FI94963B - Menetelmä t-PA-kaltaisten proteiinien tuotannon tehostamiseksi - Google Patents

Description

94963

Menetelmä t-PA-kaltaisten proteiinien tuotannon tehostamiseksi Förfarande för effektivering av framställningen av t-PA-artade proteiner

Keksintö koskee menetelmää t-PA-kaltaisen proteiinin tuotannon tehostamiseksi transformoitujen CHO-solujen viljelmästä.

Plasminogeeniaktovaattorit ovat seriiniproteaasiluokkaa, jonka yksittäiset proteaasit aktivoivat proentsyymi plasminogeenin aktiiviseksi entsyymiksi plasmiiniksi pilkkomalla aminohappo-jäännöksien Arg-560 ja Vai 561 välisen peptidisidoksen. Plas-miini puolestaan on viimeinen vaihe verisuonten fibriiniliuo-tusjärjestelmässä, jossa verisuonitukoksen fibriiniverkko tulee pilkotuksi liukoisiksi peptideiksi.

Patogeenisissä häiriöissä, kuten sepelvaltimosairauksissa, , verihyytymät eivät liukene riittävän nopeasti, jotta kudos saisi jälleen riittävästi happea. Verihyytymän tukkimista sepelvaltimoista on seurauksena infarkti, jolloin sydänlihaksen liian alhaisesta hapensaannista seuraa kyseisen kudoksen joutuminen kuolioon.

Kyseisten verisuonten nopean uudelleenreitityksen avulla sydänlihaksen verivirtaus voidaan nopeimmin varmistaa ja täten estää kokonaisten sydänlihasosien kuoleentuminen.

Toistaiseksi hoidossa on käytetty streptokinaaseja ja uro-kinaaseja. t-PA:n ominaisuudet tarjoavat kuitenkin eräitä etuja näihin tuttuihin plasminogeeniaktivaattoreihin nähden, joita etuja ovat: fibriinispesifinen paikallinen lyysi, ei fibrinogeenin hajoamisesta johtuvia syteemisiä lyyttisiä vaikutuksia, saavutettavat korkeat jälleenvirtausnopeudet sekä vasta-aine-muodostuksen puuttuminen.

2 94963 t-PA on glykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 65 000 daltonia, joka esiintyy sekä yksi- että kaksiketjuisena entsyyminä ja joka koostuu 527 aminohaposta.

t-PA:n affiniteetti plasminogeenin suhteen on fibriinin läsnäollessa noin 100 kertaa suurempi kuin tämän puuttuessa. Tämä t-PA:n korkea affiniteetti plasminogeenin suhteen fibriinin läsnäollessa varmistaa tehokkaan aktivoinnin ilman, että tapahtuu ääreisälueiden vapaan plasminogeenin aktivaatiota.

Ihmisen t-PA:ta eristettiin puhtaana ensimmäistä kertaa kohdusta. Muista kudoksista ja soluista, esim. endoteelisoluista mukaanlukien valtimo- ja laskimosuonten endoteelisolut, pystyttiin niinikään osoittamaan t-PA:ta. Muodostuvat t-PA-määrät ovat kuitenkin niin alhaisia, että t-PA:n eristys näistä kaupallisiin tarkoituksiin on mahdotonta.

Toinen luontainen t-PA-lähde ovat soluviljelmät. Useita solu-linjoja tutkittiin niiden mahdollisen t-PA-tuottokyvyn suhteen (Gronow, M. et. ai. , Trends in Biotechnology 1_ (1 983) 26-29).

Eräästä ihmissolulinjasta, Bowesin melanoomasoluista, pystyttiin eristämään suurehkoja määriä t-PA:ta rajoitettuja kliinisiä kokeita varten sekä rakenneselvitystarkoituksiin (Wallen et,al♦, European Journal of Biochemistry 132 (1983) 681-686).

t-PA:n tuottamiseen suurina määrinä laaja-alaiseen kliiniseen käyttöön nämä saannot ovat aivan liian pieniä. Vasta geeniteknologia mahdollisti suurien määrien rekombmaatti-t-PA:ta valmistuksen terapeuttiseen käyttöön.

t-PA kloonattiin v. 1983 ja sen aminohapposekvenssi selvitettiin (Pennicd, Nature 301 (1983) 214-221).

Yritykset eristää t-PA:ta E.colista, johon t-PA:n melanoomasoluista saatu geneettinen informaatio siirrettiin, eivät onnis- 3 94963 tuneet, koska saatua proteiinia ei ole glykosyloitu (solun toimesta) eikä se täten vastaa natiivia t-PA:ta.

Tämän vuoksi eri tutkijaryhmät ovat ihmis-t-PA:n tuottamiseksi seuloneet eri lähteistä saatuja pysyviä nisäkässolu1injoja.

Jotkut näistä soluiinjöistä ovat ihmislinjoja, joiden tuottama t-PA-saalis on jossain määrin aiempaa korkeampi. Erään toisen solulinjan muodostavat kiinalaisen hamsterin tavalliset muna-sarj asolut.

EP-hakemusjulkaisussa 0093619 kuvataan t-PA:n valmistusta transformoiduista kiinalaisen hamsterin munasarjasoluista (CHO-soluista). Saatava t-PA (r-tPA) ei mitenkään eroa luontaisesti esiintyvästä t-PA:sta.

Useissa patenttijulkaisuissa kuvataan t-PA:n rautanttuja ja niiden valmistusta, esim. EP-A n:ot 241,208, 241,209, 241,210, 240,334, 234,051, 233,013, 231,624, 225,286, 213,794, 201,153, 199,574, 196,920 ja DE-A n:o 3708681.

Kyseisessä hakemusjulkaisussa kaikkia t-PA-johdannaisia nimitetään mutanteiksi riipunnatta siitä, sisältävätkö ne yhden tai useamman aminohapon, jotka poikkeavat luontaisesti esiintyvän t-PA:n vastaavissa asemissa käsittämistä aminohapoista tai ’ ' siitä, ettei näihin 'mutantteihin' sisälly yhtä tai useampaa aminohappoa, jotka esiintyvät luontaisesti esiintyvässä t-PA:ssa. t-PA-lajia, josta puuttuu useita luontaisesti esiintyvän t-PA:n aminohappojäännöksistä, kuten esim. ΕΡ-Λ-hakemusjui-kaisussa 196,920 kuvatussa on asianlaita, kutsutaan usein degeneraatti la j eiksi .

Esimerkiksi EP-A-hakemusjulkaisussa 199,574 kuvataan erästä t-PA-mutanttia, joka käsittää asemissa 270-279 tietyt aminohappojäännökset, jotka kuitenkin poikkeavat luontaisen t-PA:n vastaavissa asemissa käsittämistä aminohapoista.

4 94963 DE-A-hakemusjulkaisussa 3708681 hakija on kuvannut eräitä t-PA-lajeja, jotka omaavat asemassa 117 aminohapon, joka poikkeaa luontaisen t-PA:n vastaavassa asemassa käsittämästä aminohaposta, jolloin mutantti-t-PA vastoin kuin luontainen t-ΡΛ ei ole glykosyloitunut tässä asemassa.

Useissa patenttijulkaisuissa on kuvattu eri aineiden vaikutusta soluviljelmien proteiinisynteesien tuottokykyyn.

Erilaisiin solujärjestelmiin liittyen esitetään tietoja solun-sisäisen c-AMP-peilin ja t-PA-synteesin keskinäisestä riippuvuudesta (katso esim. Kooistra, et.a 1., Thrombosis and Haemostasis, 54 ( 1 ): 1 92 , Abstract P 1133), sillä dibutyryy1i-c-AMP nostaa t-PA:n tuottoa ihmisen endoteelisoluissa 2-/3-kertaises-ti, jolloin se ei kuitenkaan osoita minkäänlaista vaikutusta t-PA:n synteesiin Bowesin melanoomasoluissa. Munuaissoluissa fosfodiesteraasi-inhibiittorit kohottivat t-PA:n syntetisoitu-misastetta (Journal of Cell Biology 91 (1981) 195-200). Toi saalta c-AMP estää t-PA-synteesiä makrofageissa (Vassalli et.ai., Cells 8 (1 976) 271 -281 ) eikä vaikuta mitenkään alkio-syöpäsoluissa (Nishimune et.ai., Experimental Cell Research 146 (1983) 439-444).

Voihappo indusoi t-PA-synteesiä alkiosyöpäsoluissa (Nishimune, ; ; supra), jolloin sen vaikutus munuaissvöpäsoluissa on kuitenkin estävä (Nelson et.ai., Proc.Am.Ass. for Cancer Research 26 (1985) 35) eikä alkiokeuhkosoluissa ilmene mitään vaikutusta, mistä ilmoittivat Brouty- tioe et.ai., Biotechnology 1 2 (1 984) 10 .

** Ihmisen endoteelisoluissa t-PA-synteesiä voidaan stimuloida trombiinilla (Levin et,al., Thrombosis and Haemostasis 56:2 (1986) 115-116), alkoholilla (Laug, Jama, 250:6 (1983 B) 772- 776), C-vitamiinilla ja A-vitamiinilla (Inada et,ai., Biochemical and Biophysical Commumincations 1 30:1 (1 985) 1 82-187).

5 94963

Naudan endoteelisoluissa trombiini kuitenkin estää t-PA-eri-tystä (Loskutoff, Jounarl of Clinical Investigations 64 (1979) 329-332) kuten myös endotoksiini (Crutchley et.ai., Journal of Biological Chemistry 26:1 (1986) 154-159).

Sian endoteelisoluissa hepariini välittää t-PA-eritystä (March-wardt et,al., Thrombosis Research 8 (1976) 217-223), jolloin kuitenkin ihmisen alkiokeuhkosoluissa hepariinin vaikutus on minimaallinen.

t-PA-synteesiin oli positiivinen vaikutus niinikään konkanaval-liini-A:lla alkiokeuhkosoluissa (Brouty-Boye, supra) sekä epiteelisoluissa (Electricwala et.ai., Thrombosis and Haemostasis 53 (1985) 200-203), 5-atsasytidiinillä epiteelisoluissa (Elec-tricwala, supra) ja melanoomasoluissa (Silagi et.ai., Biological Medicine 57 (1 984 ) 41 8 ), titsabriini 1la melanoomasoluissa (Roba et.ai., Thrombosis and Haemostasis 50 : 1 ( 1 983) 83) ja afidikoliinilla maksakasvainsoluissa (Orfanoudakis et.ai., Biological Chemistry, Hoppe-Seyler 336:9 (985) 832).

EP-patenttijulkaisussa 0219270 selvitetään, että hepariinin ja endoteelisolukasvutekijän (ECGF:n) yhdistelmä kohottaa ihmisen normaalien diploidisten keuhkosidekudosmuodostussolujen t-PA-tuotantoa sekä yksiketjuisen urokinaasi-plasminnogeeniaktivaat-torin tuotantoa seerumivapaassa ympäristössä.

Voihapon vaikutusta kiinalaisen hamsterin munasarjasoluihin ovat kuvanneet Storrie et,al., Journal of Cell Physiology 94 (1978) 69-76 sekä Wright, Experimental Cell Research 78 (1978) 456-460. Nämä tutkimukset suoritettiin kuitenkin ei-transfor-·. moidulla solu1 injoi 1la ja tulokset liittyivät kaiken kaikkiaan • solujen morfologisiin muutoksiin sekä muutoksiin niiden kasvu nopeudessa .

Kyseinen keksintö koskee menetelmää proteiinien tuoton nostami- 6 94963 seksi näitä proteiineja tuottavien solujen viljelmissä, jolloin soluviljelmään lisätään pitoisuutena 0,005 - 500 mM tio-glykolihappoa, tiodiglykolihappoa, L-kysteiiniä, glutationia, butyryylikoliinikloridia, butyylikoliinibromidia, nonaktiini-happoa, furaanirasvahappoa, askorbiinihappoa, afidikoliinia, 6-hydroksi-4,6-dimetyyli-3-hepten-2-onia, D-a-hydroksisubsti-tuoituja (C3- tai C4-) alifaattisia mono- tai dikarboksyyli-happoja, C3-C4-alifaattisia monokarboksyylihappoja tai niiden suoloja.

Proteiineina tulevat kyseeseen kudosplasminogeeniaktivaattorit ja sen mutantit.

t-PA-mutantit ovat t-PA:n johdannaisia, jotka omaavat yhden tai useamman aminohappojäännöksen, joka poikkeaa luontaisen t-PA:n kulloinkin vastaavassa asemassa käsittämästä aminohappo j äännöksestä tai joissa ei esiinny t-PA-mutantteja kuvataan kirjallisuudessa, erityisesti edellä mainituissa patenttijulkaisuissa ja hakemusjulkaisuissa, erityisesti julkaisuissa EP-A nro 199,574 ja DE-A nro 3708681.

Lisäksi totesimme, että C3-C5-alifaattiset monokarboksyyliha-pot sekä niiden suolat kykenivät nostamaan t-PA-tuotantoa ja t-PAm mutanttien transformoiduissa CHO-soluviljelmissä.

Edullisina proteiinituotantoa lisäävinä aineina tulevat kyseeseen tioglykolihappo, nonaktiinihappo, voihappo ja propioni-happo.

Proteiinituotantoa lisäävät aineet ovat kaupallisesti saatavia .täi kirjallisuudesta tunnettuja aineita tai valmistettavissa tuttujen menetelmien mukaan.

Yhdisteitä butyryylikoliinibromidi ja -kloridi on kaupallisesti saatavan esimerkiksi valmistajalta Sigma Chemical Co., Louis, Missouri, U.S.A.

7 94963

Nonaktiinihappoa ja menetelmiä sen valmistamiseksi kuvataan esim. lähteissä Hely.Chim.Acta. osat XLV (1962), n:ot 15 ja 16, s 129 - 138; Tetrahedron, osat 36 n:o 1, s. 46 - 49 ja J.Orq.Chem. 45 (1980) 4259 - 4260.

Furaanirasvahappoja kuvataan eri lähteissä, esim. Lipids 12:10 (1977) 828 - 836; J.Chem.Soc.Chem.Commun. 16 (1976) 630 - 631; Lipids 10:1 (1975) 695 - 702; sekä Fetter. Seifen. Anstrich-mittel no. 8 (1986) 290 - 292.

Hyödyllisiä tämän tyyppisiä happoja voidaan valmistaa myös konversioreaktiossa seuraavan reaktiokaavion mukaan: a)

3 fU CU

KCH^CH,

C + BrMg (CH2) n- TOA -► CH, (CH2) „ -A V (CH2) - TOA

H O

1 2 3 ch3 ch3 hydrolyysi nΛ

3 -► CHJlcna)a —p- (CH2)nCOOH

’ 4 jossa m= 2-5, edullisesti 4, n= 7-12, edullisesti 8 tai 10, ja -TOA= := o-/\ o— 94963

O

b) CHj CH3 ♦ Br(CH2)n- TOA 3 i*”1***1. 4 c> 5 6

Yhdisteiden 2 ja 6. valmistusta kuvataan lähteessä Voss et.ai. . Hely.Chim.Acta 66 (1983) 2294.

m on edullisesti 4, ja n 8 tai 10.

Yhdiste 6-hydroksi-4,6-dimetyyli-3-hepten-2-oni on valmistettavissa alan teknisen tason mukaisella menetelmällä.

Se on niin ikään luonnonaine ja sellaiseen eristettävissä lajista Capiscum annuns var angulosum, kuten kuvattu lähteissä C.A. 97:159552f sekä Eiyo & Shokuryo 35.:2 (1982) 95-101. Tätä yhdistettä kuvataan myös väitöskirjajulkaisussa "Neue Sekundärstoffe aus Streptomycesten: Isolierung und Strukturaufklärung der Colabomycine, Pyrrolame und des Pyridazamycins", Groten, R. Göttingenin yliopisto 1987, jossa kuvataan myös sen valmistusta lajia Streptomvces ollvaceus (kanta Tu3082, talletettu tallennuslaitokseen diä‘Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen 23. marraskuuta 1987 Budapestin sopimuksen mukaan hakunumerolla n:o 4309) viljelemällä sekä edelleen eristystä tästä. Sen NMR-spektri on seuraava: il i in mm ι ι t ai i 9 94963 C9H16°2 (156.23) EI-MS: m/e = 138 (M+-H20, korkea erotuskyky, C9H140, 6 %); 123 (M+-CH50, 8 %); 98 korkea erotuskyky CgH10Of 48 %); 83 (100 %) 1H-NMR (200 MHz, CDC13): δ = 1,27 (s, 7-H3 ja 8-H3); 1,43 (s, leveä, HO, vaihto MeOD); 2,21 (s, 1-H3); 2,35 (d, J = 1,3 Hz, 9-H3); 2,32 (s, leveä, 5-H2); 6,13 (s, leveä, 3H) miljoonasosaa 13C-NMR (50,3 MHz, CDCI3): δ = 22,0 (o, C-9)/ 30,0 (o, 2C, C-7 ja C-8); 32,0 (o, C-l); 54,4 (u, C-5); 71,1 (u, C-6); 127,1 (o, C-3); 155,1 (u, C-4), 198,6 (u, C-2) miljoonasosaa.

Mainittujen happojen suoloina tulevat kyseeseen erityisesti alkalimetallisuolat, edullisesti natrium- ja kaliumsuolat.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa seerumipitoi-sessa kasvualustassa tai edullisesti seerumivapaassa ympäristössä .

Käytettäessä menetelmää seerumipitoisessa ympäristössä on edullista käyttää esim. tioglykolihappoa, nonaktiinihappoa tai furaanirasvahappoja tai niiden suoloja.

Käytettäessä menetelmää seerumivapaassa ympäristössä käytetään edullisesti C3-C5-alifaattista, monokarboksyylihappoa, erityisesti voi- tai propionihappoa, tai niiden suoloja.

Tatesimme, että proteiinituottoa lisäävät yhdisteet omaavat vaikutusta pitoisuuksina 10 μΜ - 500 mM, esim. 1 mM - 10 mM. Erityisesti C3-C5-alifaattiset ja glutationi sekä niiden suolat omaavat vaikutusta pitoisuutensa 1 mM - 10 mM.

10 94963

Proteiinituottoa lisäävät aineet voidaan lisätä viljelmään tätä valmistettaessa, esim. päivänä 0, eli kasvatusta aloitettaessa, ja tästä aina kolmannen kasvatuspäivän päättymiseen.

Proteiinituottoa lisäävää ainetta voidaan käyttää niin ikään monilisäysmuodossa. Toisin sanoen soluja voidaan viljellä jonkin aineen läsnäollessa, minkä jälkeen solut poistetaan viljelmästä sekä siirretään edelleen muuhun kasvualustaan ja viljellään edelleen jonkin proteiinituottoa lisäävän aineen läsnäollessa. Tämän monilisäysmuodon kyseessä ollen erityisesti C3-C5-alifaattiset monokarbok-syylihapot ja niiden suolat, edullisesti voihappo tai tioglykolihappo tai niiden suolat, osoittavat lisäysvaiku-tusta.

Monilisäysmuodossa ei välttämättä tarvitse käyttää samaa ainetta kaikkiin lisäyksiin, vaan voidaan käyttää jotain ainetta yhdessä lisäyksessä ja jotain toista ainetta jossain myöhemmässä lisäyksessä. Tämä monilisäysmuoto tuottaa niin ikään lisäysvaikutuksen, kuten erityisesti afidikolii-r.in käyttö yhdessä lisäyksessä ja aineista jonkin toisen, esim. voihapon, propionihapon, butyryylikoliinikloridin tai butyryylikoliinibromidin tai niiden suolojen, käyttö jossain myöhemmässä lisäyksessä.

Voidaan käyttää myös kahden tai useamman aineen yhdistelmää. Edullisesti ei käytetä yli yhtä solukasvua estävää ainetta. Voidaan esimerkiksi käyttää jotain C3-C5-alifaat-tista monokarboksyylihappoa, edullisesti voihappoa tai tioglykolihappoa, tai niiden suoloja, jolloin monokarbok-syylihappo tai sen suola lisätään soluviljelmään edullisesti 2. aineena.

= ' «H < Hill I I t st 11 94963

Transformoiduilla kiinalaisen hamsterin munasarjasoluilla tarkoitetaan CHO-soluja, jotka on transformoitu jollain jotain toivottua proteiinia koodaavalla vektorilla, jolloin ne viljel-täessä kykenevät ilmaisemaan ja syntetisoimaan kyseistä proteiinia.

Transformoiduksi kiinalaisen hamsterin munasarjasoluiksi soveltuvat esimerkiksi solut, joita kuvataan EP-hakemusjulkaisuissa n:ot 009361 9 ja 0199574 ja DE-patenttijulkaisussa 3708681 . Viljelmällä näitä transformoituja CHO-soluja voidaan valmistaa t-PA:ta (EP-A 0093619) ja tiettyjä t-PA-mutantteja (EP-A 0199574 ja DE-A 3708681). CHO-solujen transformointi vektoreilla, mitä seuraten solut ilmaisevat niille uusia proteiineja, suoritetaan kirjallisuudesta tutun menettelytavan mukaan kuten esimerkiksi kuvattu edellämainituissa EP- ja DE-julkaisuissa.

Isäntäsoluina voidaan käyttää CHO-K1-tunnusmerkin mukaisia soluja, jotka Puck eristi v. 1957 kudosnäytemateriaalista ja jotka liitettiin kokoelmaan the American Type Culture Collection (ATCC) tunnuksella CCL-61 v. 1970. ATCC-laitos on uudel-leentallettanut tämän solulinjan 23. joulukuuta 1987 Budapestin sopimuksen mukaan tunnuksella CRL 9618.

Haluttua proteiinia koodaava DNA-sekvenssi voidaan valmistaa . entuudestaan kirjallisuudesta tutun menettelytavan mukaan, esi- • · < merkiksi kuten kuvattu useissa edellämainituissa patentti- ja hakemusjulkaisuissa. Kulloisenkin sekvenssin sekä myös säätely-sekvenssejä sisältävät vektorit voidaan rakentaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi käyttämällä E.coli-kantaa K-12294 (ATCC 31446) tai E.coli-kantaa X-1776 (ATCC 31537), jotka kannat ATCC-tallennuslaitos on uudelleentallettanut 23. joulukuuta 1 987 Budapestin sopimuksen mukaan hakunumeroi1 la 53704 ja 53705, jolloin voidaan rakentaa esimerkiksi plasmidit pETPER ja pETPFR, joita kuvataan EP-A-hakemusjulkaisussa n:o 093619. CHO-solut voidaan transformoida kuten kuvattu hakemusju1 kai«ui 1 2 94963 EP-A U93619, DE-Λ 3708681, ΕΡ-Α 0117059 ja ΕΡ-Α 199574 tai muiden kirjallisuudesta tuttujen menetelmien mukaan.

t-PA-tuottovektori integroitiin ulaklooniin CHO-K1 -DUX Hl 1 (Urlaub et.a 1., Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 77 (1980) 4216-4220). Tämä solulinja - mutantti, jota puuttuu dihydrofolaattireduktaasi (DHFR-) - soveltuu transformoitujen solukloonien valikointiin DHFR:n suhteen. Humuani-c-DNA:n vektori voi olla tuttu plasmivektori pBR322 tai sen jälkeläinen Esherichia colissa. Kyseisen geenin sekä DHFR-geenin promoottorialue on peräisin SV40:stä ja kummankin geenin lope-tusalue eräästä hepatiitti-B-pinta-antioeenista. Esimerkeissä käytettiin plasmidilla pETPER tai pETPFR transformoituja CHO-K1-DUX- B11-soluja (katso EP-A 0117059).

Seerumivapaaksi kasvualustaksi soveltuu jokin useammasta tutusta tuotteesta (katso esim. BMFT-tilanneseminaari 12,13.marras -kuuta 1 985 , Bundesministerium fiir Forschung und Technologie, 5300 Bonn 2. ss. 111-120). Seuraavassa esimerkissä seerumiva-paana kasvualustana käytetään yhdistelmäkasvualustaa DMEM/llam's F 12 (1:1) (Gibco). Kasvualustaan lisätään vasikansiösoerumia (FKS) pitoisuus 7,5% tai 1-2 %.

Soluviljelmiä inkuboidaan 37°C:ssa inkubaattorissa ja ilmustuk- . sena käytetään kaasuseosta, jossa on 7,5 % hiilidioksidia il-• · massa ja jonka suhteellinen ilmankosteus on 100 %. Kulloisenkin viljelmän mukaan käytetään erilaisia viljelysastioita: 100-1000 ml:n kasvualustaerille käytetään ravistelupulloja, 70-100 ml:n erille 175 cm^in Roux-kolveja (Nunc), 75 cm^n samoja kolveja 30-50 ml:n erille, 25 cm^m samoja kolveja 7-10 ml:n erille sekä Costar-valmistajän 2 cm^in moniviljelymaljoja 1 ml:n viljelmäerille. Kannan ylläpitämiseksi solut sijoitetaan viljelmiin 0,2-0,3 x 106 solun/ml kerrokseksi alakloonataan joka 2.-3. päivä.

1 3 94963

Proteiinituottoa stimuloivat aineet voidaan kulloisellakin ajankohtana lisätä 1:100 laimennoksina, eli ne liuotetaan ensin kasvualustaan tai, jos ne ovat niukkaliukoisiä, etanoliin ja sitten kasvualustaan, minkä jälkeen tämä kulloinkin lisättävän aineen sisältävä kasvualustaerä lisätään solut käsittävään kasvualustaan suhteessa 1:100 (v/v).

Seuraavissa esimerkeissä otetaan t-PA-synteesin stimuloitumisen tuottamiseksi eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevasta viljelmästä soluja, jotka erotetaan sentrifugoimalla muoviputkissa (Falcon) 10 minuutin ajan 1000 x g:ssä Beckmann T-3-6 -sentrifu-gissa. Viljelmäsupernatantti poistetaan dekantoimalla, minkä jälkeen solupelletti uudelleensuspendoidaan uuteen kan.vualus-taerään.

t-PA:n tuottamiseksi seerumipitoisessa kasvualustassa uutena kasvualustana käytettiin alustaa F12/DMEM, johon oli lisätty 7,5 % FKS:ää sekä gentamysiiniä. Saatavaa suspensiota voidaan sitten siirtää 2 cm^:n 24 kuopan kuoppalevyille solupitoi suu-tena 0,2-0,3 x 10® solua/ml.

t-PA:n tuottamiseksi seerumivapaassa kasvualustassa soluja sopeutettiin aluksi 3-4 päivän ajan kasvualustassa, joka sisälsi 1-2 % FKS:ää, minkä jälkeen ne sentrifugoitiin toistamiseen ja solupelletti uudelleensuspensoitiin seerumivapaaseen kasvualus-taan sekä siirrettiin lopuksi saatua suspensiota 2 einein 24 kuopan kuoppalevyille solupitoisuutena 0,4-0,5 x 10® solua/ml.

Kvantitati iviset t-PA-määritykset.

Soluviljemä supernutanteista ja solu-uutteista otettiin tai valmistettiin eri ajankohtina näytteitä. Näytteet mitattiin joko välittömästi tai säilytystä -20°C:ssa seuraten seuraavia menetelmiä käyttäen: 1 4 94963

MÄÄRITYSMENETELMÄT

1. Suora kromogeenimääritys (DCA) t-PA muodostaa valmistajan Kabi Diagnostica synteettisestä peptidi substraatista S-2288 (D-H-Ile-Pro-Arg-p-nitroani1iini) reaktiotuotteena p-nitroaniliinia. t-PA-aktiivisuus on verrannollinen p-nitroani1iinin muodostukseen, joka mitataan 405 nm:ssä 37°C:ssa.

Entsyymikinetiikka määritettiin spektrofotometrisesti valmistajan Eppendorf automaattisella ACP-5010-analyysilaitteella.

Entsyymiaktiivisuus laskettiin annetusta standardista Labor-standardin avulla valmistettiin t-PA-standardipitoisuuskuvaaja 1-15 jum, jolloin käytetty entsyymi koostui 72-%:isesti 1-ket-juisesta materiaalista.

Substraatti 1iuoksen (liuoksena 100 mM Tris/ 106 mM NaCl) käyttökelpoisuus oli 50 mM.

2, ELISA.

Viljelmäsupernatanteista ja solu-uutteista otettujen näytteiden kvantitatiiviset määritykset suoritettiin ELISA-määrityksenä ·· (entsyymiliitteinen immunosorbenttimääritys). Standardina käytettiin Laborstandardin avulla valmistettua kuvaajaa pitoisuus-alueella 0,038 - 5 ug/ml. Näytteet laimennettiin suhteessa 1:10 - 1 : 1 000.

Transformoitujen CHO-solujen karakterisointi.

CHO-soluja siirrostettiin pitoisuutena 0,2-0,3 x 10^ solua/ml viljelymaljoihin (kasvualustassa 7,5 % FKS:ää), jolloin ne lisääntyivät aluksi hyvin hitaasti. Vasta 24 tunnin lag-vaiheen jälkeen alkoi logaritminen solukasvuvaihe. Pitoisuuden ollessa il . m i nm I I » «l : 15 94963 1,3^ 0,04 x 10^ solua/ml ilmenivät viljemässä 4. päivänä ensimmäiset ei-e1inkelpoiset solut; niiden osuus kokonaissoluluvusta oli 13,2 1 ,3 %. Maks imisolupi toi suus saavutettiin 5. päivänä ja se oli 1,8 ^0,05 x 1 O6 solua/ml (liite 1).

Seitsemän päivän kuluttua elävien solujen osuus oli edelleen 72 3 % kokona issolumassasta .

Eksponentiaalista solukasvuvaihetta seuraavaan statiouäärivai-heeseen johtavat useat tekijät. Korkean populaatiotiheyden sekä oleellisten ravinteiden kulutuksen johdosta solut eivät enää jakaannu. Stationäärivaiheen kesto vaihtelee suuresti ja on riippuvainen kasvualustan sisältämistä aineosista kuten seerumista. Happojen sekä myrkyllisten aineenvaihduntatuotteiden kerääntyminen kasvualustaan sekä ympäristötekijöiden muutokset (hapan pH, alhainen hapen osapaine, puutteellinen läpi-ilmas-tus) jouduttavat niinikään solujen kuolemista.

CHO-solujen t-PÄ-tuotanto.

Solukasvun ja t-PA-synteesin välillä vallitsee lineaarinen riippuvuus.

t-PA-tuotannossa esiintyy ajallisesti 2 vaihetta. Ensimmäisessä . vaiheessa t-PA-pitoisuus viljelmäsupernatantissa kohoaa tasaisesti. Toisessa vaiheessa entsyymisynteesi pysähtyy käytännöllisesti katsoen kokonaan ja kasvualustan t-PA-pitoisuus pysyy likimain vakiona (liite 2A). t-PA-pitoisuusmaksimi on 4. päivänä ELISA-määrityksen mukaan 11,1 +0,7 /jg/ml. Kromogeenimääri-tyksillä mitatut t-PA-pitoisuudet ovat jonkin verran korkeammat, mikä johtuu oletettavasti 2-ketjuisen t-PA:n läsnäolosta, jolloin kuitenkin ELISA-määritykseen verrattaessa määritysmenetelmien mukaiset kuvaajat ovat 4. päivään asti rinnakkaiset.

Solu:, -isäinen t-PA-pitoisuus seuraa niinikään solukasvua ollen 16 94963 kuitenkin suhteellisen alhainen syntetisoituneeseen kokonais-t-PA-määrään nähden. Neljäntenä päivänä sen osuus on 7 % koko-naisaktiivisuudesta (liite 2B).

Kuten liitteestä 3A ilmenee, soluluvusta laskettu t-PA-synteesi voimistuu kevyesti 4. päivään asti; ELI SA-määr i t ykseri mukaisesti maksimiarvoksi saadaan 8,1 ^ 1,2 λιί t-PA:ta 1 x 10^ solua kohden. Solunsisäinen t-PA saatiin määritetyksi vain ELISA-mää-rityksen avulla, sillä nämä vähäiset t-PA-pitoisuudet (<1 ug) ole määritettävissä DCA-määrityksen avulla.

Solulukua kohden laskettu solunsisäinen t-PA-pitoisuus on kuitenkin solukasvun log-vaiheen kestäessä jonkin verran korkeampi ollen 500 - 900 ng t-PA:ta 1x10^ solua kohden ja 4. päivästä eteenpäin noin 450 ng/1 x 10^ solua (liite 3B).

Kasvualustan sisältämän seerumin ja seerumitekijoiden vaikutus CHO-solujen solukasvuun ja t-PA-tuotantoon.

Solut sijoitettiin viljelemään pitoisuudeksi 0,25 x 10^ so-lua/ml, ja kasvualustan seerumipitoisuutta vaihdeltiin.

Kasvualustan alle 5 %:n seerumipitoisuudella on solujakaantu-miseen negatiivinen vaikutus, jolloin t-PA-tuottokykyyn on sitä . vastoin vähäinen.

Kasvualustan seerumipitoisuuden vaikutus solukasvuun ja solujen t-PA-tuotantoon, kun soluja on viljelty 48 tuntia, on esitetty taulukossa 1. Esitetyt arvot ovat prosentteja maksimiarvoista (kasvualustan sisältäessä 7,5 % FKS:ää). Soluluvun maksimiarvo on 0,56 0,03 x ΙΟ** solua/ml ja t-PA-pitoisuuden 5,7^ 0,5 ,υκ/ηιΐ.- PA-määntykset tehtiin DCA-menetelmän avulla (keskiarvo ^ standardipoikkeama, n = 4).

Il i id i ι,ιΐ! , I , IF) , 1 7 94963 TAULUKKO 1 .

f ! " ---

: % FKS Soluluku t-PA

40 61,5 + 2,8 59,2+3,9 20 79,4 13,8 , 81 ,2 1 2,4 10 88,6 1 5,3 I 90,3 1 6,7 7,5 100,0 1 6,4 100,0 1 7,9 5 72,4 14,9 87,0 111,3 1 43,1 1 1 ,5 79,2 + 6,7 0 37,5 1 1 ,8 75,4 1 4,6

Soluviljelmä seerumivapaassa kasvualustassa.

Solut sijoitettiin viljelmään seerumivapaaseen kasvualustaan solupitoisuutena 0,4-0,5 x 10^ solua/ml. Solut jatkoivat jakaantumista 4. päivään asti, jolloin niinikään elävien solujen maksimiarvo 1,0 1 0,2 x 10^ solua/ml saavutettiin 4. päivänä (li ice 4 ).

t-PA-tuotanto seerumivapaassa kasvualustassa.

Viljelmäsupernatantin t-PA-pitoisuus kohoaa 7. päivään asti tasaisesti ja saavuttaa ELISA-määrityksen mukaisen maksimiarvon 13,6 1 0,54 ^jg/ml. DCA-määrityksillä mitatut t-PA-arvot ovat päivinä 1-3 alhaisemmat ja 4. päivästä eteenpäin korkeammat kuin ELISA-määrityksillä saadut t-PA-arvot (liite 5).

Solua kohden laskettu t-PA-synteeriarvo on seerumivapaassa ympäristössä likimain yhtä korkea kuin seerumipitoisessa ympäristössä ja /(7,2 13,6) - (10,3 12,8)/jug/l x 106 solua (ELISA) (liite 6 ).

18 94963

Seerumivapaassa ympäristössä t-PA:n prosentuaalinen osuus vil-j elmäsupernatantin kokonaisproteiinipitoisuudesta on /(10,9 1,0) - (12,5 +_ 1,4)/ %. Tulokset on esitetty taulukossa 2. t-PA-arvot määritettiin ELISA-määrityksinä (keskiarvo ^ stan-dardipoikkeama, n = 4).

TAULUKKO 2.

I — " I ' f Päivä proteiinia .ug/lxlO® solua , t-PA v.< < /1 x 1 0 ^ solua | 1 71,0 + 8,0 7,2 + 3,6 3 81,8+9,4 | 9,0+2,3 5 82,0 + 12,2 i 9,3 + 0,8 _I__ AIifaattisten monokarboksyylihappojen vaikutus.

Eri alifaattisten monokarboksyylihappojen CHO-solujen t-PA-tuotantokykyyn 7,5 % FKSrää sisältävässä kasvualustassa tuottama kohoaminen on esitetty taulukossa 3. Kutakin happoa käytettiin pitoisuutena 10 mM - 500 mM. Kaikkien monokarboksyy1i-happojen optimiannos oli 1 - 10 mM. Kyseisten happojen vaikutus riippuu niiden ketjupituudesta.

Kaikki vaikutusta omaavat monokarboksyylihapot estävät solu-kasvua. Propioni-, voi- isovoi- ja isovaleriaanahapon vaikutusalue on niiden pitoisuuden osalta laajempi, koska niiden pitoisuudesta riippuvainen solukasvun estoon johtava primääriaineen-vaihdunnan inhibitio esiintyy samanaikaisesti t-PA-synteesin tehostumisen kanssa. Taulukon 3 arvot on laskettu 1 ml viljelmä superna tanttia kohden ja ne ilmoitetaan prosentteina kontrolli ;ta (= 0%). t-PA-määritykset suoritettiin DCA:n avulla (kes- > äu-t emi li t iu • · 1 9 94963 kiarvo standardipoikkeama, n = 3-24). Maksimiarvo on saatu yhdestä yksittäisestä näytteestä. Yksittäisistä näytteistä saadut mittaustulokset on esitetty sulkeissa.

TAULUKKO 3.

( ' ;Monokarboksyy- Optimiannos t-PA-synteesin lihappo tehostumis-%

Maksimi Keskiarvo f muurahaishappo 100 /im | 7,4 6,5 ^ 0,9 propionihappo 5-10 mM (10 mM) 45,5 28,0 ^ 2,5 voihappo 1-5 mM ( 1 mM) 68,3 41,9 + 3,8 isovoihappo 0,6-10 mM (10 mM) 32,9 16,6 + 2,8 j

isoValeriaani- J

happo 1-10 mM ( 5 mM) 39,3 18,7+2,4 j

Keskimääräarvot on saatu useammasta 3-4 päivän tuotantokasva-tuksesta, jolloin monokarboksyy1ihapot on lisätty viljelmään päivänä 0-3, kuten alla taulukossa 3A on esitetty. Yksittäis-ten näytteiden tietoja on esitetty sulkeissa.

20 94963

TAULUKKO 3A

monokarboksyy1i- lisäyspäivä näytteenotto- happo päivä n i .

muurahaishappo 10 (0) I 2-3 (2) 4 propionihappo 0-3(2) ! 1-4(3) 24 j voihappo 1(3) 2-4 (3) 18 isovoihappo 0-2(3) 2-4 (3) 11 isovaleriaanahappo 0-2(4) 1-4 (4) 19 n = tuotantokasvatusluku

Liitteessä 7 on esitetty t-PA-tuotannon kohoaminen Cj_C5-mono-karboksyylihappojen vaikutuksesta ajan funktiona 7,5 % FKSrää sisältävässä kasvualustassa. Jo 24 tunnin kuluttua on todettavissa t-PA-tuotannon stimuloituminen, jonka aste on 18,1 +. 5,7 %:sta (C4) aina 24,8 0,5 %:iin (C5) asti. Isovoihapon kohdalla tuotantoasteen kohoamista esiintyi vasta 48 tunnin kuluttua. C3- ja C4-karboksyylihappoj en kohdalla t-PA-tuotannon maksimitehostaminen saavutettiin 3. päivänä ja se oli Nu-buty-raatin kyseessä ollen 37,2 ^ 5,1 %. Voi- ja isovoihapon osalta tuotannon tehostuminen on ainoastaan lyhytaikaista ja vaikutusta ei enää 4. päivänä ole todettavissa. Propionihapon ja isova-i. leriaanahapon tuotantoa tehostava vaikutus sitä vastoin on 4. päivänä edelleen tallella ja ilmenee t-PA-tuotannon 31,8 %:n kohoamana C3_hapon vaikutuksesta ja 8,5 %:n kohoamana C5~hapon vaikutuksesta.

Vaikutukset ovat lisäksi solujen fysiologisesta tilasta riippuvaisia. Herkimmillään stimuloinnille solut ovat eksponentiaalisen kasvunsa aikana.

Taulukossa 4 on esitetty CHO-solujen ja t-PA-tuotannon kohoa- 21 94963 niinen C3~C5-inonokarboksyylihappojen vaikutuksesta 7,5 % FKS:ää sisältävässä kasvualustassa karboksyylihappojen lisäyspäivän funktiona, kun soluja on kasvatettu 48 tunnin ajan 7,5 % FKS:ää sisältävässä kasvualustassa. Voihapon ja isovaleriaanahapon pitoisuus oli 1 mM ja propionihapon ja isovaleriaanihapon 5 mM. Arvot on laskettu 1 ml viljelmäsupernatanttia kohden ja ne ilmoitetaan prosentteina kontrollista (= 0 %) (keskiarvo ^ standardipoikkeama, n = 3-5). t-PA-määritykset tehtiin DCA:n avulla.

TAULUKKO 4.

lisäyspäivä C3 C4 j C4-I C5 0 28,7+9,3 33,0+ 5,* 20,1+10,7 17,2+1,0 1 24,4 + 4,1 40,2 + 12,2 25,3 + 5,1 1 9,4 + 1 , 5! ______I_i

Voihapon vaikutus CUO-solujen t-PA-tuotantoon.

Stimuloitumisvaikutus on yhdistettävissä sekä solunsisäisen t-PA-pitoisuuden kohoamissen että myös solunulkoisen t-PA-pitoi-r suuden kohoamiseen.

Kuten liitteestä 8 ilmenee, on solunsisäisen t-PA-pitoisuuden kasvu viljelmässä, johon on lisätty butyraattia, kontrolliin nähden suurimmillaan 24 tunnin inkuboinnin jälkeen (43,8 ^ 9,8 %). Viljelmäsupernatantissa prosentuaalinen kohoama 24 tunnin jälkeen on jonkin verran alhaisempi ollen keskimäärin 19,2 % (DCA ja ELISA) kontrolliarvoista. Tämä vaikutus säilyy supernatantissa 72 tuntia.

22 94963

Liitteessä 9A-C on esitetty solulukua kohden lasketut t-PA-syn-teesiarvot ja niistä ilmenee, että t-PA-synteesin stuuuloitu-minen Na-butyraatin vaikutuksesta säilyy solukasvuestovaikutuk-sesta huolimatta 7 päivän ajan. Ensimmäisten 4 päivän aikana tehostuu entsyymisynteesi solua kohden tasaisesti. t-PA-pitoi-suus viljelmäsupertantissa nousee 7,5 ^ 1,1 /ugista 1 x 10^ solua kohden 28,9 5,3 uniaan t-PA:ta samoin 1 x 10^ solua koh den (ELISA-määritys) (liite 8A). DCA-menetelmän mukaan saadaan maksimi-t-PA-pitoisuudeksi 47,4 7,4 ,ug t-PA:ta 1 x 10^ solua kohd en (liite 9B). Samanaikaisesti solunsisäinen t-PA-pitoisuus laskee 1,5 ^ 0,2,-ugista t-PA:ta 1 x 10^ solua kohden 5. päivään asti (liite 9C).

Taulukossa 5 on esitetty solulukua kohden laskettu t-PA-syn-teesin stimuloituminen Na-butyraatin vaikutuksesta 7,5 % FKSiää sisältävässä kasvualustassa. Na-butyraattia lisättiin päivänä 0 pitoisuus 1 mM. Päivien 1-4 arvot on ilmoitettu prosentteina kontrollista ( - 0%) ja laskettu 1 x 10^ solua kohden. Viljel-mäsupernatantin ja solu-uutteen t-PA-pitoisuus määritettiin ELISA-määrityksenä (keskiarvo standardipoikkeama, n = 5-10).

TAULUKKO 5 ' ; i r päivä solunsisäinen solunulkoinen pitoisuus pitoisuus 1 90,9 + 9,5 68,5 + 12,4 2 ! 99,7+26,5 118,8+16,1 3 93,9 + 31,4 223,4 +77,4 4 209,8 + 41 ,4 280,7 + 85,9 23 94963

Optimaaliseen tuotannon tehostumiseen päästiin, kun Na-buty-raatti lisättiin soluihin niiden eksponentiaalisen kasvun aikana. Na-butyraatin maksimivaikutus esiintyy 1isäysajankohdan ajoittuessa päiviin 0-2 aina 3. päivänä (liite 10).

Lisäämällä Na-butyraattia joka 2-3. päivä samaan solupopulaatioon tämän kasvualustan vaihtoa seuraten pystyttiin t-PA-tuotanto pitämään pitkähköjä aikajaksoja kohonneella tasolla.

Taulukossa 6 on esitetty CHO-solujen t-PA-tuotannon lisäys vil-jeltäessä soluja 7,5 % FKS:ää sisältävässä kasvualustassa. Na-butyraattia lisättiin 1 mM jokaisen kasvualustavaihdon yhteydessä tai vain päivänä 0. Kahden, neljän, seitsemän tai yhdeksän päivän kuluttua kasvualustavaihdosta mitatut arvot on ilmoitettu prosentteina kontrollista (= 0%) ja laskettu 1 ml viljelmäsupernatanttia kohden. t-PA-määritykset suoritettiin DCA:n avulla (keskiarvo ^ standardipoikkeama, n = 3).

TAULUKKO 6 '-i-“-1-r kusvualustanvaihtc [ lisäyspäivä päivänä: j 0, 2, 4, 7 i -1 — --- 2 j 33,0 + 5,4 4 107,4 + 7,6 7 96,6 + 5,8 9 62,0+4,8

Voihapon vaikutus CHO-solujen t-PA-tuotantoon seerumivapaassa kasvualustassa.

Vastoin seerumipitoisesa kasvualustassa todettavaa butyraatti-stLmulaation lyhytaikaisuutta kyseinen vaikutus säilyy seerumi- 24 94963 vapaassa kasvualustassa pitempään ja on 1 päivän kuluttua Na-butyraatin lisäämisestä 44,1 ^ 7,1 % kontrollista. Maksimite-hostamiseen päästiin 3 päivän kuluttua Na-butyraatin lisäämisestä ja se oli 143, 12,8 %. Tuotannon tehostuin i svn ι kut us oli todettavissa vielä 6 päivän kuluttua Na-butyraatin lisäämisestä, jolloin se oli 49,9 7,0 % (liitteet 11 ja 12).

1 x 106 solua kohden laskettu t-PA-synteesitaso on seerumi-vapaassa kasvualustassa niinikään korkeampi kuin seerumipi-toisessa kasvualustassa ja kohoaa 50 ug:n 1x10^ solua kohden (liite 13).

Propionihapon vaikutus.

Kyseinen C3-karboksyylihappo osoittaa hyvin samankaltaisia vaikutuksia t-PA-synteesiin kuin voihappo. Tuotannon prosentuaalinen tehostaminen jää kuitenkin noin 14 % alhaisemmaksi ja t-PA-stimulaatioon tarvittavat pitoisuudet ovat korkeammat (5-10 mM). Edelleen propionihappo estää vähäisemmässä määrin solu-ka svua ja tuottaa sen vuoksi pitempiaikaisen t-PA-synteesin tehostamisen .

t-PA-synteesin tehostuminen propionihapon vaikutuksesta vaikuttaa vastoin voihapon vaikutusta olevan hyvin spesifinen, koska seerumivapaassa kasvualustassa solunulkoinen proteiinipitoisuus kohosi kontrolliin nähden vain vähän ja ^H-leusiinin kulutus proteiinisynteesiin kohosi vain vähän.

Dikarboksyylihappojen, hydroksikarboksyylihappojen ja ketokarboksyy1ihappojen vaikutus CHO-solujen t-PA-tuotantoon.

Hydroksikarboksyylihapoilla, kuten maitohapolla, glyseriiniha-polla, omenahapolla ja viinihapolla, tavataan vain lievä t-PA-synteesin tehostuminen, joka oli 6-10 %, jolloin parhaiten t-PA-synteesiä stimuloi viinihappo pitoisuutena 10 mM (saatu <1 . .Ui Milli I I I «I · 25 94963 arvo 10,3 2,9 % kontrollista). Hydroksyylihapot eivät vaikuta solujakaantumiseen ja niiden vaikutus t-PA-synteesiin on todettavissa vielä 96 tunnin kuluttua.

Askorbiinihapon vaikutus

Askorbiinihapon vaikutus, kun sen pitoisuus oli 10 mM, t-PA-tuotantoon kesti 72 tuntia ja se tuotti päivänä 0 lisättynä 24 tunnissa t-PA-synteesin tehostumisen 15,2 3,1 %:lla (liite 14).

Pitkäketjuisten rasvahappojen vaikutus CHO-solujen t-PA-tuotantoon.

Totesimme, että myös pitkäketjuiset rasvahapot kuten nonaktii-nihappo, joka käsittää 10 hiiliatomia, sekä furaanirasvahapot kykenivät aikaansaamaan t-PA-tuotannon tehostumista (taulukko). Tässä esimerkissä käytettiin kaavan 4 mukaista furaanirasvahap-poa, jolloin ko. kaavassa m = 4 ja n = 8.

Seerumivapaassa ympäristössä ei kuitenkaan ollut todettavissa t-PA-synteesin tai yleensä proteiinisynteesin minkäälaista tehostumista.

CHO-solujen t-PA-tuotannon tehostuminen pitkäketjuisten rasvahappojen vaikutuksesta on esitetty taulukossa 8. Soluja viljeltiin 7,5 % FKSrää käsittävässä kasvualustassa. Hapoille kokeiltiin pitoisuuksia 10 - 10 mM, jolloin optimaalinen oli pi toisuus 1 mM. Saadut arvot on laskettu 1 ml viljelmäsuperna-tanttia kohden ja ne ilmoitetaan prosentteina kontrollista ( = 0 %) (keskiarvo ^ standardipoikkeama, n = 4-9). Saatu maksimiarvo on mitattu yhdestä yksittäisestä näytteestä. t-PA-mää-ritykset tehtiin DCA:n avulla.

TAULUKKO 7 26 94963 f —--1-—-——

Rasvahapoo t-ΡΛ-synteesin tehostumis-%

Maksimi Keskiarvo __1

Nonaktiinihappo 58,3 30,3 6,5

Furaanirasvahappo 32,1 1 9,0 3 , 2

Keskimääräarvot on laskettu useista 4 päivän tuotantokasvatuk-sista, jolloin hapot lisättiin päivänä 0, kuten esitetty taulukossa 8A. Yksittäisiä näytteitä koskevat tiedot on esitetty sulkeissa.

TAULUKKO 7A

Rasvahappo Lisäyspäivä Näytteenottopäivä n |

Nonaktiinihappo 0 (0) 1 - 4 (2) 4

Furaanirasvahappo 0 (0) 1 - 4 (2) 9

Tiolien ja sulfidien vaikutus CHO-solujen t-PA-tuotantoon.

Neljä rikkipitoista yhdistettä, jotka olivat karboksyy1ihappo je n johdannaisia tai niiden substituutiotuotteita, osoittivat t-PA-tuotannon tehostumista, joka oli 16 - 31,2 %, jolloin niillä ei kuitenkaan ollut kielteistä vaikutusta solukasvuun (taulukko 8). Substituoitujen karboksyy1ihappojen optimaalinen • 27 94963 vaikutus esiintyi samoilla pitoisuuksilla (1-10 mM) kuin muidenkin vaikutusta omaavien karvoksyylihappojen. Vain glutationi oli tehokas alhaisemmissa, 1-10.<uM:n pitoisuuksissa. Tioglyko-lihappo osoittautui edulliseksi t-PA-synteesiä CHO-soluissa stimuloivaksi aineeksi.

Tässä esimerkissä soluja viljeltiin 7,5 % FKS:ää sisältävässä kasvualustassa. Kutakin ainetta kokeiltiin pitoisuuksina 1 ,uM. Taulukossa 9 esitetyt arvot on laskettu 1 ml viljelmäsuperna-tanttia kohden ja ne ilmoitettiin prosentteina kontrollista ( = 0 %) (keskiarvo standardipoikkeama, n = 6-19).

Saatu maksimiarvo on mitattu yhdestä yksittäisestä näytteestä. t-PA-määritykset suoritettiin DCA:n avulla. Kulloisenkin aineen pitoisuus on ilmoitettu sulkeissa.

TAULUKKO 8 —-— I---—--—»

Tioli tai sulfidi Optimiannos t-PA-synteesin tehostamis- %

Maksimi Keskiarvo

Tioglykolihappo 1 mM 66,4 31,2 + 3,2 ' Tiodiglykolihappo 1 mM 31 ,0 18,0 3,8 L-kysteiini 1-10 mM (1 mM) 41,4 20,9 +3,4

Glutationi 1-IO^M (10/jM) 30,6 16,0 + 2,0

Keskimääräarvot on laskettu useista 3 päivän tuotantokusvatuk-sista, jolloin aineet lisättiin päivänä 0-2, kuten taulukossa 9A esitetty. Yksittäisiä näytteitä koskevat tiedot on esitetty sulkeissa.

«

TAULUKKO 8A

28 94963 --!-~—Π—1-Π-~-1

Rasvahappo Lisäyspäivä | Näytteenottopäivä n !

Tioglykolihappo 0-2 (1) 1-3 (2) 19

Tiodiglykolihappo 1 (1) 2-3 (3) 9 L-kysteiini 0-1 (0) 1-3 (2) 11

Glutationi 0 (0) 2-3 (2) 6

Tiokarboksyylihappojen etu monokarboksyylihappoihin nähden on, että niillä ei ilmene estovaikutusta solulisääntymiseen, joskaan näilläkään aineilla ei t-PA-tuotantoa saatu kohoamaan voi-hapolla saavutetusta tasosta edelleen. Samoin tehostumisvaiku-tus on kestoltaan lyhytaikainen ja maksimiarvo saavutetaan 24 tunnin kuluttua tioglykolihapon kyseessä ollen ja 48 tunnin kuluttua kysteiinin kyseessä ollen. Solujen 4 päivää kestäneen inkuboinnin jälkeen on vaikutus t-PA-tuotantoon edelleen vain vähäinen (liite 15).

Seerumivapaassa kasvualustassa stimulaatiovaikutus t-PA-syntee-siin on kuitenkin vähäisempi kuin seerumia sisältävässä kasvualustassa, koska kaikki kyseiset aineet estävät solujakaantu-·; mistä 10-20 %:lla.

Tioglykolihapon vaikutus.

Tioglykolihapon lisäämistä seuraten t-PA-tuotanto säilyy kohonneena 72 tunnin ajan lisäyspäivästä riippumatta. Entsyymisyn-teesin prosentuaalinen nousu on kuitenkin 24 tunnin kuluttua korkeimmillaan ja laskee tästä ajankohdasta eteenpäin jatkuvasti .

Taulukossa 9 on esitetty lisäyspäivän funktiona CHO-solujen t- 0

Il : lll.L lllli 1,1 * M .

29 94963 PA-tuotannon kohoaminen viljeltäessä soluja 24-96 tuntia 7,5 % FKS:ää ja 1 mM tioglykolihappoa sisältävässä kasvualustassa.

Arvot on laskettu 1 ml vi1jelmäsupernatanttia kohden ja ne ilmoitetaan prosentteina kontrollista ( = 0 % ) (keskiarvo 1 standardipoikkeama, n = 4-6). t-PA-määritykset tehtiin DCA:n avulla.

TAULUKKO 9 —— , ' 1 1 — - I —— r - "1 ' }

Aika (tuntia) . Lisäyspäivä i

i I

-1---i 0 1 2 24 27,6 + 5,6 34,7 + 10,9 34,5 + 7,5 48 16,9 12,3 17,1 1 3,6 16,3 + 8,6 72 14,7 11,0 10,2 1 2,7 9,4 11,7 96 3,413,0 2,710,8 0,511,0 t-PA-tuotantoa voidaan kohottaa lisäämällä tioglykolihappoa yhden kerran asemesta kahtena eri lisäyksenä (liite 16).

Liitteessä 17A (DCA) ja liitteessä 17B (ELISA) on esitetty . t-PA-synteesin eteneminen 1x10® solua kohden laskettuna.

t-PA-synteesi tehostuu 1 mM:n tioglykolihappoa vaiku;uksesta ensimmäisinä 3 päivänä (DCA) kontrolliin verrattuna. ELISA-määrityksellä saadut t-PA-arvot sitä vastoin pysyvät kohonneina kautta koko ajanjakson. Kohoamisnopeus on vielä 4. päivänä noin 35 %. Tioglykolihappo kohottaa samoin solunsisäistä, samoin solua kohden laskettua t-PA-pitoisuutta. Solunsisäinen maksimi-t-PA-pitoisuus on 1 ,1 1 0,1 ,ug 1 x 10® solua kohden 24 tunnin kuluttua ja laskee 96 tunnissa noin puoleen alkuperäisestä pitoisuudesta (liite 17C).

30 94963

Solunulkoinen t-PA-pitoisuus on 5. päivänä kohonnut kontrolliin verrattuna 10,7 %. Tioglykolihapon tuottama t-PA-synteesin prosentuaalinen tehostuminen on seerumivapaassa kasvualustassa jonkin verran vähäisempi, koska solujakaantummen estyy tällöin jonkin verran (10-20 %).

Monokarboksyylihappojohdannaisten vaikutus CHO-solujen t-PA-tuotantoon.

C4-karboksyylihappojohdannaisten ryhmästä löydettiin lisää yhdisteitä, jotka osoittavat vaikutusta CHO-solujen t-PA-synteesiin. Näihin yhdisteisiin kuuluvat ensijassa butyryyliko-liinibromidi (BCB) ja -kloridi (BCC), jotka kohottavat t-PA-tuotantoa 30-40 %:lla. Nämä C4-johdannaiset osoittavat joka suhteessa samoja vaikutuksia kuin Na-butyraatti ja omaavat vaikutusta samoina pitoisuuksina.

Taulukossa 10 on esitetty näiden kahden edellämainitun johdannaisen tuottama CHO-solujen t-PA-tuotannon tehostuminen. Soluja viljetiin 7,5 % FKS:ää sisältävässä kasvualustassa. Kaikkia aineita kokeiltiin pitoisuuksina 10 ^uM - 10 mM. Tulosarvot on ilmoitettu prosentteina kontrollista (= 0 %) ja ne on laskettu 1 ml viljelmäsupermatanttia kohden (keskiarvo ^ standardipoik-keama, n = 4-15). Arvot, jotka on tahollaan saatu yhdestä yksittäisestä näytteestä, on merkitty sulkeisiin. Saatu maksimiarvo on saatu yhdestä yksittäisestä näytteestä. t-PA-määrityk-set suoritettiin DCA:n avulla.

TAULUKKO 1 0 31 94963

Monokarboksyy- Optimi- t-ΡΛ-synteesin lihappojohdan- annos tehostumis- % nainen __

Maksimi Keskiarvo n BCC 5-10 mM ( 10 mM) 63,9 38,8+4,4 15 BCB 5-10 mM (2,5 mM) 49,6 29,1+4,4 9

Keskimääräarvot on saatu useasta 4 päivän tuotantoviljeimästä, kuten taulukossa 10A esitetty. Yksittäisiä näytteitä koskevat arvot on merkitty sulkeisiin.

TAULUKKO 10A

Aine Lisäyspäiva Näytteenottopäiva n BCC 1(1) 2-4(4) 15 BCB 1(1) 2-4(4) 9 Käytettäessä aineyhdistelmää ainakin yhden aineen tulisi olla solukasvua ei-estävä.

Parantuneeseen saantoon päästiin esim. käyttämällä tioglykoli-·. hapon ja voihapon yhdistelmää. Yksittäisten aineiden lisäys-ajankohtien välinen ero saattaa tällöin esittää merkittävää osaa, minkä vuoksi esim. voihappo lisättiin aina 2. aineena sen solukasvua estävän vaikutuksen vähentämiseksi.

32 94963

Lisättäessä kyseiset aineet samanaikaisesti päivänä O ei voi-hapolla saatava vaikutus parane.

Yhdistelmän voihappo ja tioglykolihappo vaikutus on additiivi-nen. Tehostumisvaikutus oli parhaimmillaan 70 %.

Seerumivapaassa kasvualustassa ei voihapon vaikutusta pystytty lisäämään toisen aineen käytöllä.

Taulukossa 11 on esitetty CHO-solujen t-PA-tuotannon kohoaminen, kun soluja viljeltiin 3 päivän ajan 7,5 % FKS:ää sisältävässä kasvualustassa. Soluihin lisättiin vaihtelevina ajankohtina yhdistelmää 1 mM tioglykolihappoa (TG:tä) ja 1 mM voihap-poa. Arvot on laskettu 1 ml viljemäsupernatanttia kohden ja ne ilmoitetaan prosentteina kontrollista (= 0 %) keskiarvo standardipoikkeama, n = 4-8). t-PA-määritykset tehtiin DCA:n avulla.

TAULUKKO 11

Lisäyspä iva Voihappo 0 1 2 0 31,3 +1,7 67,9 +5,2 30,3 +3,2 1 68,8+4,4 31,4 + 5,5 2 41,4 + 5,5

Afidikoliinin vaikutus.

Afidikoliini, joka on lajista Cephalosporium aphidicola peräi- 33 94963 sin oleva diterpeeni, estää spesifisesti DNA-alfa-polymeraasia ja stimuloi pitoisuutena 1-10 ^m. CHO-solujen t-PA-synteesiä 24 tunnissa t-PA-saanto on kohonnut 44,9 +13,9 %:lla.

Afidikoliini osoitti CHO-solujen t-PA-synteesin stimulointia.

Se saattaa reversiibelisti estää DNA-synteesiä, jolloin vaikutuksia RNA- ja proteiinisynteesiin ei ilmene. Afidikoliini soveltuu siis toisaalta t-PA-synteesiin stimulointiin ja toisaalta solujen synkronointiin. Afidikoliinin vaikutusta t-PA-synteesiin inkuboitaessa soluja pitkähkö aikajakso afidikolii-nia sisältävässä kasvualustassa on kuvattu edellä. Kyseinen jakso käsittelee kokeita soluilla, jotka olivat alttiina afidi-koliinin vaikutukselle 24 tunnin ajan sekä joita sitten viljeltiin edelleen kasvualustassa joka ei sisältänyt afidikoliinia. Solukasvusyklin eri vaiheita sekä ^H-tymidiinin siirtymistä syntetisoituihin proteiineihin analysoitiin 24 tunnin altistus-aikajakson aikana ja sen jälkeen DNA-synteesin estymisen sekä sen uudelleen alkamisen afidikoliinin poistamista seuraten seuraamiseksi. Edelleen määritettiin RNA-, proteiini- ja t-PA-synteesitasot.

Solukasvu.

Afidikoliini (1 /mO esti lievästi solukasvua 2k tunnin altistuksen . jälkeen (5-10 %:n estovaikutus). Kasvualustaa vaihdettaessa afidikoliinia sisältäneet viljelmäsolut sijoitettiin kuitenkin uusiin viljelmiin samana solupitoisuutena kuin kontrolliviljel-mät.

t-PA-synteesi.

' t-PA-synteesi stimuloitu! 1 mM:n afidikoliinipitoisuudella synkronisoidussa soluissa. Vaikutus oli todettavissa vielä 96 tunnin kuluttua kasvualustan vaihdosta.

34 94963

Taulukossa 12 on esitetty t-PA-tuotannon kohoaminen 1 ,uM:n afi-dikoliinipitoisuudelle altistetuissa CHO-soluissa, joita viljeltiin 7,5 % FKS:ää sisältävässä kasvualustassa. Arvot on laskettu 1 ml vi1jelmäsupernatanttia kohden ja ne ilmoitetaan prosentteina kontrollista ( = 0 %) (keskiarvo ^ standardipoikkea-ma, n = 4). t-PA-määritykset suoritettiin DCA:n avulla.

TAULUKKO 12

Aika (tuntia kasvualusta- t-PA-synteesin .

vaihdosta) tehostamis-% 24 40,2 + 6,7 48 59,9+11,1 72 32,8 + 6,4 96 14,7+1,3

Liitteessä 18 on esitetty t-PA-synteesin tehostuminen seerumi-vapaassa kasvualustassa ajan funktiona. Vaikutus on maksimissaan 48 tunnin kuluttua kasvualustan vaihdosta.

V Seerumivapaan kasvualustan t-PA-pitoisuus määritettiin 96, 120 ja 144 tunnin kuluttua ELISA-määrityksinä, joista saadut tulokset olivat kontrolliarvoihin nähden oleellisesti korkeampia kuin DCA:n avulla mitatut arvot. Tulokset on esitetty taulukossa 13. Koe suoritettiin 1 /jM:n afidikoliinipitoisuudelle altistetuilla CHO-soluilla, joita viljeltiin seerumivapaassa kasvu-.· alustassa. Arvot on laskettu 1 ml viljelmäsupernatanttia kohden ja ne ilmoitetaan prosentteina kontrollista (= 0 %) (keskiarvo +_ standardipoikkeama, n = 4). t-PA-määritykset suoritettiin ELISA-määrityksinä.

.* itt i dj» l i 1 st ; TAULUKKO 13 35 94963

Aika (tuntia kasvualusta- t-PA-synteesin vaihdosta) tohostumis-% 96 36,7 + 6,2 120 42,0 + 8,8 144 51,3 + 10,2

Kohonnut solunsisäinen t-PA-pitoisuus oli todettavissa ainoastaan 24 tunnin afidikoliinialtistuksen kestäessä ja kohoaminen oli noin 30 %.

Voihappo, propionihappo, butyryylikoliinikloridi ja -bromidi kykenivät kohottamaan t-PA-tuotantoa edelleen tässä järjestelmässä. Stimulaatiota tapahtui sekä seerumivapaassa että niinikään seerumipitoisessa kasvualustassa, jolloin kuitenkin seerumivapaassa kasvualustassa lisäkohoamisvaikutukseen päästiin ainoastaan lisättäessä kyseiset aineet solujen 24 tuntia kestäneen sopeutuksen kyseiseen ympäristöön jälkeen.

Taulukossa 14 on esitetty t-PA-tuotannon prosentuaalinen kohoaminen afidikoliinille altistetuissa viljemissä Na-butyraatin lisäystä viljemään seuraten. Na-butyraatti kohottaa t-PA-syn-teesiastetta edelleen 14 %:lla 96 tunnin kuluttua.

Koe suoritettiin 1 yuM:n afidikoliinipitoisuudelle altistetuilla CHO-soluilla, joita viljeltiin joko Na-butyraatin läsnäollessa tai sen puuttuessa seerumivapaina viljelminä. Arvot on laskettu 1 ml viljelmäsupernatanttia kohden ja ne ilmoitetaan prosentteina kontrollista ( = 0 %) (keskiarvo standardipoikkeama, n = 4). t-PA-määritykset suoritettiin ELISA-määrityksinä.

TAULUKKO 14 36 94963

Aika (tuntia kasvu- Afidiko- + Na-butyraatti: alusvaih- liini lisäysajan- _dosta )____kohta (tuntia )_ ___0_24_ 96 36,7 +6,2 34,1 + 9,7 50,6 +11,0 120 42,0 +8,8 31,8 +10,2 49,7 + 4,3 6-Hydroksi-4,6-dimetyyli-3-hepten-2-onin (DHO:n) vaikutus.

t-PA-tuotanto on kohoneella tasolla 144 tunnin kuluttua viljelmän altistamisesta otsikon yhdisteelle. t-PA-synteesiä stimuloiva vaikutus ilmeni mikromolaarisilla yhdistepitoisuuksi1la, esim . 0,005 - 1 00 ,uM.

Liitteessä 19 on esitetty t-PA-tuotannon kohoaminen CHO-soluis-sa, joita viljeltiin aina 168 tuntiin asti seerumivapaassa kasvualustassa, jossa DHO-pitoisuus oli >jM - 7mM. Arvot on määritetty DCA:n avulla. Liitteessä on esitetty vastaavat - ELISA-määrityksinä saadut arvot.

Edelläkuvattujen menetelmien mukaan valmistettuja soluviljelmiä voidaan sinänsä tunnetulla tavalla ede1leentyöstää t-PA:n eristämiseksi, esim. tuotantovaiheen päätyttyä kasvualusta erotetaan solumassasta ja viljelmäsupernatantti puhdistetaan ultra-suodatuksen ja kromatografisten menettelyjen avulla.

Eristetty t-PA voidaan sitten koostaa farmaseuttisiin valmisteisiin, esim. liuokseksi tai kylmäkuivatuksi valmisteeksi.

Edeltävät esimerkit voidaan suorittaa korvaten t-PA:ta tuotta- 94963 37 vat CHO-solut transformoiduilla CHO-soluilla, jotka kykenevät ilmaisemaan muita proteiineja, esim. t-PA-mutantteja tai muita farmakologisesti aktiivisia proteiineja, esimerkiksi kuten kuvattu edellä aiemmin mainituissa EP- ja DE-patentti- ja hake-musjulkaisuissa, jolloin huomionarvoisia ovat erityisesti CHO-solut julkaisuissa EP-A 199574 ja 196920 sekä DE-A 3708681.

4

Claims (8)

94963 38

1. Menetelmä t-PA-kaltaisten proteiinien tuotannon tehostamiseksi transformoitujen CHO-solujen viljelmästä, tunnettu siitä, että viljelmään lisätään pitoisuutena 0,005 - 500 mM tioglykolihappoa, tiodiglykolihappoa, L-kyste-iiniä, glutationia, butyryylikoliinikloridia, butyylikoliini-bromidia, nonaktiinihappoa, furaanirasvahappoa, askorbiinihap-poa, afidikoliinia, 6-hydroksi-4,6-dimetyyli-3-hepten-2-onia, D-a-hydroksisubstituoituja (C3- tai C4-) alifaattisia mono-tai dikarboksyylihappoja, C3-C4-alifaattisia monokarboksyyli-happoja tai niiden suoloja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini on t-Pa tai sen mutantti.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinia indusoivana aineena käytetään voihappoa tai sen suolaa.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljely suoritetaan seerumipitoi-sessa väliaineessa.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, ·. tunnettu siitä, että C3-C4-alifaattista monokarboksyy- lihappoa tai sen suolaa lisätään pitoisuuksina 1 mM - 10 mM.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluja viljellään jonkin seuraa-vien aineiden läsnäollessa: tioglykolihappo, tiodiglykolihap- « '· po, L-kysteiini, glutationi, butyylikoliinibromidi, butyryyli- koliinikloridi, nonaktiinihappo, furaanirasvahappo, askorbii-nihappo, afidikoliini, 6-hydroksi-4,6-dimetyyli-3-hepten-2-oni, D-a-hydroksisubstituoitu (C3- tai C4-) alifaattinen mono- tai dikarboksyylihappo tai niiden suolat, solut erotetaan viljelmästä ja sen jälkeen lisätään uuteen viljelyväli- •I td;» tilli I I I n I 39 94963 aineeseen ja viljellään jonkin C3- tai C4-alifaattisen mono-karboksyylihapon tai sen suolan läsnäollessa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että afidikoliini on ensiksi mainittu aine ja voihappo, propionihappo tai C3- tai C4-alifaattinen monokarboksyylihappo tai sen suola on toinen aine.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään voihappoa tai tioglykolihappoa tai niiden suolaa. « 40 94963