0	+ 2,5
Ácido	butírico	1-5 mM ( 1 mM)	68, 3	41, 9	+ 3,8
Ácido	isobutírico	0,6-10 mM (10 mM)	32, 9	16, 6	+ 2,8
Ácido	isovalérico	1-20 mM ( 5 mM)	39, 3	18, 7	+ 2,4

Os valores médios referem-se a vários ensaios de produção com 3 a 4 dias tendo os ácidos monocarboxílicos sido adicionados desde o dia O até ao dia 3 da cultura, como se apresenta seguidamente no Quadro 3A. Os dados de cada amostra são dados entre parêntesis.

QUADRO 3A

Ácido Dia da Dàa da tnonocarboxílico adição amostragem n

Ácido	fór mico	10	(0)	2-3	(2)	4
Ácido	propiónico	0-3	(2)	1-4	(3)	24
Ácido	butírico	1	(3)	2-4	(3)	18
Ácido	isobutírico	0-2	(3)	2-4	(3)	11
Ácido	isovalérico	0-2	(4)	1-4	(4)	19

n = número de ensaios

Na Figura 7 apresenta-se o aumento da produção de t-PA em função do tempo em meio com 7,5 % de SFV por ácidos monocarboxílicos C3-C5. Após 24 h é já detectável uma estimulação da produção de t-PA de 18,1 + 5,7 % (C4) até 24,8 + O,5 % (C5). Com o ácido isobutírico verifica-se um aumento da produção logo após 48 h. Atingiu-se um aumento máximo da produção de t-FA para os ácidos carboxílicos C3 e C4 ao 32 dia com 37, 2 + 5,1 % para o butirato de sódio. 0 aumento da produção verificou-se para os ácidos butirico e isobutírico apenas durante um período curto, já não se observando qualquer efeito ao 42 dia. A actividade de aumento da produção dos ácidos propiónico e isovalérico verifica-se ainda n® 42 dia e manifesta-se num aumento de produção de t-FA de 31,8 % para o ácido C3 e de 8, 5 % para C5.

Os efeitos são dependentes além do observado do estado fisiologico das células. Durante o crescimento exponencial as células estão no seu máximo de susceptibilidade para uma estimulação.

No Quadro 4 apresenta-se o aumento da produção de t-PA em células CHO em meio com 7,5 % de SFV por

meio de ácidos monocarboxílicos C3-C5 em função do dia de aplicação dos ácidos carboxílicos após 48 h de crescimento das células em meio com Ί,5 % de SFV. A concentração era de 1 mM para o ácido butírico e o ácido isovalérico e de 5 mM para o ácido propiónico e para o ácido isovalérico. Os valores referem-se a 1 ml de sobrenadante celular e são dados em % em relação ao padrão (0 %) (Valor médio + DP, n = 3 a 5). A determinação do t-FA foi levada a efeito por meio de ACD.

QUADRO 4

Dia da aplicação

O 28,7 + 9,3 33,0 + 5,4 20,1 + 10,7 17,2 + 1,0

24,4 + 4,1 40, 2 + 12, 2 25,3 + 5,1 19,4 + 1,5

Efeito do ácido butírico sobre a produção de t-PA em células

O efeito de estimulação é seguido de um aumento tanto da concentração intracelular de t-PA como também da concentração extracelular de t-PA.

Conforme se apresenta na Figura 8. o valor do conteúdo intracelular de t-PA em culturas tratadas com butirato atinge o seu máximo em relação aos valores de comparação após 24 h de incubação. No sobrenadante o aumento de produção em percentagem é após 24 h um pouco mais reduzido com um valor médio de 19,2 % (ACD e Elisa) em relação aos valòres de comparação, Egte efeito verifica-se no sobrenadante até ás 72 h.

N_a Figura 9A-C apresenta-se a sintese de t-PA em relação ao número de células, verificando-se que

a estimulação da síntese de t-PA pelo butirato de sódio se conserva até ao 72 dia apesar da inibição do crescimento celular. Durante os primeiros 4 dias a síntese enzimática por célula aumenta continuamente. A concentração de t-PA aumenta de 7, 5 + 1,1 jig até 28, 9 + 5,3 jjg de t-PA / 1 x 10^ células (Elisa) no sobrenadante (Figura 8A). Como o método de AGD determinou-se um conteúdo intracelular de t-PA máximo de 47,4 + 7,4 >ig de t-PA / 1 χ IO⁶ células (Figura 9B). Simultaneamente reduz-se o conteúdo intracelular de t-PA, diminuindo de 1,5 +0,2 /ig de t-PA / 1 χ 10⁶ células no 5a dia (Figura 9C).

No Quadro 5 apresenta-se a estimulação da síntese de t-PA pelo butirato de sódio num meio oom 7, 5 % de SFV em função do número de células. 0 butirato de sódio foi adicionado no dia O numa concentração de 1 mM. Os valores nos dias 1 a 4 são apresentados em % em relação ao ensaio de comparação (0 %) e são referidos a 1 χ 10 ⁶ células. 0 conteúdo em t-PA no sobrenadante e no extracto celular foi determinado por Elisa (valor médio + DP, n = 5 a 10).

QUADRO 5

Dia	Intracelular	Extracelular
1	90,9 +9,5	68, 5 +12,4
2	99, 7 + 26,3	118,8 + 16,1
3	93,9 + 31,4	223,4 + 77,4
4	209,8 + 41,4	280, 7 + 85, 9

Atingiu-se um aumento óptimo de produto quando o butirato de sódio foi adicionado durante o crescimen to celular exponencial. O efeito máximo do butirato de sódio verificou-se para períodos de aplicação desde o dia O até

ao dia 2 sempre no 3s dia (Figura 10).

P_or meio da aplicação de butirato de sódio todos os 22_S ou 32s dias após a mudança de meio na mesma população celular tornou-se possível manter a produção de t-PA durante um período longo num nível elevado.

No Quadro 6 apresenta-se o aumento da produção de t-PA em células CHO que foram cultivadas em meio com 7,5 % de SFV. A cada mudança de meio ou apenas no dia O adicionou-se butirato de sódio 1 rcM. Os valores dos dias 2, 4, 7 e 9 após a mudança de meio sâo dados em % em relação ao ensaio de comparação (O %) e referem-se a 1 ml de sobrenadante celular. A determinação de t-PA foi levada a efeito por meio de ACD (valor médio + DP, n = 3).

QUADRO 6

Dia de Mudança de Meio

Dia de

Aplicação 0, 2, 4, 7

2	33,0	+	5,4
4	107,4	+	7,6
7	96,6	+	5, 8
9	62,0	+	4,8

Efeito do ácido butíllco sobre a produção de t-PA em células

CHO em meio isento de soro

Ao contrário do efeito de curta duração do estímulo provocado pelo butirato sobre a síntese de t-PA em meio contendo soro, quando se trata de meio isento de soro, o efeito conservou-se durante um período superior e elevou-se 1 dia após a aplicação de butirato de sódio a 44,1

+ 7,1 % em relação ao ensaio de comparação. Atidgiu-se um aumento de produto máximo de 3 dias após a aplicação de butirato de sódio com 143,3 + 12,8 %. O efeito de aumento da produção é ainda detectável 6 dias após a adição de butirato de sódio com 49,9 + 7,0 % (Figuras 11 e 12).

, 6

A síntese de t-PA referida a 1 x 10 células é igualmente mais elevada em meio isento de soro do que em meio contendo soro e eleva-se a valores superiores a 50 _xug / 1 χ 10 ⁶ células (Figura 13).

Efeito do ácido propiónico ácido carboxílico C3 apresenta um efeito sobre a síntese de t-PA muito semelhante ao do ácido butírico. O aumento em percentagem é no entanto cerca de 14 % mais reduzido e são necessárias concentrações superiores (5 a 10 mM para o estímulo do t-PA). Para além disso, o ácido propiónico inibe em escala mais reduzida o crescimento celular e conduz em consequência a um aumento da síntese de t-PA de duração mais prolongada.

Verifica-se que a estimulação da síntese de t-PA pelo ácido propiónico é muito específica, ao contrário com o que se observou com o ácido butírico, uma vez que em meio isento de soro o conteúdo extracelular de proteínas é apenas um pouco mais elevado em relação ao ensaio de com- 3 paração e que a formação de / H_/-leucina apenas foi aumentada ligeiramente.

Efeito de ácidos dicarboxílicos, de ácidos hidrocarboxilicos e de ácidos cetocarboxílicos sobre a produção de t-PA em células CHO

Os ácidos hidrocarboxílicos, como o ácido láctico, o ácido glicérico, o ácido málico e o ácido tartárico apresentam apenas um ligeiro aumento da sintese de

t-PA que se situa entre 6 e 10 %, enquanto que o rcido tartárico numa concentração de 10 mM estimula de um modo mais marcado a síntese de t-PA (10,3 + 2, 9 % em relação ao ensaio de comparação). A divisão celular não é influenciada pelos ácidos hidroxicarboxilicos e o efeito sobre a síntese de t-PA apenas é detectável após 96 horas.

Efeito do ácido ascórbico

A actividade do ácido ascórbico a uma concentração de 10 mM sobre a produção de t-PA conserva-se durante 72 horas e provoca um aumento da síntese de t-PA de 15,2 + 3,1 % após 24 horas para uma apèicação no dia L (Figura 14).

Efeito de ácidos gordos de cadeia longa sobre a produção de t-PA em células CHO

Verificou-se que os ácidos gordos de cadeia longa, como o ácido monactínico com 10 átomos de carbono e ácidos furânicos gordos, podem provocar um aumento da produção de t-PA (Quadro 7). Neste exemplo utilizou-se um ácido furânico gordo de acordo com a fórmula 4 na qual m = 4 e n = 8.

Em meio isento de soro no entanto não se verifica qualquer aumento da síntese de t-PA nem da síntese de proteínas.

aumento da produção de t-PA em células CHO pelos ácidos gordos de cadeia longa é apresentado no Quadro 8. As células foram utilizadas em meio com 7,5 % de SFV. Os ácidos foram experimentados numa gama de concentrações desde 10 até 10 mM verificando-se que a concéntração óptima era de 1 mM. Os valores estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular e são dados em % em relação ao ensaio de comparação (0 %) (valor médio + DP, n = 4 a 9). 0 valor

máximo refere-se a uma única amostra. A determinação do t-PA foi efectuada por ACD.

QUADRO 7

Ácido gordo

Ácido monactinio Ácido gordo furânico % de aumento da síntese de t-PA

Máximo Medio

58,3 30,3 + 6,5

32,1 19,0 + 3,2

Os valores médios referem-se a várias situações de produção de 4 dias, tendo os ácidos sido adicionados no dia O, conforme se apresenta no Quadro 8A. Os dados para amostras isoladas são apresentados entre parêntesis.

QUADRO 7A

Ácido gordo

Dia da adição

D±a da amostragem n

Ácido monoctínico O(o)

Ácido gordo furânico 0(0) a 4 (2) 4 a 4 (2) 9

Efeito de tlóls e de sulfitos sobre a produção de t-PA em células CHO

Quatro compostos contendo enxofre, que representam derivados ou produtos de substituição de ácidos carboxílicos, apresentam um aumento da produção de t-PA entre 16 % e 31, 2 % sem que mostrem qualquer influência negative.

sobre o crescimento celular (Quadro 8). Os ácidos carboxílicos substituidos apresentam a sua acção óptima na mesma gama de concentrações (1 a 10 mM) do que os outros ácidos carboxílicos activos. Apenas o glutatião era eficaz numa gama de concentrações inferior (1 a 10 ;uM). 0 ácido tioglicólico mostrou ser o estimulante preferido da síntes de t-PA em células CHO.

Neste exemplo as células foram cultivadas num meio com 7,5 % de SFV. Todas as substâncias foram experimentadas numa gama de concentrações de 1 ,λιΜ a 10 mM.

Os valores no Quadro 9 referem-se a 1 ml de sobrenadante celular e são dados em % em relação ao ensaio de comparação (0 %) (Valor médio + DP, n = 6 a 19).

O valor máximo refere-se a uma única amostra. A determinação de t-PA foi efectuada por meio de ACD. A concentração da substância é dada entre parêntesis.

QUADRO 8

Tj_óis e sulfuretos	Gama de concentração óptima	% de aumento da síntese de t-PA
Máximo	Medio
Ácido tioglicólico	1 mM	66,4 31,2	+ 3, 2
Ácido tiodiglicólico	1 mM	31,0 18,0	+ 3,8
L-cisteina	1-10 mM (1 mM)	41,4 20,9	+ 3,4
Glutatião	1-10 pM (10 /iM)	30,6 16,0	+ 2,0

Os valores médios referem-se a vários ensaios de produto de 3 dias, tendo as substâncias sido adicionadas do dia 0 ao dia 2, de acordo com o que se apresenta no Quadro 9A. Os dados para ensaios isolados são apresentados entre parêntesis.

QUADRO 8A

Ácido gordo	Dia dc	i Adição	Dia da amostragem	n
Ácido tioglicólico	0-2	(1)	1-3 (2)	19
Ácido tiodiglicó- lico	1	(1)	2-3 (3)	9
L-cisteína	0-1	(0)	1-3 (2)	11
Glutatião	0	(0)	2-3 (2)	6

A vantagem dos ácidos carboxílicos em relação aos ácidos monocarboxílicos reside na ausência de um efeito inibidor sobre a proliferação celular, se bem ijue a produção de t-PA com estas substâncias não se tenha mostrado superior à verificada com o ácido butirico. A duração do efeito de aumento de produção é igualmente curta e atinge o valor máximo após 24 h para o ácido tioglicólico e após 48 h para a cisteína. Após 4 dias de incubação das células o efeito sobre a produção de t-PA é novamente apenas reduzido (Figura 15).

Efeito do ácido tioglicólico

A produção de t-PA após o tratamento com ácido tioglicólico eleva-se durante 72 h e é independente do dia da aplicação. O aumento em percentagem da síntese da enzima é em todos os casos máximo após 24 h e em seguida reduz-se continuamente.

N_o quadro 9 apresenta-se o aumento da produção de t-PA em células CHO que foram cultivadas durante 24 a 96 h em meio com 7,5 % de SFV e ácido tioglicólico 1 mM em função do dia da aplicação. Os valores estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular e são dados em % em relação aos ensaios de comparação (0 %) (valor médio + DP, n = 4 a 6). A determinação de t-PA foi efectuada por meio de ACD.

QUADRO 9

T_empo (h)		Dia da aplicação
	0	1	2

24	27,6	+	5, 6	34,7	+	10,9	34,5	+	7,5
48	16, 9	+	2,3	17,1	+	3, 6	16, 3	+	8,6
72	14,7	+	1,0	10, 2	+	2,7	9,4	+	1,7
96	3,4	+	3,0	2,7	+	0, 8	0,5	+	1,0

A produção de t-PA pode ser elevada por uma aplicação dupla de ácido tioglicólico em relação a uma aplicação simples (Figura 16).

Na Figura 17A (ACD) e na Figura 17B (Elisa) a síntese de t-PA está referida a 1 χ 16⁶ células.

A síntese de t-PA é elevada por ácido tioglicólico 1 mM nos 3 primeiros dias (ACD) em relação ao ensaio de comparação.

Os valores de t-PA avaliados por Elisa ficam pelo contrário mais elevados durante todo o período. A taxa de aumento era no 42 dia ainda de cerca de 34 %. O conteúdo intracelular de t-PA por célula é igualmente elevado pelo ácido tioglicólico. A máxima concentração de t-PA intracelular foi de

1,1 +0,1 jig / 1 x 10^ células após 24 h e reduziu-se no decurso de 96 h para aproximadamente metade da concentração original (Figura 17C).

A concentração extracelular de t-PA era no 52 dia 10,7 % mais elevada em relação ao ensaio de comparação. O aumento em percentagem de síntese de t-PA pelo

ácido tioglicólico em meio isento de soro e um pouco mais reduzido, uma vez que a divisão celular é apenas ligeiramente inibida (10 a 20 %).

Efeito de derivado de ácidos monocarboxílicos sobre a produção de t-PA em células CHO

N_o grupo dos derivados de ácidos carboxilicos C4 encontram-se outras substâncias que apresentam uma actividade sobre a síntese de t-PA em células CHO. Nestas substâncias contam-se em primeiro lugar o brometo (BBC) e o cloreto de butirilcolina (CBC) que aumentam a produção de t-PA entre 30 % e 40 %. Egtes derivados C4 apresentam em todos os aspectos os mesmos efeitos do butirato de sódio e são activos na mesma gama de concentrações.

No Quadro 10 apresentam o aumento da produção de t-PA em células CHO por meio dos dois referidos derivados de ácidos monocarboxílicos. Ag células foram cultivadas em meio com 7,5 % de SFV. T_odas as substâncias foram experimentadas numa gama de concentração de IO _zuM a 10 mM.

Os valores são dados em % em relação ao ensaio de comparação (O %) e estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular (valor médio + DP, n = 4 a 15). Os valores que se referem a ensaios isolados são dados entre parêntesis. 0 efeito máximo refere-se a um ensaio único. A determinação de t-PA foi levada a efeito por meio de ACD.

QUADRO 10

Derivados de ácidos mono carboxilicos

Gama óptima de

Con cai tração % de aumento da síntese de t-PA

Máximo Medio n

BCC

BCB

5-10 mM (ΐφ mM)

5-10 mM (2.5 mM)

63,9 38,8 + 4,4 lí

49.6 29.1 + 4,4 £

- 32 Os valores médios referem-se a vários ensaios de produção de 4 dias conforme se apresenta no Quadro 10A. Os valores de ensaios isolados são apresentados entre parêntesis.

QUADRO 10A

Substância	Dia da adição	Dia da	amostragem n
CBC	1 (D	2 a	4	(4)	15
BBC	1 (1)	2 a	4	(4)	9

Efeito combinado de diferentes estimuladores da síntese de t-PA

Na utilização de combinações de substâncias pelo menos uma das substâncias deve possuir a propriedade de não inibir o crescimento celular.

Atingiu-se um rendimento elevado por exemplo com uma combinação de ácido tioglicólico e de ácido butlrico. Nestes resultados o período de aplicação de cada substancia representa um papel importante, sendo por exemplo o ácido butlrico sempre adicionado como substância a fim dê reduzir a acção inibidora sobre o crescimento celular.

Para uma aplicação simultânea das substâncias no dia O não se verificou qualquer efeito do ácido butlrico sobre o aumento da produção.

Para a combinação de ácido butlrico com ácido tioglicólico o efeito é aditivo.

Em meio isento de soro não se verificou qualquer aumento da produção adicional do ácido butlrico por uma nova adição da substância aumento da produção de t-PA em células CHO cultivadas 3 dias em meio com 7,5 % de SFV é apresentado no Quadro 11. Adicionarara-se ácido tioglicólioo (TG) 1 mM e ácido butírico em combinação às células a diferentes momentos. Os valores referem-se a 1 ml de sobrenadante celular e são apresentados em % em relação ao ensaio de comparação (0 %) (valor médio + DP, n = 4 a 8). A determinação de t-PA foi levada a efeito por meio de ACD.

QUADRO 11

Dia da aplicação
TG	Ácido butírico
	0	1	2
0 1	31, 3 + 1,7	67, 9 + 5, 2 30, 3 68,8 + 4,4 31,4	+ 3, 2 + 5,5

41,4 + 5,5

Efeito de afidicolina

A afidicolina, um diterpeno obtido a par tir de Cepbalosporium aphiéicola, inibe de forma específica o ADN de alfa-polimerase e estimula a síntese de t-PA em células CHO numa concentração de 1 a 10 uM. Após 24 h o rendimento de t-PA elevou-se de 44,9 + 13,9 %.

A afidicolina apresenta uma estimulação da síntese de t-PA em células CHO. Pode inibir a síntesecfe ADN de modo reversível sem influenciar a síntese do ARN e das proteínas. A afidicolina possui ainda as propriedades de por um lado estimular a síntese de t-PA e por outro lado de sincronizar as células. O efeito de afidicolina sobre a síntese de t-FA durante uma incubação mais demorada das células num meio com afidicolina é descrito acima. T_ambém estão relacionados com a descrição apresentada trabalhos com células CHO que foram cultivadas durante 24 h com afidicolina e em seguida foram cultivadas novamente em meio sem afidicolina. Analisaram-se as fases do ciclo celular e a inz-3 corporação de / H_/-timidina durante a marcação de 24 h e na fase seguinte, a fim de acompanhar a inibição da síntese de ADN e uma retoma da síntese após eliminação da afidicolina. Para além disso, efectuou-se a determinação da síntese de ARN, de proteínas e de t-PA.

Crescimento celular

O crescimento celular foi pouco inibido pela afidicolina (1 /íM) após um tratamento de 24 h (5 a IO %). Quando se mudou o meio as culturas tratadas com afidicolina restabeleceram no entanto novamente um número de células igual ao das culturas de comparação.

Síntese de t-FA

A síntese de t-PA foi estimulada em células sincronizadas em afidicolina 1 >uM. Era possível detectar o efeito de estimulo mesmo 96 h depois da mudança de meio.

O aumento da produção de t-PA em células CHO tratadas com 1 ,uM que tinham sido cultivadas em meio com

7,5 % de SFV é apresentado no Quadro 12. Os vaiores estão referidos a 1 ml em relação à cultura de comparação (O %) (valor médio + DP, n = 4). A determinação de t-PA foi efectua da por meio de ACD.

QUADRO 12

T_empo (h após a mudança de meio) % de aumento da síntese de t-PA

24	40, 2	+	6,7
48	59,9	+	11,1
72	32,8	+	6,4
96	14,7	+	1,3

N_a Figura 18 apresenta-se a variação do aumento da síntese de t-PA em função do tempo em meio de soro O efeito atingiu um máximo de 48 h após a mudança de meio.

A concentração de t-PA em meio isento de soro foi também determinada por meio de análise de Elisa após 96, 120 e 144 h, sendo os valores determinados em relação às culturas de comparação significativamente mais elevados do que os valores determinados por ACD. Os resultados são apresentados no Q_uadro 13. O ensaio foi levado a efeito com células CHO tratadas com afidicolina 1 juM que foram cultivadas em meio isento de soro. Os valores estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular e são dados em % em relação aos ensaios de comparação (O %) (valor médio + DP, n = 4). A determinação de t-PA foi efectuada por meio de Elisa.

QUADRO 13

T_empo (h após a mudança de meio) % de aumento da síntese de t-PA

96	36,7		6,2
120	42,0	+	8,8

144	51,3	+	10, 2

Apenas foi possível observar uma concentração intracelular de t-PA mais elevada durante as 24 h de incubação com a fidicolina e esta era cerca de 30 % aumentada.

Por meio de ácido butírico, ácido propiónico# cloreto de butirilcolina e brometo de butirilcolina foi possível aumentar ainda mais a produção de t-PA neste sistema. A estimulação foi bem sucedida tanto em meio isento de soro como também em meio contendo soro# conseguindo-se um efeito adicional de aumento de produção em meio isento de soro apenas por aplicação das substâncias após uma estadia de 24 h das células nestas condições de melo.

O Quadro 14 mostra o aumento em percentagem da produção de t-PA em culturas tratadas com afidicolina após aplicação de butirato de sódio. O butirato de sódio provoca um aumento da síntese de t-PA em mais 14% após 96 h.

O ensaio foi levado a efeito com células CHO tratadas com afidicolina 1 zUM que foram cultivadas com e sem butirato de sódio em meio de cultura isento de soro. Os valores estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular e são dados em % em relação ao ensaio de comparação (O %) (valor médio + DP# n = 4). A determinação de t-PA foi efectuada por meio de Ejisa.

QUADRO 14

T_empo (h após a Afidicolina + buticato de sódio mudança de meio) Momento da aplicação (h)

O 24

36# 7 + 6# 2 34,1+9,7 50,6 + 11,0

120 42,0+8,8 31,8 + 10, 2 49, 7 + 4# 3

Efeitos de 6-hidroxi-4,6-dimetil-5-hepteno-2-ona

A produção de t-PA sofre uma elevação após tratamento com o composto em epígrafe depois de 144 h. Para a estimulação da síntese de t-PA foram activadas concentrações na gama da micromolaridade, por exemplo entre 0,005 a 100 zuM.

Na Figura 19 apresenta-se o aumento da produção de t-PA em células CHO gue foram cultivadas até um máximo de 168 h em meio isento de soro e contendo DHD de 7 mM a 7 jjM. Os valores foram determinados por meio de ACD.

Na Figura 20 são dados os valores correspondentes determinados por meio de Elisa.

As culturas celulares preparadas de acordo com os métodos anteriormente descritos podem ser processadas de modo conhecido a fim de se isolar o t-PA, por exemplo após a fase de produção separa-se a massa celular do caldo de cultura e purifica-se o sobrenadante celular por fases de ultrafiltração e de cromatografia.

t-PA isolado pode em seguida ser incorporado em formulações de preparados farmacêuticos por exemplo sob a forma de solução ou após liofilização.

É possível repetir os exemplos anteriormente apresentados substituindo as células CHO produtoras de t-PA por células CHO transformadoras que expressam outras proteínas, por exemplo mutantes de t-PA ou outras proteínas dotadas de actividade farmacológica, como por exemplo, as cél las descritas nos pedidos de patentes europeias e alemãs anteriormente referidas, especialmente as células CHO descritas em EP-A 199 574 e 196920 bem como em DE-A 3 708 681.

Claims

REIVINDICAÇÕES - lfi Processo para a preparação melhorada de uma proteína em culturas de células produtoras dessa proteína por adição à cultura das células de uma substância que induz a produção da proteína caracterizado por a substância indutora da produção da proteina usada ser o ácido tioglicólico, o ácido tiodiglicólico, L-cisteína, glutatião brometo de butirilcolina. cloreto de butirilcolina, ácido nonactínico, ácidos gordos furânicos, ácido ascórbico, afidicolina, 6-hidroxi-4,6-dimetil-3-heptano-2-ona, ácido fusárico, ácido mevalónico, ácido trans-anidromevalónico, lactona do ácido anodromevalónico, lactona do ácido cis-anidromevalónico, ácidos monocarboxílicos ou dicarboxílicos alifáticos (C^ ou C^) D-a-hidroxisubstituidos ou os respectivos sais. - 2« Processo para a preparação melhorada de uma proteína a partir de culturas de células CHO transformadas caracterizado por se adicionar à cultura um ácido monocarboxilico alifático (C^ ou C^) ou os respectivos sais. - 3« Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a proteina obtida ser t-PA (activador de plasminogénio de tecido) ou um seu mutante. 4a Pj-ocesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se cultivarem células CHO transformadas. - 5« Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a proteína obtida ser t-PA ou um seu mutante. - 6« Processo de acordo com a reivindicação 5, caractêrizado por a substância indutora da produção da proteína usada ser o ácido tioglicólico ou um seu sal. - 7« Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a substância indutora da produção da proteína usada ser o ácido nonactínico ou um ácido gordo furânico ou um seu sal. - 8s Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 2 ou 3, caracterizado por a substância indutora da produção da proteína usada ser o ácido butírico ou um seu sal. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a cultura ser levada a efeito num meio isento de soro. - 10« Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a cultura ser levada a efeito num meio contendo soro. - 11« Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por a substância indutora da produção da proteina ser adicionada à cultura numa concentração entre 0,005 ^iM e 500 mM. - 12« Processo de acordo com a reivindicação ll, caracterizado por se adicionar um ácido monocarboxílico alifático C3~C4 ou um seu sal numa concentração de 1 mM a 10 mM. - 13« Processo de acordo com a reivindicação 11, caractérizado por se adicionar o ácido tioglicólico, o ácido tiodiglicólico, L-cisteína ou glutatião ou os respectivos sais numa concentração de 1 mM a 10 mM. 14a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado por se cultivarem as células na presença de uma das substâncias, se separarem as células da cultura e em seguida se adicionar um novo meio de cultura e se cultivarem as células na presença de uma das substâncias. - 15« Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a primeira das substâncias referidas ser afidicolina e a segunda substância referida ser ácido butírico, ácido propiónico, cloreto de butirilcolina ou brometo de butirilcolina ou os respectivos sais. - 16« reivindicações 1 a taneamente duas ou Processo de acordo 13, caracterizado por mais substâncias. com qualquer das se utilizarem simul- 17« Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se utilizar ácido butírico e ácido tioglicólico ou os respectivos sais, adicionando-se o ácido butírico como segunda substância à cultura celular. A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na República Federal AlemS em 13 de Outubro de 1987, 13 de Novembro de 1987 e em 20 de Janeiro de 1988, sob os n^s. P 37 34 632.6, P 37 38 649.2 e P 38 01 562.5, respectivamente. Liáboa, 13 de 0utubro de 1988 β AGENTE RFlClAL »A FRCPKlEOA&t INRUSÍN.*- FIG. 1 Tempo (dias) Crescimento celular das células CHO, que tinham sido cultivadas em meio com 7,5 % de SFV. Os númerod de células estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular; número de células total (-ψ-), células viáveis (-7-), células nao viáveis (-0-), (valor médio +_ DP, n = 14 a 47). Tempo (dias) Produção de t-PA era células CHO, que tinham sido cultivadas em meio com 7,5 % de SFV. A. Variação em função do tempo da concentração extracelular de t-PA. Os valores de t-PA estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular e foram determinados por meio de ACD (-o-) e por Elisa (-·-) (valor médio + DP, n= 7 a 47) . B. Variaçao em função do tempo da concentração extracelular de t-PA. Os valores de t-PA estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular e foram determinados por meio de Elisa (-«-) (valor médio + DP, n = 4). FIG . 3 Tempo (dias) Produção de t-PA em células CHO, que tinham sido cultivadas era meio com 7,5 % de SFV. A. Concentração extracelular de t-PA. Os valores de t-PA estao referidos a 1 x 10 células e foram determinados por meio de ACD (-Δ-) e por Elisa (-A-) (valor médio + DP, n = 7 a 47) B. Concentração extracelular de t-PA. Os valores de t-PA estão referidos a 1 χ 10θ células e foram determinados por meio de Elisa (--) (valor médio + DP, n = 4). FIG . 4 Tempo (dias) Crescimento celular das c/lulas CHm cultivadas em meio com 7,5 % de SFV células estão referidos a 1 ml de s lar; número de células total (-A-) (-Δ-), células nao viáveis (-□-), (n= 4 a C). , <jue i.inhari; sido . Os números de obrenadante celu, células viáveis valor· nédjo j_ Di', FIG.5 vadas ém meio isento de soro. Os valores de t-PA estão referidos a 1 ml de sobrenadante e foram determinados por meio de ACD (-O-) e por Elisa (-·-) (valor médio + DP, n = 4 a 6). FIG. 6 Tempo (dias) Síntese de T-PA células CHO, que tinham sido cultivadas em meio isento de soro. Os valores de t-PA estão referidos a 1 x 10^ células e foram determinados por meio de ACD (—o—) e por Elisa (-·-) (valor médio + DP, n= 4 a 6). FIG. 7 Tempo (dias) Aumento da produção de T-PA em células CHO por meio de ácidos monocarboxilicos C3-C5 em função do tempo· As células foram cultivadas em meio com 7,5 % de SFV. A concentração para o ácido butírico (--) e o ácido isobutírico (-·-) foi de 1 mM e para o ácido propiónico (-o-) e o ácido isovalérico (-a-) foi de 5 mM. Os valores estão referidos a 1 ml de sobrenadante celular e são expressos em do valor dç ensaio de comparação (0 %) eem adição de ácido (valor médio + DP, n = 11 a 24). A determinação de t-PA foi efectuada por meio de ACD. FIG. 8 Aumento da produção de t-PA em células CHO por meio de butirato de sódio. 0 butirato de sódio foi adicionado no dia 0 numa concentração de 1 mM às células, que tinham sido cultivadas em meio com 7,5 % de SFV. Os valores são expressos em % do valor do ensaio de comparação (0 %) e referem-se a 1 ml de sobrenadante celular /ÃCD (--) e Elisa (-□-)_/ ou a 1 ml de suspensão celular /Elisa (-v-)_7, (valor médio + DP , n» 5 114). t-PA ug/lxlOD células Tempo (dias) Tempo (dias) Influência do butirato de sódio sobre a síntese de t-PA em células CHO, que tinham sido cultivadas em meio com 7,5 $ de SFV. 0 butirato de sódio foi adicionado no dia 0 numa concentração de 1 mM. Os valores estão referidos a 1 x 10^ células (-□- , -o-, -v-) e são expressos em comparação com culturas de comparação (--, -·-, -▼-) (valor médio + DP). A. Concentração extracelular de t-PA (ACD, n = 5a 14) B. Concentração extracelular de t-PA (Elisa, n * 5 a 8) C. Concentração intracelular de t-PA (Elisa, n = 5 a 8). FIG .10 ... , ΙΟΟ-Γ—i dc aumento de t-PA

1 j» ΞΞΞ 20 j ! 71 ----‘ [ 7/7· — η í //27 =

Dia da adição

3 4

Tempo (dias)

Aumento da produção de t-PA em células CHC, que tinham sido cultivadas em meio com 7,5 £ de S7V. C butirato de sódio 1 mM foi adicionado por uma vez ou por duas vezes e- diferentes momentos.

Os valores são expressos em y, do valor do ensaio de comparação (0 /) e referem-se a 1 r.l de sobrenadante celular (valor médio + DP, n = 4). A determinação de T-PA foi efectuada por ACD.

FIG. 11

Tempo (dias)

Aumento da produção de t-PA em células CHO por meio de butirato de sódio. 0 butirato de sódio foi adicionado após 24 horas de cultura das células em meio isento de soro numa concentração de 1 mM· Os valores.são expressos em % do valor do ensaio de com paração (0 $>) e referem-se a 1 ml de sobrenadante celular. A determinação de t-PA foi efectuada por Elisa (valor médio + DP, n =

4.)

FIG.12

Tempo (dias)

Influência do butirato de sódio sobre a produção de t-PA em células θΗθ· θ butirato de sódio foi adicionado após 24 horas de cultura em meio isento de soro numa concentra ção de 1 mM· Os valores estão referidos a 1 ml de sobrena* dante celular e foram determinados por meio de ACD (-·-) e por Elisa (-□ -) (valor médio + DP, n = 4 a 6)·

FIG .13

Influência do butirato de sódio sobre a produção de t-PA em células CHO. 0 butirato de sódio foi adicionado após 24 horas de cultura em meio isento de soro numa concentração de 1 mM. Os valores estão referidos a 1 x 10^ células e foram determinados por meio de ACD (--) e por Elisa (-□ -) (valor médio + DP, n = 4 a 6).

FIG .14

Tempo (dias)

Influência do ácido ascórbico (10 mM) sobre a sintese de t-PA (A) e sobre a síntese proteica (B) em células CHO, que tinham sido cultivadas em meio com 7,5 % de SPV. A determinação de t-PA foi efectuada por meio de ACD. Os valores (- -) são dados em relação a culturas de comparação (- -) e estão referidos a 1 x 10⁶ celu las (valor médio + DP, n = 4).

Aumento da produção de t-PA em células CHO por meio de diferentes compostos contendo enxofre, ácido tioglicólico (-·-), ácido tiodiglicólico (-a-), L-cisteina (--) e glutationa (-o-) em função do tempo. As células foram cul tivadas em meio com 7,5 % de SFV. Os valores referem-se a 1 ml de sobrenadante celular e são expressos em i» do va lor do enãaio de comparação (0 %) valor médio + DP, n = 4 a 6)· A determinação de t-PA foi efectuada por ACD.

FIG . 16

2 3 4

Tempo (dias)

Dia da adiçao

I I o V///A ο·ι Κ3Ώ o+2 tssa ?

Aumento da produção de t-PA em células CHO, que tinham sido cultivadas em meio com 7,5 > de SFV, após aplicação simples ou dupla de ácido tioglicólico (1 mM) em diferentes comentos. Cs valores sao expressos em % de aumento sobre o valor do ensaio de comparação (0 ¢) e referem-se a 1 ml de sobrenadante celular (valor médio + DP, n = 4 a 6). A determinação de t-PA foi efectuada por ACD.

-PA ug/lxlO células

Tempo (dias) Tempo _(dias)

Tempo (dias)

Influência de ácido tioglicólico 1 mM sobre a síntese de t-PA em células CHO, que tinham sido cultivadas em meio com 7,5 % de SFV. Os valores estão referidos a 1 χ 10θ células -ο-, -Δ-) e sáo expressos em comparação com culturas de conqaaração - A-) (valor médio + DP, n = 4 a 5).

A. Concentração extracelular de t-PA (ACD)

B. Concentração extracelular de t-PA (Elisa)

C. Concentração intracelular de t-PA (Elisa).

FIG. 18

Tempo (h dp. mud. m. )

Aumento da produção de t-PA em células CHO sincronizadas por afidicolina 1 μΜ, que tinham sido cultivadas em meio isento de soro, após mudança de meio (mud. m.)· Os valores referem-se a 1 ml de sobrenadante celular e sao exprejs sos em % do valor do ensaio de comparação (0 (valor médio + DP, n=4a9)«A determinação de t-PA foi efectuada por ACD.