JPH10509514A

JPH10509514A - 止血活性の分析のための方法、試薬およびキット

Info

Publication number: JPH10509514A
Application number: JP8515252A
Authority: JP
Inventors: グスタフロンビ，マーツ
Original assignee: グローバル、ヘモステイシス、インスティチュート、エムジーアール、アクチボラグ
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 1998-09-14
Also published as: WO1996014581A1; SE9403833D0; US6156530A; EP0870200A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物、特にヒトからの特に血液または血漿中の凝固、フィブリン溶解および止血活性の分析法が記載されてる。この方法は、試料をイン・ビトロで、固定して好ましくはその成長支持体から脱離した内皮細胞またはその細胞の外膜と接触させ、生成する凝固物質および場合によっては溶解した凝固物質を検出することを含んでなる。上記の内皮細胞およびその外膜に基づいた試薬、および上記試薬を含む方法を行うためのキットも記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】止血活性の分析のための方法、試薬およびキット発明の分野本発明は、一般には止血の分野、または哺乳動物、特にヒトの止血系の研究に関する。更に詳細には、本発明は、生物学的流体(biological fluid)における凝固またはフィブリン溶解活性または総止血活性を評価することを可能とする、新規で単純であり、これにより臨床的に有用性のある分析法に関する。主として、には、これは、血友病および／または栓友病(thrombophilia)の検出を目的とする血液または血漿の、単純かつ再現性がありしかも信頼性のある方法での分析を意味する。本発明による技術は、生物学的流体と凝固過程を行う試薬とを接触させた後、凝固した物質を先行技術の方法に従って検出することに基づいている。本発明に関する新規性は、哺乳動物個体でのイン・ビボで凝固を行う因子に極めて類似しており、止血活性の全体的臨床像を得る上で先行技術より良好な可能性を与える試薬の利用である。本発明は、この方法を行うためのキットにも関する。発明の背景循環障害は、出血または血栓を伴う疾患である、それぞれ血友病または栓友病として表される臨床的症状を生じることがある。このような障害は、血液を凝固しまたは凝固した物質を溶解する能力の動揺により、またはこれらの間のバランスの動揺によって生じることがある。凝塊形成および凝塊溶解はいずれも精確に調節される過程であり、それらのいずれも駆動作用および抑制作用からなるものと見なすことができる。凝塊形成過程は凝固と呼ばれており、従って凝固促進(p ro-coagulative)と抗凝固活性とのバランスである。同様に、凝塊溶解過程はフィブリン溶解と呼ばれ、フィブリン溶解促進(pro-fibrinolytic)作用および抗フィブリン溶解作用を示す。凝固とフィブリン溶解とのバランスは止血として表され、従ってこれは、循環路からの血液の漏洩を防止しかつこれらを開いたままにする総ての過程を含んでいる。これら２種類の概念である循環障害および止血障害は、この関連において実際上同義である。血友病の理解とこの疾患の効果的な治療法の開発は、単純で包括的な機能的検査室的方法(laboratory methods)によって著しく左右されてきており、これにより問題となっている個人の血液および血漿の凝固特性の変化が明らかになってきた。これらの方法の原理は、血液または血漿に凝固を引き起こす試薬を添加し、一定の凝塊形成に要する反応時間を記録することである。異常なほど遅いまたは弱い凝塊形成が血友病の特徴となっていたものであり、分析によって測定された値を正常にした医学的治療がこの疾患の臨床的症状の緩和に有効であることが明らかになってきた。止血についての上記の観点によれば、凝固活性を特微付けするための略記した先行技術による包括的な機能的検査室的方法は、主に凝固促進性障害に対して感受性を有する。しかしながら、これらの方法は、血友病の診断にかなり満足であると思われてきたのであり、関連の止血障害は、止血の凝固促進性部分に精確に限定されることが多いからである。しかしながら、先行技術による包括的方法では、総ての血友病患者における障害を明らかにすることはできず、これらの方法では栓友症に対しては実際上役に立たない。これは、これらの方法が凝固過程の抗凝固部分における障害を全く示唆せずまたはごく僅かしか示唆せず、かつこれらの方法はフィブリン溶解障害に対して感受性を欠いている事実によることが考えられる。従って、血液および血漿の凝固、フィブリン溶解および止血特性を分析しまたは検出する上で実際に有用な一層包括的な方法が欠けているまたは必要であることは、明らかである。包括的な止血に関する単純で、特に一層信頼性のある方法があれば、特に栓友病の診断が改良され、治療が改良され、かつ治療法が一層効率的に開発されるであろう。本発明は、血液および血漿の凝固、フィブリン溶解または止血特性の診断分析の包括的検査室的方法の改良を提供する。更に、この方法は、例えば滑液および脳液のような上記活性が存在する他の生物学的流体の相当する分析に直接適用可能な性質のものである。発明の説明従って、本発明は、哺乳動物個体、特にヒトの生物学的流体を分析して、哺乳動物個体の凝固活性またはフィブリン溶解活性、または上記流体における総または包括的止血活性を測定または分析する方法を提供する。換言すれば、本発明によれば、１種類の同じ分析法を用いることによって血友病の性質を有する個体、並びに栓友病の性質を有する個体を同定することが可能である。更に、これは、本発明によれば、問題となっている生物学的流体の極めて少量の試料についてイン・ビトロで分析を行うことによって極めて簡単な方法で行うことができる。これにより、本発明による方法は、検査室的診断用途に特に好適となる。本発明による方法は、失活した内皮細胞、または失活してその支持体から遊離された内皮細胞が、血友病および栓友病のいずれにも典型的な止血障害を検出することができるようなやり方で、生物学的流体、特に血液および血漿で凝固を引き起こすという驚くべき発見に基づいている。更に、生物学的流体が失活した内皮細胞と接触したときに形成される凝固した物質が生物学的流体のフィブリン溶解活性の基質として働くことができ、従って本発明により分析して、特性決定を行うことができることを見いだした。また、これにより、以下に詳細に説明するように、止血活性と関連付けることができる量を分析し、特性決定することも可能である。従って、失活した内皮細胞、および失活してその支持体から遊離された内皮細胞は、止血障害に関してかなりの診断上の可能性を有することを見いだした。内皮細胞の特性、およびそれらと生物学的流体、特に血液および血漿との相互作用に関しては、これまでのところ何も明らかになっていない（Stern et al.， 1985，Proc．Natl．Acad．Sci.，82，2523-2527 およびKirchhofer et al.，J． Clin．Invest.，93，2073-2082を参照されたい）。上記文献の著者らは、イン・ビトロでの検査室的診断目的にこれらの細胞の使用を開始しようとした。内皮細胞は抗凝固性が強いという一般に受け入れられた見解により、当業者が、試料の凝固またはフィブリン溶解または止血特性を分析しようとする診断の場合において内皮細胞を使用しようとするのは控えるべきである。少なくとも、このような状況において内皮細胞の診断での可能性は考えられも見られもしなかったと、確証することができる。先行技術の例としては、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−５３８９５１号明細書を挙げることができる。そこでは、組織因子と、細胞外組織からの細胞および内皮細胞の間のトロンボプラスチン活性との間の差が挙げられ、すなわち内皮細胞は、本発明によって意図された状況では役に立たないと考えられてきた。しかしながら、本発明によれば、内皮細胞を固定しその支持体から脱離すること、またはその逆を行うことができ、これらの固定された内皮細胞は、哺乳動物個体の凝固、フィブリン溶解および止血の分析または特性決定のための試薬における主成分として有用な性質の活性をまだ持っていることが示される。それにより本発明の方法に用いられる試薬の性質は、これらの状況とは関連のないある因子または若干の因子の代わりに、本発明に従って協力および対立因子の系の影響下で凝固を研究する点において真実に極めて近くなるであろう。内皮細胞を培養しまたは成長させてきた支持体からの内皮細胞の離脱は、これに関連して活性な膜構造に明らかに悪影響を与えないという事実により、本発明では、上記の効果を、特に有利な方法で、すでに存在している装置で利用できる。例えば、本発明による新規な試薬を正規の凝固装置で粒子懸濁物として用いることができ、または固体表面をコーティングするのに用いて粒状調製物を固定することができる。また、これが、多くの場合に、固定されたおよび離脱した細胞の問題とする活性の意外な発見の完全な利点が得られないことを意味するとしても、本発明による方法は、用いられる内皮細胞が元の成育場所から離脱しない場合も含んでいる。従って、本発明による方法は、哺乳動物個体、特にヒトからの生物学的流体、特に血液または血漿における凝固、フィブリン溶解または止血活性の分析、特に定量分析の方法であって、上記流体の試料の一定量をイン・ビトロで、固定されかつ好ましくはその成長の場所から離脱した内皮細胞またはこの細胞の外膜と接触させ、好ましくは一定量の凝塊を形成するのに要する時間を測定することによってまたは一定時間中に形成された凝塊の量を測定することによって生成する凝固物質を検出することを特徴とする方法である。試料の凝塊溶解活性を発現する機会を有する前後のいずれにおいても、生成する凝固物質を検出することができ、これが一層有利であることが判るときには、溶解過程(lytic processes)の結果を検出する。更に具体的には、本発明の一つの局面は、哺乳動物個体、特にヒトからの生物学的流体、特に血液および血漿における凝固、フィブリン溶解または止血活性の分析、特に定量分析の方法であって、生物学的流体、特に血液または血漿の試料の一定量をイン・ビトロで、固定されかつ好ましくはその成長の場所から離脱した内皮細胞またはこの細胞の外膜と接触させ、 a) 凝塊形成の速度(rate)または一定量の凝塊を形成するのに要する時間を測定し、この速度または凝固時間を正常個体の速度および凝固時間の対照値と比較し、この速度または凝固時間が対照値より短い場合には、生物学的流体の試料は血栓症の性向を有する個体から生じると見なし、またこの速度または凝固時間が対照値より長い場合には、生物学的流体の試料は出血症の性向を有する個体から生じると見なし、または b) 凝固過程を中断して、所定の接触時間中に形成された凝塊の量を測定し、凝塊の量を正常個体の凝塊の量の対照値と比較し、凝塊の量が対照値より小さい場合には、生物学的流体の試料は出血の性向を有する個体から生じると見なし、また凝塊の量が対照値より大きい場合には、この試料は血栓症の性向を有する個体から生じると見なし、または c) 一定時間および追加の一定反応時間おいた後に凝固過程を中断し、続いて溶解した凝固物質(coagulated material)の量を測定し、この溶解した凝固物質の量を正常個体の溶解した凝固物質の対照値と比較し、凝固物質の溶解量が対照値より大きい場合には、生物学的流体の試料は出血の性向を有する個体から生じると見なし、また凝固物質の溶解量が対照値より小さい場合には、この生物学的流体は血栓症の性向を有する個体から生じると見なし、または d) 一定時間および追加の一定反応時間おいた後に凝固過程を中断し、続いて凝固物質の残量を測定し、この残留凝塊の量を正常個体の残留凝塊の量の対照値と比較し、残留凝塊の量が対照値より小さい場合には、生物学的流体の試料は出血の性向を有する個体から生じると見なし、また残留凝塊の量が対照値より大きい場合には、この生物学的流体は血栓症の性向を有する個体から生じると見なす、方法に関する。操作段階a)またはb)を行うときには、凝固活性に関する結果が得られる。操作段階c)を行うときには、フィブリン溶解活性に関する結果が得られ、操作段階d) を行うときには、止血活性に関する結果が得られる。また、フィブリン溶解または凝塊溶解活性は、b)およびd)で得られた分析結果の差として同定することができる。本発明の一態様では、生物学的流体の試料の量は、予め可逆的に抗凝固した血液または血漿であって、上記のイン・ビトロでの接触に関連して凝固活性状態へ戻るものである。従って、例えば血液または血漿であることができる流体は、Ｃａ²⁺イオンと結合する物質、好ましくはクエン酸塩またはＥＤＴＡを用いて抗凝固され、その凝固活性状態への復帰は過剰量のＣａ²⁺イオンの添加によって行われる。或いは、この流体を凝固抑制物質、例えばヒルジンまたはヘパリンで凝固防止することができ、また凝固活性状態への復帰は、上記凝固抑制物質の効果を抑制する物質、例えばそれぞれヒルジンの活性を抑制する抗体またはヘパリナーゼを添加することによって行われる。分析は、最大１．０ｍｌ、好ましくは０．０１〜１．０ｍｌの生物学的流体の試料の量について行うのが好都合である。試料の量が最大０．２ｍｌであり、凝固時間が最大１５分であるのが、最も好ましい。操作段階b)、c)またはd)の実行において、凝固過程を、凝固抑制物質の添加によって中断することができ、この物質はヒルジンおよびヘパリンからなる群から選択するのが好ましいが、クエン酸塩、シュウ酸塩またはＥＤＴＡのようなＣａ²⁺ イオン錯化剤も可能である。操作段階a)またはb)の実行では、分析をフィブリン溶解抑制物質の存在下にて行うことができ、この物質は、６−アミノ−ヘキサン酸、およびｔＰＡおよびｕＰＡに対する抗体の群から選択するのが好ましい。操作段階a)の実行の結果は、反応混合物の光学的またはレオロジー特性の変化、好ましくは光透過または粘度の変化を測定して凝固物質を検出することによって得ることができる。操作段階b)、c)またはd)の実行の結果は、凝固物質、好ましくはフィブリンまたは血小板のある種の成分または分解生成物を測定して凝固物質を検出することによって得ることができる。これに関する結果は、フィブリンの量をその酵素分解により、好ましくはプラスミンによって可溶性分解生成物として、これを免疫学的手法によって測定することによって得るのが好都合である。例えば、上記の分解生成物は、Ｄ−二量体断片に特異的な免疫学的手法で測定することができ、またはフィブリンに関連した血小板の量は、フィブリンの酵素分解の後にフローサイトメトリーによって測定することができる。本発明のもう一つの様相は、哺乳動物個体、特にヒトからの生物学的流体、特に血液または血漿における凝固、フィブリン溶解または止血活性の分析の試薬であって、懸濁したまたは支持体に付着した内皮細胞またはこの細胞からの外膜からなるものに関する。本発明のこの様相の態様では、内皮細胞またはその外膜は、生物学的流体を分析しようとする個体と同じ種の個体からのものであり、好ましくは同じ個体からのものであり、最も好ましくは上記分析を行う身体の部分からのものである。もう一つの態様では、内皮細胞またはその外膜は、固相に固定されている。活性表面構造を安定させるため、ポリエチレンエーテルまたは多糖類を内皮細胞のの外膜に共有結合させることができる。本発明の更にもう一つの様相は、哺乳動物個体、特にヒトからの生物学的流体、特に血液または血漿における凝固、フィブリン溶解または止血活性の分析法を行うためのキットであって、凝固試薬として本発明による試薬と、この方法を行うための使用説明書(instructions)とを含んでなる、キットに関する。本発明によれば、失活した（他の普通に用いられる表現では、固定した）、または失活してその支持体から離脱した（他の普通に用いられる表現では、懸濁した）内皮細胞を用いて、生物学的流体、特に血液および血漿の凝固、フィブリン溶解および止血活性を特性決定することができ、かつこれは診断上価値のあるやり方で行うことができ、すなわち循環器疾患を有する個体を正常な個体と区別することができることが示された。生内皮細胞に典型的な機能、例えば排出、エンドサイトーシス、および外膜構造の修飾は、内皮細胞が意義のある診断を可能にする生物学的流体に活性を引き起こすのに必要ではないことは明らかである。このことから、内皮細胞から単離された外膜は、本発明の実施に用いることができることは明らかである。従って、このような外膜の使用は、本発明の精神からの逸脱を表すものではなく、これに関しては、内皮細胞の表面に特徴的な合成的に製造した構造体を考えることもできる。換言すれば、「この細胞の外膜」という表現は広汎に解釈すべきであり、固定した、または固定し懸濁した内皮細胞として生物学的流体、特に血液および血漿で同じまたは類似の活性を引き起こす膜様構造に（合成的にも）到達する総ての試みを包含する。本発明による方法で用いられる固定した内皮細胞は、様々な供給源から得ることができ、また本発明の本来の思想から逸脱することなく様々な方法で調製することができる。内皮細胞は、例えば既知の方法論によって臍帯静脈の内部表面から離脱した培養細胞から得ることができる。胎盤は、軽質転換した内皮細胞の確立した細胞系のような内皮細胞のもう一つの可能な供給源である。固定したまたは固定してその支持体から離脱した内皮細胞の本発明による効果的な調製は必ずしも完全に均質である必要はないことを理解すべきである。本発明による細胞調製の主成分が内皮細胞であることで十分である。生物学的流体を得る個体と同じ種の個体からのものである内皮細胞を選択するのが好ましい。更に好ましくは、内皮細胞は、同じ個体からのものであり、最も好ましくは、本発明による分析を行う身体の部分からのものである。生物学的流体の試料を得るのと同じ個体から内皮細胞を選択すれば、個体の生物学的流体と共に凝固、フィブリン溶解および／または止血活性の障害を発現するこの個体の内皮細胞構造の異常から生じる循環障害を検出することもできる。これらの細胞の培養からの内皮細胞の調製において、これらの細胞が成長している支持体からこれらの細胞を分離して、主として単分散懸濁液を得ることができる。これらの細胞は、例えばクエン酸塩、またはＣａ²⁺イオンと結合する他の物質によって脱離した後、固定することができる。例えば、ＥＤＴＡを用いることによる内皮細胞を脱離する他の方法も、本発明の範囲内にある。これらの細胞を酵素によってその支持体から脱離するときには、細胞を幾らかの時間培養した後、固定して必要な表面構造を再形成することが必要なことがある。細胞の様々な固定法は、先行技術において既に知られていることは確実である。これらの方法は本発明にも適用できるが、本発明による方法では、内皮細胞をホルマリンおよびＳＴＦ（商標）固定溶液の群から選択された物質で失活しまたは固定するのが好ましい。本発明は、細胞を最初に固定した後、その支持体から脱離する場合に限定されない。逆の作用順路が、本発明の範囲内で完全に可能である。凝固、フィブリン溶解または止血活性の特異的分析は本発明によれば可能であるが、凝固抑制またはフィブリン溶解抑制物質を添加することが必要なこともあり、これについては以下に詳細に説明する。凝固抑制物質の好ましい例としては、ヒルジンおよびヘパリンを挙げることができ、フィブリン溶解抑制物質の好ましい例としては、６−アミノ−ヘキサン酸、およびｔＰＡおよびｕＰＡに対する抗体を挙げることができる。本発明による固定した内皮細胞の使用に関してかなり有利な点は、これらを懸濁液、好ましくは水を基剤とする懸濁物の形態をしており、好ましくは市販されている凝固の検出用装置を用いることができるものを用いることができることである。このような装置の例としては、液体または懸濁液と共に操作する凝固装置であって、凝塊形成の検出をほとんどの場合に光度測定法によって行うものを挙げることができる。しかしながら、固定した内皮細胞または外膜と生物学的溶液との間のイン・ビトロでの接触は懸濁液の使用に限定されず、自体既知の他の原理を用いて行うことができる。例えば、好ましくは微量試験プレート型の固相に固定された内皮細胞または外膜を用いて接触させることができる。固相上の固定は、好ましくは、ビオチンを内皮細胞または外膜に結合した後、ビオチン結合物質、好ましくはストレプトアビシンによって固相の表面に結合することによって行うことができる。本発明による方法の更にもう一つの好ましい態様によれば、安定性および均質性が増加した内皮細胞、好ましくは懸濁したものまたは相当する外膜は、内皮細胞をこの細胞の外膜構造に親水性物質を共有結合的に結合する反応性化合物で処理する場合に調製される。このような安定性および均質性が向上する化合物の好ましい例としては、ポリエチレンエーテルおよび多糖類が挙げられる。従って、このような向上した安定性および均質性は、分析が適度に安定な試薬に依存する本発明の種類の方法では極めて重要である。本発明による方法を行うことによって生じる凝固物質は、特に懸濁物中の細胞の使用が関与する場合には、反応混合物の光学的またはレオロジー特性の変化を測定することによって検出するのが好ましい。これは、それぞれ光透過および粘度の変化に関係しているのが好ましい。凝固物質はもう一つの態様によれば、反応混合物と磁場、電場または電磁場との相互作用の変化を測定することによって検出することができる。この方法論は、固相上に固定した細胞で操作するのに特に適している。凝固物質は、特にフィブリンおよび血小板を含んでいるまたはから作られる成分によって検出するのが好ましい。フィブリンの量は、好ましくは、これを、好ましくはプラスミンによる酵素分解によって免疫学的手法によって測定される可溶性分解生成物とすることによって測定することができる。好ましい手法は、Ｄ−二量体断片に特異的な手法である。本発明のもう一つの好ましい態様では、血小板に関連した血小板の量を、例えばフローサイトメトリーによって測定する。これは、凝塊を酵素的に分解してしまった、すなわち溶解した、後に行うことができる。上記のように、本発明の方法は、主として血液および血漿を分析しようとするものであるが、これに限定されることはなく、相当する種類の活性が存在するあらゆる場合に適用することができる。臨床的に実際に有用な分析については、これは、この方法では、予め可逆的に抗凝固した血液または血漿の使用であって、上記のイン・ビトロでの接触に密接に関連して凝固活性状態へ復帰し、これは本発明によれば、固定した内皮細胞またはこれらの相当する活性成分で行われることを示している。一つの好ましい態様は、Ｃａ²⁺イオンと結合する物質、好ましくはクエン酸塩またはＥＤＴＡを用いて抗凝固され、過剰量のＣａ²⁺イオンの添加によって凝固活性状態へ復帰する血液または血漿が関連する。もう一つの興味深い態様では、血液または血漿をヒルジンまたはヘパリン型の凝固抑制物質で抗凝固し、また問題となっている抗凝固物質、好ましくはそれぞれヒルジンの活性を中和する抗体、およびヘパリンを分解して不活性な糖類とするヘパリナーゼの効果を抑制する薬剤を添加することによって凝固活性状態へ復帰することが必要である。臨床試験上の有用性の方法については、少量の試料について操作可能で無ければならないことが更に必要である。本発明による方法は極めて少量の試料で行うことができるので、この要件は本発明の場合に満たされている。本発明の一つ好ましい態様によれば、これは、分析法を１．０ｍｌ未満、好ましくは０．０１〜１．０ｍｌの試料の量について行なわれることを意味している検査室的診断の有用性については、特に大規模では、分析法を余り長時間にすべきではないことが更に要求される。凝固活性は、本発明によれば、１５分未満で測定し、フィブリン溶解および止血活性を９０分以内に測定することができる。本発明は、上記の種類の分析法を行うためのキットであって、上記の内皮細胞またはその外膜を含んでなる凝固試薬と、この方法を行う方法を開示している用説明書とを含んでいることを特徴とする、キットにも関する。発明の詳細な説明本発明を、多数の具体的実施例によって以下に更に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。これらを詳細に提示する前に、用いられる方法および材料の簡単な背景を、以下に示すことにする。今日、血液および血漿の凝固特性の検査室的検出に普通に用いられている方法を、活性化プロトロンビン時間ＡＰＴＴ、プロトロンビン時間ＰＴ、およびプロトロンビン複合体時間ＰＴＫと表す。これらの方法は、血液または血漿の試料と混合することによって凝固させる１または２種類の試薬を用いることに基づいている。反応混合物が凝固する速度が、分析応答を構成する。問題となる時間を、試薬の添加の瞬間から一定の凝塊が形成するまで測定することが多い。これは、反応混合物の光学特性の一定の変化またはレオロジー特性の一定の変化を測定することによって検出される。分析は、クエン酸塩またはＣａ²⁺イオンと結合する他の物質を添加することによって抗凝固する試料について行うことが多く、凝固過程を必要とする。試薬は、試料の凝固能力を回復するＣａ²⁺イオンを含んでいる。抗凝固していない試料を分析する場合には、Ｃａ²⁺イオンは血液試料に十分量に含まれているので、試薬はＣａ²⁺イオンを含む必要はない。ＡＴＰＰ試薬はシリカ粒子を含んでおり、ＰＴおよびＰＴＫ試薬は組織因子調製物を含んでいる。これらの試薬は両方とも、リン脂質を含んでいる。上記の一般に用いられる方法では、循環障害を持たない個体からの血液および血漿は正常の凝固時間を示すが、血友病患者からの試料では、凝固時間が長くなる。栓友病患者からの試料では、ほとんど例外なく、正常の凝固時間を示す。本発明の方法の一様相によれば、循環障害を持たない個体は、正常の凝固時間を示し、血友病の個体は異常なほど長い凝固時間を示すことが多く、栓友病の個体は、多くの場合に異常なほど短い凝固時間を示す。本発明の操作の一態様では、Ｃａ²⁺イオンを含む水溶液に懸濁した固定した内皮細胞からなる試薬が用いられる。この試薬をクエン酸塩で抗凝固した血液または血漿と混合すると、ほとんどの血友病患者について正常より長い凝固時間が得られ、多くの栓友病患者については正常より短い凝固時間が得られる。凝固時間は、血漿の凝固活性の尺度である。同一の方法を用いると、血液、および滑液および流体(liquor)のような他の生物学的流体について、同様に有利な方法で凝固活性を測定することができる。抗凝固した血液、血漿または他の生物学的流体の凝固活性は、本発明の方法の他の態様を用いて分析し、特性決定することもできる。一つのこのような態様によれば、生物学的流体の抗凝固した試料を、小型容器、例えば微量試験プレートのウェルであって、その表面に内皮細胞が固定されているものに加える。抗凝固効果を中和する物質を添加することによって、試料を凝固性状態へ戻したならば、凝固過程を一定時間進行させた後、ヒルジンまたはヘパリンのような凝固抑制物質を添加して凝固過程を停止させる。その後、凝固物質の量を測定する。凝固した物質中のフィブリンの量または血小板の数を測定する。フィブリンの量は、これを酵素によって分解して可溶性分解生成物とした後、免疫学的手法によってこれらの量を測定することによって測定することができる。凝固物質中の血小板の数は、血小板を凝固物質を酵素分解によってこれから遊離した後、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。試料のフィブリン溶解活性がかなりあるときには、分析の前に試料にフィブリン溶解抑制物質を加えることによって、凝固活性の分析の乱れを回避することができることに言及すべきである。反応容器の内部表面の固定された内皮細胞はこの部位で培養することができ、または固定してその支持体から脱離した内皮細胞の調製物からそこに固定することができ、これは本発明の可能性を一層実際的にかつ良好に利用したものである。本発明は、試料溶液のフィブリン溶解活性を分析することもできる。この目的のために、最初に凝固物質を一定時間で形成させる。その後、凝固抑制物質、例えばＥＤＴＡ、ヒルジンまたはヘパリンを添加して反応を停止した後、十分な時間置いて、フィブリン分解生成物の量の増加として試料のフィブリン溶解活性の結果を測定可能なようにする。生物学的流体の試料中のフィブリン溶解活性は不安定であることが指摘されている。これは、抑制活性、特にプラスミノーゲンアクチベーター抑制剤型１（ＰＡＩ−１）によって引き起こされることがあり、特殊な試料収集および試料操作法が必要なことがある。従って、例えば、試料のｐＨを直ちに５．８〜６．０まで減少させ（Ranby et al.,1989,Thromb Haemostas .,62，917-922を参照されたい）、ｔＰＡとＰＡＩ−１との反応を防止することができる。このような酸性化した試料を本発明によって分析するため、十分な量のｐＨ上昇物質を添加して、凝固およびフィブリン溶解過程の妨害を回避することができる。フィブリン溶解活性の正しい評価には、ｐＨを中和した後に上記反応を防止する物質を添加する必要があることもある。このような物質の一例は、ＰＡＩ−１に対する阻止抗体である。本発明の後者の適用と類似している分析法により、止血活性で同定することができる分析応答が可能になる。これにより、凝固活性を最初に一定時間発現させ、凝固活性に比例する一定量の凝固物質を形成した後、凝固抑制物質を添加して凝固過程を停止する。その後、フィブリン溶解活性を十分な時間作用させ、凝固物質の量を測定可能なほど減少させる。次に、残っている凝固物質の量は、凝固およびフィブリン溶解のバランス、すなわち止血活性の尺度を構成する。凝固物質の量を、上記のように、フィブリンの量としておよび／または凝塊関連血小板の数として測定する。本発明の一態様による方法は、主としてＡＰＴＴ、ＰＴおよびＰＴＫの方法による分析の方法と同様にして試料と混合する試薬の使用に基づいている。凝固時間を、これらの方法と同様に記録する。実施例材料臍帯由来のヒト内皮細胞を、臨月胎児(full term foetus)の３０〜４０ｃｍのンから得た。調製の前に、臍帯を、ペニシリンとゲンタマイシンを含む滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に２〜６℃で２４時間以下保存した。調製の際に、臍帯静脈をペニシリンとゲンタマイシンを含む滅菌ＰＢＳ約５０ｍｌで洗浄し、５００ｍｇ／リットルのコラゲナーゼを含む細胞培地Ａ（ダルベッコ最小必須培地(D ulbeccos Minimal Essential Medium)、１％非必須アミノ酸、２％の２００ｍＭＬ−グルタミン、１．２％の１００ｍＭ／２０ＩＵ／ｍｌオキザロ酢酸／インシュリン、１２％のウシ胎児血清、０．１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を満たし、両端をPeans で閉じ、３７℃で１５分間インキュベーションした後、これを２分間揉んだ。２５ｍｌの洗浄液（培地Ａ）を含む臍帯静脈の内容物を５０ｍｌの試験管に移し、これを約５００×ｇで５分間遠心分離して、内皮細胞を沈降させた。上清を捨てて、内皮細胞を培地Ａ１０ｍｌに懸濁した。内皮細胞を、細胞を５００×ｇで５分間遠心分離することによって沈降させた後、上清を捨てて、細胞を培地Ａ５ｍｌに懸濁し、底部表面をゼラチン処理した２３ｃｍ²の細胞培養フラスコに移した。この主培養物を、５％ＣＯ₂を含む雰囲気で３７℃ で２〜４日間インキュベーションした。細胞が集密的細胞単層にまで発育したことを顕微鏡により確認したならば、これらを継代培養した。継代培養は、細胞培地は捨てられ、０．１５ＭＮａＣｌおよび５ｍＭＥＤＴＡに溶解した１０ｇ／リットルの最少量のトリプシンで処理することによって細胞がその支持体から脱離したことを示している。脱離した内皮細胞を培地Ａ１０ｍｌに懸濁し、それぞれ約２３ｃｍ²のゼラチン処理した底部表面を有する２個の細胞培養フラスコに接種した。２〜４日培養して集密的の時点で、細胞を二度目の継代培養をい、それぞれ２３ｃｍ²のゼラチン処理した底部表面を有する４個の細胞培養フラスコに接種した。幾つかの実験では、内皮細胞を、ゼラチン処理した底部表面を有する約５０個の微量試験プレートウェルに接種した。以後ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）と呼ばれるこれらの細胞が２〜４日以内に集密的細胞単層を形成したならば、これを下記の実施例で用いた。細胞培養フラスコおよび微量試験プレートウェルのゼラチン処理は、底部表面を０．２％ゼラチン／水で被覆し、１５分間インキュベーションし、過剰のものを空けて、風乾する方法で行った。実施例１では、懸濁して失活（固定）した内皮細胞であって、一つの細胞培養フラスコ中のＨＵＶＥＣ細胞をＰＢＳで洗浄して、これを、２０ｍＭＴＭ−ＰＥＧを０．０５ｍｌ添加した０．１Ｍ（Ｎａ⁺）クエン酸緩衝液ｐＨ７．３の４ｍｌ中で３７℃で１５分間インキュベーションすることによって、それを成長の支持位置から脱離することによって得た細胞を用いた。実施例４および５では、懸濁して固定した内皮細胞であって、これにビオチンを抱合した細胞を用いた。これらは、１個の２３ｃｍ²の細胞培養フラスコ中でＨＵＶＥＣを、１０５ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２ｍＭＣａＣｌ₂を含む２１ｍＭＨｅｐｅs緩衝液ｐＨ８．２の２ｍｌと共に、ＴＭ−ＰＥＧ０．０５ｍｌおよびＮＨＳ−ビオチン２ｍｇ／ｍｌを０．０５ｍｌを添加すること事により３７℃で３０分間インキュベーションすることによって得た。細胞は、小型の細胞ゴムポリスマンで脱離した。このようにして懸濁した細胞を、４ｍｌのＳＴＦ固定溶液（下記を参照されたい）を添加して室温で３０分間固定し、３回の繰り返し遠心分離および０．１ＭＮａＣｌを含む０．０２ＭＨｅｐｅs緩衝液ｐＨ７．５で再懸濁によって洗浄した。懸濁して固定し、ビオチンと抱合したＨＵＶＥＣを、ストレプトアビジンで処理した微量試験プレートウェル（Labsystems製品９５０２９２９０）の表面に、それぞれのウェルに０．１ＭＮａＣｌを含む０．０２ＭＨｅｐｅｓ緩衝液０．１ｍｌに懸濁し、室温で１８時間インキュベーションした約４，０００個の細胞を添加することによって固定した。実施例２および３では、微量試験プレートウェルで培養したＨＵＶＥＣを使用した。これらをＰＢＳで２回洗浄し、ウェル当たり０．１％ホルマリン／ＰＢＳ０．１ｍｌを添加することによって失活し、室温で１０分間インキュベーションした後、０．２ｍｌＰＢＳで２回繰り返し洗浄した。血漿の試料は、Tomas Lindahl 博士の強い支持により臨床化学実験室、１９９４年６月中に実験室で用いた試薬および装置を用いる日常分析で４時間以内に得た。また、同じ実験室は、既知の止血障害を持たない個体、すなわち健康な（正常な）個体からのクエン酸で抗凝固した試料をも寛大にも供給した。患者および正常個体からのこれらの試料を、使用前最大５か月間−７０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ法、１２４１ＴｉｎｔＥｌｉｚｅＤ−二量体、およびラテックス法、１５０７０７ＭｉｎｕｔｅｘＤ−二量体によるＤ−二量体（フィブリンの分解生成物）の測定試薬は、Biopool AB、Umea、スウェーデンから得た。ｔＰＡ、一本鎖構造を有する組織プラスミノーゲン活性化物質、一本鎖ｔＰＡ、Biopool ABの製品１２２１０１を、０．５Ｍ（Ｎａ⁺）Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ８．５に溶解して、３，０００ＩＵ／ｍｌの濃度とした。ヒルジンである製品５３０００は、American Diagnostics Inc．、グリーンウィッチ、コネチカット州から得た。ヒルジンをＨ₂Ｏに溶解して、１００ＡＴｕ／ｍｌの濃度とした。ヘパリン、注射用１００ＩＵ／ｍｌは、Lφvens化学工場(kemiske fabrik)、バレルップ、デンマークから得た。ジアゾリジニル−尿素、２−ブロモ−２−ニトロ−プロパン−１，３−ジオール、硫酸亜鉛、およびクエン酸塩を含むＳＴＦ（Streck Tissue Fixative）は、 Streck Laboratories Inc.、オマハ、ネブラスカ州、米国から使用準備のできた溶液として得た。ＴＭ−ＰＥＧ（メトキシポリエチレン−グリコール−トレシレート）、製品Ｍ −３０３８は、Sigma Chemical Company、セントルイス、ミズーリ州、米国から得た。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（スルホスクシンイミジル−６−（ビオチアミド）ヘキサノエート）、製品２１３３５は、Ｐｉｅｒｃe，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国から得た。ＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂、Ｈｅｐｅｓ、クエン酸、ホルマリン、および６−アミノ−ヘキサン酸は、高商業品質のものであった。高純度の水は、臨床化学部、Li nkoeping大学病院によって補助されたイオン交換および逆浸透を用いる装置から得た。実施例１本発明は、Quick よる一段階プロトロンビン分析に類似のプロトコールであって、クエン酸塩の抗凝固血漿１容をＣａＣｌ₂を含むトロンボプラスチン試薬１容と混合し、凝固時間を記録することを特徴とする方法で凝固活性の分析の目的で実施した。この実験では、脱脂したウサギ脳組織からの懸濁抽出物からなるBiopool AB、 Umea製の市販のQuick 試薬である５０２２０Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎを用いた。本発明による相当する試薬はＨＵＶＥＣ試薬１であり、１５ｍＭＣａＣｌ₂、３０ｇ／リットルＰＥＧ６０００、３０ｇ／リットルＢＳＡおよび２ｇ／リットルＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．３に懸濁して固定したＨＵＶＥＣ０．２×１０⁶個／ｍｌの細胞を含んでいた。分析は、凝塊形成の光度測定法検出を有する凝固装置Coagulator 4、Behnk Elektronikにより、試料０．１５ｍｌおよび試薬０．１５ｍｌをいずれも温度３７℃で平衡にしたものを用いて行った。下記のクエン酸塩抗凝固試料を分析した。正常個体（ＮＰ）、およびクエン酸塩およびＮａＣｌを含むバルビツール酸塩緩衝液（Tampon pour SPA、Diagnostica Stago、フランコンビル、フランス）で１：２に希釈したＮＰ（ＮＰ５０％）、およびＮＰ１：４（ＮＰ２５％）からのプールされた血漿。更に、下記のものを分析した。ＰＴＫ値が２５％下回る（ＰＴＫ＜２５％）血漿試料、および血栓症患者の血漿試料（ＴＲＢＰ）。１９９４年４月〜５月に臨床化学実験室、Linkoeping大学病院で行った分析によれば、ＰＴＫ値が２５％未満であったビタミンＫ拮抗薬で治療した個体から血漿試料ＰＴＫ＜２５％をプールした。Quick 試薬およびＨＵＶＥＣ−試薬１による分析の結果を下表に示し、結果は凝固時間による優先順位で配置し、凝固時間は秒で括弧内に示した。 Quick 試薬を用いた分析ではＴＲＢＰはＮＰより凝固時間が長く、本発明のＨＵＶＥＣ試薬１による分析ではＴＲＢＰはＮＰより凝固時間が短いと特記することができる。従って、栓友病患者からの血漿試料は、本発明による分析では凝固時間が短縮される。従来の分析では、このようにはならない。希釈した正常血漿並びに他の従来法（ＰＴＫ）による凝固時間の長いプール血漿では、本発明による分析および従来のQuick 法のいずれでも凝固時間は長くなる。しかしながら、本発明による分析は、Quick 試薬を用いる場合よりも一層明確にＰＴＫ＜２５％識別すると思われる。要約すれば、例示した実験では、本発明による分析では、従来の分析よりも栓友病についての適切な診断情報が得られ、少なくとも血友病に関する良好な情報が得られる。確認のために、同じ血栓症の血漿（ＴＲＢＰ）および同じ正常血漿（ＮＰ）のプールを後の機会に、別のＨＵＶＥＣ試薬およびもう一つのトロンボプラスチン試薬の市販製剤（IL Test PT- フィブリノーゲン、製品９７５６７−１０、Inst rumentation Laboratories、ミラノ、イタリア）を用いて分析した。本発明による分析は、ＨＵＶＥＣ試薬２およびＨＵＶＥＣ試薬３であってそれぞれ０．２３ ×１０⁶個および０．４６×１０⁶個／ｍｌの細胞を含む点だけが異なる試薬を用いて、行った。ＨＵＶＥＣ試薬３を用いる実験は、同じ装置経路で２回行った。他の実験の詳細は、上記したものと同一であった。秒で示した凝固時間を有する下記の結果が得られた。これにより、本発明による凝固分析は、従来の分析が診断的効果がない場合に、栓症患者の血漿を正常個体のものと識別することができることが確認された。実施例２病院に属する１０名の患者からのクエン酸塩で抗凝固した血漿に適用して、血栓症の原因に関する検討を行い、１０名の健康な個体、すなわち血栓症に冒されたことのない個体の同じ種類の試料に適用する。分析において、０．１ｍｌの量の試料を、底部表面が固定したＨＵＶＥＣの集密的層で被覆された微量試験プレートウェルに加えた。０．５ＭＣａＣｌ₂の０．０１０ｍｌを加えて反応を開始し、偏心距離１ｍｍおよび２００回転／分の環状偏心運動を有する振盪装置上で攪拌下にて室温で５分間進行させた。反応を、２０ＡＴｕ／ｍｌのヒルジン０．０１０ｍｌを添加して停止した。ウェルからその内容物を取り出して、０．１５ＭＮａＣｌの０．２５ｍｌで３回洗浄した。細胞と結合したフィブリンを、３００ＩＵ／ｍｌのｔＰＡを含むヒト血清０．１ｍｌに溶解し、室温で２０分間作用させた後、血清中のＤ−二量体の量をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｄ−二量体の含量の増加による優先傾位で示した下記の結果が得られた。血栓症患者健康個体Ｄ−二量体(ng/ml) Ｄ−二量体(ng/ml) 75 73 77 78 77 88 83 89 215 99 366 119 577 179 952 193 1849 467 2553 470 これらからの血漿を本発明により分析したところ、内皮細胞と結合したフィブリンの量は、１０名の血栓症患者の内４名では、健康な個体のいずれより高く、３名ではかなり高かった。また、統計分析でも、これらの群が互いに異なる確率が極めて高いことを示した：ｐ＜０．０５、片側ｔ検定による。この実施例による凝固活性の本発明による分析は、この手順の診断上の可能性をいくつか示している。実施例３本発明による凝固活性の定量分析を、実施例２と同じプロトコールでクエン酸塩で抗凝固した７個の血漿試料について行った。これらの試料を、臨床化学実験５月１８日に予め２時間未満で分析した。これらの７個の試料についての結果を、下記にＰＴＫ時間による優先順位で示す。百分率でのＰＴＫ値を、括弧内に示す。本発明によるＤ−二量体。線形回帰分析では、本発明による凝固活性はＰＴＫ時間と良好な負の相関を示し、百分率でのＰＴＫ値と同様に良好な正の相関を示すことが示されている。ＡＰＴＴ時間との負の相関も明らかである。この結果は、本発明による凝固活性が、ＰＴＫおよびＡＰＴＴ分析を用いる診断において、すなわち出血性向を有する個体の同定、および血友病患者の置換治療および経口抗凝固薬（ワルファリン）または皮下抗血栓薬（ヘパリン）を用いる血栓症の予防治療の指導および監視に用いることができることを示している。本発明による分析とＰＴＫおよびＡＰＴＴとの相関は、両者共ＰＴＫとＡＰＴＴとの相関より良好である。これにより、本発明による分析の全体的で包括的な特徴が強調される。実施例４本発明による凝固活性の定量分析であるが、プロトコールが幾つかの細部において実施例３とは異なる分析を、４名の血栓症患者および１名の健康な個体からのクエン酸塩で抗凝固した血漿に適用した。このプロトコールによれば、血漿０ .１０ｍｌを、付着して失活し固定したビオチン−抱合した内皮細胞と共にストレプトアビジンをコーティングした微量試験プレートウェル、またはコントロールとしての、細胞がないことを除いて同様なウェルに加えた。０．１５ＭＣａＣｌ₂の０．０２５ｍｌを添加して凝固反応を開始し、１００ＩＵ／ｍｌのヘパリン０．０２５ｍｌを加えることによって反応を停止した。形成したフィブリンの量を、３０００ＩＵ／ｍｌのｔＰＡ０．０２５ｍｌを添加して、これにより２０分間形成したフィブリンを加工して可溶性の分解生成物とすることによって、定量測定した。これらは、ＥＬＩＳＡによってＤ−二量体として測定された。分析の結果であるｎｇ／ｍｌで表したＤ−二量体を下記に示し、ここでは内皮細胞を含むウェルに対する値を「ＨＵＶＥＣ有り」と表し、コントロールウェルを「ＨＵＶＥＣなし」と表す。差は、「有り−なし」として与えられる。この実施例では、４名の血栓症患者の内の２名（患者３および患者４）が、健康な個体よりも多量の内皮細胞へのフィブリン付着物を示した。血栓症患者１は、フィブリンの付着は顕微鏡的に確認されたが、著しく低いＤ−二量体成長を示した。恐らく、これは、血栓症患者が、プラスミノーゲン活性化物質は高濃度であるが、フィブリンを分解する能力は低いことによると思われる。実施例５本発明によるフィブリン溶解活性の定量分析を、健康な個体からの一連の５個の血漿試料であって少量の濃ｔＰＡ溶液を添加してｔＰＡ活性の最終的添加量が０、０．７３、２．９、１１．７および４６．７ＩＵ／ｍｌとなるようにした試料で説明した。これらのｔＰＡ濃度の高い血漿のうち、０．１０ｍｌを、実施例４に用いたのと同じ種類の内皮細胞が付着した微量試験プレートウェルに加えた。ＣａＣｌ₂の０．０２５ｍｌを加えたところ、７分間で、限定された量のフィブリンが形成した。１００ＩＵ／ｍｌのヘパリン０．０２５ｍｌを添加してフィブリン形成を停止した後、フィブリン溶解反応を更に６０分間継続した。このようにして形成されたフィブリン分解生成物の量をフィブリン溶解活性の尺度として用いて、ＥＬＩＳＡによってウェル内容物中のＤ−二量体として測定した。結果は下記の通りであった。これらの実施例は、本発明による分析を用いてフィブリン溶解活性を分析することができることを示している。高濃度のｔＰＡを含む血漿は、高濃度のＤ−二量体を示している。

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物個体、特にヒトからの生物学的流体、特に血液または血漿中の凝固、フィブリン溶解または止血活性の分析、特に定量分析の方法であって、生物学的流体の試料の一定量をイン・ビトロで、固定されかつ好ましくはその成長の場所から脱離した内皮細胞またはこの細胞の外膜と接触させ、 a) 凝塊形成の速度または一定量の凝塊を形成するのに要する時間を測定し、この速度または凝固時間を正常個体の速度および凝固時間の対照値と比較し、この速度または凝固時間が対照値より短い場合には、生物学的流体の試料は血栓症の性向を有する個体から生じると見なし、またこの速度または凝固時間が対照値より長い場合には、生物学的流体の試料は出血症の性向を有する個体から生じると見なし、または b) 凝固過程を中断して、所定の接触時間中に形成された凝塊の量を測定し、凝塊の量を正常個体の凝塊の量の対照値と比較し、凝塊の量が対照値より小さい場合には、生物学的流体の試料は出血の性向を有する個体から生じると見なし、また凝塊の量が対照値より大きい場合には、この試料は血栓症の性向を有する個体から生じると見なし、または c) 一定時間および追加の一定反応時間おいた後に凝固過程を中断し、続いて溶解した凝固物質の量を測定し、この溶解した凝固物質の量を正常個体の溶解した凝固物質の対照値と比較し、凝固物質の溶解量が対照値より大きい場合には、生物学的流体の試料は出血の性向を有する個体から生じると見なし、また凝固物質の溶解量が対照値より小さい場合には、この生物学的流体は血栓症の性向を有する個体から生じると見なし、または d) 一定時間および追加の一定反応時間おいた後に凝固過程を中断し、続いて凝固物質の残量を測定し、この残留凝塊の量を正常個体の残留凝塊の量の対照値と比較し、残留凝塊の量が対照値より小さい場合には、生物学的流体の試料は出血の性向を有する個体から生じると見なし、また残留凝塊の量が対照値より大きい場合には、この生物学的流体は血栓症の性向を有する個体から生じると見なすことを特徴とする方法。２．上記流体の試料の上記量が、予め可逆的に抗凝固した血液または血漿であって上記のイン・ビトロでの接触に関連して凝固活性状態へ戻ることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。３．上記流体の試料の上記量が、Ｃａ²⁺イオンと結合する物質、好ましくはクエン酸塩またはＥＤＴＡを用いて抗凝固されている血液または血漿であり、その凝固活性状態への復帰は過剰量のＣａ²⁺イオンの添加によって行われることを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の方法。４．上記流体の試料の上記量が、凝固抑制物質、好ましくはヒルジンまたはヘパリンで抗凝固されている血液または血漿であり、また凝固活性状態への復帰は、上記凝固抑制物質の活性を抑制する物質、好ましくはそれぞれヒルジンの活性を中和する抗体およびヘパリナーゼを添加することによって行われることを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の方法。５．分析を、最大１．０ｍｌ、好ましくは０．０１〜１．０ｍｌの生物学的流体の試料の量について行うことを特徴とする、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。６．分析中に、凝固過程を、凝固抑制物質の添加によって中断し、この物質は好ましくはヒルジンおよびヘパリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１項のｂ）、ｃ）またはｄ）に記載の方法。７．分析をフィブリン溶解抑制物質の存在下にて行い、この物質は、好ましくは６−アミノ−ヘキサン酸、およびｔＰＡおよびｕＰＡに対する抗体の群から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１項のａ）またはｂ）に記載の方法。８．凝固物質を、反応混合物の光学的またはレオロジー特性の変化、好ましくは光透過または粘度の変化によって検出することを特徴とする、請求の範囲第１項ａ）に記載の方法。９．凝固物質を、凝固物質のある種の成分または分解生成物、好ましくはフィブリン、フィブリンの分解生成物または血小板を測定することによって検出することを特徴とする、請求の範囲第１項のｂ）、ｃ）またはｄ）に記載の方法。１０．フィブリンの量を、酵素分解により、好ましくはプラスミンを用いて可溶性分解生成物として、これを免疫学的手法によって測定することによって測定することを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の方法。１１．上記の分解生成物を、Ｄ−二量体断片に特異的な免疫学的手法で測定することを特徴とする、請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．凝塊に結合した血小板の量を、凝塊の酵素分解の後に測定することを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の方法。１３。哺乳動物個体、特にヒトからの生物学的流体、特に血液または血漿における凝固、フィブリン溶解または止血活性の分析試薬であって、懸濁したまたは支持体に付着した内皮細胞またはこの細胞からの外膜からなることを特徴とする、試薬。１４．内皮細胞またはその外膜は、生物学的流体を分析しようとする個体と同じ種の個体からのものであり、好ましくは同じ個体からのものであり、最も好ましくは上記分析を行う身体の部分からのものであることを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の試薬。１５．内皮細胞またはその外膜が、固相に固定されていることを特徴とする、請求の範囲第１３項または１４項に記載の試薬。１６．内皮細胞またはその外膜が、ポリエチレンエーテルまたは多糖類に共有結合していることを特徴とする、請求の範囲第１３〜１５項のいずれか１項に記載の試薬。１７．哺乳動物個体、特にヒトからの生物学的流体、特に血液または血漿における凝固、フィブリン溶解または止血活性の分析法を行うためのキットであって、凝固試薬として請求の範囲第１３〜１６項のいずれか１項に記載の試薬と、この方法を行うための使用説明書とを含むことを特徴とする、キット。