EA000673B1

EA000673B1 - Анализ крови на соотношение активности фактора v для оценки вероятности заболевания тромбоэмболией

Info

Publication number: EA000673B1
Application number: EA199800493A
Authority: EA
Inventors: Йэйл С. Аркел; Дехью Вэйн Ку
Original assignee: Эй Эйч Эс Хоспитал Корп.
Priority date: 1995-11-30
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 2000-02-28
Also published as: IL124662A0; DE69630808D1; IL124662A; AR004826A1; EP0873418A1; CA2238814A1; MX9804305A; WO1997020066A1; EP0873418B1; US5766869A; EA199800493A1; PL327006A1; AU1055697A; ATE254666T1

Description

Предпосылки изобретения

1. Область техники

Данное изобретение относится к диагностическому анализу крови.

2. Краткое описание предпосылок изобретения.

Свертывание крови зависит от сложной системы взаимосвязанных ферментов, проферментов и кофакторов, именуемой коагулирующей системой, которая действует на поверхности эндотелиальных клеток и тромбоцитов, активируемых в результате повреждения. При отсутствии такой активации указанные факторы крови находятся в динамическом равновесии, не позволяющем фибриногену растворимой фракции крови образовывать фибрин, который в результате поперечного связывания вызывает образование нерастворимого тромба. Коагулирующая система, ее составляющие и их взаимодействие подробно рассмотрены Стефаном Розеном в патенте США № 5439802, выданном 8 августа 1995 г. Любое нарушение баланса в этой системе у чувствительного субъекта приводит к неостанавливаемому кровотечению (гемофилия) или спонтанному образованию тромбов (тромбофилия).

Последние исследования, проведенные несколькими группами ученых, позволили выявить наследственную тромбофилию, отличительной особенностью которой является плохая антикоагулянтная реакция на экзогенный активированный белок С (АРС). Бьорн Даглбэк недавно опубликовал статью, посвященную этой научной работе (Bjorn Dahlback, Journal of Laboratory Clinical Medicine, т. 125 (1995), стр. 566571). Причиной такой аномальной устойчивости к АРС является нарушение взаимодействия между АРС и фактором V в кровотоке. Фактор V, в нормальной и активированной формах, является основной частью механизма свертывания крови. Активированный белок С расщепляет молекулы активированного фактора V, разрушая их коагулянтную активность, и таким образом помогает сохранить баланс между коагулянтным и антикоагулянтным действием в нормальных, неповрежденных кровеносных сосудах. Субъекты, у которых фактор V устойчив к расщеплению под действием АРС, страдают образованием тромбов в неповрежденных кровеносных сосудах, т.е. тромбоэмболией. В вышеуказанной статье рассматривается также процесс создания методики анализа крови, позволяющего обнаружить этот дефект.

При исследовании крови здоровых субъектов с помощью анализа на время образования и активности тромбопластина (АРТТ) его продолжительность увеличивается при экзогенном введении АРС, т.к. наряду с другими факторами АРС расщепляет активированный фактор V (фактор Va), разрушая его коагулянтную активность. Установлено, что у многих субъектов, страдающих тромбофилией, молекула фактора

Va имеет генетический дефект, который делает ее устойчивой к расщеплению под действием АРС. Этот генетический дефект определяется как дефект фактора V Лейдена (FVL). Причиной этого дефекта является мутация гена фактора V, в результате которой Аrg506 заменяется Gln в белке этого фактора. Известно, что этот дефект имеет примерно один из двадцати человек кавказского типа в Европе и Северной Америке. Он обнаружен у 25-50% субъектов, страдающих венозной тромбоэмболией.

Кроме того, Даглбэк описывает методику анализа на устойчивость к АРС, исходя из неспособности АРС продлевать время образования сгустков при выполнении анализа АРТТ. Индикатором этого метода является соотношение между временем свертывания, измеряемое в процессе анализа АРТТ при наличии или отсутствии АРС в свертывающейся пробе. Этот анализ определяется как анализ APCR.

Установлено, что вероятность мутации FVL у субъектов с положительной реакцией на анализ APCR, равна 94% у людей, страдающих тромбофилией. Из-за отсутствия полной корреляции между анализом коагулирующей активности APCR на устойчивость к АРС и мутацией FVL сделано предположение о том, что могут иметь место другие механизмы, определяющие устойчивость к АРС. На результаты анализа коагулирующей активности влияет наличие антител ингибитора волчанки (LI), при этом полученные результаты устойчивости к АРС позволяют сделать вывод об индуцированной устойчивости под действием антител LI или, возможно, неспецифического воздействия антител LI на фосфолипидзависимые анализы коагулирующей активности (т.е. анализы АРТТ). В недавно опубликованной работе (Tosetto et al., Thrombosis and Haemostasis, т. 73 (1995), стр. 732-733) указывают, что введение плазмы, не содержащей фактор V, в тест-систему АРТТ позволяет в значительной степени устранить вышеуказанные расхождения, благодаря чему результаты анализа более точно указывают на наличие мутации FVL.

Dzung The Le, et al.(Blood, т. 85, № 7 (1995), стр. 1704-1711) описывают метод определения устойчивости к АРС, в основе которого лежит анализ тканевого фактора, специально предназначенный для измерения коагулянтной активности фактора V. В соответствии с этим анализом (рассмотренным в патенте США № 5169786, выданном 8 декабря 1992 г.) разбавленную анализируемую плазму инкубируют с плазмой, не содержащей фактор V, и с тканевым фактором, содержащим тромбопластин. Затем одинаковые пробы (аликвоты) коагулируют, добавляя Са²⁺ или Са²⁺ и АРС. Ли определяет разницу между временем свертывания в ряде анализов в зависимости от степени разбавления плазмы и в результате тщательно выполненного анализа выявляет субъектов с положительной и отрицательной реакцией на FVL. Полученные им результаты практически не зависели от антикоагулянтной обработки или от наличия антител LI. Однако по-прежнему необходим анализ, который прост в выполнении и отличается более высокой чувствительностью и специфичностью в отношении обнаружения дефекта FVL.

Краткое изложение существа изобретения

Рассматриваемый анализ крови на соотношение активности фактора V (FVR) позволяет выявить субъектов, имеющих конкретный генетический дефект, известный как дефект фактора

V Лейдена, другие генетические дефекты фактора V или приобретенный дефект молекулы фактора V, который вызывает возникновение венозной тромбоэмболии. При выполнении этого анализа активность фактора V в пробе плазмы крови под воздействием активированного белка С (АРС) сравнивают с активностью фактора V в аналогичной пробе без АРС после обработки обеих проб активирующим агентом. Соотношение между уровнем активности фактора V без АРС и уровнем активности фактора

V с АРС позволяет выявить субъектов с дефектом фактора V, а также с гетерозиготным и гомозиготным дефектом. Антикоагулянтная терапия назначается субъектам с дефектом фактора

V во время подготовки к хирургической операции, перед родами или в других ситуациях, представляющих опасность для сердечнососудистой системы. Рассматриваемые наборы для анализа крови представляют собой комплекты реагентов, специально стандартизированных и нормализованных для выполнения анализа FVR по методу определения коагулирующей активности или хромогенному методу с целью выявления субъектов с возможными тромботическими нарушениями из-за дефекта фактора V.

Используемые ранее анализы, предназначенные для выявления субъектов с повышенным риском заболевания тромбоэмболией, были чувствительны к антикоагулянтной обработке и присутствию антител ингибитора волчанки и/или антикардиолипина. Мы решили эту проблему путем создания метода определения активности фактора V с использованием тканевого фактора. Этот анализ можно легко и экономично выполнять в клинической лаборатории по исследованию свертывания крови. Результаты нового анализа, т.е. анализа на соотношение активности фактора V (FVR), выражают в виде соотношения активности фактора V без АРС и активности фактора V при добавлении АРС. Активность фактора V в каждой пробе можно определить путем измерения времени свертывания посредством стандартного анализа коагулирующей активности или на основании изменения цвета, вызываемого ферментативной активностью фактора V, в соответствии со стандартным хромогенным методом. Созданный нами метод отличается от метода на основе фактора

V, описанного Ли и др. (Blood, т. 85 (1995), стр. 1704-1711), тем, что в свой анализ FVR мы включили начальную стадию инкубации анализируемой плазмы с фосфолипидом контактным активатором, таким как коммерческий реагент аРТТ, которая предшествует измерению активности фактора V. Благодаря этому достигается 100% специфичность и чувствительность этого метода в отношении к обнаружению мутации фактора V.

Кроме того, мы сравниваем чувствительность и специфичность анализа FVR по настоящему изобретению с двумя методами определения времени образования и активности тромбопластина, APCR и АРСМ. Анализ APCR является методом, описанным Даглбэком и др., который выполняют с помощью коммерческого набора Coatest (Chromogenix, Inc.). Анализ АРСМ является методом на основе аРТТ с введением в тест-систему плазмы, не содержащей фактор V. Полученные данные показывают, что новый анализ FVR по настоящему изобретению обладает 100% специфичностью в отношении обнаружения мутации FVL.

В отличие от этого анализы APCR и АРСМ характеризуются наложением результатов, полученных для здоровых субъектов и субъектов, имеющих дефект фактора V. Кроме того, они не позволяют с высокой точностью выявлять субъектов с гомозиготным и гетерозиготным дефектами. Помимо того, сравнение с анализами фактора V на основе тканевого фактора без фосфолипида показывает, что анализ FVR по настоящему изобретению является более чувствительным и специфичным в отношении обнаружения дефекта фактора V. Выражение результатов анализа в виде соотношения активности фактора V устраняет многие проблемы, а первоначальная обработка фосфолипидом повышает чувствительность метода, активизируя фактор V по сравнению с фактором Va и увеличивая разрушение фактора Va под действием АРС. На анализ FVR не оказывает влияния антикоагулянтная обработка или присутствие антител антикардиолипина или ингибитора волчанки. У обследованных субъектов результаты анализа FVR полностью коррелируют с результатами генетического исследования на наличие дефекта FVL, что позволяет точно определить субъектов с гомозиготными и гетерозиготными дефектами. Кроме того, в соответствии с методом по настоящему изобретению можно выявить субъектов с другими наследственными дефектами фактора V или с приобретенными дефектами молекулы фактора V.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображена карта результатов измерения соотношений АРС по методам АРСМ, APCR и соотношений активности фактора V по методу FVR у 110 обследованных субъектов. В каждой колонке аббревиатурой NEP обозначено количество неучтенных проб из-за возникновения состояния, определяемого как отсутствие конечной точки свертывания, и пунктирной линией отмечен более низкий контрольный диапазон результатов анализа при исследовании плазмы 25 нормальных контрольных субъектов.

На фиг. 2 изображена карта результатов измерения соотношений активности фактора V по методу FVR и соотношений АРС по методам АРСМ и APCR в плазме субъектов, принимавших кумадин или гепарин, субъектов с положительной реакцией на антитела ингибитора волчанки антикардиолипина и субъектов с положительной реакцией на антитела антикардиолипина, принимавших кумадин и/или гепарин. Результаты каждого анализа указаны отдельно для субъектов с нормальным фактором V(FVL(-)) и для субъектов с дефектом фактора V Лейдена (FVL(+)).

Подробное описание изобретения

Обследуемые субъекты и применяемые методы.

Пробы плазмы, используемые в исследовании, получены у субъектов, направленных в Центр нарушений свертывания крови и диагностический стационар в г. Саммит, шт. НьюДжерси, для диагностики тромботических нарушений, или у субъектов, генетически предрасположенных к тромбоэмболии. Семь дополнительных проб плазмы, взятых у субъектов с дефектом FVL, обнаруженным посредством генетического исследования с помощью полимеразной реакции синтеза цепи (PCR), получены из Объединенной справочной лаборатории Питсбурга (Pittsburg Reference Alliance Laboratory). Контрольные пробы получены у 25 субъектов с отрицательной реакцией на FVL, установленной посредством полимеразной реакции синтеза цепи. Это здоровые люди, никогда не страдавшие тромбоэмболией. Данное исследование проведено в общей сложности на 110 субъектах, обследованных на наличие дефекта FVL по методу PCR. Пятьдесят девять из 110 (54%) субъектов страдали венозной тромбоэмболией. У девятнадцати из 59 субъектов (32%) получена положительная реакция на PVL, т.е. они имели дефект фактора V Лейдена. Семь из 19 субъектов принимали кумадин, один из 19 принимал гепарин и трое из 19 принимали как кумадин, так и гепарин. Из 110 субъектов 19 имели положительную реакцию на антитела ингибитора волчанки (LI) и/или антикардиолипина (ACL) и отрицательную реакцию на FVL (нормальный фактор V). Пять из 110 субъектов имели положительную реакцию на антитела LI/ACL и дефект FVL (положительная реакция на FVL). Один из пяти субъектов принимал кумадин и гепарин в качестве антикоагулянтной терапии. Девятнадцать из 110 субъектов принимали кумадин и имели отрицательную реакцию на FVL. Пять из 110 субъектов имели отрицательную реакцию на FVL и принимали гепарин.

Двое из 110 субъектов имели отрицательную реакцию на FVL и принимали как кумадин, так и гепарин.

Реагенты.

Активированный белок С (АРС) человека предоставлен фирмой Enzyme Research Laboratories, Саут-Бенд, шт. Индиана. Реагент Automated APTT™ (фосфолипид мозга кролика с тонкоизмельченным силикагелем в качестве активатора), CaCl2 (0,023 м/л), плазма без фактора V и Simplastin EXCEL™ предоставлены фирмой Organon Teknica, Дарем, шт. Северная Каролина. Набор Coatest APCkit™ предоставлен фирмой Chromogenix, Швеция. Реагент Pathromtin™ APTT (липидный экстракт из плаценты с каолином в качестве активирующего агента) и раствор каолина (5 г/л каолина в солевом растворе) предоставлены фирмой Behring Diagnostic Inc. Лизат тромбоцитов предоставлен фирмой America Diagnostic Company. Реагент SynthASIL™ aPTT (синтетический фосфолипид с силикагелем в качестве активатора) предоставлен фирмой Hemoliance Corp., Раритан, шт. Нью-Джерси.

Методы.

Пробы плазмы всех обследуемых и контрольных субъектов анализировали тремя методами с целью определения устойчивости к АРС. Двумя методами являются анализы на основе системы aPTT (APCR и АРСМ) и третьим методом является анализ FVR на основе измерения соотношения коагулянтной активности фактора V при использовании тканевого фактора.

Два метода, определяемые как APCR (т.е. на основе соотношения АРС) и АРСМ (т.е. модифицированный метод на основе соотношения АРС), представляют собой анализ аРТТ, при выполнении которого используют фосфолипид контактный активатор и осуществляют коагуляцию путем добавления СаШ₂ или CaCl₂ вместе с АРС. При выполнении этого анализа используют стандартные тест-наборы, выпускаемые промышленностью, например, такие как Chromogenix Coatest™. Результатом анализа является соотношение времени свертывания при наличии или отсутствии АРС. Соотношение между плазмой и разбавителем в анализируемых пробах плазмы не имеет критического значения. Время свертывания зависит от концентрации. Чем ниже концентрация плазмы, тем продолжительнее время свертывания. Это свойство использовано для регулирования времени свертывания в соответствии с рекомендуемым рабочим диапазоном используемого прибора. Прибор стандартизирован при выбранной концентрации объединенной нормальной плазмы или плазмы контрольной группы здоровых субъектов.

При выполнении метода АРСМ плазму, не содержащую фактор V, добавляют в количестве, которое по крайней мере равно анализируемой плазме, чтобы увеличить специфичность анализа в отношении выявления субъектов с различ7 ной активностью фактора V под воздействием АРС. Этот метод разработан Тозетто и др. (см. приведенную выше ссылку).

В соответствии с описываемым здесь новым методом анализируемую плазму сначала инкубируют с реагентом, содержащим фосфолипид и контактный активатор, такой как тонкоизмельченный силикагель или каолин. Фосфолипид необходимо использовать в количестве от 0,25 до 75 микрограммов на 100 микролитровую порцию. Можно использовать другие контактные активаторы, такие как целит и эллаговая кислота. Приемлемыми фосфолипидами являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. Эти соединения могут быть натуральными или синтетическими. После добавления АРС к одной или двум аликвотам анализируемой плазмы и инкубации указанных двух аликвот измеряют коагулянтную активность фактора V в обеих пробах. После этого высчитывают соотношение коагулянтной активности фактора V в двух анализируемых пробах, нормализованных относительно активности фактора V в объединенной нормальной плазме, и используют полученный результат в качестве индикатора анализа. Результаты анализа определяют на основании времени свертывания, при этом свертывание инициируют путем добавления CaCl₂ в присутствии плазмы, не содержащей фактор V, и тромбопластина. Можно использовать альтернативные хромогенные анализы, которые позволяют обнаружить ферментативную активность фактора V в зависимости от коагуляции. В основе этих анализов лежит изменение цвета, происходящее в результате взаимодействия хромогенного субстрата с серинпротеазой, такой как тромбин или фактор Ха, образуемой коагулирующей системой. Такой хромогенный метод можно также использовать при выполнении анализа FVR. В этом случае добавляют хромогенный субстрат и тромбопластин без CaCl₂. Тромбопластин инициирует химические реакции свертывания под действием внешних факторов, в осуществлении которых участвует фактор V. В результате этих химических реакций образуются соединения серинпротеазы, которые взаимодействуют с хромогенным субстратом (например, с одним из хромогенных субстратов серии Immunochrome фирмы ImmunoAG Вена, Австрия), который специально предназначен для взаимодействия с одним из таких соединений.

Аппаратура.

Для измерения времени свертывания и хромогенного изменения цвета при выполнении анализа FVR используют приборы, которыми обычно оборудованы больничные лаборатории. Таким образом, рассматриваемый здесь анализ FVR можно легко и без особых затрат включить в программу анализов на гемостаз, выполняемых в больнице. Приведенные ниже результаты анализов получены с использованием следующих приборов: Behring Fibrintimer фирмы Behring Diagnostics, Inc., Сан-Хосе, шт. Калифорния, и автоматическая коагуляционная лаборатория ACL3000+ фирмы Instrumentation Laboratories, Лексингтон, шт. Массачусетс. Прибор Behring Fibrintimer служит для измерения степени коагуляции. Прибор ACL3000+ предназначен для измерения времени коагуляции, при этом он имеет специальные средства для измерения хромогенного изменения цвета. Все приборы для анализа крови поставляются фирмамиизготовителями с подробным описанием процедур стандартизации и нормализации.

Для выполнения анализов крови необходимо несколько реагентов. Хотя эти реагенты можно приобрести по отдельности, обычно их покупают в виде набора (комплект реагентов), предназначенного для каждого анализа, у одного производителя реагентов. Производитель приводит концентрации реагентов в соответствие с требованиями определенного анализа и представляет параметры, кривые и указания, необходимые для стандартизации результатов анализа. Фирмы-изготовители приборов и производители реагентов сотрудничают друг с другом, что гарантирует полное соответствие тестнаборов и приборов для выполнения анализов установленным требованиям лицензирования.

Подробное описание методов

I. Анализ FVR.

Анализы FVR выполняли в приборе, именуемом автоматическая коагуляционная лаборатория ACL 3000+. При осуществлении этого метода данные, полученные при анализе проб, взятых у обследуемых субъектов, сравнивали со стандартной кривой. Для этих анализов использовали реагент Simplastin Excel™ и плазму, не содержащую фактор V, фирмы Organon Teknika. Для нормализации использовали контрольную нормальную плазму с фактором V и плазму без фактора V фирмы George King Biomedical, Inc. Время свертывания преобразовывали в процентное значение активности на основании стандартной кривой, выведенной в соответствии с указаниями, предоставленными изготовителем прибора. Многие приборы для выполнения анализов, например, автоматическая коагуляционная лаборатория ACL 3000+, поставляются с программным обеспечением, которое автоматически строит стандартную кривую на основании данных, полученных при выполнении анализа с использованием стандартизированных проб плазмы.

Соотношение активности FVR получено при параллельном анализе проб, состоящих из двух аликвот анализируемой плазмы с низким содержанием тромбоцитов. Анализируемые смеси, состоящие из 100 мкл анализируемой плазмы и 100 мкл фосфолипида, содержащего тонкоизмельченный силикагель, представляли собой реагент AutoAPTT™ фирмы Organon Teknika. Эти смеси инкубировали при темпера9 туре 37°С в течение 5 мин. После инкубации к одной пробе добавляют 0,5 мкл дистиллированной воды, а к другой пробе добавляли 0,5 мкл АРС (1,18 мг/мл). Обе пробы инкубировали в течение 2 мин при температуре 37°С. После окончания инкубации к обеим пробам добавляли 250 мкл разбавителя фактора (Instrumentation Laboratory) до соотношения 1:4,5 и анализировали фактор V так, как это описано выше. Результаты выражены в виде соотношения между процентным значением коагулянтной активности фактора V необработанной пробы и процентным значением коагулянтной активности фактора V пробы, обработанной АРС. Объединенную нормальную плазму анализировали одновременно с пробами обследуемых субъектов и соотношение FVR нормализовали относительно объединенной нормальной плазмы.

II. Анализ APCR.

При выполнении анализа APCR использован стандартный коммерческий набор Coatest™ фирмы Chromogenix. Результаты выражены в виде соотношения между временем свертывания аРТТ пробы плазмы, обработанной АРС, и временем свертывания аРТТ необработанной пробы, что представляет собой соотношение APCR.

III. Анализ АРСМ.

Анализ АРСМ является модификацией анализа APCR. При выполнении анализа АРСМ перед введением АРС в плазму обследуемого субъекта добавляют плазму, не содержащую фактор V. Измеряют время свертывания и высчитывают соотношение АРСМ так же, как в анализе APCR.

Методика выполнения анализов.

Анализ I.

Наименование.

Определение соотношения активированного белка С (АРС) в приборе Behring Fibrintimer A (BFA).

Принцип.

Плазму инкубируют с реагентом аРТТ без CaCl2 в течение стандартного периода времени. Свертывание инициируют путем добавления CaCl₂ при отсутствии или наличии АРС, при этом регистрируют время образования сгустка. Тест-набор для этого анализа поставляется фирмой Chromogenix в виде набора Coatest™. Время свертывания измеряют в приборе Behring Fibrintimer A.

Требования к препаратам.

Плазму с низким содержанием тромбоцитов, полученную из цельной крови, собранной в 3,8% растворе цитрата натрия (соотношение 9:1) с помощью двух шприцев или в пробирки с вакуумом, хранят на влажном льду. Затем ее центрифугируют при температуре 4°С, градиент 3000, в течение 20 мин, используя фильтр Millex-GS фирмы Millipore. Плазму отделяют от клеток через два часа после сбора. Препарат можно хранить замороженным при температуре

-80°С в течение трех месяцев, если он не используется сразу же после получения.

Две пробы анализировали в отдельных пробирках. В обоих случаях смешивали 75 мкл плазмы субъекта с низким содержанием тромбоцитов и 75 мкл реагента АРТТ фирмы Chromogenix и пробы инкубировали при температуре 37°С в течение 3 мин. Через 3 мин к одной пробе добавляли 75 мкл CaCl₂ (0,025 моль/л) фирмы Chomogenix, а к другой пробе добавляли 75 мкл CaCl₂ (0,025 моль/л) вместе с АРС. Измеряли время свертывания, которое составляло от 150 с, и результаты анализа выражали в виде соотношения времени свертывания проб, обработанных АРС, и необработанных проб. Прибор: Behring Fibrintimer A (BFA).

Реагенты.

- CaCl₂ фирмы Chromogenix;

- Фосфолипид в виде реагента аРТТ и контактный активатор, содержащий силикагель, фирмы Chromogenix;

- APC/CaCl₂ фирмы Chromogenix;

- Нормальная контрольная плазма фирмы Chromogenix;

Не соответствующая норме контрольная плазма фирмы Chromogenix;

- Промывочный раствор фирмы Behring.

Приготовление реагентов.

CaCl2 фирмы Chromogenix, готовый к применению. 8 мл хлорида кальция с концентрацией 0,025 моль/л. Сохраняет стабильность в течение 1 месяца при температуре 2-8°С.

Реагент аРТТ фирмы Chromogenix, готовый к применению. 16,5 мл синтетического фосфолипида с коллоидным силикагелем в качестве контактного активатора. Сохраняет стабильность в течение 1 месяца при температуре 2-8°С. Не замораживайте этот реагент и тщательно перемешивайте его в смесителе Cortex перед использованием.

APC/CaCl2 фирмы Chromogenix необходимо восстановить 2,0 мл дистиллированной воды. Оставьте на 20 мин для выстаивания и осторожно перемешайте перед использованием. Сохраняет стабильность в течение 2 ч при температуре 37°С, 8 ч при комнатной температуре и 5 дней при температуре 2-8°С.

Нормальная контрольная плазма фирмы Chromogenix, необходимо восстановить содержимое каждой ампулы 1,0 мл дистиллированной воды. Оставьте на 20 мин для выстаивания при комнатной температуре. Осторожно перемешайте перед использованием. Сохраняет стабильность в течение 2 ч при температуре +20°С и 6 ч при температуре 2-8°С.

Не соответствующая норме контрольная плазма фирмы Chromogenix - содержимое двух ампул необходимо восстановить путем введения в каждую из них 0,5 мл дистиллированной воды. Оставьте на 20 мин для выстаивания при комнатной температуре. Осторожно перемешайте перед использованием.

Сохраняет стабильность в течение 2 ч при температуре +20°С и 6 ч при температуре 2-8°С.

Промывочный раствор фирмы Behring готов к использованию. Сохраняет стабильность при комнатной температуре до истечения срока годности.

Способ выполнения анализа.

Готовят две пробы, содержащие 75 мкл плазмы обследуемого субъекта и 75 мкл реагента аРТТ фирмы Chromogenix. Обе пробы инкубируют при температуре 37°С в течение 3 мин. Через 3 мин к одной пробе добавляют 75 мкл CaCl2 (0,025 моль/л), а к другой пробе добавляют 75 мкл CaCl₂ (0,025 моль/л) вместе с АРС. Измеряют время свертывания, которое составляет до 150 с.

Вычисление результата.

Время свертывания под действием APC/CaCl2

-= Соотношение АРС

Время свертывания под действием CaCl2

Контрольный диапазон.

Нормальный диапазон, указанный изготовителем тест-набора, равен 2,0-5,0. Нормальный диапазон, полученный нами у 25 здоровых контрольных субъектов с отрицательной реакцией PCR в отношении дефекта фактора V Лейдена, составляет от 2,2 до 3,4. Мы считаем нормальным любое значение, которое равно или больше 2,2.

Ограничения метода.

Время образования и активности тромбопластина (аРТТ) должно находиться в пределах нормального диапазона. Изготовитель предупреждает, что пробы плазмы, показывающие более длительное время аРТТ вследствие недостаточности внутренних факторов коагуляции, наличия антител ингибитора волчанки и фактора коагуляции, могут дать ложный результат. Изготовитель предупреждает также, что обследуемые субъекты не должны принимать антагонисты гепарина или витамина К.

Анализ II.

Наименование.

Модифицированный метод определения соотношения АРС в приборе Behring Fibrintimer A (BFA).

Принцип.

Анализ на соотношение АРСМ является модифицикацией анализа на соотношение активированного белка С (анализ I). В соответствии с этим методом, к смеси разбавленной плазмы обследуемого субъекта и реагента аРТТ перед введением активированного белка С добавляют плазму, не содержащую фактор V. Вследствие разбавления пробы и добавления плазмы, не содержащей фактор V, надежность этого анализа как индикатора FVL увеличивается для субъектов, перорально принимающих антикоагулянты, и субъектов, в организме которых присутствуют антитела ингибитора волчанки антикардиолипина.

Требования к препаратам.

Плазму с низким содержанием тромбоцитов, полученную из цельной крови, собранной в 3,8% растворе цитрата натрия (соотношение 9:1) с помощью двух шприцев или в пробирки с вакуумом, хранят на влажном льду. Затем ее центрифугируют при температуре 10°С, градиент 3000, в течение 20 мин, используя фильтр Millex-GS фирмы Millipore. Через два часа после сбора плазму отделяют от клеток пипетированием. Препарат можно хранить замороженным при температуре -80°С в течение трех месяцев, если он не используется сразу же после получения.

Прибор.

Behring Fibrintimer A (BFA).

Реагенты.

- СаО₂ фирмы Organon Teknika;

Фосфолипид в виде реагента Auto аРТТ и контактный активатор, содержащий силикагель, фирмы Organon Teknika;

- Плазма, не содержащая фактор V, фирмы Organon Teknika;

- АРС фирмы Enzyme Research Laboratories;

- Промывочный раствор фирмы Behring;

- Разбавитель фактора V фирмы Instrumentation Laboratories;

Приготовление реагентов.

CaCl₂ Фирмы Organon Teknika готов к использованию. 10 мл хлорида кальция с концентрацией 0,025 моль/л. Сохраняет стабильность в течение 1 месяца при температуре 2-8°С.

Реагент Auto aPTT фирмы Organon Teknika необходимо восстановить 6 мл дистиллированной воды. Сохраняет стабильность в течение 24 ч при температуре 2-8°С.

APC/CaCl2 фирмы Enzyme Research Laboratories необходимо добавить 10,5 мкл АРС (1,18 мг/мл) к 5 мл хлорида кальция, 0,025 моль/л. Сохраняет стабильность в течение 2 ч при температуре 37°С и 2 ч при температуре 28°С.

Нормальная контрольная плазма фирмы Chromogenix - необходимо восстановить содержимое каждой ампулы 1,0 мл дистиллированной воды. Оставьте на 20 мин для выстаивания при комнатной температуре. Осторожно перемешайте перед использованием. Сохраняет стабильность в течение 2 ч при температуре +20°С и 6 ч при температуре 2-8°С.

Не соответствующая норме контрольная плазма фирмы Chromogenix - содержимое двух ампул необходимо восстановить путем введения в каждую из них по 0,5 мл дистиллированной воды. Оставьте на 20 мин для выстаивания при комнатной температуре. Осторожно перемешайте перед использованием. Сохраняет стабильность в течение 2 ч при температуре +20°С и 6 ч при температуре 2-8°С.

Промывочный раствор фирмы Behring, готовый к использованию. Сохраняет стабильность при комнатной температуре до истечения срока годности.

Разбавитель фактора V фирмы Instrumentation Laboratories готов к использованию. Сохраняет стабильность при комнатной температуре до истечения срока годности.

Способ выполнения анализа.

Готовят две пробы, каждая из которых содержит 50 мкл плазмы обследуемого субъекта, разбавленной до соотношения 1:20 разбавителем фактора фирмы Instrumentation Laboratories, 50 мкл реагента AUTOAPTT и 50 мкл плазмы, не содержащей фактор V.

Пробы инкубируют при температуре 37°С в течение 3 мин. Через 3 мин к одной пробе добавляют 50 мкл CaCl₂ (0,025 моль/л), а к другой пробе добавляют 50 мкл CaCl₂ (0,025 моль/л) вместе с АРС. Измеряют время свертывания, которое составляет до 250 с.

Вычисление результата.

Время свертывания под действием АРС/СаСк

-= Соотношение АРСМ

Время свертывания под действием СаС1₂

Контрольный диапазон.

Диапазон, полученный у 25 здоровых контрольных субъектов с отрицательной полимеразной реакцией синтеза цепи (PCR) в отношении дефекта фактора V Лейдена, составляет от 2,2 до 3,0. Нормальным считается любое значение, которое равно или больше 2,2.

Ограничения метода.

Полученные нами данные показывают, что этот анализ может дать ложные положительные и ложные отрицательные результаты.

Анализ III.

Наименование.

Анализ на соотношение активности фактора V (FVR), выполняемый в приборе ACL3000+.

Принцип.

Субъекты с мутацией гена фактора V, известной как дефект фактора V Лейдена (FVL), в большей степени подвержены венозному тромбозу. Отличительной особенностью этой мутантной формы фактора V является более высокая устойчивость к расщеплению активированным белком С (АРС). Широко используемые анализы с применением системы на основе времени образования и активности тромбопластина (аРТТ) позволяют выявить вышеуказанное отклонение от нормы. Для этого производят сравнение времени свертывания плазмы, обработанной АРС, и необработанной плазмы. Метод FVR основан на сравнении коагулянтной активности фактора V при воздействии на анализируемую плазму активированным белком С и без такого воздействия. При выполнении этого метода анализируемую плазму сначала обрабатывают реагентом, содержащим фосфолипид и контактный активатор. После инкубации в течение 5 мин при температуре 37°С аликвоту анализируемой плазмы обрабатывают АРС, эту плазму инкубируют в течение 2 мин при температуре 37°С, после чего производят анализ фактора V в обработанных и необработанных аликвотах в приборе ACL3000+, добавляя плазму, не содержащую фактор V, и реагент Simplastin Excel, чтобы инициировать свертывание. Указанный последним реагент содержит CaCl2. Соотношение между уровнем коагулянтной активности фактора V в необработанной пробе и уровнем коагулянтной активности фактора V в пробе, обработанной АРС, представляет собой соотношение FVR.

Преимуществами этого метода по сравнению с методами на основе аРТТ являются:

1. Более высокая специфичность обнаружения дефекта FVL.

2. Отсутствие воздействия со стороны антикоагулянтов (кумадина или гепарина).

3. Отсутствие воздействия со стороны антител ингибитора волчанки антикардиолипина.

Требования к препаратам.

Плазму с низким содержанием тромбоцитов, полученную из цельной крови, собранной в 3,8% растворе цитрата натрия (соотношение 9:1) с помощью двух шприцев или в пробирке с вакуумом, хранят на влажном льду. Затем ее центрифугируют при температуре 4°С, градиент 3000, в течение 20 мин, используя фильтр Millex-GS фирмы Millipore. Через один час после сбора плазму отделяют от клеток пилотированием. Препарат можно хранить замороженным при температуре -80°С в течение трех месяцев, если он не используется сразу же после получения.

Прибор.

Автоматическая коагуляционная лаборатория ACL 3000+ фирмы Instrumentation Laboratories, Лексингтон, шт. Массачусетс.

Реагенты.

- Фосфолипид в виде реагента Auto аРТТ силикагель фосфолипид вместе с контактным активатором фирмы Organon Teknika;

- Реагент Simplastin Excel фирмы Organon Teknika тромбопластин с CaCl2;

- Калибровочная плазма фирмы Instrumentation Laboratories;

- Факторсодержащая замороженная объединенная нормальная контрольная плазма (фирма George King Fact);

Факторсодержащая замороженная объединенная не соответствующая норме контрольная плазма;

- Плазма, не содержащая фактор V (фирма George King В Fact);

- АРС фирмы Enzyme Research Laboratories (1,18 мг/мл);

- Разбавитель фактора фирмы Instrumentation Laboratories;

- Контрольная эмульсия ACL фирмы Instrumentation Laboratories.

Приготовление реагентов.

Реагент Auto aPTT фирмы Organon Teknika необходимо восстановить 6 мл дистиллированной воды. Этот реагент содержит примерно равные количества фосфатидилхолина, фосфатидил-этаноламина и фосфатидилсерина. Сохраняет стабильность в течение 24 ч при температуре 2-8°С.

АРС фирмы Enzyme Research Laboratories, готовый к использованию.

Плазма, не содержащая фактор V, фирмы Organon Teknika -необходимо восстановить содержимое каждой ампулы 1,2 мл дистиллированной воды. Оставьте продукт на 20 мин для выстаивания при комнатной температуре и осторожно перемешивайте перед использованием. Сохраняет стабильность в течение 8 ч при температуре 2-8°С.

Реагент Simplastin Excel фирмы Organon Teknika -тромбопластин с CaCl2. Перед восстановлением продукт необходимо довести до комнатной температуры. Восстановите реагент предоставляемым разбавителем. Затем оставьте его на 15 мин для выстаивания и перемешайте, интенсивно встряхивая. Продукт необходимо использовать в течение четырех дней после восстановления.

Калибровочная плазма. Перед восстановлением этот продукт необходимо довести до комнатной температуры. Восстановите реагент 1 мл дистиллированной воды и оставьте его для выстаивания в течение 15 мин. Осторожно перемешайте перед использованием. Сохраняет стабильность в течение 8 ч при температуре 28°С.

Факторсодержащая замороженная объединенная нормальная и не соответствующая норме плазма. Быстро разморозьте при температуре 37°С и сразу же используйте.

Контрольная эмульсия ACL готова к использованию. Сохраняет стабильность при температуре 25°С до истечения срока годности.

Способ выполнения анализа.

1. Готовят две пробы. В обе пробы добавляют по 100 мкл плазмы обследуемого субъекта и 100 мкл реагента Auto aPTT и инкубируют при температуре 37°С в течение 5 мин.

2. Через 5 мин к одной пробе добавляют 0,5 мкл дистиллированной воды, а к другой пробе добавляют 0,5 мкл АРС (1,18 мг/мл). Обе пробы инкубируют при температуре 37°С в течение 2 мин.

3. По истечение 2 мин к обеим пробам добавляют 250 мкл разбавителя фактора и анализируют фактор V в приборе ACL3000+ в соответствии с указаниями изготовителя, при этом пробу разбавляют до соотношения 1:3,5. Пробу можно разбавить в соотношении от 1:2 до 1:20, чтобы производить измерения в пределах диапазона измерения, рекомендуемого изготовителем для этого прибора.

Вычисление результата.

Соотношение FVR = FV(%) без APC/F V (%) с АРС.

Контрольный диапазон.

Диапазон, полученный у 25 здоровых контрольных субъектов с отрицательной полимеразной реакцией синтеза цепи (PCR) в отношении дефекта фактора V Лейдена, составляет от 2,1 до 3,7. Значение, которое равно или больше

2,1, свидетельствует о наличии у субъекта нормального фактора V.

Контрольная процедура.

- Нормальная объединенная плазма фирмы George King Fact (George King Biomedical, Inc.).

- He соответствующая норме объединенная плазма фирмы George King В Fact.

- Не соответствующая норме контрольная плазма фирмы Chromogenix.

Ограничения метода.

На результаты этого анализа не влияет наличие антител ингибитора волчанки или лечение антикоагулянтами. Он в высшей степени чувствителен и специфичен в отношении обнаружения дефекта фактора V Лейдена.

Генетическое исследование методом PCR

Генетическое исследование в отношении дефекта фактора V Лейдена (FVL) выполняют с помощью полимеразной реакции синтеза цепи (PCR), как это описано Киршенбаумом и Фостером (Kirschenbaum and Foster, Thrombosis and Hemostasis, т. 74, (1995), стр. 874-878).

Результаты.

Нормальные контрольные диапазоны соотношений для этих анализов получены в результате выполнения трех анализов плазмы, взятой у 25 контрольных субъектов с отрицательной реакцией на FVL. Контрольные диапазоны составляют: APCR - от 2,2 до 3,4, АРСМ от 2,2 до 3,6 и FVR - от 2,1 до 3,7 (см. таблицу 1А). Указанный изготовителем контрольный диапазон для коммерческого тест-набора COATEST равен 2,0-5,0. Следующие результаты получены в результате выполнения трех анализов плазмы, взятой у 110 субъектов. Из-за увеличения продолжительности основного метода аРТТ точная конечная точка свертывания не установлена при выполнении анализа APCR у 33 субъектов и при выполнении анализа АРСМ у одного субъекта. Конечные точки свертывания обнаружены во всех пробах плазмы, исследованных методом FVR, поэтому соотношения FVR высчитаны во всех случаях. В большинстве случаев конечное время свертывания при выполнении методом APCR и АРСМ не установ17 лено у субъектов, принимавших антикоагулянты или имевших LI.

Результаты анализов на определение соотношения активности фактора V.

Из 110 обследованных субъектов все субъекты с положительной реакцией PCR в отношении FVL имели соотношения FVR, равные 2,0 или меньше, 29 из 34 субъектов с мутацией FVL имели соотношения FVR, равные 1,8 или ниже. Не было субъектов с отрицательной реакцией на FVL по методу PCR, у которых соотношение было ниже 2,1. Обнаружены два субъекта с отрицательной реакцией на FVL, у которых соотношение FVR было равно 2,1. Соотношения FVR для всех других субъектов с отрицательной реакцией на FVL было выше 2,2 (см. фиг. 1) . Из 37 субъектов, принимавших гепарин и/или кумадин, у всех субъектов с положительной реакцией на FVL были соотношения FVR ниже 2,1 и у всех субъектов, имевших отрицательную реакцию на FVL, соотношения FVR были выше

2,1.

Аналогичным образом, присутствие антител ACL и/или LI не влияло на специфичность результатов анализа.

Исследовали плазму, полученную в общей сложности у 24 субъектов, имевших антитела LI и/или ACL. Из этих 24 субъектов у 19 субъектов, имевших отрицательную реакцию на FVL, соотношения FVR были равны 2,2 или выше, и у 5 субъектов, имевших положительную реакцию на FVL, соотношения были равны 1,7 или ниже. Эти данные, приведенные в таблице 2, показывают, что анализ FVR имеет 100% чувствительность и специфичность в отношении обнаружения мутации FVL и что лечение антикоагулянтами и присутствие антител LI/ACL не изменяет специфичность или чувствительность анализа FVR. У 4 субъектов с гомозиготным дефектом FVL соотношения FVR были равны 1,1 или меньше (трое имели 1,1 и один 1,0). Соотношение FVR в группе с гетерозиготным дефектом составляли от 1,3 до 2,0, причем среднее значение равно 1,6 +/- стандартное отклонение первого порядка 0,2 (см. таблицу 1В).

Таблица 1

А.
Контрольная группа	N=25	N=25	N=25
	Соотношение АРСМ	Соотношение APCR	Соотношение FVR
Диапазон	2,2-3,8	2,2-3,4	2,1-3,7
Среднее значение	3,0	2,8	2,9
Стандартное отклонение первого порядка	0,4	0.3	0,4

В.
FVL(+)	Г етерозиготный дефект	Гомозиготный дефект
	N=30	N=22	N=30	N=4	N=4	N=4
	АРСМ	APCR	FVR	АРСМ	APCR	FVR
Диапазон	1,1-2,3	1,3-3,3	1,2-2,0	1,1-1,5	1,2-1,6	1,1-1,1
Среднее значение	1,7	2,3	1,6	1,3	1,4	1,1

Стандартное отклонение первого порядка	0,3	0,5	0,2	0,1	0,1	0,0

С.
FVL(-) кумадин	N=19	N=7	N=19
	Соотношение АРСМ	Соотношение APCR	Соотношение FVR
Диапазон	2,0-3,2	2,4-4,0	2,0-3,6
Среднее значение	2,6	3,2	2,8
Стандартное отклонение первого порядка	0,3	0,4	0,4

D.
FVL(-) ACL/LI	N=16	N=10	N=17
	Соотношение АРСМ	Соотношение APCR	Соотношение FVR
Диапазон	1,7-3,7	1,3-3,7	2,1-3,7
Среднее значение	2,7	2,5	2,9
Стандартное отклонение первого порядка	0,5	0,6	0,4

В таблице 1 (A-D) суммируются величины диапазона, среднего значения и стандартного отклонения, полученные при измерении соотношений в соответствии с тремя методами: (а) для контрольной группы, состоящей из 25 человек с FVL (-); (b) для субъектов с гетерозиготным или гомозиготным дефектом FVL; (с) для субъектов с нормальным фактором V, принимавших кумадин; и (d) для субъектов с нормальным фактором V и положительной реакцией на антитела ACL/LI.

Результаты анализа APCR.

На фиг. 1 показано, что соотношение APCR плазмы, взятой у 15 из 26 обследуемых субъектов с положительной реакцией на FVL, превышает 2,2, т.е. находится в пределах нормального диапазона, указанного в таблице 1 А. У 3 из 51 субъекта с отрицательной реакцией на FVL соотношение APCR ниже 2,2, т.е. оно ниже нормального диапазона, указанного в таблице 1 А. Этот анализ не был выполнен в отношении 33 проб плазмы (см. фиг. 1). Двадцать из 33 проб, которые не удалось анализировать, были взяты у субъектов, принимавших антикоагулянты, четыре пробы содержали антитела LI, пять проб содержали антитела LI и принадлежали субъектам, принимавшим антикоагулянты, и четыре субъекта не принимали антикоагулянты и имели отрицательную реакцию на антитела ACL/LI. В плазме 21 субъекта с гетерозиготным дефектом FVL соотношения APCR находились в интервале от 1,3 до 3,3 при среднем значении 2,3 (стандартное отклонение первого порядка +/- 0,5) (см. таблицу 1В). В плазме 4 субъектов с гомозиготным дефектом FVL соотношения APCR составляли от 1,2 до 1,5. Хотя соотношения APCR у 4 субъектов с гомозиготным дефектом были ниже, чем соотношения APCR в группе с гетерозиготным дефектом, был выявлен один субъект с гетерозиготным дефектом, плаз19 ма которого характеризовалась соотношением APCR, равным 1,3, что соответствует соотношению, полученному в гомозиготной группе. У одного субъекта с отрицательной реакцией на FVL соотношение было равно 1,3, что ниже нормального диапазона, указанного в таблице 1А. При анализе APCR плазмы, взятой у 5 субъектов с положительной реакцией на FVL, которые не принимали антикоагулянты и не имели антител ACL/LI, были получены соотношения APCR выше 2,2, т.е. в пределах нормального диапазона, указанного в таблице 1А. Для этих пяти субъектов соотношение FVR было равно 1,9 или меньше и соотношение АРСМ было равно 1,6 или меньше, что ниже нормального диапазона. Чувствительность и специфичность соотношения APCR в отношении FVL составляли соответственно 42% и 94% (см. таблицу 2).

Таблица 2

А. Анализ APCR
	APC-R(+)	APC-R(-)
FVL(+)	11	15
FVL(-)	3	48

Чувствительность 42%

Специфичность 94%

Прогнозируемое положительное значение 78%

Прогнозируемое отрицательное значение 76%

Определение не произведено 42%

В. Анализ АРСМ
	APC-R(+)	APC-R(-)
FVL(+)	33	1
FVL(-)	3	72

Чувствительность 97%

Специфичность 96%

Прогнозируемое положительное значение 91%

Прогнозируемое отрицательное значение 98%

Определение не произведено 1%

С. Анализ FVR
	APC-R(+)	APC-R(-)
FVL(+)	34	0
FVL(-)	0	76

Чувствительность 100%

Специфичность 100%

Прогнозируемое положительное значение 100%

Прогнозируемое отрицательное значение 100%

Определение не произведено 0% *APC-R означает устойчивость к АРС.

В таблице 2 суммированы прогнозируемые значения анализов APCR, АРСМ и FVR для идентификации субъектов с дефектом FVL. В этой таблице приведены величины чувствительности, специфичности, прогнозируемых положительных значений и прогнозируемых отрицательных значений для трех анализов (APCR, АРСМ и FVR) . Чувствительность каждого метода означает количество субъектов с положительной реакцией на FVL, у которых фактор V устойчив к АРС, выраженное в процентном значении от общего количества субъектов с положительной реакцией на FVL. Специфичность каждого метода означает количество субъектов с нормальной реакцией на FVL, у которых фактор V расщепляется АРС, выраженное в процентном значении от общего количества субъектов с нормальной реакцией на FVL. Прогнозируемое положительное значение для каждого метода означает количество субъектов с положительной реакцией на FVL, у которых фактор V устойчив к АРС, выраженное в процентном значении от общего количества субъектов с устойчивостью к АРС. Прогнозируемое отрицательное значение означает количество субъектов с нормальной реакцией на FVL, у которых фактор V расщепляется АРС, выраженное в процентном значении от общего количества субъектов с нормальной реакцией на АРС. В графе определение не произведено этой таблицы указано процентное значение субъектов, плазму которых невозможно было анализировать этим методом.

Результаты анализа АРСМ.

Соотношение АРСМ не было получено для одной пробы плазмы. У этого субъекта положительная реакция на антитела LI/ACL. У одного из 34 субъектов с положительной реакцией на FVL соотношение АРСМ выше 2,2 (3,1), т.е. находится в пределах нормального диапазона, и у 3 из 75 субъектов с отрицательной реакцией на FVL соотношения АРСМ равны 2,1, что ниже нормального диапазона. (См. фиг. 1). Один из 3 субъектов последней группы не принимал антикоагулянтов, и у этого субъекта была отрицательная реакция на антитела ACL/LI. Соотношения АРСМ в группе с гетерозиготным дефектом FVL (29 субъектов) составляли от 1,1 до 2,3 при среднем значении 1,7(+/- стандартное отклонение первого порядка 0,3) (см. таблицу 1С). У 4 субъектов с гомозиготным дефектом FVL соотношения АРСМ составляли от 1,1 до 1,5. Однако соотношения АРСМ субъектов с гомозиготным дефектом соответствовали соотношениям АРСМ группы с гетерозиготным дефектом. Плазма трех других субъектов с гомозиготным дефектом имела соотношения АРСМ ниже соотношений АРСМ в группе субъектов с гетерозиготным дефектом. Чувствительность и специфичность анализа АРСМ в отношении обнаружения дефекта FVL составляли соответственно 97% и 96%. (См. таблицу 2).

Общие замечания по анализам.

В рассмотренных выше анализах APCR и

АРСМ хорошо заметно влияние, оказываемое на результаты анализов антикоагулянтами и наличием антител ACL/LI. (См. фиг. 2). Полученные результаты показывают, что при выполнении анализов APCR и АРСМ у многих субъектов анализ плазмы оказался невозможен. При выполнении этих анализов было выявлено много субъектов с отрицательной реакцией на FVL (нормальная реакция), у которых соотношения были ниже диапазона для нормальных субъек21 тов, указанного в таблице 1А, и много субъектов с положительной реакцией на FVL, у которых определяемые соотношения находились в пределах диапазона для нормальных субъектов. При выполнении анализа APCR не было установлено надежной конечной точки свертывания для плазмы 17 субъектов с отрицательной реакцией на FVL и 5 субъектов с положительной реакцией на FVL, принимавших кумадин. Семь из этих субъектов дополнительно принимали гепарин и/или имели положительную реакцию на антитела ACL/LI.

При выполнении анализа АРСМ был выявлен один субъект с положительной реакцией на антитела ACL/LI, у которого невозможно было определить требуемое соотношение. При анализе APCR плазмы 6 субъектов с положительной реакцией на FVL, принимавших кумадин, были получены соотношения от 2,2 до 3,1, т.е. в пределах нормального диапазона, указанного в таблице 1А. Субъекты с отрицательной реакцией на FVL и положительной реакцией на ACL/LI имели соотношения APCR в интервале от 1,9 до 1,3. У 3 субъектов с положительной реакцией на FVL и положительной реакцией на ACL/LI соотношение APCR составляло от 2,3 до 2,4, т.е. находилось в нормальном диапазоне. У одного субъекта с положительной реакцией на FVL, принимавшего кумадин, соотношение АРСМ было равно 3,1, что соответствует нормальному диапазону. У двух субъектов с отрицательной реакцией на FVL соотношения АРСМ были равны 2,1. Один из этих субъектов принимал кумадин и имел положительную реакцию на ACL/LI, а другой субъект имел положительную реакцию на антитела ACL/LI. Еще у двух субъектов с отрицательной реакцией на FVL соотношения находились у нижней границы контрольного диапазона. У 5 субъектов с отрицательной реакцией на FVL, принимавших гепарин, соотношения FVR составляли от 2,5 до

3,2, т. е. находились в пределах нормального диапазона. У одного субъекта с положительной реакцией на FVL, принимавшего гепарин, соотношение FVR было равно 1/7, что ниже нормального диапазона.

Коротко говоря, было выявлено 15 субъектов с положительной реакцией на FVL, для которых при выполнении анализа APCR были получены ложные отрицательные результаты (т.е. соотношение APCR находилось в пределах нормального диапазона). Большинство этих субъектов принимало антикоагулянты (6 из 15 человек) или имели антитела LI и/или антикардиолипина (ACL) (4 из 15 человек). Помимо этого, при анализе APCR трех субъектов с отрицательной реакцией на FVL были получены ложные положительные результаты (т.е. соотношение APCR было ниже нормального диапазона). Анализ АРСМ характеризовался лучшей чувствительностью и специфичностью. Однако по методу АРС были получены положительные результаты у трех субъектов с отрицательной реакцией на FVL и у одного субъекта с положительной реакцией на FVL было получено нормальное соотношение APCR (т. е. отрицательное значение APCR). В отличие от этого, при выполнении анализа FVR у всех 34 субъектов с положительной реакцией на FVL соотношения FVR были ниже нормального диапазона, и не было выявлено ни одного субъекта с отрицательной реакцией на FVL, у которого соотношения FVR были ниже нормального контрольного диапазона. Это относится также к субъектам с положительной реакцией на антитела ACL/LI и субъектам, принимавшим кумарин или гепарин в качестве антикоагулянтной терапии.

Сравнительный анализ.

Чтобы оценить влияние стадии инкубации с фосфолипидом, пробы плазмы анализировали методом FVR и аналогичным методом без инкубации с фосфолипидом, который по всем остальным параметрам был аналогичен вышеуказанному методу.

1) Для каждого обследуемого субъекта параллельно анализировали пробы, содержащие четыре аликвоты (2 серии проб) плазмы с низким содержанием тромбоцитов. Две пробы анализировали по методу FVR со 100 мкл коммерческого реагента, состоящего из фосфолипида для аРТТ и контактного активатора, а другую серию проб анализировали со 100 мкл разбавителя фактора V (Factor Diluent™), который использовали вместо фосфолипида и контактного активатора. Результаты выражены в виде соотношения коагулянтной активности фактора V.

Таблица 3

Уровень FV с фосфолипидом и силикагелем		Уровень FV без фосфолипида / силикагеля
	FV%	FV% +АРС		FVR	FV%	FV% +АРС		FVR
	72,0	33,0	39,0	2,2	70,0	48,0	22,0	1,4
	63,0	28,0	35,0	2,3	57,0	44,0	13,0	1,3
FV Лейдена(-)	106,0	38,0	68,0	2,8	101,0	61,0	40,0	1,7
ACL/LI(-)	129,0	56,0	73,0	2,3	117,0	85,0	32,0	1,4
Кумадин(-)	73,0	16,0	57,0	4,6	73,0	39,0	34,0	1,9
N=15	134,0	56,0	78,0	2,4	123,0	75,0	48,0	1,6

	139,0	46,0	93,0	3,0	103,0	57,0	46,0	1,8
	150,0	41,0	109,0	3,7	136,0	76,0	60,0	1,8
	129,0	48,0	81,0	2,6	102,0	58,0	44,0	1,7
	91,0	38,0	53,0	2,4	73,0	57,0	16,0	1,3
	111,0	45,0	66,0	2,5	93,0	53,0	40,0	1,8
	103,0	41,0	62,0	2,5	103,0	61,0	42,0	1,7
	123,0	47,0	76,0	2,6	105,0	65,0	40,0	1,6
	81,0	29,0	52,0	2,8	75,0	42,0	33,0	1,8
	97,0	37,0	60,0	2,6	90,0	65,0	35,0	1,4
Среднее значение	*106,7	**39,9	***66,8	2,8	*94,7	**59,1	***36,3	1,6
Стандартное отклонение 1-го порядка	27,0	10,7		0,6	21,9	13,0	12,3	0,2

FV Лейдена(-)	87,0	40,0	47,0	2,2	63,0	41,0	22,0	1,5
ACL/LI(+)	136,0	47,0	89,0	2,9	118,0	62,0	56,0	1,9
N=5	113,0	41,0	72,0	2,8	108,0	62,0	46,0	1,7
	91,0	40,0	51,0	2,3	64,0	38,0	26,0	1,7
	114,0	46,0	68,0	2,5	101,0	67,0	34,0	1,5
Среднее значение	108,2	42,8	65,4	2,5	90,8	54,0	36,8	1,7
Стандартное отклонение 1-го порядка	19,8	3,4	17,0	0,3	25,6	13,4	14,1	0,2

FV Лейдена(+)	147,0	84,0	63,0	1,8	147,0	108,0	39,0	1,4
ACL/LI(-)	123,0	75,0	48,0	1,6	102,0	89,0	13,0	1,1
N=5	90,0	60,0	30,0	1,5	87,0	72,0	15,0	1,2
	157,0	84,0	73,0	1,9	118,0	105,0	13,0	1,1
	97,0	55,0	42,0	1,8	87,0	69,0	18,0	1,3
Среднее значение	122,8	71,6	51,2	1,7	108,2	88,6	19,6	1,2
Стандартное отклонение 1-го порядка	29,6	13,5	17,0	0,2	25,2	18,1	11,0	0,1

*р < 0,05; **р < 0,05; ***р < 0,05; t-тест по двум пробам.

В таблице 3 сравниваются результаты серии анализов FVR и параллельной серии анализов, выполняемой в аналогичных условиях, но без использования фосфолипида и контактного активатора, в процессе которых обследовали (а) 15 субъектов с нормальным фактором V и отрицательной реакцией на антитела ACL/LI, не принимающих антикоагулянтов; (b) 5 субъектов с нормальным фактором V и положительной реакцией на антитела ACL/LI; и (с) 5 субъектов с положительной реакцией на дефект FVL, но с отрицательной реакцией на антитела ACL/LI.

В таблице 3 приведены результаты оценки влияния стадии инкубации с фосфолипидом и контактным активатором на анализ FVR. Для анализа использовали плазму 15 субъектов с отрицательной реакцией на FVL и отрицательной реакцией на антитела ACL/LI, которые не принимали антикоагулянтов. Анализ FVR, включающий стадию инкубации с фосфолипидом и контактным активатором, и аналогичный анализ с использованием инертного реагента выполняли в отношении проб плазмы 15 субъектов с отрицательной реакцией на FVL. Среднее соотношение FVR при использовании фосфолипида и контактного активатора равнялось 2,8 (+/- стандартное отклонение первого порядка 0,6) и среднее соотношение при использовании инертного реагента равнялось 1,6 (+/стандартное отклонение первого порядка 0,2). Различия между средними соотношениями при использовании фосфолипида и контактного активатора и без этого реагента были статистически значимыми. (См. таблицу 3). При обследовании аналогичным образом 5 субъектов с отрицательной реакцией на FVL и положительной реакцией на ACL/LI среднее соотношение FVR при использовании фосфолипидного реагента составляло 2,5 (+/-стандартное отклонение первого порядка 0,3), т.е. оно находилось в пределах нормального диапазона, и без фосфолипида и контактного активатора среднее соотношение составляло 1,5 (+/- стандартное отклонение первого порядка 0,2), что ниже нормального диапазона. При аналогичном исследовании проб плазмы 5 субъектов с положительной реакцией на FVL пробы, обработанные фосфолипидом, имели среднее соотношение FVR, равное 1,7 (+/- стандартное отклонение первого порядка 0,2). Без фосфолипида среднее соотношение равнялось 1,2 (+/-стандартное отклонение первого порядка 0,1). Эти результаты показывают, что инкубация с фосфолипидом и контактным активатором нейтрализует действие антител LI/ACL и увеличивает различие между соотношением FVR у субъектов с положительной и отрицательной реакцией на FVL, позволяя более точно выявить субъектов с дефектом FVL и без него.

2) Выполнена серия анализов для сравнения воздействия других препаратов, состоящих из фосфолипида контактного активатора (силикагель или каолин), на анализ FVR. Для выполнения этого сравнения анализ FVR выполняли с использованием 4 коммерческих фосфолипидных препаратов в качестве реагентов аРТТ, разбавителя фактора V и одного контактного активатора (каолиновая суспензия). Один из коммерческих реагентов аРТТ, AutoaPTT, является реагентом, который использовали в соответствии с приведенным выше описанием. Параллельно анализировали пробы, содержащие 12 аликвот (6 серий) плазмы с низким содержанием тромбоцитов. Анализы выполняли аналогично методу FVR за исключением того, что использовали 100 мкл AutoaPTT, патромтин (Pathromtin), каолин, разбавитель фактора, тромбоцитолизат и SynthASIL™. Реагенты аРТТ разбавляли в соответствии с рекомендациями поставщика стандартного набора для аРТТ.

Таблица 4

Реагент 1. AutoaPTT (фирма Organon Tekn	ka)
	FV%	FV%+APC		FVR
	81,0	22,0	59,0	3,7
	97,0	44,0	53,0	2,2
	87,0	38,0	49,0	2,3
	97,0	37,0	60,0	2,6
	72,0	29,0	43,0	2,5
Среднее значение	86,8	34,0	52,8	2,7

Реагент 2. SynthASIl для аРТТ (фирма Hemoliance)
	FV%	FV%+APC		FVR
	123,0	32,0	91,0	3,8
	123,0	53,0	70,0	2,3
	118,0	54,0	64,0	2,2
	109,0	61,0	48,0	1,8
	109,0	47,0	62,0	2,3
Среднее значение	116,4	49,4	67,0	2,5

Реагент 3. Патроматин для аРТТ (фирма Behring Diagnostic Inc.)
	FV%	FV%+APC		FVR
	76,0	15,0	61,0	5,1
	101,0	27,0	74,0	3,7
	101,0	39,0	62,0	2,6
	84,0	33,0	51,0	2,5
	94,0	30,0	64,0	3,1
Среднее значение	91,2	28,8	62,4	3,4

Реагент 4. Фосфолипид (фирма American Bioproduct)
	FV%	FV%+APC		FVR
	70,0	42,0	28,0	1,7
	94,0	61,0	33,0	1,5
	80,0	62,0	18,0	1,3
	84,0	59,0	25,0	1,4
	данных нет	данных нет	данных нет	данных нет
Среднее значение	82,0	56,0	26,0	1,5

Реагент 5. Разбавитель фактора (фирма Instrumentation Lab.)
	FV%	FV%+APC		FVR
	84,0	47,0	37,0	1,8
	101,0	61,0	40,0	1,6

	97,0	83,0	14,0	1,2
	90,0	65,0	25,0	1,4
	87,0	63,0	24,0	1,4
Среднее значение	91,8	63,8	28,0	1,5

Реагент 6. Каолин ((	)ирма Behring Diagnostic Inc.)
	FV%	FV%+APC		FVR
	105,0	59,0	46,0	1,8
	данных нет	данных нет	данных нет	данных нет
	109,0	65,0	44,0	1,7
	109,0	55,0	54,0	2
	101,0	53,0	48,0	1,9
Среднее значение	106,0	58,0	48,0	1,9

В таблице 4 суммируются результаты серии анализов FVR (при параллельном выполнении анализов FVR плазмы 5 субъектов с нормальным фактором V (FVL(-)) с использованием на первой стадии инкубации шести разных реагентов. Реагенты 1-4 являются коммерческими фосфолипидными препаратами, причем реагент 4 получен без контактного активатора. Реагент 5 является разбавителем фактора, и реагент 6 представляет собой суспензию каолина.

В таблице 4 приведены результаты оценки четырех имеющихся в продаже фосфолипидных реагентов аРТТ и используемого отдельно каолина, которую производили в соответствии с методикой анализа FVR. Реагенты 1 и 2 содержат фосфолипид и силикагель в качестве контактного активатора. Реагент 3 содержит фосфолипид и каолин в качестве контактного активатора. Реагент 4 содержит фосфолипид без контактного активатора. Реагент 6 является отдельно используемым каолином. Реагент 5 является разбавителем фактора без фосфолипида или контактного активатора. Реагенты 1-4 являются коммерчески изготовленными реагентами, которые предназначены для анализа коагулирующей активности по методу аРТТ. При использовании реагентов 1, 2 и 3 в анализе FVR все 5 проб плазмы с отрицательной реакцией на FVL показали соотношения, равные 2,5 или выше, т. е. в пределах нормального диапазона. При использовании реагентов 4 и 6 соотношения FVR были соответственно равны 1,5 и 1,9, т.е. ниже нормального диапазона. Без фосфолипида или активирующего вещества соотношение было аналогично полученному в вышеуказанном сравнении анализа FVR с аналогичным анализом без фосфолипида. Наблюдаемое увеличение соотношения FVR при использовании реагентов, содержащих как фосфолипид, так и контактный активатор (реагенты 1, 2 и 3), по сравнению с соотношениями, полученными при использовании реагентов без обоих компонентов (реагенты 4, 5 и 6), связано с более высокой степенью расщепления FVa под действием АРС. Наблюдаемое различие FVR в группе реагентов, содержащих как фосфолипид, так и активатор, может быть связано с составом и/или источником получения этих веществ. Однако все соот27 ношения находились в пределах нормального диапазона.

Введение фосфолипида/контактного активатора в анализ FVR позволяет нейтрализовать ингибирующее воздействие антител LI на расщепление фактора Va под действием АРС. Данные использования фосфолипида с силикагелем или каолином приведены в таблице 4. Три реагента, которые содержали фосфолипид и силикагель или каолин, характеризовались гораздо большей степенью расщепления фактора Va под действием АРС и более высоким соотношением FVR по сравнению с результатами, полученными при использовании только фосфолипида или каолина (реагенты 4 и 6). Соотношения, полученные при использовании реагентов 4 и 6, были ближе к результатам анализа FVR, полученным без использования фосфолипида или активирующих веществ (реагент 5). Эти результаты подтверждают предположение, что фосфолипидные препараты с контактным активатором создают условия для более высокой активности АРС. Конкретная композиция фосфолипидного реагента имеет определенное значение для реакции, на что указывают небольшое расхождение результатов, полученных при использовании реагентов 1, 2 и 3. Однако результаты этих анализов показывают, что указанные различия не влияют на способность анализа FVR выявлять субъектов с положительной и отрицательной реакцией на FVL. В заключение следует отметить, что полученные результаты указывают на то, что система анализа фактора V на основе тканевого фактора с использованием дополнительной стадии инкубации с фосфолипидом и силикагелем, т. е. анализ FVR, весьма неожиданно оказывается более надежным методом обнаружения мутации FVL по сравнению с известными ранее методами.

Влияние инкубации с фосфолипидом и контактным активатором на систему анализа FVR продемонстрировано в таблице 3, в которой результаты анализа FVR сравниваются с результатами анализа фактора V, который не включает стадию инкубации с фосфолипидом и контактным активатором. Различие соотношения FVR для 15 субъектов с отрицательной реакцией на FVL при выполнении анализа с включением в него стадии инкубации с фосфолипидом и контактным активатором и без этой стадии имеет статистически значимое значение (р < 0,005). Уровни коагулянтной активности фактора V при включении в анализ стадии инкубации с фосфолипидом и контактным активатором перед добавлением АРС были выше, чем в группе, анализируемой без использования фосфолипида и контактного активатора, при этом наблюдалась более высокая степень расщепления фактора Va под воздействием фосфолипида и контактного активатора (р < 0,005). Эти результаты позволяют предположить, что фосфолипид в сочетании с контактным активатором увеличивает расщепление фактора Va под действием АРС.

Влияние анионных фосфолипидов при выполнении анализа APCR (Coatest™) исследовано Луддингтоном и др. (Luddihgton et al., British Journal of Hematology, т. 92 (1996) 744). Они установили, что загрязнение тромбоцитами может привести к кажущейся устойчивости к АРС, т. к. на анионных фосфолипидных поверхностях происходит модуляция скоплений протромбиназного комплекса и инактивация фактора V. Теоретически обосновано, что анионная поверхность тромбоцитов, на которой происходит расщепление фактора Va под действием АРС, увеличивается в результате повышенной активности протромбиназы, которая стимулируется на фосфолипидной поверхности тромбоцитов.

Поэтому комбинация этих противоположных воздействий может вызвать увеличение образования тромбина и привести к более высокой устойчивости к АРС. Другие ученые связывают это явление с использованием подвергаемых замораживанию и размораживанию проб плазмы и с последующим влиянием анионного фосфолипида, высвобождаемого из разрушенных тромбоцитов. Почти 95% проб, использованных в нашем анализе, замораживали и размораживали после отделения плазмы путем интенсивного центрифугирования и фильтрации. Мы не отметили никаких различий между результатами анализа FVR при использовании замороженных и свежих проб, и этот фактор не влиял на выявление субъектов с положительной и отрицательной реакцией на FVL.

Результаты анализа FVR показывают, что дополнительная стадия инкубации с фосфолипидом/контактным активатором перед добавлением АРС нейтрализует действие антител ингибитора волчанки или антикардиолипина. Это подтверждено анализом 5 проб плазмы, взятых у субъектов с отрицательной реакцией на FVL и положительной реакцией на антитела ингибитора волчанки и/или антикардиолипина. Анализ FVR со стадией инкубации с фосфолипидом/контактным активатором выполняли параллельно с анализом, в котором использовали инертный реагент вместо фосфолипида и силикагеля. Результаты соотношений, полученных при выполнении анализов без фосфолипида и силикагеля, были аналогичны соотношениям, полученным при аналогичном анализе 5 проб, взятых у субъектов с положительной реакцией на FVL. Использование стадии инкубации с фосфолипидом и силикагелем позволяло легко дифференцировать субъектов с отрицательной реакцией на FVL и субъектов, имевших антитела LI.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ идентификации субъектов с риском тромботических нарушений вследствие дефекта фактора V, включающий

a) инкубацию анализируемой плазмы с первым реагентом, содержащим фосфолипидную композицию и контактный активатор;

b) добавление второго реагента, содержащего активированный белок С, к первой аликвоте анализируемой плазмы и инкубации первой аликвоты и второй аликвоты; и

c) измерение активности фактора V плазмы в первой аликвоте и во второй аликвоте в присутствии плазмы, не содержащей фактор V, и тромбопластина.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию определения соотношения активности фактора V во второй аликвоте к активности фактора V в первой аликвоте.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию определения того, является ли это соотношение выше или ниже заранее определенного порогового значения, причем соотношение ниже заранее определенного порогового значения характерно для субъектов с дефектом фактора V.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что фосфолипидная композиция является натуральным фосфолипидом, синтетическим фосфолипидом или их комбинацией.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что фосфолипидная композиция состоит из примерно одинаковых количеств фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что фосфолипидная композиция составляет от 0,25 микрограмма до 75 микрограммов на 100 микролитровую порцию первого реагента.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что контактный активатор является, по крайней мере, одним веществом, выбранным из группы, состоящей из тонкоизмельченного силикагеля, каолина, целита и эллаговой кислоты.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии измерения плазма разбавлена остальными компонентами, включая раствор инертного разбавителя, в отношении от 1:2 до 1:20.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия измерения активности фактора V в первой аликвоте и активности фактора V во второй аликвоте состоит из стадий

a) добавления плазмы, не содержащей фактор V, к первой аликвоте и второй аликвоте;

b) добавления третьего реагента, включающего тромбопластин и соединение, содержащее ионы Са²⁺, к первой аликвоте и второй аликвоте с целью инициирования свертывания; и

c) измерения времени свертывания первой аликвоты и времени свертывания второй аликвоты.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что плазма, не содержащая фактор V, присутствует в количестве, по крайней мере, равном количеству анализируемой плазмы в первой аликвоте и второй аликвоте.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия измерения активности фактора V в первой аликвоте и активности фактора V во второй аликвоте включает стадии

a) добавление определенного количества плазмы, не содержащей фактор V, к первой аликвоте и второй аликвоте;

b) добавление хромогенного субстрата, чувствительного к серинпротеазе, образуемой под действием фактора V;

c) добавление тромбопластина, инициирующего химические реакции во внешней части системы свертывания; и

d) измерение изменения цвета, происходящего в результате взаимодействия серинпротеазы с хромогенным субстратом, в первой аликвоте и второй аликвоте.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что пороговое значение соотношения активности фактора V определяют заранее посредством анализа плазмы, полученной у контрольной группы субъектов с нормальным фактором V.
13. Набор для анализа, представляющий собой комплект реагентов, стандартизированных для выявления субъектов с риском тромботических нарушений вследствие дефекта фактора V, включающий

a) первый реагент, содержащий фосфолипидную композицию и контактный активатор;

b) второй реагент, содержащий активированный белок С;

c) третий реагент, содержащий плазму без фактора V; и

d) четвертый реагент, содержащий тромбопластин с Са²⁺.
14. Набор по п.13, отличающийся тем, что активирующая композиция включает фосфолипидное соединение и контактный активатор.
15. Набор по п.14, отличающийся тем, что контактный активатор является, по крайней мере, одним веществом, выбранным из группы, состоящей из микроизмельченного силикагеля, каолина, целита и эллаговой кислоты.
16. Набор для выявления субъектов с риском тромботических нарушений вследствие дефекта фактора V способом по п.1, включающий

a) первый реагент, содержащий фосфолипидную композицию и контактный активатор;

b) второй реагент, содержащий активированный белок С;

c) третий реагент, содержащий плазму без фактора V; и

d) четвертый реагент, содержащий тромбопластин с Са²⁺.
17. Набор для выявления субъектов с риском тромботических нарушений вследствие дефекта фактора V способом по п.1, включающий

a) первый реагент, содержащий фосфолипидную композицию и контактный активатор;

b) второй реагент, содержащий активированный белок С;

c) третий реагент, содержащий плазму без фактора V;

d) четвертый реагент, содержащий тромбопластин без Са²+; и

e) пятый реагент, содержащий хромогенный субстрат, чувствительный к серинпротеазе, образуемой под действием фактора V.