JP2001021557A5

JP2001021557A5 -

Info

Publication number: JP2001021557A5
Application number: JP1999197378A
Authority: JP
Filing date: 1999-07-12
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2019-07-12

Description

本発明に用いるモノクローナル抗体は、公知の手段により得ることができる。具体的には、例えば、以下に示すとおりである。
モノクローナル抗体は、所望のモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマを、例えば、培地又はマウスの腹腔内で培養することによって製造することができる。ここで用いるマウスハイブリドーマは、一般的には、Ｄダイマーで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）参照］により細胞融合して得ることが可能である。

前記ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ；以下、ＤＭＥと称する）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸、及び抗生物質（ペニシリンＧ及びストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
前記ハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、５％ＣＯ₂濃度且つ３７℃の条件下で約３日間で行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約１４日間で行なうことができる。

第１試薬自体は、検体希釈の目的のために用いるものであり、その組成としては、緩衝液をベースにする。また、前記緩衝液に、適宜、界面活性剤を添加することができる。前記界面活性剤としては、非イオン系の界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｒｉｔｏｎＸ１００等が好適に用いられる。緩衝液としては、化学的に安定で、金属イオンとの錯形成能が小さく、酸解離定数ｐＫａがｐＨ６〜９の間にある点で、グッドバッファーを用いることが好ましい。前記グッドバッファー以外にも、例えば、トリスバッファー又はリン酸バッファー等を用いることもできるが、前記理由によりグッドバッファーを用いることが好ましい。

【００２１】
【作用】
以下、本発明の作用機序について説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
先に、従来技術の説明において述べたように、モノクローナル抗体を感作したラテックス凝集試薬を用いた場合、臨床の現場において、多数の患者検体の中で、希に分析結果が低値になるケースが認められるようになった。種々の原因が考えられるが、その主たる要因としては、従来、体内では１次線溶でのＤモノマーの存在はほとんどないという考え方が一般的であったが、近年、医学の進歩、治療及び治療薬の進歩の影響等により、従来では予測し得なかったＤモノマーの存在が影響しているものと、本発明者は考えている。

ＭａｒｃＨｏｙｌａｅｒｔｓ等［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５７，２９１２−２９１９（１９８２）］が述べているとおり、線溶酵素のプラスミンは、フィブリン上で効率よく生成されるので、生体内においては、局所のフィブリンのみを分解すると考えるのが一般的である。液相においては、プラスミンの生理的阻害剤であるα２−プラスミンインヒビターが高濃度に存在するので、プラスミンは瞬時に失活され、フィブリノーゲンの分解は起こらないものと考えられていた。従って、Ｄモノマーと反応するモノクローナル抗体を用いた場合であっても、ＸＤＰを測定することにおいては、重要視する必要はなかった。

しかしながら、近年、医学の進歩、治療及び治療薬の進歩により、例えば、血栓症患者等の治療に血栓溶解剤が使われるようになり、前記のごとく生理的環境では起こり得ないと考えられていた態様で１次線溶がおこり、Ｄモノマーを含むフィブリノーゲン分解産物の存在が無視できないようになってきたものと考えられる。すなわち、従来では予測し得なかったＤモノマーの存在がラテックス凝集系においてその測定値に影響していると考えられる。
このように、被検試料中にＤモノマーが存在した場合、使用するモノクローナル抗体の特性によっては、ラテックス凝集反応に対してＤモノマーが干渉し、本来の凝集が抑制されて、本来の値より低値の結果を与えてしまうものと思われる。本発明においては、被検試料由来の不確定なＤモノマーの影響を、過剰量のＤモノマーを予め人為的に共存させておくことで打ち消すものと、本発明者は考えている。

すなわち、フィブリノーゲン（カビ社，スウェーデン）２０ｍｇ（１０ｍｇ／ｍｌ）に、ヒトトロンビン及び塩化カルシウムを、それぞれ終濃度が１０単位／ｍｌ及び１０ｍＭとなるように加え、３７℃で２時間反応させることにより、フィブリノーゲンをフィブリンに変換させた。続いて、１８０００×ｇで３０分間遠心し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。得られたフィブリンを、０．１５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）−５ｍＭ塩化カルシウム−０．０２％ＮａＮ₃液２０ｍｌに浮遊させた。浮遊液にヒトプラスミン（１単位／ｍｌ，ミドリ十字社）を１時間毎に０．５ｍｌずつ添加した。１０時間経過後に、アプロチニン（ＭｏｂａｙＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．）２００単位を加えて分解反応を停止させた。反応液を容量１０ｍｌのリジンセファロースカラムに通過させ、プラスミンを除去した。

【００４２】
【実施例３】
《第１試薬の調製（Ｄモノマー含有緩衝液の調製）》
０．２Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．００）−０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−０．１５Ｍ−ＮａＣｌ−０．１％ＥＤＴＡ−２Ｎａ−０．０５％ＮａＮ₃に、Ｄモノマー（シグマ社）を１テストあたりの反応時濃度で、０．７６μｇ／ｍｌになるように添加し、第１試薬（すなわち、Ｄモノマー含有緩衝液）を調製した。
対照試験では、Ｄモノマーを添加する前の前記緩衝液を、従来法による第１試薬として使用した。