JPH01291796A - ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト正常細胞の産する組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子（以後、ｔＰＡと略す）の製法に関する。

ｔＰＡは、血管内皮細胞および種々の組繊細胞から生産
分泌され、血栓の本体であるフィブリンを溶解し、血栓
症の治療薬として有効なものである。

〔従来の技術〕

ｔＰＡは１本鎖のものと２本鎖のものがあることが知ら
れている。これらの血栓溶解活性は、２本鎖のものが１
本鎖にくらべて太き（、従来、いわゆるＬＰＡと言われ
るものは、２本鎖単独のものまたは２本鎖に１本鎖が混
合した状態のものが開発されてきた。

２本積ｔＰＡは、血栓の溶解活性が大きく、フィブリン
溶解効果を必要とする血栓部分ではなく、血流中でプラ
スミノーゲンを活性化させる可能性が非常に高く、臨床
的には出血傾向が高い（特開昭５９−１１８７１７　）
。

しかしながら、２本積ｔＰＡの前駆体と考えられる１＊
ｔｌｔＰＡは、フィブリンにはより高い親和性を有し、
フィブリンに吸着されると直に早い速度で２本ｔＡｔ　
ＰＡに転換される。

したがって、ｌ＊鎮ｔＰＡは凝血部分でプラスミノーゲ
ン活性を最大に発揮することができる。

このように血栓溶解活性が比較的不活性とされていた１
末鎖ｔＰＡは、血流中で作用することがないとされ、臨
床的には多く望まれるようになっている状況であり、１
末鎖ｔＰＡのみを効率良く生産させる方法が強く望まれ
ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、１末鎖ｔＰＡを細胞を用いて生産させる
場合には、培地中に含まれるプロテアーゼまたは細胞そ
のものが生産するプロテアーゼ（これらのプロテアーゼ
は主にプラスミンやトリプシンと考えられる）により生
産中に１本鎖から２本鎖へ転換して効率よく１本鎖を得
ることは離しいという問題がある。

したがって、このような問題を解決する方法として、次
のような方法が知られている。

すなわち、アプロチニンの存在下に培養または後処理を
行う方法（ヨーロッパ特許公開公報第４１７６６号）、
生産細胞培養液中に大豆より誘導されるトリプシン阻害
剤またはアプロチニンを使用する方法（特開昭５９−１
１８７１７）　、アプロチニンまたはベンズアミジンを
添加した培地で培養もしくは誘導生産させる方法（特開
昭６ｌ−１９４８６）　、精製時にアプロチニン、６−
アミノカプロン酸を添加して１本鎖のみを生産させる方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ
　１９８２．７１９（２）、　３１８〜３２８）等が知
られている。

また、とくに付着性細胞を使用する場合、培養中に細胞
が器壁またはビーズから剥離することが大きな問題とな
るが、これを防ぐ方法として、血清からプラスミンを除
去する、またはアプロチニンを加えることが報告されて
いる（カウフマンモルキエラー・アンド・セルラー・バ
イオロジ　５巻、　１７５０頁）。

これらの公知方法において使用されるアプロチニンは掻
めて高価であり、また血清からプラスミンを除去する方
法は煩雑な操作を必要とする等、産業上実施するには問
題が多い。

〔課題を解決するための手段） 本発明者は、上述の公知技術の問題点を解消するｔＰＡ
生産方法について鋭意検討し、細胞、特に付着性細胞の
ｔＰＡ生産において、ｐ−アミノメチル安息香酸類を培
地に添加することが、１本鎖の生産性の向上及び細胞の
器壁やビーズからのＷ’ｌ　諦防止に極めて有効である
ことを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は細胞を使ってヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を製造する方法において、培養培地中
にｐ−アミノメチル安息香酸類を添加することを特徴と
するヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法、お
よび細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を製造する方法において、培養後、ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子誘導物質を含む生産培地にＰ−ア
ミノメチル安息香酸類を添加することを特徴とするヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法である。

本発明において使用するｐ−アミノメチル安息香酸類と
しては、例えばｐ−アミノメチル安息香酸、３−メトキ
シ−４−アミノメチル安息香酸、３−エトキシ−４−ア
ミノメチル安息香酸、３−ヒドロキシ−４−アミノメチ
ル安息香酸、３−フルオロ−４−アミノメチル安息香酸
、３−クロロ−・１−アミノメチル安息香酸、３−メチ
ル−４−アミノメチル安息香酸、２−アミノ−４−アミ
ノメチル安息香酸なとである。

また、本発明のおけるｐ−アミノメチル安息香酸類とし
てはそのエステル化合物、塩酸塩の形で使用できること
は言うまでもない。

本発明におけるρ−アミノメチル安息香酸類の培地への
添加量は、１０−４〜１０−’Ｍ、更に好ましくは１０
４〜１０４Ｍである。

本発明において使用されるｔＰＡ生産細胞としては、例
えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列をヒト由来メタロ
チオネインのプロモーターに接続し、ＢＰＶ由来プラス
ミドの一部及びｐＢＲ３２２プラスミドの一部及び転写
停止に必要なりＮＡ配列などを組み込んで構築したプラ
スミドをマウスＣ−１２７細胞に形質転換して得られた
ｔＰＡ生産株、ｈＴ−３８２株などが使用できる（特開
昭６２４２６９７８　）。

また、例えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードするＤＮＡ配列を５Ｖ−４０
の初期プロモーターを接続したＤＮＡ配列とジヒドロ葉
酸還元酵素をコードするＤＮＡ配列から成るプラスミド
で、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形質
転換し、更にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の増
幅した細胞を選択して得られたｔＰＡ生産株、ＳＶ−２
１−Ｍ２．５に７株などが使用できる（特開昭６２−１
２６９７８）。

もちろん、突然変異、馴化など手段を併用したもの、あ
るいはウィルス他により形質転換された細胞などいずれ
もｔＰＡ産生株であれば使用できる。

使用する培地は、ダルベツコ変法イーグルＭＥＭ培地（
日永製薬製）、１９９培地（日永製薬製）、イーグルの
最小必須培地（日永製薬製）などに予め不活性化させた
ウシ胎児血清（ＦＣＳギブコ社製）を０〜１０％添加し
たものが使用されるが、成分濃度などは必要に応じて変
更できる。

また、必要に応じて界面活性剤など第３成分を添加して
もよい。

ＬＰＡの生産を誘導する物質として亜鉛、カドミウムも
しくはその塩を添加する。添加量は１〜１００μＭであ
る。

１８養方法は、とくに限定されるものではなく、例えば
、次のような方法で行われる。

すなわち、ルーフラスコに培地及び必要ならばｔＰＡ誘
導物質を装入し、細胞の適切量を植え付け、適温、適切
な時間炭酸ガスインキュベーター中で増殖と同時にｔＰ
Ａの生産を行う。

または、ルーフラスコに培地を装入し、細胞の適切量を
植え付け、適温、適切な時間、炭酸ガスインキュベータ
ー中で増殖させ、コンフレンドに達した後、生産培地と
切り換え、同じく炭酸ガスインキュベーターで適温、適
時ｔＰＡの生産を行う。

例えば、７５ｃＪのルーフラスコを使用した場合、細胞
を０．５〜２．０Ｘ１０’ケ／ｍｌを植え付け、３７°
Ｃ２３〜４日間増殖と同時にｔＰＡの生産を行う。

または、例えば、７５ｃｆｆｌのルーフラスコを使用し
た場合、細胞を１〜２Ｘ１０５ケ／ｍｅを植え付け、３
７°Ｃ１３〜４日間増殖させ、生産培地と切り換えた後
は３７’Ｃ，１〜３日間ｔＰＡの生産を行う。

このような方法で、ｔＰＡの生産量は分析の結果、１本
鎮ｔＰＡが５〜１０ｍｇ／４２．２末鎖ｔＰＡが０〜２
ｍｇ／ｌであり、全体に占める１本鎖の比率は９５％以
上であった。

〔本発明の効果〕

本発明では、培養培地または生産培地中に従来高価なア
プロチニンなどを添加していたものを、安価なｐ−メチ
ル安息香酸類を添加することにより、１末鎖ｔＰＡの生
産性の向上及び細胞の器壁やビーズからの２す離を防止
することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により説明する。

実施例１ ｔＰＡの生産に用いた細胞は、ヒトメタロチオネインを
プロモーターとしてＢＰＶ由来プラスミドの一部及びｐ
ＢＲ３２２プラスミドの一部及び転写停止に必要なりＮ
Ａ配列などを組み込んで構築したプラスミドをマウスＣ
−１２７細胞に形質転換して得られたｈＴ−３８２株を
使用した。

７５ｃｍのルーフラスコにダルベツコ変法イーグルＭ　
Ｅ　Ｍ培地に予め不活性化させたウシ胎児血清を１０％
添加したものを２Ｏｎ＋１仕込み、塩化亜鉛をＩＯμＭ
になるように、及び表１に掲げる各物質を各濃度で添加
したｌａ地を作成し、それぞれに上記細胞を１．０Ｘ１
０’ケ／…１となるように植菌した。

炭酸ガスインキュベーター中で３７°Ｃ２４日間培養し
、コンフレンド（細胞数１０　ＸＩＯ’ケ／　ｍ　ｌ　
）に達した時点で培養液中の１本鎖及び２末鎖ＬＰＡ　
’ｇ５度を以下の分析法で定堅し、表１のような結果を
得た。

培地中の１本鎖及び２末鎖ｔＰＡの分析方法を以下に示
す。

１、ＥＬＩＳ八法 ■ＥＬＩＳＡ専用プレート（コーニング社９６ｗｅｌｌ
）を１末鎖ＬＰへに対するモノクローナル抗体（ＰＡＭ
−１アメリカンダイアゴノティカ社）、１末鎖＋２本鎖
ｔＰＡに対するモノクローナル抗体（ＰＡＭ−２アメリ
カンダイアゴノティ力社）をコート溶液で希釈して１０
μｇ／ｍｌとし、各プレートの−ｅｌｆに５０μｉずつ
加え、室温で２時間放置後、ｗｅｌｌ内の液を捨てる。

■洗浄液で洗浄後、各−ｅｌｌをブロッキング溶液で満
たし、室温で３０分以上放置する。

１０００〜２０００倍に希釈したサンプル及びスタンダ
ード（０，１，２，４，８ｎｇ／ｍｌ）を各５０μＰず
つ各−ｅｌｌに加えて２時間放置する。

■洗浄液で洗浄後、抗ｔＰＡウサギ抗体を添加する。

■洗浄液で洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｒａｂｂｉｔ
　ＩｇＧ。

八Ｉｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ（シグマ社）を５００倍に希釈して各−ｅｌ
ｆに５０μＰずつ添加し、１時間放置する。

■洗浄液で洗浄後、基質溶液（Ｐ−ＮｉＬｒｏｐｈｅｎ
ｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅシグマ社０．６ｍｇ／　Ｒ）を
各−ｅｌｆに５０μＥずつ加えて３０分間放置する。

■各ｗｅｌｌに５０μ２ずつの３ＮＮａ０１１を加えて
酵素反応を停止する。

■４０５ｎｍにおける吸収を市販のＥＬＴＳＡ　ＲＥＡ
ＤＥＲで読み取る。

■スタンダードより検量線を作成し、サンプル中のＬｒ
’Ａ濃度を測定する。

■計算法 １本鎖　ｔ　Ｐ　Ａ　量＝ＰＡＭ−１測定値（ｍｇ／　
１　）２本鎖　ｔＰＡ量＝ＰＡＭ−２−ＰＡＭ−１測定
値（ｍｇ／　ｅ　） ■、イムノプロットによる定性的分析 ■培養液をβ−メルカプトエタノールを含むあるいは含
まない電気泳動用試料処理で処理することによって蛋白
質を還元した後、あるいは還元しない状態で、Ｌａｅｍ
ｎ＋ｕｌｉ（１９７０）の方法で電気泳動する。

■泳動された蛋白をＴｏｗｂｉｎ　ら（１９７９）の方
法で電気的にニトロセルロース上に転移する。

■非特異的蛋白吸着部位をウシ血清アルブミンで飽和す
る。

■ニトロセルロースを第一抗体である抗ｔＰＡ抗体（例
えばヤギやウサギ由来のポリクローナル抗体、またはマ
ウス由来のモノクローナル抗体）で処理し、ニトロセル
ロース上のｔＰＡと反応させる。

■二次抗体を抗ｔＰΔ抗体と反応させた後、アルカリフ
ォスファターゼと結合した、二次抗体に対する抗体と反
応さセる。

■アルカリフォスファターゼの基質として、ニトロブル
ーテトラゾリウムを含む溶液に溶解したブロモクロロイ
ンドリルリン酸を用い発色させ、ニトロセルロース」−
のｔＰＡあるいはその分解物、凝集物等の位置を検知す
る。

１零ｔｉｔｐＡでは、還元、非還元の前処理にかかわら
ず、約７０ＫＤの主要なバンドが得られる。

２本積ＬＰＡでは、非還元の場合、１本鎖同様約７０Ｋ
Ｄの主要なバンドが得られるが、還元した場合は、約７
０ＫＤのバンドは消失し、かわって約３０ＫＤと約４０
ＫＤのバンドが得られる。これら還元、非還元の試料の
イムノプロントに於ける約７０ＫＤ、約３０および約４
０ＫＤのバンドを比較することにより、定性的に試料中
の１本鎖、２本鎖の呈比を推定することができる。

１ｍｍｕｎｏ　Ｂｌｏｔによる分析は定性的であるが、
常々ＥＬＩＳＡにより得られた定量的Ｄａ　ｔａと矛盾
がないことを確認するために用いた。

実施例２ 実施例１と同じ細胞を使用し、７５ｃＪのルーフラスコ
にダルヘソコ変法イーグルＭＥＭ培地に予め不活性化さ
せたウシ胎児血清を１０％添加したものを２０ｍ１仕込
み、１．ＯＸＩＯ’ケ／ｍｌとなるように植菌した。

炭酸ガスインキュヘーター中で３７°Ｃ１４日間培養し
、コンフレンド（細胞数１０　ＸＩＯ’ケ／ｌｌ１Ｎ）
に達した時点で培地を捨て、同一の組成で塩化亜鉛を１
０８ｍとなるように、及び表２に掲げる各物質を各濃度
で添加した培地を２０ｎ＋　１ずつ加えて炭酸ガスイン
キュベーター中で３７°Ｃ，２日間ｔＰＡを生産させ、
その時点での生産培地中でのｔＰＡ濃度を実施例と同様
に分析し、表２のような結果を得た。

実施例３ ｔＰＡの生産に用いた細胞は、ｔＰＡをコードするＤＮ
Ａ配列を５Ｖ−４０の初期プロモーターを接続したＤＮ
Ａ配列と、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ配
列から成るプラスミドで］１０（チャイニーズハムスタ
ー卵巣）細胞を形質転換し、更にメソトロキサートを含
む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択して得られたＳＶ
−２１−Ｍ２．５に７株を使用した。

実施例１と同様な培地（ただし塩化亜鉛は添加せず）で
同様な方法で行い、表３のような結果を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
   子を製造する方法において、培養培地中にｐ−アミノメ
   チル安息香酸類を添加することを特徴とするヒト組織型
   プラスミノーゲン活性化因子の製法。 ２、細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
   子を製造する方法において、培養後、ヒト組織型プラス
   ミノーゲン活性化因子誘導物質を含む生産培地にｐ−ア
   ミノメチル安息香酸類を添加することを特徴とするヒト
   組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法。