CN101317855A - 从抗凝全血生产的自体或同种促凝剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于产生伤口愈合材料的方法，其包括：a)将一体积抗凝全血与沉淀剂混合；b)将a)的混合物温育一段足以产生细胞和特定血浆成分沉淀物和上清液的时间；c)将所述沉淀物与所述上清液分离；d)回收所述上清液，其中所述上清液含有促凝剂；和e)将所述促凝剂与血液或血液衍生物组合以获得凝块。

Description

从抗凝全血生产的自体或同种促凝剂
相关申请的交叉引用
本申请为要求2003年1月27日提交的美国临时申请60/442,974的优先权的非临时申请，该临时申请以其全部内容引入本申请作为参考。
技术领域
本发明涉及从抗凝全血生产速效的自体或同种促凝剂的方法。
背景技术
来源于人或动物血浆的凝血酶是一种有效的血液和血液衍生物(纯化血纤蛋白原、富血小板血浆(PRP)、血小板浓缩物(PC)、贫血小板血浆(PPP))的促凝剂。它作用于血纤蛋白原，将其转化为血纤蛋白，血纤蛋白导致血纤蛋白基质的形成。牛凝血酶(BT)作为止血剂的临床使用是常见的，不过人血浆源凝血酶只被许可与人血浆源血纤蛋白粘合剂，例如TISSEEL
Figure A20081013049900041
血纤蛋白粘合剂(Baxter公司)联合使用作为各种外科操作中的局部止血剂和伤口粘合剂。
牛源凝血酶已经被用作外科处置(surgical setting)中实现临床止血的标准(standard-of-care)数十年。它已经被用作制备溶剂洗涤剂处理的混合人血浆来源的血纤蛋白粘合剂的工具。牛凝血酶也被用于凝血实验室(clotlaboratory)(例如血库)制备的冷沉物和医疗点制备的(point-of-care-prepared)自体或同种富血小板血浆、血小板浓缩物或贫血小板血浆(分别为PRP、PC和PPP)。
与牛凝血酶使用相关的危险包括疾病传播(牛海绵样脑病，BSE)和抗人因子V抗体产生的可能性。尽管文献还没有报道临床应用牛凝血酶引起BSE传播，但已经报道了抗体的产生，其导致凝固时间异常(1-5)。已经报道局部接触经层析法纯化的牛凝血酶后出现人因子V的抑制物(6)。对局部牛凝血酶的接触导致抗多种蛋白和糖抗原的抗体产生。已经报道30％到50％的被接触患者有这些抗体，它们是心磷脂性质以及抗核抗体(7，8)。
由于牛凝血酶的使用所相关的这些问题，已经研究了从患者自身的血(自体)或供体血(同种)制备得到其它的促凝剂。
目前，本发明的发明人生产了一种具有1到5分钟凝固时间的前凝血剂，已证实当它与PRP或PPP合用施用于硬组织移植材料(例如，自体移植、同种异体移植、异种移植和人造的)时是有效的。施用于这些移植材料的组合物导致这些移植材料的固结，这提供了显著改善的操作性能以及简化的对手术缺损部位的转运。获得的这种形式的移植材料可与缺损部位适合并保持稳定。PRP和PC中的某些蛋白的存在也有助于缺损的更快速的愈合。
尽管具有1到5分钟凝固时间的前凝血剂在上述适应征中是有效的，但是它对某些软组织施用可能不是有效的，使得需要一种具有更快凝固时间的非牛促凝剂。实现止血通常需要大约10秒的凝固时间(一般用牛凝血酶)。更长的凝固时间是不太理想的，并且可能在控制毛细血管出血上是不太有效的。
迄今为止，对开发非牛、速效促凝剂的研究已经集中于分离血液的细胞成分，然后应用各种方法从血浆部分中分离蛋白。使用了例如冷沉淀法、物理化学沉淀法、微滤技术的使用、密度梯度技术等方法。已经分离和表征了血浆部分。
另外，也已研究了各种通常已知的沉淀剂，例如聚乙二醇(PEG)、硫酸铵和乙醇。这些试剂中的每一种在分离特定蛋白上都有某些优点，但也导致其它蛋白的部分沉淀。尽管如此，为实现分离方法的最大效率，这些沉淀剂已经被利用并施用于无细胞血浆。
直到最近，主要的焦点已集中在施用于无细胞血浆的各种强度例如10％到25％的乙醇的使用(例如参见美国专利6,274,090，其公开了一种从单个供体的血浆制备稳定的凝血酶成分的方法)。用这种方法制备凝血酶是费时的并需要多个步骤包括在将血浆与乙醇接触之前需要首先从全血制备血浆部分。
虽然某些强度的施用于血浆的乙醇已经提供了改进的凝固时间，例如5到10秒凝固PRP或PPP(美国专利6,274,090)，但是在制备组合物1小时后，凝固时间增加到大于25秒，并且在制备后2小时，凝固时间增加到大于40秒。
因此需要一种制备自体或同种促凝剂的方法，其中所述方法需要少量体积的全血，获得于少于20秒内导致凝块的促凝剂的产生；生产保持活性大于4小时的促凝剂；并且生产要求总制备时间少于60分钟的促凝剂。
发明内容
目前，本发明的发明人已经发现通过去除血浆分离步骤以及通过将沉淀剂直接加入抗凝全血中，得到了一种具有由组合物长时间保持的快速凝固时间的人促凝剂。因此，通过减少从全血中分离血浆部分所需的时间量减少了制备促凝剂所需的总时间。
重要的是，由于去除血浆分离步骤所发生的轻微溶血并没有降低本发明方法所生产的促凝剂的工作效率。而且，不被任何具体的理论所限制，目前认为红细胞的存在实际上可能有助于细胞的凝集和抑制物蛋白的沉淀。
因此，一方面本发明涉及从抗凝全血制备速效促凝剂的快速方法，所述方法包括从供体得到一体积抗凝全血；将所述抗凝全血与沉淀剂混合；温育混合物一段足以使细胞和血浆成分发生沉淀的时间，之后分离沉淀物得到上清液，其中所述上清液含有速效促凝剂。
在相关方面，本发明涉及从抗凝全血制备自体促凝剂的快速方法，所述方法包括从为其制备促凝剂的患者得到一体积抗凝全血；将所述抗凝全血与沉淀剂混合；温育混合物一段足以使细胞和特定的血浆成分发生沉淀的时间，之后分离获得的沉淀物以得到上清液，其中所述上清液含有自体或同种促凝剂。
本发明的方法可按规模来生产各种所需体积的促凝剂以及用从患者或同种供体获得的相对少量体积，约8到10ml的全血生产促凝剂。用抗凝剂例如ACD抗凝全血，ACD任选含有浓度为5-10mg/ml ACD的甘露糖醇。
在另一方面，本发明涉及无需血浆分离而制备自体促凝剂的方法。本发明的方法包括用沉淀剂，例如乙醇直接沉淀抗凝全血，其与先前从全血分离的血浆相反。
在相关方面，本发明涉及由上述方法生产的人血部分，其包含80-90％的凝血酶原-凝血酶蛋白、检测不到量的血纤蛋白原和20-30％基线水平的ATIII、蛋白C和蛋白S。
附图说明
图1是描述五个供体的从经凝血酶激活的血小板浓缩物血样释放的PDGF-AB的水平与血小板计数之间的相关性的图。
图2是描述五个供体的从经凝血酶激活的血小板浓缩物血样释放的TGF-β1的水平与血小板计数之间的相关性的图。
图3-7是描述经牛凝血酶和自体凝血酶激活的五个供体的血小板浓缩物样本的PDGF-AB和TGF-β1的生长因子释放动力学的图。
具体实施方式
将本文所列出的所有专利、申请、出版物或其它参考文献引入本文作为参考。在随后的描述中，关于术语的使用将遵循以下的一些约定：
ACD    枸橼酸-葡萄糖
CaCl2  氯化钙
CPD    枸橼酸盐磷酸盐葡萄糖
EDTA   乙二胺四乙酸
EtOH   酒精，乙醇
PEG    聚乙二醇
PPP    贫血小板血浆
PRP    富血小板血浆
PC     血小板浓缩物
术语“抗凝剂”是指一种能阻止全血凝固的物质。
术语“自体血”是指患者自身的血。
术语“同种血”是指从不同于为其制备促凝剂的个体的血液供体得到的血。
术语“促凝剂”是指一种能导致全血或血液成分(血浆、血小板)形成凝块的物质。
根据本发明分离自体促凝剂的方法学是基于乙醇分级分离的改变。不过，与标准或常用的原材料例如血浆或冷沉淀贫血浆相反，所描述的方法利用了全血样本。因此，本发明的方法包括：
a)从供体得到一体积抗凝全血；
b)将所述抗凝全血与沉淀剂混合；
c)将b)的混合物温育一段足以使细胞和特定的血浆成分发生沉淀的时间；
d)将c)中得到的沉淀物与上清液分离(通常用离心和/或过滤)；和
e)收集上清液，其中所述上清液用作促凝剂。
在一个实施方案中，通过将供体的血取到含有抗凝剂例如枸橼酸-葡萄糖的血液收集管或注射器中而得到少量体积的抗凝全血。在充分但轻轻的混合后，将抗凝全血转移到干净的玻璃或塑料管中，并将一种沉淀剂例如乙醇与抗凝全血混合。在室温下温育所得到的混合物一段足以使血液的细胞和特定的血浆成分发生沉淀的时间，约为20-60分钟。充分的沉淀将通过凝集的细胞和不溶性的蛋白组成的粘性沉淀物的形成来证实。
然后将混合物以1000-3000×g离心约5-30分钟以将沉淀物压缩在管的底部。最后，从管中取出沉淀物上的上清液；上清液为含有所需的促凝剂的混合物部分。
在一个实施方案中，用于制备促凝剂的全血的体积将是小的，例如少到为8到10ml。将血液取到含有非肝素抗凝剂的血液收集管(例如VACUTAINER
Figure A20081013049900081
管)或注射器中。可用于本发明的抗凝剂的实例包括结合或螯合钙离子的抗凝剂，例如枸橼酸盐-磷酸盐-葡萄糖(CPD)或枸橼酸-葡萄糖(ACD)、枸橼酸钠等等。在一般的情况下，优选的抗凝剂是枸橼酸-葡萄糖(ACD)和ACD/甘露糖醇。
一般的沉淀剂将包括例如聚乙二醇、硫酸铵或乙醇，以及如氯化钙或氯化镁这样的成分。
在一个实施方案中，使用乙醇作为沉淀剂。乙醇的终浓度将优选为在10％和25％之间。因此，对于8到10ml体积的起始全血，将1到2ml100％或95％的乙醇加入该全血中。
另外将约0.05到0.4ml的10％氯化钙溶液加入抗凝全血和沉淀剂的混合物中。例如，在一个实施方案中，对于8ml体积的起始抗凝全血，使用1.6ml乙醇和0.1ml 10％氯化钙的混合物。
关于足以使细胞和特定的血浆成分发生沉淀的时间，预期在约5到45分钟内在管中形成沉淀。
在一个实施方案中，可以使用ACD和甘露糖醇的混合物来抗凝起始体积的全血，其中甘露糖醇的浓度为约5-10ml/1ml ACD。
为了举例说明本发明的方法，提供了以下的实施例。
实施例1
利用放射免疫扩散法(RID)进行自体凝血酶中和全血样本中的相关血浆蛋白水平的比较。将全血收集在含有ACD-甘露糖醇抗凝剂的试管中。然后将抗凝全血与2ml 95％乙醇溶液一起温育30分钟。之后在SMARTPREPTM系统(Harvest Technologies，Plymouth，MA)中离心混合物，同时制备了血小板浓缩物。使用血清过滤系统例如血清过滤式分离器(例如Fisher Brand，Fisher Scientific，Rochester，NY)或通过使用注射器吸取上清液将含有凝血酶的上清液与沉淀的细胞和特定的血浆成分分离。
如下制备贫血小板血浆。将来自用于制备自体凝血酶的同一供体的全血收集到ACD抗凝剂溶液(Cytosol Laboratories，Braintree，MA)中。离心血样并得到用于测试的等分血浆。将等分血浆用作用于放射免疫扩散法(RID)分析的基线样本。
如先前的描述制备自体凝血酶(AT)。基本地，将九(9)毫升全血收集到1ml ACD-甘露糖醇抗凝剂(Cytosol Laboratories，Braintree，MA)中。将八(8)ml抗凝血与1.7ml乙醇-氯化钙溶液(Cytosol Laboratories，Braintree，MA)在室温下一起温育30分钟。然后在SMARTPREP
Figure A20081013049900091
2系统中离心混合物。用血清过滤系统将含有自体凝血酶的上清液与沉淀的蛋白和红细胞分离。使用RID分析所得到的上清液。
对14个供体进行所有的RID。分析以下蛋白的水平：蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III、白蛋白、血纤蛋白原、因子XIII。分析PPP样本以得到上述蛋白的基线水平。分析含有AT的AT上清液样本的上述所提及的蛋白的水平以确定乙醇分级分离导致的这些蛋白的去除率。
放射免疫扩散操作
从Binding Site Ltd.(Birmingham UK)得到RID板，并按厂家说明书使用。从箔袋中取出RID板，检查破损并在室温下敞开放置10-15分钟。接着，轻轻地混合校准溶液并根据需要稀释。在测定前以1/10稀释对照和测试样本。在使用前即刻轻轻混合校准、对照和测试样本。
用5μl样本填装所需数目的孔并容许扩散30分钟。对于白蛋白分析，将板在室温下平放至少48小时，对于抗凝血酶III分析为至少72小时，对于因子XIII、蛋白C和S以及血纤蛋白原为至少96小时。从RID参照表中直接读取对应于每个环的直径的样本浓度。
表1和2中显示了研究结果。通过凝固血小板浓缩物来证实自体凝血酶制剂的活性。两种比例的平均凝固时间都在我们的预期范围内。在外面的实验室所分析的三个样本中，制剂中保留了85％的凝血酶原。血纤蛋白原被完全从自体凝血酶制剂中去除。抗凝血酶III，一种凝血酶活化的有效抑制剂，平均减少了79.86±2.6％。剩余的20％抗凝血酶III水平被认为是在临床缺乏(clinical deficiency)的范围内。在另外温育4小时时，ATIII、蛋白C和蛋白S的去除没有增加(数据没有显示)。表1提供了自体凝血酶和制备自体凝血酶的全血样本的血浆中的蛋白C、蛋白S和抗凝血酶III的蛋白水平的比较。表2显示在这些相同的样本中因子XIII、白蛋白和血纤蛋白原的水平。
表1
血浆和自体凝血酶中的蛋白水平
Figure A20081013049900111
*基线水平(即血浆样本)
**自体凝血酶中的水平
***去除的占基线水平的百分比
表2
血浆和自体凝血酶中的蛋白水平
Figure A20081013049900121
*基线水平(即血浆样本)
**自体凝血酶中的水平
***去除的占基线水平的百分比
因此，根据本发明的方法得到的上清液含有80-90％凝血酶原-凝血酶蛋白。在上清液中没有检测到血纤蛋白原，以及只有基线水平的20-30％的ATIII、蛋白C和蛋白S。
上清液中的血红蛋白的测定
大于6％的乙醇浓度可造成全血样本的溶血。如先前所提及的，将甘露糖醇加入抗凝剂中以减少微囊泡的形成并减轻由乙醇引入造成的溶血。
如表3所示，在自体凝血酶制剂中的平均总血红蛋白为69mg。这相应于8％的平均溶血百分比，其对于局部应用是无关紧要的。
表3
Figure A20081013049900131
残余乙醇水平的测定
用经认证的测试实验室(Chemic Laboratories，Canton，MA)测定乙醇百分比(v/v)。测试的产品包括：制备自体凝血酶的全血样本的血浆、自体凝血酶产品和血小板浓缩物凝固后得到的上清液。后一种产品血小板凝胶将含有局部施用后将存在的乙醇水平。
在使用自体凝血酶作为凝固激活剂的血小板浓缩物中形成凝块。获得来自全血的PPP样本、AT上清液和凝块释放物(releastate)样本用于如上所述的测试。对五个供体进行测试。
将0.5ml PC加入12×75mm硼硅玻璃培养管中。用校准的移液管以1∶3或1∶5比例加入AT。来回倾斜试管直到形成结实的凝块。然后离心凝块得到上清液。
由Chemic Laboratories，Canton，Massachusetts进行乙醇分析。结果显示在表4中。在全血样本中观察到的痕量乙醇显然是用于准备静脉取血部位的乙醇的结果。在自体凝血酶和血小板凝胶中测得的水平均在预期的参数内。
表4
自体凝血酶及其产品中存在的乙醇百分比(v/v)
供体#   全血％乙醇   自体凝血酶％乙醇   血小板凝胶％乙醇
  650651652653654   0.000350.000490.00170.00150.00116   1312141312   3.33.153.23.152.75
  均值标准差   0.001040.000600042   12.80.836660027   3.110.21035684
因此，当体外将促凝剂与血小板浓缩物组合产生凝胶时，残余的乙醇水平少于4％。当体内施用于受伤部位时，这一残余浓度将进一步显著地降低。
自体凝血酶激活的血小板浓缩物和贫血小板血浆的凝固时间的比较
进行体外实验室凝固时间研究以证实促凝剂的功效。使用自体凝血酶引发凝血以对血小板浓缩物和贫血小板血浆进行凝固时间的测定。对14个供体进行所有的测试。对凝固时间进行测试两次。进行测试的个体和计时/记录凝固时间的个体独立进行。
在离心后四个时间点进行凝固测试：倾倒和回收AT后即刻的0时间、制备自体凝血酶后的2小时、4小时和6小时。简单地，将0.5ml PC加入12×75mm硼硅玻璃培养管中。用校准的移液管以1∶3或1∶5的比例将AT加入含有PC的试管中。当加入AT时，立即启动计时器。来回倾斜试管直到形成结实的凝块。停止计时器并记录凝固时间。在指定的时间间隔重复该操作。
自体凝血酶激活的血小板浓缩物的凝固时间显示在表5中。
表5
AT激活的血小板浓缩物的凝固时间(秒)
Figure A20081013049900151
*0时间＝制备后即刻
在0时间和6小时时，两个比例的凝固时间没有显著性差异。在2小时(p＝0.004)和4小时(p＝0.013)时，两个比例的凝固时间的差异具有显著性。
更重要的事实为以3∶1的比例，2、4和6小时的凝固时间显著地短于0时间的凝固时间(p＝0.001)。如表6所示，以3∶1的比例，在0时间时28.75％的凝固时间为20秒或更长，仅仅50％为10秒或更短。在其它时间间隔，两个比例的所有的凝固时间都小于20秒：使用3∶1的比例，64-85％的凝固时间为10秒或更短。这与在这些研究中同时进行的观察到的4到6秒的牛凝固时间相比更有利。
表6
自体凝血酶激活的血小板浓缩物的凝固时间的分布
Figure A20081013049900161
尽管自体凝血酶激活的贫血小板血浆的凝固时间的结果稍微更长些，但它与那些用血小板浓缩物得到的结果平行(表7)。在0时间的两个比例之间没有显著性差异(p＝0.695)。以3∶1的比例，在2和4小时的凝固时间显著短于0时间的凝固时间(p＝0.0013)。虽然贫血小板血浆的凝固时间有轻微的重新分布，但凝固时间与血小板浓缩物的凝固时间相似(表8)。
表7
自体凝血酶激活的贫血小板血浆的凝固时间(秒)
表8
自体凝血酶激活的贫血小板血浆的凝固时间的分布
Figure A20081013049900171
凝血酶等价性的测定
血小板浓缩物的凝固时间的比较
利用血小板浓缩物和三个水平的人血纤蛋白原作为评价材料检查与牛凝血酶比较自体凝血酶的效价。如下制备牛凝血酶(BT)。将5.0ml 10％CaCl2溶液注入5000单位冷冻干燥的凝血酶的小瓶中并轻轻倒转。然后将BT连续稀释为1000、500、250、125和62.5单位/ml。随后将BT以1∶10比例加入血小板浓缩物中。
如上所述测定凝固时间。表9比较了范围为466×103/μl到1428×103/μl水平的血小板浓缩物的凝固时间。血小板浓缩物对自体凝血酶的比例为3∶1时，用自体凝血酶获得的平均凝固时间为9.17±1.7秒。用浓度为250单位/ml的牛凝血酶获得相当的平均凝固时间(9.00±1.7秒)。考虑到以10∶1配给(血小板浓缩物比凝血酶)进行的牛凝血酶研究的事实，这表明自体凝血酶与25单位/ml水平的牛凝血酶相当。如表10所示，以5∶1比例的自体凝血酶的凝固时间(10.83秒)在相似的范围内。
表9
使用牛和自体凝血酶激活的血小板浓缩物的凝固时间(秒)
Figure A20081013049900181
不同水平的纯化的人血纤蛋白原的凝固时间
根据使用说明书，使用SMARTPREP
Figure A20081013049900182
2系统如下制备血小板浓缩物(PC)和贫血小板血浆(PPP)。用设有隔片的30ml注射器取出PPP，以留下7ml容积在Plastic Disposable(PD)中，并将取出的PPP转移到50ml试管中。测量总体积。
将血小板重悬于该7ml体积中，转移到标记的50ml试管中，并测量总体积。将0.5ml PC和PPP样本转移到低温小瓶中以进行CBC分析。
通过将5.0ml 10％CaCl2注入5000单位干燥的凝血酶的小瓶中制备所用的牛凝血酶(BT来自Jones Pharma Inc.，Middleton WI)。制备BT的5种稀释液：1000、500、250、125和62.5单位/ml。以1∶10比例将BT加入血纤蛋白原中，其中血纤蛋白原的体积为0.5ml。
如下制备自体凝血酶(BT)。将九(9)ml全血收集到1ml ACD-甘露糖醇抗凝剂中。将八(8)ml抗凝血与1.7ml乙醇-氯化钙溶液一起温育45分钟。然后在SMARTPREP2系统中离心混合物，同时制备了血小板浓缩物。使用分离管将沉淀的蛋白和红细胞与含有凝血酶的上清液分离。以1∶3和1∶5的比例将AT加入血纤蛋白原中。
从Sigma Biologicals(St.Louis，MO)得到干燥形式的人血纤蛋白原，并分析其具有91％的可凝固性(clottable)。测试在蒸馏水中的600、300和150mg/dL三个水平的血纤蛋白原。
用自体凝血酶和牛凝血酶作为凝血起始剂进行血纤蛋白原的凝固时间测定。从9个全血样本制备自体凝血酶。如上述的其它凝固研究一样，进行测试的个体和计时/记录凝固时间的个体独立工作。
血纤蛋白原测试
使用校准的移液管将0.5ml血纤蛋白原转入12×75mm硼硅玻璃培养管中。使用校准的移液管以1∶3或1∶5比例加入AT。当全部体积的AT均加入时，启动计时器。来回倾斜玻璃管直到形成结实的凝块。然后停止计时器并记录凝固时间。用牛凝血酶/CaCl2激活剂代替自体凝血酶重复上述测试。
发现Children’s Hospital和Brigham&Women’s Hospital(Boston，MA)的100个连续外科患者的平均血纤蛋白原水平为268±27mg/dL。血纤蛋白原是一种急性期反应物；在具有慢性临床病况的患者(即慢性静脉或糖尿病性溃疡、关节炎、椎间盘脱出)中，600-800mg/dL水平不是罕见的。这是本研究中选择的血纤蛋白原水平的基础。
如表10所示，使用3∶1和5∶1两个比例的自体凝血酶三个水平的血纤蛋白原的凝固时间均显著长于对血小板浓缩物观察到的凝固时间。这不是意料之外的，因为血小板在体外和体内的凝块形成中均扮演着必不可少的作用(7)。
表10
自体凝血酶激活的不同水平的血纤蛋白原的凝固时间(秒)
Figure A20081013049900201
当用不同的牛凝血酶稀释液评价不同水平的血纤蛋白原的凝固时间时，观察到了这一相同的模式。125单位/ml牛凝血酶激活的600mg/dL水平的血纤蛋白原的凝固时间为13.75±0.9秒，以及300mg/dL时为16.25±3.8秒。这些数值与当用3∶1比例的自体凝血酶凝固600和300mg/dL水平的血纤蛋白原时观察到的结果相似(表11)。
表11
Figure A20081013049900202
使用根据本发明的方法生产的自体凝血酶(AT)的凝固时间(8-12秒)与我们以前使用100单位/ml牛凝血酶(BT)和500单位/ml人凝血酶的研究是等价的。
组织培养物研究
Slater等已证明血小板浓缩物对人胎儿成骨细胞样细胞发挥刺激作用并保持它们的分化功能(10)。也已证明高水平的血小板浓缩物释放物增强人间充质干细胞(hMSC)的增殖(11)。本研究的目的是评价与血小板浓缩物组合的自体凝血酶中的残余乙醇是否抑制培养的人成纤维细胞和hMSC的生长。
在一个共培养系统中，用放置在用人成纤维细胞铺板的培养孔上面的插入物中的自体凝血酶或牛凝血酶凝固血小板浓缩物。培养细胞3天和5天。
将铺板的hMSC与血小板浓缩物释放物一起培养。从由AT或BT激活并温育3天和5天的凝块制得释放物。将释放物直接加入培养基中并与细胞一起培养。
根据使用说明书，用SMARTPREP2系统制备血小板浓缩物。然后将血小板重悬于7ml体积中，将其转移到标记的50ml管中并测量总体积。
将冷冻的人成纤维细胞(Cambrex Corp.，East Rutherford，NJ)解冻并以～3.3×104细胞/孔的密度铺于6孔板中。在补充有MSCGM bullet kit、谷氨酰胺和青霉素/链霉素的基础培养基中培养人间充质干细胞hMSC(Cambrex Corp.，East Rutherford，NJ)，并将其以～3.3×104细胞/孔的密度种植在6孔板中。
如前述制备牛凝血酶(BT)/CaCl2和自体凝血酶(AT)。将BT和AT分别以1∶10和1∶3的比例加入PC中。
在成纤维细胞和hMSC生长的研究中，使用自体凝血酶和牛凝血酶作为凝固激活剂使血小板浓缩物形成凝块。将供给培养的成纤维细胞的混合物温育3、5和7天，而将施用给hMSC的混合物温育2小时以及3和5天。对照由在上面的培养基空插入物组成。
通过血小板凝胶插入物将凝块释放物供给成纤维细胞。通过离心含有凝块的试管并将释放物直接施用到hMSC上将凝块释放物供给hMSC。
为如下每种混合物准备6个无菌管：
1.血小板浓缩物和牛凝血酶；
2.血小板浓缩物和自体凝血酶；和
3.血小板浓缩物和自体前凝血剂。
向培养板的每个孔中加入2ml新鲜培养基。制备自体凝血酶、牛凝血酶或自体前凝血剂的膜插入物，使其凝固并将其放置在含有成纤维细胞的孔的上面。对照用在上面的空插入物和培养基制备。然后向每个插入物的上面加入1.5ml预加温的培养基。在37℃5％CO2下培养培养物48小时。
在培养开始时，取出其中每种插入物的一个并将细胞拍照。在第5天，取出全部插入物并将细胞拍照。重复测试，将所有插入物培养3、5或7天，每次都取出插入物检查并拍照细胞的外观。
人间充质干细胞培养
将细胞种植于培养板后，容许细胞粘附大约2.5小时。将PC-激活剂混合物温育2小时。从培养物中吸取旧培养基，并将含有10％AT-PC释放物或10％BT-PC释放物的新鲜预加温培养基直接加入细胞中。48小时后，检查培养板并拍照。用3和5天的释放物重复测试。
与对照细胞相比，用AT或BT制备的凝块培养的人成纤维细胞看起来全部很健康并生长很好(数据没有显示)。与对照细胞相比，用AT和BT的释放物培养的hMSC外观看起来很健康并生长很好。
还使用与AT和BT两种促凝剂与血小板浓缩物混合后的凝块上清液一起培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行组织培养物研究。接触测试混合物1小时，对照或处理组之间的细胞形态或密度没有变化。剩下与BT上清液接触24小时的培养物表现为具有致密核的圆细胞。AT处理的物质的细胞形态与对照相似。
生长因子释放动力学
血小板在伤口愈合中具有双重作用。它们参与实现止血的凝固过程，并且是它们释放的启动伤口愈合级联反应的生长因子的储库。尽管生长因子非常有效，但是当它们被注射或摄取时，很快降解。因此，来自血小板凝胶的生长因子以持续方式的控释是本发明在伤口愈合中的重要部分。
为释放血小板α颗粒的生长因子，必需使用激活剂。下面的研究中所利用的方法与那些临床上用于产生血小板凝胶的方法一致，并接近地模拟了体内发生的过程。目前，通过将血小板浓缩物与牛凝血酶/氯化钙混合物混合来启动生长因子的释放。这个研究比较了牛凝血酶和自体凝血酶的释放动力学。通过收集接触激活剂、牛凝血酶和自体凝血酶的血小板浓缩物形成的凝块(血小板凝胶)析出(express)的上清液测定释放动力学。在制备血小板凝胶后1、2和4小时以及此后的每天共6天离心后收集上清液。将上清液储存于-80℃下直到检测。用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)测定生长因子(人血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB))的水平。
如下制备血小板浓缩物和贫血小板血浆。用60ml注射器获取全血。根据使用说明书，用SMARTPREP
Figure A20081013049900231
2系统制备血小板浓缩物(PC)和贫血小板血浆(PPP)。将血小板重悬于10ml血浆中，并将浓缩物转移到标记的50ml小瓶中。将0.5ml PC和PPP样本转移到低温小瓶中以用于CBC分析。
如上所述制备牛凝血酶(BT)，并以1000单位/ml的稀释液使用。将BT以1∶10比例加入PC中。如上所述制备自体凝血酶(AT)并以1∶3比例将其加入PC中。
使用自体凝血酶和牛凝血酶作为凝固激活剂，在PC中形成凝块。对已经温育1、2、4小时以及此后每天共6天时间的凝块析出的上清液进行检测。测试所有样本的PDGF-AB生长因子的水平。如下所有测试进行两次。
用校准的移液管将1.0ml PC转移到硼硅玻璃培养管中。然后使用以1∶10比例添加的BT或以1∶3比例添加的AT使样本凝固。一旦将激活剂加入PC中，在室温下温育凝块一段指定的时间。温育结束时，用H4000转子的Sorval RC3C离心机(Sorvall Instruments，Newton，CT)2500rpm离心凝块10分钟。取出上清液，测量其体积，并将其转移到低温小瓶中，储存于-80℃下直到检测。
在1、2和4小时以及之后每天共6天时间进行以上操作。根据使用说明书，使用用ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)得到的测量计算出所有时间点的生长因子的浓度。
与在所有的生物学模型中一样，血小板浓度、血小板产量和生长因子释放具有个体变异。下面的数据显示激活剂激活的血小板生长因子的释放存在一定程度的变异性。无论激活剂是牛凝血酶、ADP或自体凝血酶，这种变异性均存在。图3到图7显示用牛凝血酶和自体凝血酶激活的五个供体的血小板浓缩物血样的生长因子的体外释放动力学(PDGF-AB和TGF-β1)。
在这一体外测试模型中，用牛凝血酶，生长因子完全释放发生在凝块形成后的最初4小时内，之后在7天时间内其水平逐渐降低。用自体凝血酶，生长因子释放逐渐增加，在48到72小时后达到最高水平。取决于生长因子，这些最高水平最少达到用牛凝血酶时所看到的生长因子水平的80％，或超过用牛凝血酶时的最高生长因子水平。
以前，我们已证明血小板数目和生长因子水平之间正相关(8)。在本研究中，将血小板浓缩物悬浮于10ml中。临床上，自体凝血酶将与悬浮于7ml中的血小板浓缩物一起使用。这将增加这些血小板浓缩物所释放的生长因子水平～30％。
已报道注射的生长因子的体内半衰期为数分钟，因此持续缓慢增加将是更为有利的(9)。用自体凝血酶，生长因子的释放动力学支持缓慢持续增加。牛凝血酶使生长因子立即释放，没有随时间的进一步增加。
因此，本发明的方法提供一种系统，其提供能应用于临床的生长因子的缓释。为测定释放动力学，通过在凝固后的规定时间收集BT或AT与相同的血小板浓缩物形成的凝块的上清液测定生长因子。BT应用于血小板浓缩物导致生长因子的立即释放；并且在5天的观察时间内没有进一步的增加。使用AT的生长因子释放的动力学表明在应用4小时内有20-30％的释放，并且有每天都增加的释放，在应用后5天达到最高。
为便于容易地应用所公开的速效非牛促凝剂的制备方法，可以将各种试剂和所需的医疗器械包装并作为完备的试剂盒提供。
用于实践本发明的方法的试剂盒的一个实施方案可以包含：
·带有塞子的玻璃或塑料管
·血清过滤系统，例如血清分离器装置、适用于从沉淀物中吸取上清液的钝头管或移液管系统
·带钝针头的3ml注射器
·带钝针头的10ml注射器
·含有ACD或ACD/甘露糖醇的小瓶
·含有EtOH/CaCl2的小瓶
·TrayPakTM和说明书。
因此，本发明提供了具有以下特征的自体或同种促凝剂的制备方法：
1.其可以从全血样本制备；
2.可以在室温下进行用于制备方法的温育；
3.该方法可使用SMARTPREP系统同时制备血小板浓缩物或作为独立的操作制备；
4.全血和沉淀物的温育时间为45分钟或更短；
5.获得的自体促凝剂制剂在临床可接受的时间内足够强地凝固血小板浓缩物或贫血小板血浆；
6.可通过各种技术或装置将自体促凝剂连同血小板浓缩物或贫血小板血浆一起传输；
7.本发明的自体促凝剂可被直接应用于伤口创面。
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Claims (19)

1.用于产生伤口愈合材料的方法，其包括：
a)将一体积抗凝全血与沉淀剂混合；
b)将a)的混合物温育一段足以产生细胞和特定血浆成分沉淀物和上清液的时间；
c)将所述沉淀物与所述上清液分离；和
d)回收所述上清液，其中所述上清液含有促凝剂；和
e)将所述促凝剂与血液或血液衍生物组合以获得凝块。
2.权利要求1的方法，其中所述抗凝全血的体积为8至10ml。
3.权利要求1的方法，其中所述全血用选自枸橼酸葡萄糖(ACD)、ACD/甘露糖醇、枸橼酸盐磷酸盐葡萄糖(CPD)和乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝剂抗凝。
4.权利要求3的方法，其中所述全血用枸橼酸-葡萄糖抗凝。
5.权利要求3的方法，其中所述全血用ACD/甘露糖醇抗凝。
6.权利要求5的方法，其中所述甘露糖醇以7.5mg/ml ACD的浓度存在。
7.权利要求1的方法，其中所述沉淀剂为乙醇。
8.权利要求7的方法，其中使用的所述乙醇的起始浓度为约10％至100％。
9.权利要求8的方法，其中使用的所述乙醇的起始浓度为约25％至95％。
10.权利要求9的方法，其中使用的所述乙醇的起始浓度为约50％至95％。
11.权利要求1的方法，其中所述沉淀剂是乙醇和氯化钙的混合物。
12.权利要求1的方法，其中所述温育步骤需要少于45分钟。
13.权利要求1的方法，其中所述温育步骤需要少于30分钟。
14.权利要求1的方法，其中制备的所述促凝剂为自体的。
15.权利要求1的方法，其中制备的所述促凝剂为同种的。
16.权利要求1的方法，其中所述分离步骤通过离心所述混合物来完成。
17.权利要求1的方法，其中所述分离步骤通过过滤所述混合物来完成。
18.权利要求1的方法，其中所述分离步骤通过离心和过滤所述混合物的组合来完成。
19.权利要求1的方法，其中所述血液衍生物选自血小板浓缩物(PC)、富血小板血浆(PRP)、贫血小板血浆(PPP)、纯化血纤蛋白原或它们的混合物以获得伤口愈合组合物。
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