HU205381B

HU205381B - Process for increasing protein production of animal cells in cell culture

Info

Publication number: HU205381B
Application number: HU885275A
Authority: HU
Inventors: Andrea Stecher-Schilling; William Werz; Hans Zahner; Axel Zeeck; Rolf-Guenter Werner
Original assignee: Thomae Gmbh Dr K
Priority date: 1987-10-13
Filing date: 1988-10-12
Publication date: 1992-04-28
Also published as: NO884549D0; KR890006671A; NZ226521A; HUT48306A; IL88001A; PT88751B; PT88751A; FI94963C; JP2688222B2; ES2064336T3; NO174778C; ATE112308T1; JPH01231887A; NO884549L; DK567888A; IE883079L; DE3851685D1; CA1341400C; FI884652A0; EP0315782B1

Description

A találmány tárgya eljárás állati sejtek fehérjéket, különösen plazminogén-aktivátorokat, például szöveti plazminogén-aktivátort (tissue plasminogen activator, továbbiakban t-PA) és mutánsait termelő képességének fokozására sejttenyészetekben (például CHO-sejtek tenyészetében).

A plazminogén-aktivátorok a szerin-proteázok oszályába tartoznak, amelyek a plazminogén-proenzimet az Arg-560 és Val-561 közötti peptidkötésnek a hasításával aktív plazminenzimmé aktiválják. Maga a plazmin a fibrinolízis folyamatának az utolsó lépcsője, amely az alvadék fibrin vázát oldható peptidekké hasítja.

Patogenetikus zavaroknál, mint a koszorúér-beteg- ségek, a véralvadék nem elég gyorsan oldódik fel ahhoz, hogy a szövetek oxigénellátása kielégítő módon biztosított legyen. A szívkoszorúér-véralvadékkal való elzáródásának a következménye infarktus, amely esetében a szívizomzat nem megfelelő oxigénellátása az érintett szövetek elhalását eredményezi.

Az erek gyors rekanalizációja biztosíthatja a szívizom vérellátását és így megakadályozhatja a szív nagyobb izomrészeinek az elhalását.

A terápiában eddig streptokinázt és urokinázt alkalmaztak. A t-PA tulajdonságai azonban néhány előnnyel rendelkeznek az eddig ismert plazminogén-aktivátorokkal szemben: a fíbrinspecifikus helyi oldás, nincsenek a fibrinogén lebontásán keresztül más oldó hatásai, magas az újbóli átáramlás mértéke és nincs antitestképződés.

A t-PA glikoprotein, molekulasúlya kb. 65 000 dalion, egyláncú és kétláncú formában fordul elő és 527 aminosavból áll.

A t-PA affinitása a plazminogénhez fibrin jelenlétében százszor nagyobb, mint annak távollétében. A t-PA ilyen nagymértékű affinitása a plazminogénhez fibrin jelenlétében biztosítja a hatásos aktiválást anélkül, hogy aktiválná a perifériás keringésben levő plazminogént.

A humán t-PA-t először uteruszból állították elő tiszta formában. Más szövetekben és sejtekben, például endotéliális sejtekben, beleértve arteriális és vénás endotéliális sejteket, hasonlóképpen kimutatható volt a t-PA. A keletkező t-PA mennyisége azonban olyan csekély, hogy annak kereskedelmi célra elegendő mennyiségben való előállítása nem lehetséges.

A t-PA egy másik természetes forrása a sejttenyészet. Több sejtvonalat vizsgáltak meg, mint lehetséges t-PA termelő forrást [Gronow M. és munkatársai: Trends in Biotechnology 1,26-29. (1983)]. Egy humán sejtvonalból, Bowes-melanoma sejtekből, nagyobb mennyiségű t-PA-t tudtak előállítani a korlátozott klinikai vizsgálatok és a szerkezet felderítése céljára [Wallen és mtsai: European Journal of Biochemistry, 132, 681-686. (1983)].

Természetesen ezek a hozamok is csekélyek a széles körű klinikai alkalmazásra elegendő mennyiségű t-PA előállítására. Csak a géntechnika tette lehetővé terápiás alkalmazás céljára nagyobb mennyiségű rekombináns t-PA előállítását.

A t-PA-t 1983-ban kiónozták és közölték az aminosav szekvenciáját [Pennica: Natúré, 301,214-221. (1983)].

Azok a kísérletek, amelyek a melanomasejtekből származó t-PA-ra vonatkozó genetikai információt E.coliba integrálták t-PA előállítás céljából, nem voltak eredményesek, minthogy a keletkező fehérje nem volt glikozilált és így nem felelt meg a természetes t-PAnak.

Ezért különböző kutatócsoportok vizsgálatokat kezdtek, hogy különböző forrásból stabil emlősállatból származó sejtvonalat hozzanak létre a humán t-PA termelésére. Ezek közül a sejtvonalak közül néhány állítólag magasabb t-PA hozamú humán sejtvonal. Egy másik sejtvonal a kínai hörcsög ováriumsejt (chinesische Hamsterovarzelle, továbbiakban CHO-sejtek).

A 0 093 619 számú európai közzétételi iratban leírják a transzformáit kínai hörcsög ováriumsejtekból (CHO-sejtekből) való t-PA előállítást A kapott t-PA (r-t-PA) semmiben sem különbözik a természetben előforduló t-PA-tól.

Több közleményben leírják a t-PA mutánsokat és azok előállítását, például: a 241208,241209,240 334, 234051,233 013,231624,225 286,213 794,201153, 199 574 és a 196 920 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésekben és a 3 708 681 számú német szövetségi kőztársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben.

A leírásban minden t-PA származékot „mutánsnak” (változatnak) nevezünk, függetlenül attól, hogy azok egy vagy több olyan aminosavat tartalmaznak, amelyek a természetes t-PA azonos helyén lévő aminosavból eltérnek, vagy egy vagy két aminosav ezekben a „mutánsokban” nincs jelen, amelyek a természetes tPA-ban jelen vannak. Egy t-PA-t, amelyből sok, a természetes t-PA-ban jelen lévő aminosav hiányzik, mint például a 196 920 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben leírt is, néha „lebontott speciesznek” nevezünk.

A 199 574 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben például leírnak egy olyan t-PA mutánst, amely a 270-től a 279-es helyig olyan aminosavakat tartalmaz, amelyek eltérnek a természetes t-PA megfelelő helyén lévő aminosavaktól.

A 3 708 681 számú német szövetségi közíársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben a bejelentő néhány olyan t-PA-t mutat be, amelyek a 117-es helyen egy olyan aminosavat tartalmaznak, amelyek különböznek a természetes t-PA megfelelő helyén lévő aminosavtól, ezenfelül a mutáns t-PA, ellentétben a természetes t-PA-val, ezen a helyen nem glikozilált.

Számos közleményben leírják különböző anyagoknak a sejttenyészetek fehérjeszintetizáló termelőképessége befolyásoló hatását.

Különböző sejtrendszerek esetében leírják az intracelluláris c-AMP szint és a t-PA szintézis összefüggését Qásd például: Kooistra és mtsai: Thrombosis and Haemostasis, 54 (1), 192; Abstract 1133. oldal), leírják, hogy a dibutiril-c-AMP humán endotéliális sejtekben a t-PA termelését 2-3-szorosára növeli, de nem befolyá2

HU 205 381 Β solja a t-PA szintézis Bowes-melanoma sejtekben. A vesesejtekben foszfodieszteráz-inhibitorok fokozzák a t-PA szintézist [Journal of Cell Biology 91, 195-200. (1981)]. Másrészről a c-AMP gátolja a t-PA szintézist makrofágokban [Vassalli és mtsai: Cells, 8, 271-281. (1976)] és indiferens a teratokarcinoma-sejtekben [Nishimune és mtsai: Experimental Cell Research 146, 439-444. (1983)].

A vajsav indukálja a t-PA szintézist a teratokarcinoma-sejtekben (Nishimuna, lásd fent), de vese daganatsejtekben gátló hatást fejt ki [Nelson és mtsai: Proc. Am. Áss. fór Cancer Research, 26, 35. (1985)], BroutyBoye és mtsai egy indiferens hatásról számolnak be embrionális tüdősejtek esetében [Biotechnology, 12,

10. (1984)].

Humán endotéliális sejtekben a t-PA szintézist stimulálni lehet trombinnal [Levin és mtsai: Thrombosis and Haemostasis, 56 (2), 115-119. (1986)], alkohollal [Laug: JAMA, 250 (6), 772-776 (1983) B) C-vitaminnal és A-vitaminnal (Inada és mtsai: Biochemical and Biophysical Communications 130 (1), 182-187. (1985)]. Azonban marha endotéliális sejtekben a trombin [Loskutoff: Journal of Clinical Investigations, 64, 329-332. (1979)] és endotoxin [Crutchley és mtsai: Jomal of Biological Chemistry, 261 (1), 155-159. (1986)] gátolja a t-PA szekréciót.

A sertés endo tél t-PA szekrécióját heparin közvetíti [Marchwardt és mtsai: Thrombosis Research, 8, 2Π233, (1976)], de humán embrionális tüdősejtek esetében a heparin hatása minimális.

A t-PA szintézist továbbá pozitív irányban befolyásolja embrionális tüdősejtekben (Brouty-Boye, lásd fent) és epitélsejtekben [Electricwala és mtsai: Thrombosis and Haemostasis, 53, 200-203, (1985)] a konkanavalin-A, az epitélsejtekben (Electricwala, lásd fent) és melanomasejtekben [Silagi és mtsai: Biological Medicine, 57, 418. (1984)] az 5-azacitidin, a melanomasejtekben [Roba és mtsai: Thrombosis and Haemostasis, 50, (1), 83. (1983)] a tizabrin, és a hepatomasejtekben az afidikolin [Orfanoudakis és mtsai: Biological Chemistry, Hoppé Seyler, 336 (9), 832. (1985)].

A 0 219 270 számú európai közrebocsátási iratban leírják, hogy heparin és endotéliális növekedési faktor (endothelial cell growth facktor, ECGF) kombinációja a t-PA termelést, és normál humán diploid tüdőfibroblaszt-sejtekből származó egyláncú urokináz-plazminogén-aktivátor termelését szérummentes közegben növeli.

A vajsavnak a kínai hörcsög ováriumsejtekre kifejtett hatását Storrie és mtsai [Journal of Cell Physiology, 94, 69-76. (1978)] és Wright [Experimental Cell Research, 78, 456-460. (1978)] írták le. Ezeket a vizsgálatokat nem transzformált sejtvonalakkal végezték és az eredményeket a sejtek morfológiájának és növekedési arányának a változásaival ítélték meg.

A találmány tárgya eljárás fehérjéket termelő sejttenyészetek fehérjetermelésének a fokozására, amely esetben a sejttenyészethez egy anyagot adunk, amely ezen fehérjék termelését indukálja, oly módon, hogy fehérjeindukáló anyagként tioglikolsavat, tiodigbkolsavat, L-ciszteint, glutationt, butiril-kolin-bromidot, butiril-kolin-kloridot, nonaktinsavat, furánzsírsavat, aszkorbinsavat vagy D-a-hidroxi-szubsztituált 3-4 szénatomos alifás mono- vagy dikarbonsavat vagy ezek sóit alkalmazzuk.

Fehérjeként különösen a plazminogén-aktivátorok, így a t-PA és ennek mutánsai jönnek szóba. Azonban az eljárás hatása függetlenül a fehérjéktől, és az ezeket a fehérjéket kódoló DNS-től és ezért alkalmazható CHO-sejtekre, amelyek minden idegen fehérje kifejezésére transzformálhatok.

A t-PA mutánsok a t-PA olyan származékai, amelyek egy vagy több olyan aminosavat tartalmaznak, amelyek eltérnek a természetes t-PA megfelelő helyén lévő aminosavjától, vagy amelyekben a természetes t-PA aminosavai közül egy vagy több nincs jelen. Néhány ilyen t-PA mutánst leírtak az irodalomban, elsősorban a 199 574 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben és a 3 708 681 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben.

A találmány szerinti eljárást előnyösen transzformált CHO-sejtekkel hajtjuk végre.

Ezenkívül azt találtuk, hogy 3-5 szénatomos alifás monokarbonsavak és ezek sói transzformált CHO-sejtek tenyészetében a t-PA-nak és mutánsainak a termelését fokozni képesek.

Fehérje termelést fokozó anyagként előnyösen a tioglikolsav, nonaktinsav, vajsav és propionsav alkalmazható.

A fehérje termelését fokozó anyagok a kereskedelemben kaphatók vagy az irodalomból ismertek vagy ismert módon előállíthatók.

A burilil-kolin-bromid és -klorid a kereskedelemben beszerezhető anyagok és például a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA cégnél beszerezhetők.

A nonaktinsav és ennek előállítási módja megtalálható például a következőkben: Helv. Chim. Acta, Vol. XLV, (1962), No. 15-16, 129-138. old.; Tetrahedron, Vol. 36, No. 1, 46-49. old. és J. Org. Chem., (1980), 45,4259-4260 oldalak.

Különböző közlemények leírják a furánzsírsavakat, például: Lipids, (1977), 12 (10), 828-836; J. Chem. Soc. Chem. Commun., (1976), (16), 630-631.; Lipids, (1975), 10 (11), 695-702 és Fette, Seifen, Anstrichmittel, 8, (1986), 290-292.

Az ilyen típusú használható savak előállíthatók az [A] és [B] sémák szerint; ahol m-2-5, előnyösen 4, n=7-12, előnyösen 8 vagy 10, és -TOA (a) képletű csoport.

A 2 és ő vegyületek előállítását Voss és mtsai írják le [Helv. Chim. Acta, 66, 2294 (1983)]. Előnyösen m=4 és n=8 vagy 10.

A transz-anhidro-mevalonsav előállítását H. Dieckmann írja le a „Die Isolierung und Darstellung von trans-5-Hydroxy-3-methyl-pentan-2-sáure” („A transz5-hidroxi-3-metil-pentán-2-sav izolálása és előállítása”) című munkában [Archív für Mikrobiologie, 62, 322-327 (1986)]. An anhldro-mevalonsav-laktont és cisz-anhidro-mevalonsav-laktont és ezek előállítását

HU 205381 Β

Keder és mtsai írják le a „Die Bildung von 2-Anhydro-mevalonsaurelacten durch verschiedene Pilze” („A

2-anhidro-mevalonsav-lakton képződése különböző gombákban”) című munkában [Biochem. Zeitschrift, 341,378-386 (1965)].

A 6-hidroxi-4,6-dimetil-3-heptén-2-on ismert eljárásokkal előállítható. Ezt a vegyületet, mint természetes anyagot is leírják, izolálható a Capsicum annuum var. angulosum-ből, amint azt leírták a C.A., 97, 159 552fben és Eiyo a Shokuryo (1982), 35 (2), 95-101. közleményben. Ezt a vegyületet ugyancsak leírja a „Neue Sekundárstoffe aus Streptoraycesten: Isolierung und Strukturaufklárung dér Colabomycine, Pyrrolame und des Pyridazomycins” (A Streptomycesek új szekunder termékei: A kolabomicin, pirrolam, és a piridazomicinek izolálása és szerkezetének megállapítása”) című disszertációban Grote, R. (Universitát Göttingen, 1987), valamint leírja a Streptomyces olivaceus tenyésztését és az abból való izolálását (Tü 3082 számú törzs, amelyet a Budapesti Egyezmény szerint 1987. november 23-án letétbe helyeztek 4309 számon a „Deutschen Sammlung für Mikroorganismen”-nél („Mikroorganizmusok Német Gyűjteménye”). A vegyület NMR-spektruma a kővetkező:

C₉H₁₆O₂ (156,23)

EI-MS: m/e-138 (M⁺-H20, nagy felbontóképesség, Ο,ΗηΟ, 6%); 123 (M⁺-CH5O, 8%), 98 (nagy felbontóképesség, CsHioO, 48%); 83 (100%)

H-NMR (200 MHz, CDCI₃): δ-1,27 (s, 7- H₃ és 8H₃); 1,43 (s, széles, HO, MeOD-re kicserélt); 2,21 (s, 1-H₃); 2,35 (d, J-1,3 Hz, 9H₃); 2,32 (s, széles, 5-H₂); 6,13 (s, széles,

3-H) ppm ¹³C-NMR (50,3 MHz, CDC1₃): δ-22,0 (o, C- 9); 30,0 (0,2C, C-7 és C-8); 3,20 (0, C-1); 54,4 (u, C-5); 71,1 (u, C-6); 127,2 (0, C-3) 155,1 (u, C-4); 198,6 (u, C-2) ppm

A fenti savak sóiként különösen az alkálifémek, előnyösen a nátrium- és káliumsők jönnek számításba.

A találmány szerinti eljárás kivitelezhető szérumtartalmú vagy előnyösen szérummentes közegben.

Abban az esetben, ha az eljárást szérumtartalmú közegben hajtjuk végre, előnyös például a tioglikolsav, nonaktinsav vagy furánzsírsav vagy ezek sóinak az alkalmazása.

Abban az esetben, ha az eljárást szérummentes közegben hajtjuk végre, előnyös egy C₃-Cs alifás monokarbonsav, különösen vajsav vagy propionsav vagy ezek sóinak az alkalmazása.

Azt tapasztaltuk, hogy a fehérjetermelést fokozó vegyület a hatását 10pmól-tól 500 mmól-ig, például 1 mmől-től 10 mmól-ig teqedő koncentrációk között fejti ki. A 3-5 szénatomos alifás monokarbonsavak, tioglikolsav, L-cisztein és glutation vagy ezek sói 1 mmől-től 10 mmól-ig hatásosak.

A fehérjetermelést fokozó anyagokat a tenyésztés megfelelő napján adhatjuk a tenyészethez, például a 0. napon, azaz a tenyésztés kezdetén egészen a harmadik nap végéig.

A fehérjetermelést fokozó anyagot több alkalommal is adagolhatjuk. Lehetséges a sejteket egy anyag jelenlétében tenyészteni, majd a sejteket a tenyészetből elkülöníteni és újból egy új tenyésztési közegbe tenni és tovább tenyészteni egy fehérjetermelést fokozó anyag jelenlétében. Hyen többszöri alkalmazás esetében különösen a 3-5 szénatomos alifás monokarbonsavak vagy ezek sói, előnyösen a vajsav és tioglikolsav és ezek sói mutatnak fokozó hatást.

A többszöri, alkalmazás esetében nem szükséges, hogy minden alkalommal ugyanazt az anyagot adagoljuk, hanem az egyik alkalommal az anyagok egyikét, a további adagoláskor egy másik anyagot alkalmazhatunk. Ez többszöri alkalmazás ugyancsak egy fokozó hatást fejt ki, különösen az afídikolin egyszeri alkalmazása és egy másik anyag, például a vajsav, propionsav, butiril-kolin-klorid vagy butiril-kolin-bromid vagy ezek sóinak a további alkalmazása esetében.

Két vagy több anyag kombinációját is lehet alkalmazni. Előnyös, ha csak egy olyan anyagot alkalmazunk, amely a sejtnövekedést gátolja. Alkalmazható például egy 3-5 szénatomos alifás monokarbonsav, vagy ezek sói, előnyösen vajsav és tioglikolsav vagy ezek sói, amelyek esetében ezeket a sejttenyészethez előnyösen második anyagként adjuk.

Transzformált kínai hörcsög ováriumsejtek olyan CHO-sejteket jelentenek, amelyeket a kívánt fehérjét kódoló vektorral transzformáltak, és amelyek a tenyésztés során a fehérjét szintetizálni és kifejezni képesek.

Transzformált kínai hörcsög ováriumsejtként például a 0 093 619 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés és a 3 708 681 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben leírt sejtek alkalmazhatók. Ezeknek a transzformált CHO-sejteknek a tenyésztésével t-PA (0 093 619 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés) és bizonyos t-PA mutánsok (0 199 574 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés és 3 708 681 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentés) állíthatókelő. A CHO-sejtek vektorokkal való transzformálása, amikor is a sejtek más fehérjéket fejeznek ki, az irodalomból ismert módon történik, mint például a fent említett európai és német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentések szerint.

Gazdasejtként CHO-K1 jelű sejteket lehet alkalmazni, amelyet 1957-nen Puck biopsziás anyagból izolált és 1970-ben az American Type Culture Collection (ATCC)-nél CCL-61 jelzéssel letétbe helyeztek. Ezt a sejtvonalat 1987. december 23-án az ATCC-nél a Budapesti Egyezmény szerint CRL 9618 számon ismét letétbe helyezték.

A kívánt fehérjét kódoló DNS-szekvenciát az irodalomból már ismert módon lehet előállítani, például a fent említett különböző szabadalmi bejelentések szerint. A vektorokat, amelyek ezt a szekvenciát és a kontrollszekvenciákat is tartalmazza, ismert eljárások szerint lehet megszerkeszteni, például E.coli K 12294 (ATCC 31446) és E.coli X 1776 (ATCC 31537) alkal4

HU 205 381 Β mazásával, amelyeket a Budapesti Egyezmény szerint 1987. december 23-án az ATCC-nél 53704 és 53705 számokon ismételten letétbe helyeztek, így például a pETPER és pETPFR plazmidokkal, amelyeket a 093 619 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben írtak le. A CHO-sejteket a 093 619 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés, a 3 708 681 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentés, a 0 117 059 és a 199 574 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentések, vagy más, az irodalomból ismert eljárás szerint lehet transzformálni.

A t-PA termelés céljából a vektort a CHO-K1-DUX Bll szubklónban lehet integrálni [Urlaub és mtsai: Proceedings of the National Academy of Science, USA, 77, 4216-4220. (1980)]. Ez a sejtvonal egy dihidrofolát-reduktáz negatív mutáns (DHFR'), így alkalmas a transzficiált sejtklónok DHFR-függő szelekciójára. A humán cDNS számára szolgáló vektort lehet az ismert pBR-322 plazmidvektor vagy ennek egy Escherichia coliból való származéka. A kérdéses gén és a DHFR-gén promotorrégiója egy hepatitis B felületi antigénből származik. A példákban olyan CHO-K1-DUX Bll sejteket alkalmazunk, amelyeket pETPER vagy pETPFR plazmidokkal transzformáltunk (lásd a 0 117 059 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentést), melynek deponálási száma: ATCC CRL 9618.

Szérummentes közegként számos ismert termék áll rendelkezésre (lásd pl. a BMFT-Statusseminar 12, 1985. november 13., Bundesministerium für Forschung und Technologie, 5300 Bonn 2, 111-120. oldalak). A következő példában egy kezelt DMEM/Ham’s F 12 tápközeget (1:1) (Gibco) alkalmaztunk szérummentes közegként. Adalékként fetális borjúszérumot (fötales Kálberserum, továbbiakban FKS) alkalmaztunk 7,5%-os vagy 1-2%-os koncentrációban.

A sejttenyészeteket 37 ’C-on egy Heraeus szekrényben inkubáltunk és 7,5% szén-dioxid és 100% nedvességtartalmú szén-dioxid-levegő eleggyel szellőztettük. Az eljárásoknak megfelelően különböző tenyésztési edényeket használtunk: 100-1000 ml közötti térfogatú közeg esetében hengeres tenyésztési edényt, 70-100 ml közeg esetében 175 cm²-es Roux palackokat (Nunc), 30-50 ml térfogat esetében 75 cm²-es tálakat, 7-10 ml térfogatú tápközeg esetében 25 cm²-es tálakat és 1 ml térfogat esetében pedig többrészes Costar-féle tenyésztési tálakat. A törzs fenntartása céljából a sejteket 0,2-0,340⁶ sejt/ml sűrűségben tartottuk és minden 2-3. napon szubklónoztuk.

A fehérjeteimelést stimuláló anyagokat különböző időpontokban mindig 1:100 arányú hígításban adagoltuk, ami azt jelenti, hogy azokat először a tápközegben oldottuk, vagy ha nehezen oldódtak, először etil-alkoholban oldottuk fel és azután adtuk a tápközeghez, majd ezt az anyagot tartalmazó tápközeget adtuk a sejteket tartalmazó tápközeghez 1:100 tf/tf arányban.

A következő példákban a t-PA szintézis stimulálása céljából a sejteket egy exponenciálisan növekedő tenyészetből vettük ki és műanyag csövecskékben (Falcon) 10 percig lOOOxg fordulattal Beckmann T 3-6 centrifugában centrifugáltuk. A felülúszó dektantálása után a sejtüledéket friss tápközeggel ismételten felszuszpendáltuk.

A t-PA szérumtartalmú közegben való termelése esetében F12/DMEM+7,5% FKS+gentamicintartalmú friss tápközeget alkalmaztunk. A kapott szuszpenziót 2 cm²-es 24 tartályos lemezekre helyeztük 0,2— 0,340⁶ sejt/ml sűrűségben.

A t-PA szérummentes közegben való termelése esetében a sejteket előbb 3-4 napig 1-2% FKS-tartalmú közegben adaptáltuk, ismét lecentrifugáltuk és a sejtüledéket szérummentes közegben felszuszpendáltuk és végül átvittük 2 cm²-es 24 tartályos lemezekre 0,40,540⁶ sejt/ml sűrűségben.

A t-PA mennyiségi meghatározása

A sejtek felülúszóiból és a sejtkivonatokból különböző időpontokban alikvot mennyiségeket kiveszünk, ill. készítünk. A minták mérése vagy azonnal történik, vagy -20 ’C-on tartjuk azokat a meghatározásig.

Meghatározási módszerek

1. Közvetlen kromogén vizsgálat (Direkter

Chromogener Assay, továbbiakban DCA)

A Kabi Diagnostica cég S-2288 jelű szintetikus peptidszubsztrátumából (H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitro-anilid) a t-PA p-nitro-anlilin reakcióterméket képez. A t-PA aktivitás arányos a keletkező p-nitro-anilin mennyiségével, amelyet 405 nm hullámhosszon 37 ’C-on mérünk.

Az enzimkinetika spektrofotometriás meghatározását egy ACP-5010 analizátorberendezéssel (Eppendorf cég) automatikusan végezhetjük el.

Az enzim aktivitását standard segítségével számoljuk ki. Egy t-PA standard sort állítunk elő laboratóriumi standarddal 1-15 gg/ml koncentrációk között, a standard anyag 72%-a egyláncú anyagból áll.

A szubsztrátoldatot (100 mmól Trisz/106 mmól NaCl) 50 mmólos koncentrációban adjuk az elegyhez.

2. ELISA

A sejtfelülúszókból és sejtkivonatokból vett t-PA mintákat ELISA (Enzyme - linked - immuno - sorbent - assay, továbbiakban ELISA) segítségével mennyiségileg meghatároztuk. Standardként egy 0,038-5 gg/ml koncentrációjú laboratóriumi standard sor szolgál-A mintákat 1:10-től 1:1000 arányban hígítjuk.

A transzformált CHO-sejtek jellemzése

Sejtnövekedés

A CHO-sejteket 0,2-0,340⁶ sejt/ml sűrűségben tenyésztési edényekbe oltjuk (7,5% FKS-tartalmú tápközegben), a sejtek kezdetben igen lassan szaporodnak. Csak egy 24 órás lag-fázis után kezdődik meg a logaritmikus sejtnövekedés. Egy 1,310,0440⁶ sejt/ml sejtsűrűség esetében a 4. napon jelennek meg az első nem élő sejtek a tenyészetben, ezek aránya az összes sejtszámnak 13,211,3%-a. Az 5. napon a maximális sejtsűrűség 1,810,0540⁶ sejt/ml-t ér el (1. ábra).

Az élő sejtek száma 7 nap után még 7213%-a az összes sejtszámnak.

HU 205 381 Β

Az exponenciális sejtnövekedést lezáró stacioner fázist különböző’ faktorok indítják be. Nagy populációsűrűség és az esszenciális tápanyagok felhasználása következtében a sejtek nem szaporodnak. A stacioner fázis időtartama nagymértékben változó és függ a tápközeg komponenseitől, így a szérumtól. Savak és toxikus anyagcseretermékek felhalmozódása, valamint a közeg egyes faktorainak a megváltozása (savanyúbb pH, alacsonyabb oxigén, parciális nyomás, hiányos átlevegőzés) okozza a sejtek elhalását

A t-PA termelés a CKO-sejtekben

A sejtnövekedés és a t-PA szintézis között lineáris összefüggés van.

A t-PA termelés időbeli lefutásának két fázisa van. Az első fázisban a t-PA koncentráció folyamatosan emelkedik. A második fázisban az enzimszintézis gyakorlatilag leáll és a közegben a t-PA koncentráció közelítőleg állandó marad (2A. ábra). Az ELISA-vizsgálat szerint a maximális t-PA koncentráció a 4. napon 11,1+0,7 gg/ml. A kromogén vizsgálati módszerrel mért t-PA koncentrációk valamivel magasabbak, amelyet feltehetőén a két láncból álló t-PA okoz, azonban a 4. napig mindkét kimutatási módszerrel párhuzamosan fut a termelési görbe.

Az intracelluláris t-PA koncentráció szintén párhuzamos a sejtnövekedéssel és az összes szintetizált t-PA mennyiséghez képest viszonylag csekély. A 4. napon 7%-a az összes aktivitásnak. (2B. ábra).

Amint azt a 3A. ábra mutatja, a sejtszámra vonatkoztatott t-PA szintézis a 4. napig enyhén emelkedik; ELISA-módszerrel 8,1+1,2 pg t-PA/l«10® sejtmaximum volt kimutatható. A sejthez kötött t-PA-t csak az ELISA-módszerrel határoztuk meg, minthogy ez a csekély (<1 pg) t-PA koncentráció DCA-val nem határozható meg.

A sejtszámra vonatkoztatott intracelluláris t-PA tartalom a sejtszaporodás log-fázisa alatt valamivel magasabb volt, és 500 és 900 ng t-PA/l«10® sejt között volt, a 4. naptól kezdve a t-PA érték kb. 450 ng/l»10® sejt körül volt (3B. ábra).

A tápközegben levő szérum és szérumfaktorok hatása a sejt növekedésére és a t-PA termelésére a CHO-sejtekben

A sejteket 0,25*10® sejt/ml sűrűségben különböző szérumkoncentrációjú közegbe helyeztük.

5% alatti szérumkoncentráciőjú tápközeg a sejtosztódást negatívan befolyásolja, a produktivitást azonban csak csekély mértékben befolyásolja.

A tápközeg szérumkoncentrációjának a sejtnövekedésre és a t-PA termelésre a sejtek 48 órás inkubálása után kifejtett hatását az 1. táblázat mutatja be. Az értékeket a maximális érték %-ában adjuk meg (75% FKS-közegben). A sejtszám maximális értéke 0,56±0,03· 10® sejt és a t-PA koncentráció 5,7+0,5 pg/ml. A t-PA meghatározását DCA-val végeztük (középértékistandard hiba, továbbiakban s.h., n=4).

1. táblázat

%	FKS Sejtszám	t-PA
40	61,512,8	59,2+3,9
20	79,4+3,8	81,212,4
10	88,6+5,3	90,3+6,7
7,5	100,0+6,4	100,017,9
5	72,4+4,9	87,0+11,3
1	43,1+1,5	79,2+6,7
0	37,511,8	75,4+4,6

Sejttenyészet szérummentes tápközegben

A sejteket a sejtmentes tápközegbe 0,4-0,5·10® sejl/ml sejtsúrűségben adtuk. A sejtek a 4. napig osztódtak és a legmagasabb élő sejtszámot szintén a 4. napon érte el 1,0±0,2·10® sejt/ml-rel (4. ábra).

t-PA termelés szérummentes tápközegben

A t-PA koncentráció a felülúszóban a 7. napig állandóan növekszik és ELISA-módszerrel mérve 13,6±0,54 pg/ml maximumot ér el. A DCA-módszerrel kapott t-PA értékek az 1-3. napon ez alatt maradnak és a 4. naptól az ELISA-módszerrel mért értékek felett vannak (5. ábra).

Az egy sejtre vonatkoztatott t-PA szintézis a szérummentes tápközegben körülbelül hasonlóan magas, mint a szérumtartalmú tápközegben és 7,2±2,8 pg/l«I0® sejt körül van (6. ábra).

A szérummentes tápközegben a t-PA százalékos aránya a felülúszóban az összfehérjére vonatkoztatva 10,9+1,0 és 12,5+1,4% között van. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. A t-PA értékeket ELISAmódszemel határoztuk meg (kőzépérték+s.h., n-4).

2. táblázat

Nap	Fehérje pg/l«10® sejt	t-PA pg/l»10® sejt
1	71,0+8,0	7,213,6
3	81,819,4	9,012,3
5	82,0112,2	9,310,8

Alifás monokarbonsavak hatása

A 7,5% FKS-t tartalmazó tápközegben tenyésztett CHO-sejtek t-PA termelésének különböző alifás monokarbonsavakkal való fokozását a 3. táblázatban mutatjuk be. Minden savat 10 mmól-tól 500 mmól-ig terjedő koncentrációtartományban alkalmaztunk. Az összes monokarbonsav optimális adagjának a tartománya 1től 10 mmól-ig terjed. A savak hatékonysága a lánc hosszúságától függ.

Minden hatásos monokarbonsav gátolja a sejtnövekedést. A propionsav, vajsav, izovajsav és izovaleriánsav magasabb koncentrációban hatásosak, minthogy az alapanyagcsere gátlása, amely a sejtnövekedés gátlásához vezet, koncentrációfuggő, a t-PA szintézis fokozódásával szuperponálódik.

HU 205 381 Β

A 3. táblázatban levő értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és'a kontroll (0%) százalékában vannak megadva. A t-PA meghatározását DCA-módszerrel végeztük (középérték±s.h., n=3-24). A maximális érték egy mintára vonatkozik. Az egyes minták adatait zárójelben adjuk meg.

3. táblázat

Mono- Az adag optimális t-PA szintézis %-os karbonsav tartománya fokozása maximum átlag

Hangyasav 100 gmól 7,4 6,5±0,9

Propionsav 5-10 mmól (10 mmól) 45,5 28,0+2,5

Vajsav 1-5 mmól ( 1 mmól) 68,3 41,9+3,8

Izovajsav 0,6-10 mmól (10 mmól) 32,9 16,6+2,8

Izovaleriánsav 1-20 mmól ( 5 mmól) 39,3 18,7+2,4

Az átlagértékek 3-4 napon keresztül végzett termelési folyamatra vonatkoznak, amikor is a monokarbonsavakat a tenyésztés 0-3. napjáig adagoltuk, amint azt az alábbi 3A. táblázatban megadjuk. Az egyes minták adatait zárójelben adjuk meg.

3A. táblázat

Mono- karbonsav	Adagolás napja	Mintavétel napja	n
Hangyasav	10(0)	2-3 (2)	4
Propionsav	0-3(2)	1-4(3)	24
Vajsav	1(3)	2-4(3)	18
Izovajsav	0-2(3)	2-4(3)	11
Izovaleriánsav 0-2(4)	1-4(4)	19

n=a termelési kísérletek száma

A 7. ábrában a 7,5% FKS-tartalmú tápközegben 3-5 szénatomos monokarbonsavakkal előidézett t-PA termelés fokozódás időbeli lefutását ábrázoljuk. 24 óra után már kimutatható a t-PA termelés emelkedése: 18,1+5,7%-tól (C₄) 24,8±0,5%-ig (C₅). Az izovajsav esetében a termelés fokozódása csak 48 óra után jelentkezik. A t-PA termelés maximális emelkedése a 3 és 4 szénatomos karbonsavak esetében a 3. napon következik be: 37,2+5,1% a nátrium-butirát esetében. A vajsav és az izovajsav esetében a termelés fokozódása csak rövid időtartamú, a 4. napon már nem mutatható ki a hatás. A propionsav és az izovaleriánsav fokozó hatása azonban még a 4. napon is kimutatható és a t-PA termelést C3 esetében 31,8%-kal, C₅ esetében 8,5%-kal fokozza.

A hatások ezenkívül még függnek a sejtek fiziológiai állapotától is. Az exponenciális növekedés alatt a legérzékenyebbek a sejtek a stimulálásra.

A 4. táblázatban a 7,5% FKS-tartalmú tápközegben tenyésztett CHO-sejteknek 3-5 szénatomos monokarbonsavak által előidézett t-PA termelés fokozódásának a karbonsavak alkalmazási napjától függését adjuk meg 48 órás, 7,5% FKS-tartalmú tápközegben való tenyésztés után. A vajsav és izovajsav koncentrációja 1 mml volt, a propionsav és izovaleriánsav koncentrációja pedig 5 mmól volt.

Az értékek 1 ml felülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%)-ában fejezzük ki (középérték+s.h., n=3-5). A t-PA meghatározását DCA-módszerrel végeztük.

4.táblázat

Alkalmazás C3 napja	C4	C4-I	C5
0	28,7+9,3	33,0+5,4	20,1+10,7	17,2+1,0
1	24,4+4,1	40,2+12,2	25,3+5,1	19,4+1,5

Vajsav hatása a CHO-sejtek t-PA termelésére

A stimuláló hatás ugyanúgy vonatkozik az intracelluláris t-PA koncentrációra, mint az extracelluláris t-PA koncentrációra.

Amint a 8. ábrából látható, az intracelluláris t-PA tartalom növekedése a.butiráttal kezelt tenyészetekben 24 órás inkubálás után a kontrollal szemben a legnagyobb (43,8+9,8%). A felülúszóban a százalékos emelkedés 24 óra után a kontrolihoz képest valamivel, átlagban 19,2%-kal csökken (DCA- és ELISA-meghatározások). Ez a hatás a felülúszóban 72 órán át tart.

A 9A-C. ábrákban a sejtszámra vonatkoztatott tPA szintézist ábrázoljuk és ez azt mutatja, hogy a t-PA szintézis stimulálása nátrium-butiráttal a sejtnövekedés gátlása ellenére 7 napon át tart. Az első 4 nap alatt az enzimszintézis állandóan fokozódik. A t-PA koncentráció 7,5+1,1 μg-tól 28,9+5,3 μg t-PA/1‘10⁶sejtértékig (ELISA) emelkedik a felülúszóban (8A. ábra). DCA-módszerrel 47,4+7,4 μg t-PA/l«10⁶ sejt maximális t-PA tartalmat mutattunk ki (9B. ábra). Egyidejűleg az intracelluláris t-PA tartalom csökken és 1,5+0,2 μg t-PA/l*10⁶ sejtértékre esik vissza az 5. naptól kezdve (9C. ábra).

Az 5. táblázatban a 7,5% FKS-tartalmú tápközegben nátrium-butirát hatására végbemenő t-PA szintézis stimulálását adjuk meg, amelyet a sejtszámra vonatkoztatunk. A nátrium-butirátot a 0. napon adjuk 1 mmól koncentrációban. Az 1-4. napokon mért értékeket a kontroll (0%) százalékában adjuk meg és azok 140⁶sejtre vonatkoznak. A felülúszó és a sejtkivonat t-PA tartalmát ELISA-módszenel határoztuk meg (középérték+s.h., n»5-10).

5.táblázat

Nap	Intracelluláris	Extracelluláris
1	90,9+9,5	68,5+12,4
2	99,7+26,3	118,8+16,1
3	93,9+31,4	223,4+77,4
4	209,8+41,4	280,7+85,9

HU 205381 Β

Abban az esetben értünk el egy optimális termelésemelkedést, ha a nátrium-butírátot a növekedés exponenciális szakaszába adagoltuk a sejtekhez. A nátriumbutirát maximális hatása a 0-2 napos alkalmazási időszak esetében mindig a 3. napon lép fel (10. ábra).

A tápközegcsere után minden 2-3. napon adagolva a nátrium-butírátot ugyanabban a sejtpopulációban a t-PA termelést hosszabb ideig lehet magas szinten tartani.

A 6. táblázatban bemutatjuk a 7,5% FKS-tartalmú tápközegben tenyésztett CHO-sejtek t-PA termelésének a fokozását. Minden tápközegcsere alkalmával, illetve csak a 0. napon 1 mmól nátrium-butírátot adtunk a tápközeghez. A tápközegcsere utáni 2., 4., 7., ill. 9. napon mért értékeket a kontroll (0%) százalékában tüntetjük fel és 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak. A t-PA meghatározását DCA-módszerrel végeztük (középérték+s.h., n=3).

6. táblázat

Tápközegcsere napja	Adagolás napja 0,2,4,7
2	33,0+5,4
4	107,4±7,6
7	96,6+5,8
9	62,0±4,8

A vajsav hatása a CHO-sejtek t-PA termelésére szérummentes tápközegben

Ellentétben a vajsavval történő t-PA termelésstimulálás rövid időtartamával szérumtartalmú tápközegben, a hatás szérummentes tápközegben hosszabb ideig tart és a nátrium-butirát adása után 1 nappal a kontrollal szemben 44,1+7,1%-otér el. A maximális fokozó hatás az adagolás utáni 3. napon érhető el, amely 143,3±12,8% emelkedést jelent. A fokozó hatás még a nátrium-butirát adása után 6. napon is 49,9±7,0% (11. és 12. ábrák).

Az 1· IO⁶ sejtre vonatkoztatott t-PA szintézis szérummentes tápközegben szintén magasabb, mint a szérumtartalmú közegben és 50 pg/ΙΊΟ⁶ sejtérték fölé emelkedik (13. ábra).

Propionsav hatásai

A C3-karbonsavak igen hasonló hatást fejtenek ki a t-PA szintézisre, mint a vajsav. Azonban a százalékos fokozódás kb. 14%-kaI alacsonyabb és a t-PA szintézis stimulálásához magasabb koncentrációk (5-10 mmól) szükségesek Továbbá, a propionsav kisebb mértékben gátolja a sejtnövekedést, és így egy tartősabb t-PA szintézísfokoződást eredményez.

A t-PA szintézis propionsavval történő stimulálása ellentétben a vajsavval azt mutatja, hogy ez a stimulálás igen nagy mértékben specifikus, minthogy a szérummentes tápközegben az extracelluláris fehérjetartalom a kontrollal szemben csak kis mértékben emelkedik és a (³H) -leucin beépülése szintén csak kis mértékben növekedik.

Dikarbonsavak, hidroxi-karbonsavak és ketokarbonsavak hatásai a CHO-sejtek t-PA termelésére

A hidroxi-karbonsavak, mint a tejsav, glicerinsav, almasav és borkősav csak gyenge stimuláló hatást fejtenek ki a t-PA szintézisre, amely 6 és 10% között van, miközben a borkősav 10 mmólos koncentrációban a legnagyobb mértékben stimulálja a t-PA szintézist (10,3+2,9% a kontrollal szemben).

A hidroxi-karbonsavak nem befolyásolják a sejtosztódást és a t-PA szintézisre gyakorolt hatásuk még 96 óra után is kimutatható.

Aszkorbinsav hatásai

Az aszkorbinsav 10 mmól mennyiségének a hatása a t-PA termelésre 72 órán át tart és a 0. napon adva 15,2+3,1% t-PA szintézisfokoződás mutatható ki 24 óra után (14. ábra).

Hosszúláncú zsírsávakhatása a CHO-sejtek t-PA termelésére

Azt tapasztaltuk, hogy a hosszúláncú zsírsavak, mint a nonaktinsav, amely 10 C-atomot tartalmaz és a furánzsírsavak szintén képesek fokozódást eredményezni (7. táblázat). Ebben a példában (4) képlet szerinti fiiránzsírsavat alkalmaztunk, amelyben m=4 és n-8.

Szérummentes tápközegben azonban nem volt kimutatható t-PA szintézisfokozódás a fehérjeszintézisre vonatkoztatva.

A CHO-sejtek t-PA termelésének a hosszúláncú zsírsavakkal való fokozását a 7. táblázatban mutatjuk be. A sejteket 7,5% FKS-tartalmú tápközegben tenyésztettük. A savakat 10 pírtól és 10 mmól koncentrációhatárok között vizsgáltuk, a legelőnyösebb az 1 mmől koncentráció volt Azértékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és akontroll (0%) százalékában adjukmeg (középérték±s.h., n-4-9). A maximális érték egy mintára vonatkozik A t-PA meghatározást DCA-módszerrel végeztük.

7. táblázat

Zsírsavak	t-PA szintézis százalékos emelkedése
maximum	átlag
Nonaktinsav	58,3	30,3±6,5
Furánzsírsav	32,1	19,0+3,2

Az átlagértékek több 4 napos termelési folyamatra vonatkoznak, amikor a savakat a 0. napon adtuk, amint azt a 7A. táblázatban megadjuk, Az egyes minták adatait zárójelben adjuk meg.

7A. táblázat

Zsírsavak	Adás napja	Mintavétel napja	n
Nonaktinsav	0(0)	1-4(2)	4
Furánzsírsav	0(0)	1-4(2)	9

HU 205 381 Β

Tiolok és szulfidok hatásai a CHO-sejtek t-PA termelésére

Négy kéntartalmú vegyület, amelyek karbonsavak szubsztitúciós származékai, a t-PA termelés 16-31,2%os fokozódását idézi elő anélkül, hogy azok a sejt növekedését negatív módon befolyásolnák (8. táblázat), A szubsztituált karbonsavak optimális hatásukat azonos koncentrációtartományban (1-10 mmól) fejtik ki, mint a többi hatásos karbonsav. Csak a glutation volt 1-10 mmól-nál alacsonyabb koncentrációtartományban is hatásos. A tioglikolsav a legelőnyösebb stimulátora a CHO-sejtekben a t-PA szintézisnek.

Ebben a példában a sejteket 7,5% FKS-tartalmú tápközegben tenyésztettük. Minden anyagot 1 μπιόΐ és 10 mmól koncentrációk között vizsgáltunk. A 8. táblázatban lévő értékek 1 ml felülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%) százalékában adjuk meg (középérték±s.h., n=6-19).

A maximális érték egy mintára vonatkozik. A t-PA meghatározását DCA-módszerrel végeztük. Az anyagok koncentrációját zárójelben közöljük.

8. táblázat

Tiolok és Optimális dózis t-PA szintézis %-os szulfidok tartomány fokozása maximum átlag

Tioglikolsav lmmól 66,4 31,2±3,2

Tiodiglikolsav lmmól 31,0 18,0±3,8

L-cisztein 1-10 mmól (1 mmól) 41,4 20,9±3,4

Glutation 1-10 pmól (10 pmól) 30,6 16,0±2,0)

Az átlagértékek több 3 napos kísérletre vonatkoznak, amikor az anyagot a 0-2. napokon adtuk, amint azt a 8A. táblázatban megadjuk. Az egyes minták adatait zárójelben közöljük.

8A. táblázat

Zsírsavak Adagolás napja Mintavétel napja n

Tioglikolsav	0-2(1)	1-3 (2)	19
Tiodiglikolsav	KD	2-3 (3)	9
L-cisztein	O-l (0)	1-3 (2)	11
Glutation	0(0)	2-3 (2)	6

A tiokarbonsavaknak a monokarbonsavakkal szembeni előnye, hogy nem fejtenek ki gátló hatást a sejtproliferációra, azonban a t-PA termelését ezekkel az anyagokkal nem lehet magasabbra emelni, mint a vajsavval. Afokozó hatás éppen olyan rövid ideig tartó és a tioglikolsav esetében 24 óra után, a cisztein esetében 48 óra után éri el a maximális értéket. A sejtek 4 napos inkubálása után a hatás a t-PA termelésre csak csekély (15. ábra).

Szérummentes közegben a t-PA szintézisre gyakorolt hatás kisebb, mint a szérumtartalmú közegben, minthogy minden anyag 10-20%-ban gátolja a sejtosztódást.

Tioglikolsav hatása

A tioglikolsav-kezelés után 72 órával megemelkedik a t-PA termelés és független az alkalmazás napjától. Az enzimszintézis százalékos fokozódása mindig 24 óra után a legmagasabb és ezután folyamatosan csökken.

A 9. táblázatban bemutatjuk a CHO-sejtek t-PA termelésének a fokozódását, 24-96 órán át 7,5% FKS és 1 mmól tioglikolsav-tartalmú tápközegben való tenyésztés során, a fokozódás és az adagolás napja közötti összefüggésben. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%) százalékában adjuk meg (középérték+s.h., n=4-6). A t-PA meghatározását DCA-módszerrel végeztük.

9.táblázat

Idő (óra)	0	adagolás napja 1	2
24	27,6±5,6	34,7+10,9	34,5±7,5
48	16,9+2,3	17,1+3,6	16,3±8,6
72	14,7+1,0	10,2+2,7	9,4±1,7
96	3,4±3,0	2,7+0,8	0,5±l,0

A t-PA termelés emelhető a tioglikolsavat nem egyszer, hanem kétszer adagolva (16. ábra).

A17A. ábrában (DCA) és a 17B. ábrában (ELISA) a t-PA szintézis lefolyását adjuk meg l»10⁶ sejtre vonatkoztatva. A t-PA szintézist 1 mmól tioglikolsav az első 3 napon emeli (DCA) a kontrollal szemben. Az ELISA-módszenel kapott t-PA értékek az egész időtartam alatt magasabbak. A fokozódás mértéke a 4. napon még kb. 35%. A sejtenkénti intracelluláris t-PA tartalmat a tioglikolsav szintén emeli. A maximális intracelluláris t-PA koncentráció 1,1+0,1 pg/140⁶ sejt 24 óra után és 96 órán belül körülbelül az eredeti koncentráció felére csökken (17C. ábra).

Az extracelluláris t-PA koncentráció az 5. napon 10,7%-ra emelkedik a kontrollal szemben. A t-PA szintézis százalékos fokozódása tioglikolsav hatására szérummentes közegben valamivel kisebb, minthogy a sejtosztódás könnyebben gátolható (10-20%).

Monokarbonsav-származékok hatása a CHO-sejtek t-PA termelésére

A 4 szénatomos karbonsavszármazékok között további anyagokat találtunk, amelyek befolyásolják a CHO-sejtek t-PA termelését. Ezen anyagok közé tartozik első sorban a butiril-kolin-bromid (BCB) és -klorid (BCC), amelyek a t-PA termelést 30-40%-kal fokozzák. Ezek a 4 szénatomos származékok minden tekintetben azonos hatásúak, mint a nátrium-butirát és azonos koncentrációtartományban hatásosak,

A 10. táblázatban bemutatjuk a CHO-sejtek t-PA termelésének az emelkedését a fent említett két monokarbonsav-származék hatására. A sejteket 7,5% FKS-tartalmú közegben tenyésztettük. Minden anyagot 10 pírtól és 10 mmól koncentrációk között vizsgáltunk. Az értékeket a kontrollal (0%) szembeni százalékban adjuk meg és

HU 205381 Β azok 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak (középérték±s.h., n=4-15). Az egyes mintákra vonatkozó értékeketzárójelben adjuk meg. A maximális érték egy mintára vonatkozik. A t-PA meghatározást DCA-mődszenel végeztük.

10. táblázat

Mono- Optimális t-PA szintézis %-os emelkedése
karbonsav- dőzis- -származék tartomány maximum	átlag	n
BOC 5-10 mmól (10 mmól) 63,9	38,8+4,4	15
BOB 5-10 mmól (2,5 mmől) 49,6	29,1+4,4	9

Az átlagértékek több 4 napos kísérletre vonatkoznak, amint azt a 10A. táblázatban megadjuk. Az egyes minták adatait zárójelben adjuk meg.

10A. táblázat

Anyag	Adás napja	Mintavétel napja	n
BCC	Ki)	2-4(4)	15
BCB	Ki)	2-4(4)	9

Különböző t-PA szintézis-stimulátorok kombinációjának a hatása

Anyagok kombinációját alkalmazva legalább egynek kell olyan tulajdonsággal rendelkezni, hogy nem gátolja a sejtnövekedést.

így például egy magasabb hozamot értünk el tioglikolsav és vajsav kombinációjával. Ebben az esetben fontos szerepet játszhat az egyes anyagok alkalmazásának az időtartama, például a vajsavat mindig második anyagként adtuk, hogy a sejtnövekedésre gyakorolt gátló hatást csökkentsük.

Ha az anyagokat a 0. napon egyszerre adjuk, a vajsav nem növeli a hatást

A vajsav és a tioglikolsav kombinációjának a hatása additív. Maximálisan 70%-os fokozó hatás érhető el.

Szérummentes közegben a vajsav hatását más anyaggal nem lehet tovább fokozni.

A 7,5% FKS-tartalmú közegben 3 napon át tenyésztett CHO-sejtek t-PA termelésének a fokozását a 11. táblázatban mutatjuk be. Különböző időpontokban 1 mmól tioglikolsav (TG) és 1 mmől vajsav kombinációját adtuk a sejtekhez. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%) százalékában adjuk meg (középérték+s.h., n-4-8). A t-PA meghatározást DCA-módszeirel végeztük.

11. táblázat

Alkalmazás napja

TG	0	Vajsav 1	2
0	31,3+1,7	67,9+5,2	30,3+3,2
1		68,8+4,4	31,4+5,5
2			41,4+5,5

Ajtdikolin hatásai

Az afídikolin a Cephalosporium aphidicoláből izolált diterpén, specifikusan gátolja a DNS alfa-polimerázt és stimulálja a t-PA szintézist a CHO-sejtekben 1-10 pmól koncentrációban. 24 óra után. a t-PA termelés 44,9±13,9%-kal emelkedik.

Az afídikolin t-PA szintézist fokozó hatást mutat a CHO-sejtekben. A DNS-szintézist reverzibilisen gátolhatja, amellett nem befolyásolja az RNS és fehérjeszintézist Az afídikolin egyrészt alkalmas a t-PA szintézis stimulálására, másrészt a sejtek szinkronizálására. Az afídikolin a t-PA szintre gyakorolt hatását a sejtek hosszabb inkubálása esetén afídikolintartalmú közegben fent leírtuk. Ebben a fejezetben azokat a munkákat vázoljuk, amelyekben a CHO-sejteket 24 órán át afidikolinkezelésnek vetettük alá és végül afídikolin nélküli tápközegben tenyésztettük tovább. A sejtciklus fázisait és a (³H)-timidin 24 órán át történő beépülését vizsgáltuk, hogy a DNS-szintézis gátlását és az afídikolin eltávolítása utáni újbóli beindulását kövessük. Ezenkívül meghatároztuk az RNS-, fehérje- és a t-PA szintézis mértékét is.

Sejtnövekedés

Az afídikolin (1 pmól) a sejtnövekedést 24 órás kezelés során kismértékben gátolta (5-10%). A tápközeg cseréje után az afidikolinnal kezelt tenyészeteket azonban ismét a kontrolltenyészettel azonos sejtszámra állítottuk be.

t-PA szintézis

Az 1 pmól afidikolinnal szinkronizált sejtek t-PA szintézise emelkedett. A hatás a tápközeg cseréje után 96 órával is kimutatható volt

A 7,5% FKS-tartalmú tápközegben 1 pmól afídikolinnal kezelt CHO-sejtek t-PA termelésének az emelkedését a 12. táblázatban adjuk meg. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%) százalékában adjuk meg (középérték±s.h., n=4). A t-PA meghatározást DCA-módszerrel végeztük.

12. táblázat

Idő (tápközegcsere utáni óra)	t-PA szintézis %-os emelkedése
24	40,2+6,7
48	59,9+11,1
72	32,8+6,4
96	14,7+1,3

A 18. ábrában bemutatjuk a t-PA szintézisének az emelkedését szérummentes tápközegben. A hatás 48 órával a tápközeg cseréje után éri el a maximumot

A szérummentes tápközeg t-PA koncentrációját 96, 120 és 144 óra után ELISA-módszenel határoztuk meg, amely értékek ellentétben a kontrollértékekkel jelentősen magasabbak voltak, mint a DCA-módszenel kapottak. Az eredményeket a 13. táblázatban adjuk

HU 205 381 Β meg. A vizsgálatot 1 pmól afidikolinnal kezelt CHOsejtekkel végeztük, amelyeket szérummentes közegben tenyésztettünk. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%) százalékában adjuk meg (középérték+s.h., n=4) A t-PA meghatározást ELISAmódszerrel végeztük.

13. táblázat

Idő (tápközegcsere utáni óra)	t-PA szintézis %-os emelkedése
96	36,7+6,2
120	42,0+8,8
144	51,3+10,2

Magasabb intracelluláris t-PA koncentrációt csak 24 órás afidikolinos inkubálás után lehetett megfigyelni, és ez kb. 30%-os emelkedés volt.

Vajsav, propionsav, butiril-kolin-klorid és -bromid ebben a rendszerben a t-PA termelést tovább képesek fokozni. A stimulálás mind a szérummentes, mind a szérumban gazdag közegben is eredményes volt, miközben egy további fokozó hatás szérummentes közegben csak a sejteknek ehhez a tápközegkörülményekhez való 24 órás alkalmazkodás utáni anyagadagolás esetében volt elérhető.

A 14, táblázat a t-PA termelés emelkedését mutatja be afidikolinnal kezelt tenyészetekben nátrium-butirát hozzáadása után. A nátrium-butirát a t-PA szintézist további 14%-kal emeli 96 óra után.

A vizsgálatot 1 pmól afidikolinnal kezelt CHO-sejtekkel végeztük, amelyeket nátrium-butiráttal, illetve anélkül tenyésztettük szérummentes közegben. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%) százalékában adjuk meg (középérték+s.h., n=4). A t-PA meghatározást ELISA-módszerrel végeztük.

14. táblázat

Idő (tápközegcsere Afídikolin Nátrium-butirát utáni óra) az alkalmazás időpontja (óra)

24

36,7+6,2 34,1+9,7 50,6+11,0

120 42,0+8,8 31,8+10,2 49,7±4,3

6-HidroxÍ-4,6-dimetil-3-heptén-2 -on (DHO) hatásai

A fenti vegyülettel való kezelés után 144 órával megemelkedik a t-PA termelés. A t-PA szintézis stimulálásához mikromoláris koncentrációk már hatásosak voltak, például 0,005-100 pmól.

A19. ábrában bemutatjuk a CHO-sejtek t-PA termelésének az emelkedését, amely sejteket 168 órán át szérummentes közegben és 7 mmól-7 pmól DHO jelenlétében tenyésztettünk. Az értékeket DCA-val határoztuk meg. A 20. ábrában az ELISA-val meghatározott megfelelő értékeket adjuk meg.

A sejttenyészeteket, amelyeket a fent leírt eljárásokkal állítottunk elő, ismert módokon fel lehet dolgozni a t-PA izolálása céljából, például a termelési fázis után a tenyésztési közeget a sejttömegtől elválasztjuk és a sejtfelülúszót ultraszűréssel és kromatografálási lépésekkel tisztítjuk.

Az izolált t-PA-t ezután gyógyszerkészítményként lehet formulázni, például oldatként vagy liofilizátumként.

A fenti példákban leírt eljárásokat alkalmazni lehet a t-PA termelő CHO sejteket transzformált CHO-sejtekre cserélve, amelyek más fehérjéket termelnek, például t-PA mutánsokat vagy más farmakológiai hatással rendelkező fehérjét, mint például a fent megnevezett európai és német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésekben, különösen a 199 574 számú és 196 920 számú európai szabadalmi bejelentésekben és a 3 708 681 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben szereplő CHO-sejtekre,

Az ábrák ismertetése

1. ábra

7,5% FKS-tartalmú közegben tenyésztett CHO-sejtek növekedése. A sejtszám 1 ml sejtfelülúszóra vonatkozik. Összsejtszám (-▼-); élő sejtek (-V-). nem élő sejtek (-□-) (középérték±s.h., n-14-47).

2. ábra

7,5% tartalmú közegben tenyésztett CHO-sejtek tPA termelése.

A) Az extracelluláris t-PA koncentráció időbeli lefutása. A t-PA értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és DCA-módszerrel (-O-) és ELISA (-·-) módszenei határoztuk meg azokat (középérték+s.h., n=7-47).

B) Az intracelluláris t-PA koncentráció időbeli lefutása. A t-PA értékek 1 ml sejtszuszpenzióra vonatkoznak és meghatározásuk ELISA-módszerrel (-0-) történt (középérték±s.h., n=4).

3. ábra

7,5% FKS-tartalmú közegben tenyésztett CHO-sejtek t-PA szintézise.

A) Extracelluláris t-PA koncentráció. A t-PA értékek 1 · 10⁶ sejtre vonatkoznak és meghatározásuk DCA (-Δ-) és ELISA (-£,-) módszerrel történt (középérték±s.h,, n-4).

B) Intracelluláris t-PA koncentráció. A t-PA értékek 1·10⁶ sejtre vonatkoznak és meghatározásuk ELISA-módszerrel (-Q-) történt (középérték+s.h., n-4).

4. ábra

Szérummentes közegben tenyésztett CHO-sejtek sejtnövekedése. A sejtszámok 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak. Összsejtszám (-Á-), élő sejtek (-Δ-), nem élő sejtek (-□-) (középérték+s.h,, n-4-6).

HU 205 381 B

5. ábra

Szérummentes közegben tenyésztett CHO-sejtek t-PA termelése. A t-PA értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és meghatározásuk DCA-módszerrel (-O-) és ELISA-módszerrel (-·-) történt (középérték±s.h., n=4-6).

6. ábra

Szérummentes közegben tenyésztett CHO-sejtek t-PA szintézise. A t-PA értékek 1*10® sejtre vonatkoznak és meghatározásuk DCA (-O-) és ELISA (-·-) módszerrel történt (középérték+s.h., n=4-6).

7. ábra

A CHO-sejtek t-PA termelésének a fokozása C3-C5 monokarbonsavakkal az idő függvényében. A sejteket 7,5% FKA- tartalmú közegben tenyésztetük. A vajsav (--) és izovajsav (-·-) koncentrációja 1 mmól és a propionsav (-O-) és izovaleriánsav (-□-) koncentrációja 5 mmól volt. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és a sav hozzáadása nélküli kontroll (0%) százalékában adjuk meg azokat (középérték±s.h., n=ll24). At-PAmeghatározása DCA-módszerrel történt.

8. ábra

A CHO-sejtek t-PA termelésének a fokozása nátrium-butiráttal. A nátrium-butirátot a 0. napon adjuk a sejtekhez 1 mmól koncentrációban, a sejteket 7,5% FKS-tartalmú tápközegben tenyésztettük. Az értékeket a kontroll (0%) százalékában adjuk meg és 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak [DCA (-B-) és ELISA (-□.-)], illetve 1 ml sejtszuszpenziőra [ELISA (-V-)] (középérték+s.h., n=5-14).

9. ábra

Nátrium-butirát befolyása a 7,5% FKS-tartalmú tápközegben tenyésztett CHO-sejtek t-PA szintézisére. A nátrium-butirátot a 0. napon adtuk 1 mmólos koncentrációban. Az értékek 1·10® sejtre vonatkoznak (-□-, -0-, -7-) és a kontrolltenyészetekkel hasonlítottuk össze (-1-, -β-, -T-) (középérték±s.h.)

A) Extracelluláris t-PA koncentráció (DCA, n=5-14)

B) Extracelluláris t-PAkoncentráció (ELISA, n=5-8)

C) Intracelluláris t-PA koncentráció (ELISA, n=5-8)

10. ábra

7,5% FKS-tartalmú tápközegben tenyésztett CHOsejtek t-PA termelésének a fokozása. Különböző időpontokban 1 mmól nátrium-butirátot adtunk egy vagy két alkalommal a tenyészethez. Az értékeket a kontroll (0%) százalékában adjuk meg és 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak (középérték±s.h., n=4). A t-PA meghatározást DCA-módszerrel végeztük.

11. ábra

CHO-sejtek t-PA termelésének az emelése nátriumbutiráttal. A sejtek szérummentes közegben történő tenyészetéhez a 24. órában 1 mmól koncentrációban nátrium-butirátot adtunk. Az értékeket a kontroll (0%) százalékában adjuk meg és 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak. A t-PA meghatározást ELISA módszerrel végeztük (középérték+s.h., n=4).

12. ábra

Nátrium-butirát hatása a CHO-sejtek t-PA termelésére. A nátrium-butirátot a szérummentes közegben 24 órán át tenyésztett sejtekhez adtuk 1 mmól koncentrációban. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és DCA-módszerrel (--) és ELISA-módszerrel (-□-) határoztuk meg azokat (középérték+s.h., n=4-6).

13. ábra

Nátrium-butirát hatása a CHO-sejtek t-PA termelésére. A nátrium-butirátot a szérummentes közegben 24 órán át tenyésztett sejtekhez adjuk 1 mmól koncentrációban. Az értékek 1*10® sejtre vonatkoznak és meghatározásuk DCA (--) és ELISA (-□-) módszerrel történt (középérték±s.h., n=4-6).

14. ábra

Aszkorbinsav (10 mmól) hatása a CHO-sejtek t-PA szintézisére (A) és fehérje szintézisére (B). A t-PA meghatározást DCA-módszerrel végeztük. Az értékeket (-O-) a kontroll (-·-) tenyészetekkel összehasonlítva mutatjuk be és azok 1*10® sejtre vonatkoznak (középérték±s.h., n=4).

15. ábra

A CHO-sejtek t-PA termelésének a fokozása különböző kéntartalmú vegyülettel, tioglikolsawal (-0 -), tiodiglikolsavval (-D-), L-ciszteinnel (--), és glutationnal (-O-) az idő függvényében. A sejteket 7,5% FKS-tartalmú közegben tenyésztettük. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%) százalékában adjuk meg (középérték+s.h., n=4~ó). A t-PA meghatározást DCA-módszerrel végeztük.

16. ábra

7,5% FKS-tartalmú közegben tenyésztett CHO-sejtek t-PA termelésének a fokozása 1 mmól tioglikolsav egyszeri vagy kétszeri, különböző időpontban történő adása után. Az értékeket a kontroll (0%) százalékában adjuk meg és 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak (középérték+s.h., n=4-6). A t-PA meghatározását DCAmódszerrel végeztük.

17. ábra mmól tioglikolsav hatása a 7,5% FKS-tartalmú közegben tenyésztett CHO-sejtek t-PA szintézisére. Az értékek 1*10® sejtre vonatkoznak (-□-, -O-, -&-) és a kontrolltenyészetekkel (-g-, -·-, -A-) összehasonlítva ábrázoltuk azokat (középérték±s.h,, n=4-5).

A) Extracelluláris t-PA koncentráció (DCA)

B) Extracelluláris t-PA koncentráció (ELISA)

C) Intracelluláris t-PAkoncentráció (ELISA)

18. ábra

A t-PA termelés fokozása 1 pmól afidikolinnal szinkronizált CHO-sejtekben, amelyeket a közeg cseréje után (Mediumwechsel-=MW) szérummentes kö12

HU 205 381 Β zegben tenyésztettünk. Az értékek 1 ml sejtfelülúszóra vonatkoznak és a kontroll (0%) százalékában adjuk meg (középértékis.h., n=4-9). A t-PA meghatározást DCA-módszerrel végeztük.

Claims

1. Eljárás állati sejtek vagy sejtvonalak fehérjetermelésének indukáló anyag hozzáadásával való fokozására sejttenyészetben, azzal jellemezve, hogy a tenyészethez a fehérjetermelést indukáló tioglikolsav, tiodiglikolsav, L-cisztein, glutation, butiril-kolin-bromid, butiril-kolinklorid, nonaktinsav, furánzsírsavak, aszkorbinsav, D-ahidroxi-szubsztituált 3-4 szénatomos alifás mono- vagy dikarbonsavak vagy sóik közül egynek vagy többnek hatásos mennyiségét adjuk, azzal a fenntartással, hogy aszkorbinsavat csak transzformált CHO-sejtek tenyészetéhez adunk (Elsőbbsége: 1987.11.13.)

2. A 1. igénypont szerinti eljárás transzformált CHO-sejtek fehérjetermelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy a tenyészethez egy 3-4 szénatomos alifás monokarbonsavat vagy annak sóját adjuk. (Elsőbbsége: 1987.11.13.)

3. A 2. igénypont szerinti eljárás transzformált CHOsejtek t-PA vagy t-PA mutáns termelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy megfelelő sejttenyészetből indulunk ki. (Elsőbbsége: 1987.10.13.)

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás transzformált CHO-sejtek t-PA vagy t-PA mutáns termelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy indukáló anyagként tioglikolsavat vagy sóját alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987. 10. 13.)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás transzformált CHO-sejtek t-PA vagy t-PA mutáns termelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy indukáló anyagként nonaktinsavat vagy valamely furánzsírsavat vagy ezek sóit alkalmazzuk. (Elsőbbésge: 1987.10. 13.)

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás transzformált CHO-sejtek t-PA vagy t-PA mutáns termelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy indukáló anyagként vajsavat vagy ennek sóit alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987.10. 13.)

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy á tenyésztést szérummentes táptalajban végezzük. (Elsőbbsége: 1987.10.13.)

8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést szérumtartalmú táptalajban végezzük. (Elsőbbsége: 1987.10.13.)

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjetermelést indukáló anyagot 0,005 μΜ-tól 500 mM-ig terjedő koncentrációban alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987.11.13.)

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 3-4 szénatomos alifás monokarbonsavat vagy sóját 1-10 mM koncentrációban alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987.11.13.)

11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tioglikolsavat, L-ciszteint vagy glutationt vagy ezek sóit 1-10 mM koncentrációban alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987.11.13.)

12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket az 1. igénypontban felsorolt indukáló anyagok valamelyikének jelenlétében tenyésztjük, a sejteket a tenyészetből eltávolítjuk, ezután egy új táptalajba helyezzük, és egy másik indukáló anyag jelenlétében tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1987.11.13.)

13. Eljárás állati sejtek vagy sejtvonalak fehérjetermelésének indukáló anyag hozzáadásával való fokozására sejttenyészetben, azzal jellemezve, hogy a sejteket először afidikolin jelenlétében tenyésztjük, majd a sejteket a tenyészetből eltávolítjuk, és utána egy új táptalajban vajsav, propionsav, butiril-kolin-klorid, vagy butiril-kolin-bromid, illetve ezek sóinak jelenlétében tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1987.11.13.)

14. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy két vagy több indukáló anyagot egyidejűleg adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1987. 11.13.)

15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vajsavat és tioglikolsavat vagy ezek sóját adjuk a tenyészethez, a vajsavat második indukáló anyagként alkalmazva. (Elsőbbsége: 1987.11.13.)