JPH01231887A - タンパク質の調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特に、ｔ−ＰＡ　（組織プラスミノーゲン活
性化因子）のようなプラスミノーゲン活性化因子等のタ
ンパク質の調製法で、特に、タンパク質合成のための細
胞培養（例えばＣＨＯ細胞）の生産性を向上させる方法
に関するものである。

プラスミノーゲン活性化因子は、Ａ−５６０とＶａｌ　
−５６１の間のペプチド結合を切断することにより、活
性酵素プラスミンとする、プロ酵素プラスミノーゲンを
活性化する一種のセリン・プロテアーゼである。逆に、
プラスミンは、凝血のフィブリン構造を分解して、可溶
性のペプチドとする血液の繊維素溶解システムの最終段
階であるということができる。

冠動脈性の病気のような病原性の病気では、凝血は、そ
の組織が適当量の酸素の供給をうけることを保証するの
に十分早く、破壊される。凝血による冠状動脈の閉鎖は
、不適正な結果を引き起こすが、一方、心筋への酸素供
給の欠乏は、影響を受ける組織の壊死を意味する。

血管の迅速な再開は、短時間内での、心筋への血液供給
を保証し、従って、心筋の全セクションが死ぬの妨ぐ。

現在まで、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼがこの
治療に使われてきた。しかし、ｔ−ＰＡの性質は、これ
ら従来のプラスミノーゲン活性化因子以上の有利性をも
っている；フィブリン特異的部位の溶解、フィブリノー
ゲン分解によって引き起こされる組織溶解効果の欠除及
び抗体形成の欠除。

ｔ−ＰＡは、５２７アミノ酸残基がらできている、１本
鎖又は２本鎖で生成する、約６５，０００ダルトンの分
子量を有するグリコプロティンである。

ｔ−ＰＡのプラスミノーゲンに対する親和性は、フィブ
リン不在下よりもフィブリン存在下の方が約１００倍大
きい。フィブリン存在下での、このｔ−ＰＡのプラスミ
ノーゲンに対する親和性は、末梢における遊離プラスミ
ノーゲンを活性化することなしに、効果的な活性化を保
証している。

まず、ヒトのｔ−ＰＡを、子宮から純粋な形で入手する
。また、ｔ−ＰＡは、他の組織又は、例えば動脈及び静
脈内皮細胞を含む内皮細胞などの細胞にも検出される。

しかし、形成するｔ−ＰＡ量は非常に少ないため、それ
らを商業的規模で人手するのは、不可能である。

他の天然のｔ−ＰＡ源は、細胞培養である。可能性のあ
るｔ−ＰＡ生産のため、多くの細胞系列が研究されてき
た（グロノ−（Ｇｒｏｎｏｗ　）　、Ｍ等、トレンド・
イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓｉｎ　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）、　　１巻、２６〜２９頁、
１９８３年）。限定された臨床的研究及び、ヒトの細胞
系列、及びその構造研究のため、ヒトの細胞系列、主に
ポウズ・メラノーマ細胞から、相当大量のｔ−ＰＡが得
られた（ワレン（Ｗａｌｌｅｎ　）等、ヨーロピアン・
ジャーナル・オプ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ
）　。

１３２巻、６８１−６８６頁（１９８３年））。

しかし、これらの収量でも、広汎な臨床的使用のための
大規模生産に対しては、少なすぎる。

遺伝子工学によってのみ、治療のための組換えｔ−ＰＡ
をより多量に生産することが可能である。

１９８３年、ｔ−ＰＡをクローン化し、そのアミノ酸配
列が決定された（ペニカ（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）＋ネイチ
＋−（Ｎａｔｕｒｅ　）＋　３０１巻、　２１４〜２２
１頁。

１９８３年）。

メラノーマ細胞由来のｔ−ＰＡの遺伝的情報が組込まれ
た大腸菌からｔ−ＰＡを得る試みは、生じたタンパク質
がグリコジル化されておらず、結果的に天然のｔ−ＰＡ
に対応していないことから、不成功に終った。

この理由で、ヒトのｔ−ＰＡの生産を研究している、多
くの研究グループは、様々な種に由来する、耐久性のあ
るホ乳類細胞系列を探し求めた。

これらの細胞系列のうちのいくつかは、明らかに、ｔ−
ＰＡの収率の向上した、ヒトの細胞系列である。他のも
のは正常なチャイニーズハムスターの卵巣細胞である。

刊行されている、ヨーロッパ特許出願第００９３６１９
号は、トランスホームしたチャイニーズ・ハムスターの
卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）からのｔ−ＰＡの調製について
報告している。生成したｔ−ＰＡ　（ｒ−ｔＰＡ）は、
天然のものと、なんら変りはなかった。

いくつかの刊行物は、ｔ−ＰＡの変異体及びその調製法
について報じている；　Ｅ　Ｐ　−Ａ２４１，２０８．
２４１．２０９．２４１，２１０　、２４０，３３４．
２３４，０５１．２３３．０１３．２３１，６２４．２
２５，２８６．２１３，７９４．２０１．１５３．１９
９，５７４．１９６，９２０　、及びＤ　Ｅ　−Ａ３７
０８６８１゜ 本出願は、天然のｔ−ＰＡ中の同じ位置のアミノ酸と異
なる１つ以上のアミノ酸をそれらが含んでいるか、又は
、天゛然に生じる１つ以上のアミノ酸がそれら変異体中
に見られないこととは関係なしに、変異株としての全て
のｔ−ＰＡ誘導体に関して言及している。天然に生じる
ｔ−ＰＡの多くのアミノ酸を欠（ｔ−ＰＡ、（例えばＥ
Ｐ−Ａ−１９６、９２０参照）は、しばしば、“分離種
”と呼ばれる。

例えば、Ｅ　Ｐ　−Ａ　１９９．５７４は、部位２７０
から２７９に、天然のｔ−ＰＡの対応する部位のアミノ
酸と異なるアミノ酸を有するｔ−ＰＡ変異体について報
じている。

Ｄ　Ｅ　−Ａ　３７０８６８１では、出願者は、部位１
１７に、天然のｔ−ＰＡの対応する部位のアミノ酸と異
なるアミノ酸を含み、一方、天然のｔ−ＰＡと異なり、
その変異体ｔ−ＰＡは、この部位がグリコジル化されて
いない、いくつかのｔ−ＰＡを調製している。

多くの出願者は、タンパク質合成に対する細胞培養の生
産性に関する、種々の物質の影響について報じている。

種々の細胞システムにおいて、細胞内ｃ　　ＡＭＰレベ
ルとｔ−ＰＡ合成の間に相関があると報じられており（
例えばクーイストラ（Ｋｏｏｉｓｔｒａ　）等。

トロンボシスとへモスタシス、５４巻（１）。

１９２頁、概要ｐＨ３３）、また、ヒトの内皮細胞中、
ジブチリルｃ−ＡＭＰは、ｔ−ＦＡの生産を２〜３倍増
加させるが、ボウズ・メラノーマ細胞においては、ｔ−
ＦＡ合成に影響を与えないと報じられている。腎臓細胞
において、ｔ−ＰＡの合成は、ホスホジェステラーゼ・
インヒビターによって増加する（ジャーナル・オブ・セ
ル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ）、　　９１巻。

１９５〜２００頁、１９８１年）。一方、Ｃ−ＡＭＰは
、マクロファージにおけるｔ−ＰＡ合成を阻害しくヴア
サリ（Ｖａｓｓａ　１１　ｉ）等、セル（ｃｅｌｌｓ）
。

８巻、２７１〜２８１頁、１９７６年）、またテラトカ
ルシノーマ細胞においては、不活性であるにシムネ（Ｎ
ｉｓｈｉｍｕｎｅ）等、エクスペリメンタル・セル・リ
サーチ（ｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ
５ｅａ−ｒｃｈ）１４６巻、４３９〜４４４頁、１９８
３年）。

醋酸は、テラトカルシノーマ細胞におけるｔ−ＰＡの合
成を誘導するにシムネ（Ｎｉ３ｈｉｍｕｎｅ）、上と同
じ）が、腎臓腫瘍細胞においては、阻害的効果を示しく
ネルメン（Ｎｅｌｓｏｎ）等、プロシーディング・イン
・アメリカン・アソシエーション・フｔ’キャンサー・
リサーチ（Ｐｒｏｃ、Ａｍｍ、　Ａｓｓ。

ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、２６巻
３５頁、　１９８５年）、また、ブルーティ’ボーイ（
Ｂｒｏｕｔｙ−Ｂｏｙｅ）等は、それが胎児肺細胞にお
いて、中性の効果をもつ事を報告した（バイオテクノロ
ジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１２巻１０頁１
９８４年）。

ヒトの内皮細胞におけるｔ−ＰＡ合成は、トロンビン（
レビン（Ｌｅｖｉｎ　）等、トロンボシス・アンド・ヘ
マトスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄＨｅｍａ
ｔｏｓｔａｓｉｓ　）５６巻（２）、１１５〜１１９頁
（１９８６年））、アルコール（ローブ（Ｌａｕｇ　）
、ジャマ（Ｊａｍａ）　２５６巻（６）７７２〜７７６
頁１９８３年Ｂ）、ビタミンＣ及びビタミンＡ（イナダ
（ｌｎａｄａ）、等バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎｓ）１３０巻（１）、１８２〜１８７頁
、１９８５年）により、促進される。しかし、子ウシの
内皮細胞におけるｔ−ＰＡの分泌は、トロンビン（ロス
クトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）、ジャーナル・オブ・ク
リニカル・インブスチゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　）
　、　　６４巻、３２９〜３３２頁、１９７９年）及び
内毒素 （クルチレー（Ｃｒｕｔｃｈｌｅｙ）等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）２６１．１５４−１５９．１９８６年）により阻害さ
れる。

ブタの内皮細胞からのｔ−ＦＡ分泌は、ヘパリンによっ
て、影響をうけるが（マークワード（Ｍａｒｃｋｗａｒ
ｄｔ　）等、トロンボシス、リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏ
ｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　、８巻、２１７〜２２
３頁１９７６年）、一方、ヒトの胎児肺細胞ではヘパリ
ンは小さい効果しかもたない。

また、ｔ−ＰＡの合成には、胎児肺細胞（ブルーティー
ボーイ　（Ｂｒｏｕｔｙ−ｂｏｙｅ）、上記）及び上皮
細胞（エレクトリカラ（Ｂｌｅｃｔｒ　ｉｃｗａｒａ）
等、トロンボシス・アンド・ヘマトスタシス（Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓａｎｄ　　Ｈｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ　）
５３巻、２００〜２０３頁、１９８５年）におけるコン
カナバリンＡ１上皮細胞（エレクトリカラ（Ｂｌｅｃｔ
ｒ　ｉｃｗａｒａ）等、上記）及びメラノーマ細胞（シ
ラン（Ｓｉｌａｇｉ）等、バイオロジカル・メディシン
（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、５７巻
、４１８頁１９８４年）における、５−アサシチジン、
メラノーマ細胞におけるチザブリン（ロバ（Ｒｏｂａ）
　等、）ロンボシス、アンド・ヘマトスタシス（Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　　Ｈｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ
　）５０巻（１）、８３頁１９８３年）及びヘパトーマ
細胞におけるアフィジコリン（オーマノラダキス（Ｏｒ
ｆａｎｏｕｄａｋｉｓ）等、バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、
ホブーセイラー（Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ）　、３３
６巻（９）、８３２頁１９８５年）がポジティブな影響
を与える。

刊行されているヨーロッパ特許出願第０２１９２７０号
では、ヘパリンと内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）を組合
せると、無血清培地中の、正常なヒトの二倍体肢繊維芽
細胞からのｔ−ＰＡ及び、−本領ウロキナーゼプラスミ
ノーゲン活性化因子の産生が増大すると報じている。

チャイニーズ・ハケスターの卵巣細胞における酪酸の影
響が、ストーリー（Ｓｔｏｒｒｉｅ）等（ジャーナル・
オブ・セル・フィジオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣ
ｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　）　、９４巻、６９〜
７６頁、１９７８年）及びライト（Ｗｒｉｇｈｔ　）　
　（ｚシスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌＣｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、７８巻
、４５６〜４６０頁、１９７８年）によって報告されて
いる。しかし、これらの研究は、トランスホームされて
いない細胞で行なわれており、またその結果は、細胞の
形態や生育速度に大きく依存している。

本発明は、用いるタンパク質誘導物質が、チオグリコー
ル酸、チオジグリコール酸、Ｌ−システイン、グルタチ
オン、臭化ブチリルコリン、塩化ブチリルコリン、ノナ
クチン酸、フラン脂肪酸、ススコルビン酸、アフィジコ
リン、６−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−３−へブテ
ン−２−オン、フザリン酸、メバロン酸、トランスアン
ヒドロメバロン酸、アンヒドロメバロン酸ラクトン、シ
ス−アンヒドロメバロン酸ラクトン又はＤ−α−ヒドロ
置換（Ｃ３又はＣ４）脂肪族モノ又はジカルボン酸もし
くは、これらの塩であることを特徴とする、細胞培養物
の中に、タンパク質の生産を誘導する物質を添加するこ
とにより、これらタンパク質の生産を増加させる方法に
関するものである。

問題とするタンパク質としてはプラスミノーゲン活性化
因子、特に、ｔ−ＰＡ及びその変異体が望ましい。しか
し、本方法の効果は、タンパク質や、これらタンパク質
をコードするＤＮＡには依存せず、それゆえ、いかなる
外来タンパク質をも発現するようトランスホームしたＣ
ＨＯに応用することができる。

変異体ｔ−ＰＡは、天然のｔ−ＰＡの対応する部位のア
ミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を１つ以上もつか、あ
るいは、天然のｔ−ＰＡの１つ以上のアミノ酸残基をも
たない、ｔ−ＰＡの誘導体である。この種の、いくつか
のｔ−ＰＡ変異体は、文献、特に上記の特許出願、例え
ば、ＥＰ−Ａ１９９．５７４及びＤ　Ｅ　−Ａ　３７０
８６８１に報じられている。

本発明の方法は、トランスホームしたＣＨＯ細胞に応用
されることが望ましい。

また、Ｃ３−６脂肪族モノカルボン酸及びその塩は、ト
ランスホームしたＣＨＯ細胞培養物において、ｔ−ＰＡ
及びその変異体の生産を向上することができることが分
った。

好ましい、タンパク質生産促進物質には、チオグリコー
ル酸、ノナクチン酸、酪酸及び、プロピオン酸がある。

このタンパク質生産促進物質は、市販されているものも
あるし、文献から明白なものもあるし、場合によっては
従来法で合成されたものもある。

化合物、臭化及び塩化ブチリルコリン、フザリン酸、マ
バロン酸ラクトンは、市販されているもので、例えば、
ＵＳＡ、ミズリー州、セントルイス、シグマ化学社から
、入手できる。

ノナクチン酸及び、その合成法は、例えば、ヘルプ・ヒ
ム・アクタ（Ｈｅｌｖ　、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、）
、ＸＬＶ巻、（１９６２年）、ＮｔＸ１５〜１６，１２
９〜１３８頁、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ　）、３６巻、階１．４６〜４９頁及び、ジャーナル
・オン・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、　Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ　、　）、１９８０年、４５巻、４２５９〜４
２６０頁に報告されている。

種々の文献、例えば、リピッド（Ｌｉｐｉｄ　）　　、
１９７７年、１２巻（１０）、８２８〜３６、ジャーナ
ル・オン・ケミカル・ソサイアティー・アンド・ケミカ
ル・コミュニケーション（Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　ｓｏｉ、Ｃｈｅｍ、　［’ｏｍｍｕｎ、　
　）　　１９７６年）、（１６）、６３０〜６３１頁、
リビッド（Ｌｉｐｉｄｓ）、１９７５年、１０　（１１
）、６９５〜７０２及びツェナ・セイフエン・アンスト
リッヒミテル（Ｆｅｔｔｅ　；　５ｅｉｆｅｎ、　Ａｎ
ｓｔｒｉｃｈｍｉｔｔｅｌ、　）　、Ｎｏ、８゜１９８
６年、２９０〜２９２頁は、フラン脂肪酸について報告
している。

この種の有用な酸も、次の図に従って反応を行ない合成
することができる。

ここでｍ＝２〜５、好ましくは４、 ｎ＝４〜１２、好ましくは８又は１０ 化合物２及び６の合成は、ボス（Ｖｏｓｓ）等（ヘルプ
・ヒム・アクタ（Ｈｅ１ｖ、　［’ｈｉｍ、　Ａｃｊａ
、）、１９８３年、６６巻、２２９４頁に報じられてい
る。

好ましくはｍ＝４、及びｎ＝８又は１０゜トランスーア
ンヒドロマバロン酸合成については、Ｈ，ディークマン
（Ｄｉｅｃｋｍａｎ）により報じられている（アーチブ
・ファ・マイクロバイオロジー（Ａｒｃｈｉｖ　Ｆｉｉ
ｒ　Ｍｉｃｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ　）、６２巻、３２
２〜３２７頁（１９８６年）、“ディエ・イソリエラン
グ・ランド・ダルステラング・フォノ・トランス−５−
ヒドロキシ−３−メチル−ペンタン−２−ザウア（Ｄｉ
ｅ　Ｉｓｏｌｉｅｒｕｎｇ　ｕｎｄＤａｒｓｔｅｌｌｕ
ｎｇ　　ｖｏｎ　　ｔｒａｎｓ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−
３−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｎ　−２−５ａｉｊｒｅ
）″　）。化合物アンヒドロマバロン酸ラクトン及びシ
スーアンヒトロマバロン酸ラクトン及びその合成法につ
いては、ケダー（Ｋｅｄｅｒ）等によって報じられてい
る（バイオケム・ゼイツリフト（Ｂｉｏｃｈｅｍ　　Ｚ
ｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　）。

３４１巻、３７８〜３８６　（１９６５年）、ディエ・
ビルゾング・フォノ　１．−アンヒドロマバロンザウア
ラクテン・ダルヒ・ヘルシーテン・ビルゼ（Ｄｉｅ　Ｂ
ｉｌｄｕｎｇ　　ｖｏｎｌ　２−＾ｎｈｙｄｒｏｍａｖ
ａｌｏｎｓａｉｊｒｅｌａｃｔｅｎ　ｄｕｒｃｈ　ｖｅ
ｒｓｃｈｉｅｄｅｎｅ　Ｐｉｌｚｅ　）。

化合物６−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−３−ヘプテ
ン−２−オンは、当分野での従来法により合成すること
ができる。また、それは、天然物であり、Ｃ，Ａ、　　
９７　；　１５９５５２９　、及びエイヨー・ト・シフ
クリヨー１９８２年、３５（２）。

９５〜１０１頁で報じられているように、カビスカム・
アナンス・バー・アングロサム（Ｃａρｉｓｃｕｍａｎ
ｎｕｎｓ　ｖａｒ　ａｎｇｕｌｏｓｕｍ　）から単離す
ることができる。また、この化合物は、ストレプトマイ
セスオリバセウス　（Ｓｔｒｅｐｌｏｍｙｃｅｓ　ｏｌ
ｉｖａｃｅｕｓ　）の培養による合成（Ｔｕ３０８２株
、ブダペスト条約に従がい、Ｎｏ、４３０９として１９
８７年１１月２３日、ジャーマン・コレクション・オン
・マイクロオーガニズムス（Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎ　１５ｍ５
）に登録された）とその単離と同様に、ゲッチンゲン大
学のＲ，ブローチ（Ｇｒｏｔｅ　）により、“ネウエ・
セクンダ・ルストフェ・アウス・ストレプトミセステン
（Ｎｅｕｅ　５ｅｋｕｎｄ！ｒｓｔｏｆｆｅａｕｓ　Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔａｎ　）　；イソリエラング
・ランド・ストラフタル　オウフクララング・デル・コ
ラボミシン、ピロラメ・ランド・デス　ピリダソミシン
ス（Ｉｓｏｌｉｅｒｕｎｇ　ｕｎｄ　　５ｔｒｕｋｔｕ
ｒａｕｆに１ｉｊｒｕｎｇ　ｄｅｒ　Ｃｏｌａｂｏｍｙ
ｃｉｎｅ、　Ｐｙｒｒｏｌａｍｅ　ｕｎｄ　ｄｅｓＰｙ
ｒｉｄａｚｏｍｙｃｉｎｓ　）”という論文に報じられ
ている。

それは次に示すようなＮＭＲスペクトルをもつ。

Ｃ，Ｈ，，０２（１５６，２３） Ｅ　Ｉ　−ＭＳ　：ｍ／ｅ　＝１３８　　（Ｍ”　−Ｈ
，Ｏ。

高分解能、Ｃ，Ｈ，，０，６％）； １２３　　（Ｍ”　−ＣＨ３０，８％）；９８　（高分
解能、Ｃｓ　Ｈｉｏｏ、４８％）。

８３（１００％） ’ＨＮＭＲ（２Ｑ　ＯＭＨｚ、ＣＤＣ１５）　　：δ＝
１．２７　　（ｓ、７　　Ｈｓ　　ｕ、　　８　　Ｈｓ
　）　　：１．４３（ｓ、ブロード、ＨＯ，ＭｅＯＤと
交換）；２．２１　　（ｓ、Ｉ　　　Ｈ３）　　；２．
３５　　（ｄ、Ｊ＝１．３　　Ｈ２，９８３）；２．３
２　　（ｓ、ｂｒｏａｄ　、　　５−Ｈ２）　　；５．
１３　　（ｓ、ｂｒｏａｄ　、　　３−Ｈ）　　ｐｐｍ
”Ｃ−ＮＭＲ（５０，３ＭＨ２，ＣＤＣ１，）：δ＝２
２．０　　（ｏ、Ｃ−９）　　；３０．０　　（ｏ、２
Ｃ，Ｃ−７ｕ、Ｃ−８）；３２．０　　（ｏ、Ｃ−１）
；５４．４（ｕ、Ｃ−５）；７１．１　　（ｕ、Ｃ−６
）、１２７．２（ｏ、Ｃ−３）；１５５．１　　（ｕ、
Ｃ−４）　　； １９８．６　　（ｕ、　　Ｃ−２）　ｐｐｍ指定した酸
の塩の例としては、特にアルカリ金属塩、好ましくは、
ナトリウム及びカリウム塩があげられる。

本発明の方法は、血清含有培地、又好ましくは、無血清
培地で行なわれる。

もし、末法が血清含有培地で行なわれる場合は、例えば
チオグリコール酸、ノナクチン酸又はフラン脂肪族ある
いはそれらの塩を使用するのが好ましい。

もし、末法を無血清培地で行う場合は、Ｃ８−３脂肪族
モノカルボン酸、さらに好ましくは、酪酸又はプロピオ
ン酸もしくはそれらの塩を用いるのが望ましい。

タンパク質の生産を増加する化合物は１０μＭから５０
０ｍＭ、例えば、１ｍＭから１ｍＭの）゛農度でその効
果を示すことが分っている。（Ｃｘ−ｓ　）脂肪族モノ
カルボン酸、チオグリコール酸、チオジグリコール酸、
Ｌ−システイン及びグルタチオンもしくはその塩が特に
、１ｍＭから１０ｍＭの範囲で効果的である。

タンパク質生産を増加する物質は、培養の３日目の終り
までの、培養の期間、例えば０日目、すなわち、培養の
開始時に添加する。

また、タンパク質生産を増加する物質は、何回か適用す
ることもある。つまり、細胞を、その物質の存在下で培
養し、培地からその細胞を取り出してから、新しい培養
培地に移し、タンパク質生産を増加する物質の存在下培
養する。この多重適用においては、特に、Ｃ５−６脂肪
族モノカルボン酸又はその塩、好ましくは、酪酸及びチ
オグリコール酸又はそれらの塩が、促進効果を示す。

多重適用を行う場合、すべての適用に同じ物質を使う必
要はなく、むしろ、１つの適用に対して１つの物質が、
別の適用には、別の物質が使われる。また、この多重適
用は、特に、１つの適用にアフィジコリンを用い、別の
適用に他の物質、例えば、酪酸、プロピオン酸、塩化ブ
チリルコリン又は臭化ブチリルコリンあるいはそれらの
塩を使用する時などに見られるように、促当効果を示す
。

２つ以上の物質を組合せて使用することもできる。でき
れば、細胞の生育を阻害する物質は、一つも使わない事
が望ましい。たとえば、Ｃ１−３脂肪族モノカルボン酸
、好ましくは、酪酸及びチオグリコール酸もしくはそれ
らの塩を使用し、第２の物質としてモノカルボン酸又は
その塩を細胞培養物に添加するのが好ましい。

トランスホームしたチャイニーズ・ハムスターの卵巣細
胞とは、培養により、望ましいタンパク質を合成及び発
現できる、それらタンパク質をコードするベクターでト
ランスホームしたＣＨＯ細胞である。

例えば、使用したトランスホームしたチャイニーズ・ハ
ムスターの卵巣細胞は、ヨー口・ツバ特許出願第００９
３６１９号及び第０１９９５７４及びドイツ特許出願第
３７０８６８１号に報告されている細胞がある。

これらトランスホームしたＣＨＯ細胞を培養することに
より、ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｅ　Ｐ　−ＡＯＯ９３６１９）
及びあるｔ−ＰＡ変異株（ＢＰ−Ａ　　０１９９５７４
及びＤ　Ｅ　−Ａ　３７０８６８１）を合成することが
できる。

ベクターでトランスホームしたＣＨＯ細胞で、他のタン
パク質を発現する細胞が、ここで参照しているヨーロッ
パ及びドイツ特許出願等の文献で知られる方法によって
作られている。

使用する宿主細胞には、パック（Ｐｕｃｋ）によって、
１９５７年生検物質から単離された、ＣＨＯ−に１とい
う名で知られる細胞があり、１９７０年、ＣＣＬ−６１
という名で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（ＡＴＣＣ）に保管された
。この細胞系列は、ブダペスト条約に従がい、ＣＲＬ　
９６１８という番号で、１９８７年１２月２３日、ＡＴ
ＣＣに保管された。

望ましいタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、例えば
、先に述べた特許出願のような、文献に見られる方法に
よって調製することができる。この配列と、同時に制御
配列を含むベクターを、例えば、ブダペスト条約に従が
い、５３７０４号及び５３７０５号として、１９８７年
１２月２３日にＡＴＣＣに再登録した、大腸菌ｋ　１２
２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６”）及び大腸菌Ｘ　１７
７６　　（ＡＴＣＣ３１５３７）を用い、従来から知ら
れている方法により構築することができる。これらベク
ターの例には、ＥＰ−Ａ０９３６１９で報告されている
、プラスミドｐ　ＥＴＰＢＲ及びｐＥＴＰＦＲが含まれ
る。ＣＨＯ細胞は、ＥＰ−ＡＯ９３６１９，ＤＰ−Ａ３
７０８６８／、ＥＰ−Ａ　０１１７０５９及びＥ　Ｐ　
−Ａ　１９９５７４又は文献から知られる他の方法によ
って、トランスホームされる。

ｔ−ＰＡ生産のためのベクターをサブクローン、ＣＨＯ
−ｋ　１−ＤＵＸＢｌ　１　　（アララブ（Ｕｒｌａｕ
ｂ）等、プロシーディング・オン・ナショナル・アカデ
ミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏ
ｆＮａｔｉｏｎａｌ＾ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　）、　Ｕ　Ｓ　Ａ、　　７７巻、４２１６〜４２
２０頁１９８０年）に組込む。この細胞系列、ジヒドロ
ホレート・リダクターゼ・マイナス変異株（ＤＨＰＲ−
）は、そのトランスホームした細胞クローンのＤＨＰＲ
依存の選択に適している。ヒトのＣＤＮＡに対するベク
ターには、よく知られているプラスミドベクターｐＢＲ
３２２又はその大腸菌誘導体がある。問題としている遺
伝子及び、ＤＨＰＲ遺伝子のプロモーター領域はＳＶ４
０由来のものであり、また両遺伝子の停止領域は、ヘパ
ティティ２８表面抗原由来のものである。例の中に、プ
ラスミドｐＥＴＰＥＲ又はｐ　Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｆ　Ｒ（Ｅ
　Ｐ−ＡＯ１１７０５９参照）によッテトランスホーム
したＣＨＯ−ｋ　１−ＤＵＸＢｌｌ細胞が使われている
。

無血清培地として、種々の製品を使用することができる
（例えば、ＢＭＦＴ−ステータス・セミナー（ＢＭＦＴ
　−３ｔａｔｕｓ　Ｓｅｍ１ｎａｒ）　　１２　　（１
９８５年、１１月１３日）、フェデラル・ミニストリー
・オン・リサーチ・アンド・テクノロジー（Ｆｅｄｒａ
ｌＭｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ
　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、　５３００ボン（Ｂｏｎｎ
）　２．　１１１〜１２０頁）。次に示す例では、新し
く開封した、ＤＭＥＭ／　　Ｈａｍ’５Ｆ１２培地（１
：　１）（ギブコ製（Ｇｉｂｃｏ））を無血清培地とし
て用いた。添加物として、胎児のウシ血清（ＦＣ３）を
、７．５％又は１〜２％の濃度で使用する。

この細胞培養物を、へりウス（Ｈｅｒｅａｕｓ）インキ
ュペター中、３７℃でインキユベートシ、相対湿度１０
０％の、７．５％ＣＯ２を含む、二酸化炭素と空気の混
合物を供給する。そのバッチにより、異なる培養器を使
用した；１００〜１０１００Ｏ！培地には、スピナーベ
セル、１７５ｃｆｌｌ（７０〜１００ｍｊ！培地）、７
５０１Ｉｌ（３０〜５０ｍ１培地）。

２５ｃｒｌ（７〜１０ｍ１培地）のローウス（Ｒｏｕｘ
）皿（ナンク（Ｎｕｎｃ））及び１　ｍｌ培養物に対し
ては、２ｃ＋ｆのコスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）で作った多
重培養皿等。

この株を維持するため、この細胞は、 ０．２〜０．３ｘｌＯ’個／ｒｎ１の密度で使用し、２
〜３日毎サブクローンした。

タンパク質生産を促進する物質を、種々の段階で、１０
０分の１希釈となるよう添加した。すなわち、まず、そ
れらを、まず培地で溶かすか、もし、それらが容易に溶
けない場合は、−度エタノールに溶かし、それから培地
に加え、ついで、この物質を含む培地を、１：１００ｖ
／ｖの比で、細胞含有培地に添加する。

次に示す例では、ｔ−ＰＡの合成を促進するため、対数
増殖期の細胞をベックマンＴ、−６遠心機で、１１００
０Ｘ・１０分間、プラスチック試験管（ファルコン製）
を用いて遠心した。上清をデカンテーション後、細胞ペ
レ・ノドを、新鮮培地に再懸濁する。

血清含有培地におけるｔ−ＰＡ生産には、新鮮培地に、
Ｆ　１２／ＤＭＥＭ＋７．５％ＦＣ３＋ゲンタマイシン
を用いた。その懸濁液を２ＣＬＩＩの２４穴デイツシユ
に、０．２〜０．３Ｘ１０ｈ細胞／ｍａｌとなるように
調製した。

無血清培地でのｔ−ＰＡ生産には、その細胞をまず、１
〜２％ウシ胎児血清培地中、３〜４日間処理し、再び遠
心後、その細胞ベレ・ソトを、無血清培地に再懸濁し、
その後、細胞密度が０．４〜０．５Ｘ１０’細胞／ｍｊ
！となるよう、２ｃｎ１２４穴デイツシユに移した。

（定量的ｔ−ＰＡの測定） 細胞上清及び細胞抽出物の部分標本を種々の時間に取り
出すか、もしくは調整する。この試料を直ちに、もしく
は、−２０℃での保存の後、次の方法に従って測定する
。

（測定法） （１，直接的比色検定（ＤＣＡ）） ｐ−ニトロアニリンを、ｔ−ＰＡを用い、メスルス・カ
ビ・ディアグノスチカ（Ｍｅｓｓｒｓ＋にａｂｉ［］ｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃａ）の合成ペプチド基質５−２２８８
（Ｄ−Ｈ−１１ｅ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−Ｐ　−ニトロ
アニリン）由来の反応産物として作る。ｔ−ＰＡの活性
は、３７℃、４０５ｎｍで測定される、ｐ−ニトロアニ
リンの生成に比例する。

この酵素の速度論の分光学的測定は、メスルス、エソベ
ンドルフ（Ｍｅｓｓｒｓ、　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）製の
ＡＣＰ−５０１０分析機を用い、自動的に行うことがで
きる。

この酵素の活性は、標準物質を用いて計算した。

１〜１５μｓ／ｍＩｌの一連のｔ−ＰＡ標準物質を、７
２％の一本鎖物質を含む研究室標準物質を用いて調製し
た。

基質溶液（１００ｍＭトリス／１０６ｍＭＮａＣｆ）は
、５０ｍＭ濃度で使用した。

（２−イライザ法） イライザ法（酵素結合免疫吸着検定法）を用い、上清及
び細胞抽出物のｔ−ＰＡ試料を定量的に測定した。用い
た標準物質は、０．０３８〜５μｇ／ｍｌｌの一連の濃
度の研究室標準物質である。試料はあらかじめｌ：１０
から１７１０００に希釈した。

（トランスホームしたＣＨ○細胞の特徴）（細胞の増殖
） 培養皿（７，５％ＦＣ３を含む）中に ０．２〜０．３　Ｘ　１０’細胞／ｍ７！となるようＣ
ＨＯ細胞を接種すると、最初は非常にゆっくりと複製が
起こる。２４時間継続するラグタイムの後、対数増殖期
が始まる。１．３±０．０４Ｘ１０ｈ細胞／ｖａｌｌの
細胞密度となる４日目に培養液中に、最初の死細胞が出
現する。全細胞数のうち；それら細胞の割合は、１３．
２±１．３％であった。最高細胞密度は、５日目に、１
．８±０．０５ＸｂｍＡに到達する。

生細胞の数は、７日目には、まだ全細胞量の７２±３％
存在する。

指数的細胞増殖につづいて、停止期が種々の要因により
始まる。高密度と、基本的栄養の消費の結果、細胞はも
はや分裂できない。停止期の期間は、かなりまちまちで
あり、血清のような培地成分に°依存する。酸及び毒性
の代謝産物の蓄積と、培地の因子の変化も細胞を死滅さ
せる。

（ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡの生産）細胞増殖と、ｔ
−ＰＡ合成には直線関係がある。

経時的ｔ−ＰＡ生産のパターンは、２つの相を示す。第
１の相では、上清中のｔ−ＰＡＬＭ度は、一定に増加す
る。第２の相では、酵素合成は事実上停止し、培地中の
ｔＰＡ？ａ度は、実質的に一定に維持される（図２Ａ）
。イライザ法によると、最高のｔ−ＰＡ濃度は、４日目
で１１．１±０．７μｇ／ｍＩＬであった。測定したｔ
−ｐＡ濃度は、比色検定ではいくぶん高い値を示したが
、これは、２末鎖ｔ−ＰＡに寄因するものらしく、イラ
イザ法と比べると、４日目まで、雨検出法の曲線は平行
線をたどる。

また細胞内ｔ−ＰＡも、細胞増殖と平行しており、また
、それは、合成された全ｔ−ＦＡＩと比較すると非常に
低い値を示す４日目でのその割合は、全活性の７％であ
った（図７Ｂ）。

図３八にみられるように、ｔ−ＰＡ合成は細胞増殖に基
づいて、４日目までゆっくりと増加する。

イライザ法によると、ｌＸｌ０”細胞当り最高１．８±
１．２μｇのｔ−ＰＡが検出された。細胞に結合したｔ
−ＰＡは、これらのｔ−ｐＡ濃度が低すぎて（１μｇ以
下）、ＤＣＡでは測定できないため、イライザ法のみで
測定した。

細胞数に基づく、細胞内ｔ−ＰＡ含量は、細胞増殖の対
数期には、いくぶん高く、１×１０６細胞当り、５００
〜９００ｎｇのイ直を示し、４日目から、そのｔ−ＰＡ
値は、ｌＸｌ０６細胞当り約４５０ｎｇとなった（図３
Ｂ）。

（細胞増殖における培地中の血清及び血清因子の影響と
、ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産）培地中の血清濃度
を、いろいろ変化させ、０．２５Ｘ１０６細胞／ｌ１１
１に細胞液を調製した。

培地中５％以下の血清濃度は、細胞分裂に影響しないが
、生産にはわずかな影響を与えた。

細胞の４８時間インキュベーション後の、細胞増殖及び
ｔ−ＰＡ生産への、培地中の血清濃度の影響を、表１に
示した。値は、最高値に対する割合で示しである（培地
中７．５％ＦＣ３）。細胞数の最高値は０．５６±０．
０３Ｘ１０６個であり、ｔ−ＰＡ濃度の最高値は５．７
±０．５μｇ／ｍｌであった。ｔ−ＰＡの測定は、ＤＣ
Ａによって行った（平均±ＳＥ、ｎ＝４）。

表　　　１ ％ＦＣ３細胞数　　ｔ−ＰＡ ４０　６１．５±２．８５９．２±３．９２０　７９．
４±３．８８１．２±２．４１０　８８．６±５．３９
０．３±６．７７．５１００．０±６．４１００．０±
７．９５　７２．４±４．９８７．０±１１．３１　４
３．１±１，５７９．２±６．７（無血清培地における
細胞培養） 無血清培地に、０．４〜０．５ｘｌＯ’細胞／’＋ｎｌ
となるよう細胞液を調製した。４日目まで細胞は分裂を
繰り返し、生細胞の最高値も４日目に１．０±０．２ｘ
ｌＯ’細胞／ｍｌに到達した（図４）。

（無血清培地におけるｔ−ＰＡ生産） 上清中のｔ−ＰＡ濃度は、７日目まで一定して増加し、
イライザ法によると、最高１３．６±０．５４μｇ／ｍ
ｌｌに到達した。ＤＣＡで測定したｔ　−ＰＡ値は、１
日目から３日目まで、イライザ法によるｔ−ＰＡ値より
も低かったが、４日目から先は、その値よりも高くなっ
た（図５）。

無血清培地における細胞当りのｔ−ＦＡ合成は、血清含
有培地とほぼ同様であり、７．２±３．６と１０．３±
２．８（μｇ／１ｘｌＯ’細胞）の間の値となった（イ
ライザ法）（図６）。

上清中の全タンパク質量に基づく、無血清培地中のｔ−
ＦＡの割合は、１０．９±１，０と１２．５±１．４（
％）の間であった。その結果を表２に示す。ｔ−ＰＡ値
はイライザ法で測定した（平均±ＳＥ、ｎ＝４）。

表　　　２ 日　　タンパク質（μｇ／ｌＸｌ０ｈ細胞）　　ｔ−Ｐ
Ａμｇ／ｌＸｌ０’細胞１７１．０±８．０　７．２±
３．６ ３８１．８±９．４　９．０±２．３ ５８２．０±１２．２　９．３±０．８（脂肪族モノカ
ルボン酸の効果） 種々の脂肪族モノカルボン酸に対する、７．５％ＦＣ３
含有培地におけるＣＨＯ細胞のｔ−ＰＡ生産の増加を表
３に示した。全ての酸は、１０ｍＭから５００ｍＭの範
囲で使用した。全てのモノカルボン酸に対して、最適な
投与範囲は、ｌから１０ｍＭの範囲であった。その酸の
効果は、鎖の長さに依存する。

全ての効果的なモノカルボン酸は、細胞増殖を■害する
。プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸及びイソ吉草酸は、細
胞増殖の阻害をもたらす一次代謝の濃度依存の阻害が、
ｔ−ＰＡ合成の増加と一致するので、広い濃度範囲で有
効であった。

表３に示した値は、１　ｍｊ！の細胞上清についてのも
ので、コントロール（０％）と比較して、％で与えられ
ている。ｔ−ＰＡはＤＣＡで測定した（平均±ＳＥ、ｎ
＝３〜２４）。最高値は個々の試料についてのものであ
る。独特の試料のデータをカッコ内に示した。

表−−１ ｔｉｌＬボン酸　最適投与範囲　ｔ−ｐへ合成の増加（
χ）最　高　　　　平均 ギ酸　１００ｕ門　　７．４　６．５±０．９プロピオ
ン　酸　　　５４０ｍＭ　　（１０ｍＭ）　　　　４５
，５　　　２８．０±２．５酪　　酸　　１−５ｍＭ　
　（１ｍＭ）　　　６８．３　　４１．９±３．８イソ
醋酸　０．６−１０ｍＭ（１６−１Ｏ３２，９１６，６
±２．８イソ吉草酸１−２０ｍＭ　（５ｍＭ）　　３９
．３　１８．７±２．４平均値は、表３Ａに示すように
、モノカルボン酸を培養の０日目から３日目に添加した
、３〜４日つづけた何回かの生産実験から得たものであ
る。

独特の試料のデータを、カッコ内に示しである。

表３Ａ モノ力）ｔギン酸添加日　　　サンプリング日　　　　
　　ｎギ　　　酸　　　　　　　１０（０）　　　　２
−３（２）　　　　　４プロピオン酸　　　０−３（２
）　　　１−４（３）　　　　２４凸各　　　　酸　　
　　　　　　　　１　（３）　　　　　２−４　（３）
　　　　　　１８イソ酪酸　　　　０−２（３）　　　
２−４（３）　　　１１イソ吉草酸　　０−２（４）　
　１−４（４）　　　１９図７は、Ｃ３−、モノカルボ
ン酸によってもたらされた、７．５％ＦＣ３を含む培地
中での、ｔ−ＰＡ生産増加の時間曲線を示している。２
４時間後、すでに、１８．１±５．７％（Ｃ４）から、
２４．８±０．５％（Ｃ３）のｔ−ＰＡ生産の増加を検
出することができる。イソ酪酸の場合、４８時間が経過
するまで、生産の増加はない。ｔ−ＰＡ生産の最高の増
加は、３日目の、Ｃ３及びＣ４カルボン酸の使用時に認
められ、酪酸ナトリウムで、３７．２±５．１％に及ん
だ。生産の増加は、酪酸及びイソ酪酸の場合、短期間で
あり、４日目の増加はもはや認められない。一方、プロ
ピオン酸及びイソ吉草酸の増加効果は、４日目にもあり
、また、それ自身、Ｃ１に対しては、３１．８％及びＣ
３に対しては８．５％のｔ−１）Ａ生産の増加を示した
。

また、その効果は、細胞の生理状態に依存している。そ
の細胞は、対数増殖期の間、刺激に対し、非常に敏感で
ある。

表４は、Ｃｆｆ−５モノカルボン酸によるＦｅ１２．５
％含有培地におけるＣ　ＨＯ細胞のｔ−ＰＡ生産増加の
、カルボン酸適用日依存性を示し、７．５％ＦＣ３含有
培地で、その細胞が４８時間生育していることを表わし
ている。酪酸及びイソ吉草酸の濃度は１　ｍ　Ｍ　％プ
ロピオン酸とイソ吉草酸の場合は、５ｍＭを使用した。

その値は、細胞上清１−についてのものであり、コント
ロール（０％）と比較した％値で示しである（平均±Ｓ
Ｅ。

ｎ＝３〜５）、ｔ−ＰＡはＤＣＡにより測定した。

表　　　４ 適 用　　　　Ｃ３Ｃａ　　　　　　Ｃａ　＋　　　　　Ｃ
ｓ日 ０　２８．７±９．３　３３．０±　５．４　２０．１
±１０．７　１７．２±１．０１　２４．４±４．１　
４０．２±１２．２　２５．３±　５．１　１９．４±
１．５（ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産に対する酪酸
の効果） その促進効果は、細胞内ｔ−ＰＡＬＭ度かつ、細胞外ｔ
−ｐＡ＞１度の増加として検知される。

図８から明らかなように、酪酸処理した培養物中の細胞
内ｔ−ＰＡ含量の増加は、コントロールと比べ、２４時
間インキュベーション後に最大となる（４３．８±９．
８％）。上清における増加の割合は、２４時間後、コン
トロール値と比べて平均１９．２％（ＤＣＡ及びイライ
ザ法）といくぶん低い。この効果は、上清において、７
２時間継続する。

図９Ａ−Ｃは、ｔ−ＰＡの合成が細胞数に依存しており
、また、酪酸ナトリウムによるｔ−ＰＡ合成の促進は、
細胞増殖の阻害にもかかわらず、７日間以上も継続する
ことを示している。始めの４日間、細胞当りの酵素合成
は、一定に増加する。

上清ニオイテハ、ｔ−ＰＡｉａ１度は、ｌＸｌ０’細胞
当り、７．５±１．１μｇから２８．９±５，３μｇｔ
−ＰＡへと増加する（イライザ法）（図８Ａ）。

ＤＣＡ法を用いて、ｌＸｌ０’細胞当り、４７．４±７
．４μｇｔ−ＰＡの最高ｔ−ＦＡ含量が測定された（図
９Ｂ）。同時に、細胞内ｔ−ＰＡ含量は増加し、また５
日目には、ｌＸｌ０’細胞当り１．５±０．２μｇｔ−
ＰＡから低下している（図９Ｃ）。

表５は、７．５％ＦＣ３含有培地での醋酸によるｔ−Ｐ
Ａ合成の促進％、細胞数に基づくものであることを示し
ている。酪酸ナトリウムは、０日目に、１ｍＭ９４度と
なるよう添加した。１〜４日目日月は、コントロール（
０％）と比較した％で表示してあり、１×１０６個細胞
の値である。上清及び細胞抽出物中のｔ−ＰＡ含量は、
イライザ法で測定した（平均±ＳＥ、ｎ＝５〜１０）。

表　　　５ 日　細胞内　細胞外 １　９０．９±９．５　６８．５±１２．４２　９９．
７±２６．３　１１８．８±１６．１３　９３．９±３
１．４　２２３．４±７７．４４　２０９．８±４１．
４　２８０．７±８５．９生産の最高の増加は、酪酸す
）　ＩＪウムを、対数増殖期の細胞に加えた時達成され
た。通常、酪酸ナトリウムの最高の効果は、０日から２
日間までの適用間隔を設けたときの、第３日月に現れる
（図１０）。

同じ細胞集団において、培地を交換後、３〜３日毎に醋
酸ナトリウムを適用することにより、非常に長い間、高
いレベルのｔ−ＰＡ生産を維持することができる。

表６は、７．５％ＦＣ３含有培地で培養したＣＨＯ細胞
でのｔ−ＰＡ生産の増加を示している。１ｍＭの酪酸す
）　ＩＪウムは、培地を交換する度か、もしくは０日目
のみ添加した。培地交換後、各々２．４．７、又は９日
目の値を、コントロール（０％）と比べた％値で示した
。又、この値は、１ｒｎ１の細胞上清についての値でし
る。ｔ−ＦＡ測測定ＯＣＡで行った（平均±ＳＥ、ｎ＝
３）。

表　　　６ 培地交換日　　　　適用日、０，２，４．７２　　　　
　　　３３、０±５．４ ４　　　　　　１０７．４±７．６ ７　　　　　　　９６、６±５．８ ９　　　　　　　６２．０±４．８ （無血清培地中のＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生度に関
する酪酸の影響） 血清含有培地における酪酸塩処理によるｔ−ＰＡ合成増
加が短時間だったのに比べて、無血清培地での効果はよ
り長く続き、酪酸ナトリウム適用から１日後には、コン
トロールと比べ４４．１±７．１％となった。最高の増
加は、酪酸ナトリウム適用後３ロ目に、１４３．３±１
２．８％という値で達成された。増加効果は、酪酸ナト
リウム適用後６臼目にも、４９．９±７．０％という値
で検出された（図１１及び１２）。

ｌＸｌ０６個の細胞に基づく、ｔ−ＰＡ合成は、血清含
有培地でよりも、無血清培地の方がより大きく、ｌＸｌ
０６細胞当り、約５０μｇにまで達した（図１３）。

（プロピオン酸の効果） Ｃ３−カルボン酸のｔ−ＰＡ合成に関する効果は、酪酸
のものと同じである。しかし、増加の割合は、約り４％
少なく、またｔ−ＰＡ合成を促進するのに、より高い濃
度を必要とした（５〜１０ｍＭ）。さらに、プロピオン
酸は、細胞増殖の阻害効果はより小さく、それゆえ、Ｉ
ＰＡ合成の増加は、より長い時間継続される。

プロピオン酸によるｔ−ＰＡ合成の促進は、無血清培地
中では、コントロールに比べ、細胞外タンパク質含有は
わずかに増加したのみであり、また、Ｃ’Ｈ）ロイシン
の取込みもわずかに増加するのみであることから、酪酸
とは対照的に、非常に特異的であるようだ。

（ジカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸及びケトカルボ
ン酸の、ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産への効果） 乳酸、グリセリン酸、リンゴ酸及び酒石酸などのヒドロ
キシカルボン酸は、ｔ−ＰＡ合成で、６〜１０％の間の
、わずかな増加のみを示したが、１０ｍＭの濃度の酒石
酸は、ｔ−ＰＡ合成を最もよく促進した（コントロール
と比べて、１０．３±２．９％）。細胞分裂は、ヒドロ
キシカルボン酸によって影響をうけず、また、ｔ−ＰＡ
合成への効果は、９６時間後もなお検出することができ
た。

（アスコルビン酸の効果） １０　ｍ　Ｍ　４度のアスコルビン酸の、ｔ−ＰＡ生産
への効果は、７２時間も続き、また、０６目に適用した
時、２４時間後に、ｔ−ＰＡ合成を１５．２±３．１％
増加させた（図１４）。

（長鎖脂肪酸の、ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産への
効果） １０個の炭素元素をもつ、ノナクチン酸や、フラン脂肪
酸などの長鎖脂肪酸も、その増加を引き起こすことが分
った（表７）。この例では、式４に従うフラン脂肪酸は
ｍ＝４からｎ＝８のものを使用した。

しかし、無血清培地では、ｔ−ＰＡ合成、あるいは、タ
ンパク質合成の増加の証拠は得られなかった。

長鎖脂肪酸によって引き起こされたＣＨＯ細胞における
、ｔ−ＰＡ生産の増加は、表８に示した。

細胞は、７．５％ＦＣ３を含む培地で培養した。酸は、
１０８Ｍから１０ｍＭの範囲の濃度（最適濃度は１ｍＭ
）でテストした。その値は、ｌ　ｍｌの細胞上清のもの
であり、コントロール値（０％）と比べた％で示されて
いる（平均±ＳＥ、ｎ＝４〜９）。最高値は、個々の試
料について出したものである。ｔ−ＰＡは、ＤＣＡで測
定した。

表　　　７ ノナクチン酸　　５８．３　　３０゜３±６．５フラン
脂肪酸　　３２．１　　１９．０±３．２平均値は４日
間の実験を何回か行って出したものであり、また、酸は
、表８に示したように、０６目に添加した。独特の試料
のデータを、カッコ内に示した。

表７Ａ 脂肪酸　　　添加口　　　採取口　　ｎノナクチン酸　
　０（０）　　　１−４（２）　　　４フラン脂肪酸　
　０（０）　　　１−４（２）　　　９（ＣＨ○細胞中
のｔ−ＰＡ生産への、チオールとスルフィドの効果） カルボン酸の置換産物又は誘専体である含硫化合物は、
細胞状増殖に負の効果を与えることなく、ｔ−ｐＡ生産
を１６から３１．２％増加させる（表８）。置換カルボ
ン酸は、他の゛活性カルボン酸と同濃度範囲（１〜１０
ｍＭ＞で最適活性を示した。

グルタチオンのみは、１〜１０μＭの低濃度でも効果的
であった。チオグリコール酸は、ＣＨＯｔｌｌ胞におけ
るｔ−ＰＡ合成に好ましい促進剤であることが分った。

この例においては、細胞を、７．５％ＦＣ３を含む培地
で培養した。全ての物質は、１μＭから１０ｍＭの１・
店度範囲でテストした。表９に示した値は、ｌ　ｍｌの
細胞上清についてのもので、コントロール（０％）と比
べた％値で表わされている（平均値±ＳＥ、ｎ＝６〜１
９）。

最高値は、各試料についてのもので、ｔ−ＰＡ測測定、
ＤＣＡで行った。基質濃度をカッコ内に示した。

表　　　　８ チトル及び　　最適投与　　　ｔ−ＰＡ合成の増加％ス
ＩＬフィト　　　　範　　　囲　　　　最高値　　　平
均値チオグリコール　酸　　　１ｍＭ　　　　　　　　
　　　６６．４　　　　３１．２±３．２チオジグリコ
ール酸　　　１ｍＭ　　　　　　　　　　　３１．０　
　　　１８．０±３．８し一ンスティン　　　１−１０
　　ｍＭ（１ｍ１ｌ）　　　　４１．４　　　　２０．
９±３．４グルタチオン　　　　１−１０μＭ（１０μ
Ｍ）　　　３０．６　　　　１６．０±２．０平均値は
、３日間の、いくつかの生産実験についてのもので、そ
の物質は、表８Ａに示されているように、０日から２日
目に添加された。独特の試料のデータを、カッコ内に示
した。

表　　８　　Ａ チオール及び スルフィド　　　添加口　　採取口　　ｎチオグリコー
ル　酸　　　　　　　　０−２（１）　　　　　１−３
（２）　　　　　１９チオングリコール酸　　　　　　
　　　　１（１）　　　　　２−３（３）　　　　　　
９［、−システイン　　０−１（０）　　　１−３（２
）　　　１１グルタチオン　　　　０　（０）　　　２
−３　（２）　　　６モノカルボン酸に対する、チオカ
ルボン酸の利点は、細胞増殖に関する阻害効果がないこ
とであるが、ｔ−ＰＡの生産は、酪酸に比べて、これら
の物質によって、増加するということはない。増加効果
がある期間も短かく、チオグリコール酸に対しては２４
時間後、システィンに対しては４８時間後までその最高
値が維持される。細胞インキュヘーション４日後、ｔ−
ＰＡ生産への効果はなお小さい（図１５）。

しかし、無血清培地では、ｔ−ＰＡ合成に関する促進効
果は、全ての物質が１０％から２０％、細胞分裂を阻害
することから、血清含有培地中はど大きくなる。

（チオグリコール酸の効果） チオグリコール酸による処理後７２時間、ｔ−ＰＡ生産
は増加し、それは、適用の日に依存しない。酵素合成の
増加率は、２４時間に最高となり、それから徐々に低下
する。

表９は、適用する日に応じて、７．５％ＦＣ３及び１ｍ
Ｍチオグリコール酸を含む培地中、２４から９６時間培
養したＣＨ○細胞におけるｔ−ＰＡ生産が増加すること
を示している。その値は、■−の細胞上清についてのも
ので、コントロール（０％）と比べた％で表わされる（
平均±ＳＥ。

ｎ＝４〜６’）、ｔ−ＰＡはＤＣＡで測定した。

表　　　９ 時間（ｈ）　　　　適用日 ２４　２７．６±５．６３４．７±１０．９３４．５±
７．５４８　１６．９±２．３１７．１±３．６１６．
３±８．６７２　１４．７±１．０１０．２±２．７９
．４±１．７９６　３．４±１．０２．７＋　０．８０
．５±１．０ｔ−ＰＡ生産は１回ではなく、２回のチオ
グリコール酸の適用により増加される（図１６）。

図１７Ａ　（ＤＣＡ）及び図１７Ｂ　（イライザ）にお
いて、ｔ−ＰＡ合成曲線は、ｌＸｌ０”個の細胞に基づ
いて示した。ｔ−ＰＡ合或は、最初の３日間、ＩｍＭの
チオグリコール酸により、コントロールに比べ増加した
（ＤＣＡ）。一方、イライザ法で測定したｔ−ＰＡ値は
全期間にわたり増加した。４日目で、その増加率はなお
約３５％であった。また、細胞当りの細胞内ｔ−ＰＡ含
量も、チオグリコール酸により増加する。細胞内ｔ−Ｐ
Ａ濃度の最適値は、２４時間後の１．１±０．１μｇ／
ｌＸｌ０’細胞であり、また９６時間以内に、元の濃度
の半分に低下する（図１７Ｃ）。

細胞外ｔＰＡ？ａ度は、５日目に、コントロールに比べ
１０．７％増加した。チオグリコール酸によるｔ−ＰＡ
合成の増加率は、細胞分裂を若干阻害する（１０−２０
％）ことから、無血清培地において、′・くぶん低くな
る。

（ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産に関する、モノカル
ボン酸の１ｍ体の効果） Ｃ４カルボン酸誘導体のグループのうち、Ｃ１１０細胞
におけるｔ−ＰＡ合成への効果をもつ、他の物質がみつ
かっている。これらの物質には、まず、臭化及び塩化ブ
チリルコリン（ＢＣＢ及びＢＣＣ）が含まれ、これらは
、３０から４０％のｔ−ＰＡ生産を増加する。これらＣ
４誘導体は、全ての点で、酪酸ナトリウムと同様の効果
を示し、同）潰度で効果を示した。

表１０は、２つの先に示したモノカルボン酸誘導体によ
って達成される、ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産の増
加を示している。細胞は、７．５％ＦＣＳ含有培地で培
養した。全ての物質は１０μＭから１０ｍＭの濃度範囲
でテストした。その値は、コントロール（０％）に対す
る％値で示され、これらの値は、■−の細胞上清につい
てのものである（平均±ＳＥ、ｎ＝４〜１５）。独特の
試料に関する値をカッコ内に示した。ｔ−ＰＡは、ＤＣ
Ａによって測定した。

表　　　１０ ｔ　／　＊　Ｉ４　＊ン酸　最適投与　　ｔ−ＰＡ合成
の増加（χ）誘導体　　範　　囲　　最高値平　均　　
ｎＢＣＣ５〜１０ｍＭ（１０ｍＭ）　　６３．９　３８
．８±４．４　１５８ＣＢ　　５〜１０ｍＭ（２，５１
１１Ｍ）　４９．６　２９．１±４．４９平均値は、表
１０Ａに示したように、いくつがの４日間生産試験につ
いてのものである。独特の試料の値をカッコ内に示した
。

表１０　Ａ 物質　添加口　　採取口　　ｎ ＢＣＣ１（１）　　２〜４（４）　　１５８ＣＢ　　１
（１）　　２〜４（４）　　　９（異なるｔ−ＰＡ合成
促進剤を合せたときの効果）物質を組合せて用いるとき
、少なくとも１つの物質は、細胞増殖を阻害しない性質
のものでなければならない。

例えば、チオグリコール酸と酪酸を組合せて、収量の増
加が成し遂げられる。個々の物質の適用間隔が重要な役
割を果たし、例えば酪酸は、細胞増殖の阻害効果を軽減
するために常に第２の物質として添加される。

それらの物質がＯ日月に同時に投与されても、酪酸の効
果は増加しない。

その効果は、醋酸とチオグリコール酸の組合せに対し、
累積的である。最高増加値７０％が達成された。

無血清培地においては、酪酸の効果は、他の物質の添加
により、さらに増加することはない。

７．５％ＦＣ３を含む培地中で、３日間培養したＣ）１
０１ｉＩ胞におけるｔ−ＰＡ生産の増加を表１１に示し
た。種々の時間に、１ｍＭチオグリコール酸（ＴＧ）及
び１ｍＭ酪酸を組合せて、細胞に投与した。その値は、
１−の細胞上清についてのものであり、コントロール（
０％）に対する％値で表わされる（平均±ＳＥ、ｎ＝４
〜８）。

１−ＰＡはＤＣＡで：測定した。

表　　　１１ ０　　３１．３±１．７　６７．９±５．２　３０．３
±３．２１　　　　　　　　　６８．８±４．４　３１
．４±５．５２　　　　　　　　　　　　　　　　　４
１．４±５．５（アフィジコリンの効果） セファロスポリウム、アフイデイコラ （Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　　ａｐｈｉｄｉｃｏ
ｌａ）由来のジテルペン、アフィジコリンは、特異的に
ＤＮＡ・アルファ・ポリメラーゼを阻害し、１〜１０μ
Ｍの濃度で、ＣＨＯ細胞中のｔ−ＰＡ合成を促進する。

２４時間後、ｔ−ＰＡの収率は、４４．９±１３．９％
増加した。

アフィジコリンは、ＣＨＯＩ胞中のｔ−ＰＡ合成を促進
することが分った。それは可逆的にＤＮＡ合成を阻害す
るが、ＲＮＡ及びタンパク質合成には、影古しない。し
たがって、アフィジコリンは、一方ではｔ−ＰＡ合成の
促進に適しているが、−方では、細胞を同調させるのに
適している。細胞をアフィジコリンを含む培地中で、か
なり長い時間インキュベーションしたとき、ｔ−ＰＡ合
成に関するアフィジコリンの効果は、先に述べた。この
出来事は、２４時間、アフィジコリンにさらし、ついで
アフィジコリンを含まない培地中で培養したＣ　ＨＯ細
胞を用いた研究に関するものである。

ＤＮＡ合成の阻害及び、アフィジコリン除去後の合成の
回復をモニターするため、細胞周期の相及び２４時時間
へリングの間及びその後の（３Ｈｌチミジンの取込みを
分析した。さらに、ＲＮＡ、タンパク質及びｔ−ＰＡ合
成を測定した。

（細胞増殖） 細胞増殖はアフィジコリンによる２４時間の処理後、わ
ずかに阻害された（５〜１０％）。しかし、培地交換の
時、アフィジコリン処理培養物は、コントロール培養物
と同じ細胞数に戻した。

（む−ＰＡ合成） ｔ−ＰＡ合成は、１μＭアフィジコリン同調細胞で促進
された。その効果は、培地交換後９６時間までも確認さ
れた。

７．５％ＦＣ３含有培地で培養した１ｍＭアフィジコリ
ン処理ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産の増加を表１２
に示した。この値は１−の細胞上清についてのもので、
コントロール（０％）に対する％値で表わされている（
平均±ＳＥ、ｎ＝４）。

ｔ−ＰＡはＤＣＡを用いて測定した。

表　　　１２ ２．４　　　　　　　４０．２±　６．７４８　　　　
　　　５９、９±１１．１７２　　　　　　　３２、８
±　６．４９６　　　　　　　１４．７±　１．３図１
８は、無血清培地におけるｔ−ＰＡ合成増加の時間曲線
を示している。その効果は、培地交換後４８時間目に最
高値に達した。

無血清培地におけるｔ　　ＰＡ？ａ度は、イライザ法を
用いて、９６，１２０及び１４４時間後に測定され、一
方、コントロール値と比べて得られた、この値は、実質
的にＤＣＡで測定された値よりも高かった。その結果を
表１３に示した。テストは、無血清培地で培養した、１
μＭアフィジコリン処理ＣＨＯ細胞で行った。その値は
、ｌ艷の細胞上清についてのものであり、また、それは
、コントロール（０％）に対する％値で示されている（
平均±ＳＥ、ｎ＝４）、ｔ−ＰＡはイライザ法で測定し
た。

表　　　１３ 時間（培地交換後の時間）　　ｔ−ＰＡ合成の増加％９
６　　　　　　　３６、７±　６．２１２０　　　　　
　　４２、０±　８．２１４４　　　　　　　５１．３
±１０．２細胞内ｔ−ｐＡ濃度の増加は、アフィジコリ
ンとの２４時間インキュベーションの間に観測され、そ
れは、約３０％増加した。

酪酸、プロピオン酸、塩化及び臭化ブチリル・コリンは
、このシステム中でなおｔ−ＰＡ生産を増加することが
できる。この促進は、無血清培地及び高血清培地の両方
で成功した一方、細胞、を無血清培地条件に２４時間適
用した後に、この物質を適用したとき、さらに増加効果
が達成された。

表１４は、酪酸ナトリウム適用後、アフィジコリン処理
培養物におけるｔ−ＰＡ生産の増加率を示している。９
６時間後、酪酸ナトリウムは、ｔ−ＰＡ合成をさらに１
４％増加させる。

テストは、無血清培地中、酪酸ナトリウム有無条件下で
培養した。１μＭアフィジコリン処理Ｃｌ−１０細胞で
行った。その値は、ＩＷｆの細胞上清についてのもので
、またそれは、コントロール（０％）に対する％値とし
て表わされている（平均上ＳＥ、ｎ＝４）、ｔ−ＰＡは
、イライザ法で測定された。

表　　　１４ ９６　３６．７±６．２　３４．１±９．７　５０．６
±１１，０１２０　４２．０±８．８　３１．８±１０
．２　４９．７±４．３（６−ヒドロキシ−４，６−ジ
メチル−３−へブテン−２−オン（ＤＨＯ）の効果） 上述化合物による処理から１４４時間後、ｔ−ＰＡ生産
が増加した。ｔ−ＰＡ合成の促進には、マイクロモル濃
度範囲、例えばｏ、　ｏ　ｏ　ｓがら１００μＭが効果
的であった。

図１９は、無血清培地及び７ｍＭから７μＭＤＨＯ中で
１６８時間まで培養したＣＨＯ細胞における、ｔ−ＰＡ
生産の増加を示している。その値はＤＣＡで測定された
ものである。図２０は、イライザ法で得られた、同様の
値を示しである。

上述の方法で調製した細胞培養物は、例えば、生産期後
その培養培地から細胞を分離し、その細胞上清を超遠心
及びクロマトグラフィー法によって精製する等の、従来
法を使って、ｔ−ＰＡを単離するのに用いた。

その後、単離し；、ｚ　ｔ　−Ｐ　Ａを、例えば、溶解
型又は、凍結乾燥型の薬学的調製法に成型する。

上記例は、ｔ−ＰＡ生産ＣＨＯ細胞を、上述のヨーロッ
パ及びドイツ特許出願にみられるような、例えばｔ−Ｐ
Ａ変異体又は他の薬理学的に有効なタンパク質のような
他のタンパク質を外に出す、トランスホームしたＣＨＯ
細胞、特にＥＰ−Ａ１９９５７４及び１９６９２０及び
Ｄ　Ｅ　−Ａ３７０８６８１におけるＣＨＯ細胞で置き
換えて、繰返すことができる。

【図面の簡単な説明】

図１は、７．５％ＦＣ３を含む培地中で培養したＣＨＯ
細胞の細胞増殖を示す。細胞数は細胞上清ｌ　ｍｌのも
ので、総数は（−マー）、生細胞はく一一）、死細胞は
（−ロー）で示される（平均±ＳＥ、ｎ＝１４〜４７）
。 図２（Ａ）及び（Ｂ）は、７．５％ＦＣ３含有培地で培
養したＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産を示し、特に、
図２　（Ａ）は、細胞外ｔ−ＰＡ濃度の時間曲線を示す
、ｔ−ＰＡ値は１−の細胞上清のもので、ＤＣＡ（−〇
−）とイライザ法（−・−）で測定した（平均上ＳＥ、
ｎ＝７〜４７）。 図２　（Ｂ）は、細胞内ｔ−ＰＡ濃度の時間曲線を示す
。ｔ−ＰＡ値はＩＭ＃１の細胞上清のもので、イライザ
法で測定した（−一−）（平均±ＳＥ。 ｎ＝４）。 図３（Ａ）及び（Ｂ）は、７．５％ＦＣ３含有培地中で
培養したＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ合成を示し、特に
図３（Ａ）は、細胞外ｔ−ＰＡｉａ度を示す。ｔ−ＰＡ
値は、ｌＸｌ０６個の細胞についてのもので、ＤＣＡ　
（−△−）及びイライザ法（−ム一）で測定した（平均
±ＳＥ、ｎ＝７〜４７）。 図３　（Ｂ）は、細胞内ｔ−ＰＡ９ｍ”度を示す。 ｔ−ＰＡ値は、ｌＸｌｏｈ個の細胞についてのもので、
イライザ法によって測定した（−ｍ−）（平均±ＳＥ、
ｎ＝４）。 図４は、無培養培地で培養したＣ　ＨＯ細胞の細胞増殖
を示す。細胞数はｌ　ｍｌの細胞上清のもので、総細胞
数は（−ム一）、生細胞は（−△−）、死細胞は（−ロ
ー）で示されている（平均±ＳＥ。 ｎ＝４〜６）。 図５は、無血清培地で培養したＣＨＯ細胞におけるｔ−
ＰＡ生産を示す。ｔ−ＰＡ値は１Ｍｌの細胞上清につい
てのもので、ＤＣＡ　（−０−）及びイライザ（−・−
）法で測定した（平均±ＳＲ。 ｎ＝４〜６）。 図６は、無血清培地で培養したＣＨＯ細胞におけるｔ−
ＰＡ合成を示す。ｔ−ＰＡ値は、Ｉ　Ｘ　１０６個の細
胞についてのもので、ＤＣＡ（−〇−）及びイライザ法
（−・−）によって測定したく平均±ＳＥ、ｎ＝４〜６
）。 図７は、時間に対する、Ｃ，−Ｃ，モノカルボン酸によ
って引き起こされたＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産の
増加を示す。細胞は、７．５％ＦＣＳ含有培地で培、養
した。酪酸（−■−）及びイソ酪酸（−・−）の濃度は
１ｍＭ、またプロピオン酸（−０−）及びイソ吉草酸（
−ロー）の濃度は５ｍＭである。この値は１Ｉｎ１の細
胞上清についてのちので、酸を添加していないコントロ
ール（０％）に対して、％値で表わしである（平均±Ｓ
Ｅ。 ｎ−１１〜２４）、ｔ−ＰＡはＤＣＡで測定した。 図８は、酪酸ナトリウムを用いて達成されたＣ　Ｈ○細
胞におけるｔ−ＰＡ生産の増加を示す。 ７．５％ＦＣ３含有培地で培養した細胞に、０日日、１
ｍＭ濃度で酪酸ナトリウムを添加した。その値はコント
ロール（０％）に対して、％値で表わしてあり、またこ
れは、ｌ　ｍｌの細胞上清（ＤＣＡ（−■−）及びイラ
イザ法（−ロー））又は２ｍｌの細胞懸濁物（イライザ
法（−−））についてのものである（平均±ＳＥ、ｎ＝
５〜１４）。 図９　　（Ａ）、　　（Ｂ）、　　（Ｃ）は、７．５％
ＦＣ３含有培地で培養したＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ
合成に関する酪酸ナトリウムの影響を示す。酪酸ナトリ
ウムはＯ日月、１ｍＭ濃度で添加した。その値は、１×
１０ｂ個の細胞についてのもので（−ロー、−〇−２−
一）、またそれは、コントロール培養との比較で得られ
たものである（−■−２−・−２−マー）（平均±ＳＥ
）。 図９（Ａ）は、細胞外ｔ−ＰＡ濃度（ＤＣＡ。 ｎ＝５〜１４）を示し、図９（Ｂ）は、細胞外ｔ−ｐＡ
＞４度（イライザ法、ｎ＝５〜８）を示し、図９　（Ｃ
）は、細胞内ｔ−ＰＡ濃度（イライザ法。 ｎ＝５〜８）を示す。 図１０は、７．５％ＦＣ３含有培地で培養したＣＨＯ細
胞におけるｔ−ＰＡ生産の増加を示す。 １ｍＭの醋酸ナトリウムを１度もしくは、異なる時間に
２度添加した。この値は、コントロール（０％）に対す
る％値で表わされ、また、ｌ　ｍｌの細胞上清について
の値である（平均±ＳＥ、ｎ＝４）。 ｔ−ｐΔは、ＤＣＡで測定した。 図１１は醋酸ナトリウムで達成されたＣＨｏ細胞におけ
るｔ−ＰＡ生産の増加を示す。無血清培地における細胞
の２４時間培養の後、酪酸ナトリウムを１ｍＭ濃度とな
るよう添加した。その値は、コントロール（０％）に対
する％値で表わされ、またそれは、１　ｍｌの細胞上清
についてのものである。ｔ−ＰＡはイライザ法で測定し
た （平均±ＳＥ、ｎ＝４）。 図１２は、ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産に関する、
酪酸ナトリウムの影９を示す。無血清培地での細胞の２
４時間培養後、酪酸ナトリウムを１ｍＭ：５度となるよ
う添加した。この値はｌ−の細胞上清についてのもので
、それはＤＣＡ（−■−〉及びイライザ法（−口−）で
測定した（平均±ＳＥ、ｎ＝４〜６）。 図１３は、ＣＨｏ細胞におけるｔ−ＰＡ生産に関する酪
酸ナトリウムの影響を示す。無血清培地での細胞の２４
時間培養後酪酸ナトリウムを１ｍＭ濃度となるよう添加
した。その値は１×１０６個の細胞についてのものであ
り、それは、ＤＣＡ（−■＝）及びイライザ法（−口−
）によって測定した（平均±ＳＥ、ｎ＝４〜６）。 図１４は、７．５％ＦＣＳ含有培地で培養したＣＨｏ細
胞におけるｔ−ＰＡ合成（Ａ）とタンパク質合成（Ｂ）
に関するアスコルビン酸（１０ｍＭ）の影響を示す。ｔ
−ＰＡは、ＤＣＡで測定した。 その値は（○）、コントロール値（・）と比較して表わ
され、またその値は、Ｉ　Ｘ　１０’個の細胞について
のものである（平均上ＳＲ，ｎ＝４）図１５は、時間に
関する、チオグリコール酸（−・−）、ヂオジグリコー
ルＭ（−口−）、Ｌ−システイン（−ｍ−）及びグルタ
チオン（−〇−）の種々の含硫化合物によって引き起こ
されるＣＩ（０細胞におけるｔ−ＰＡ生産の増加を示す
。細胞は、７．５％ＦＣ３含有培地で培養した。その値
は、１ｍｌの細胞上清についてのもので、コントロール
（０％）に対する％値で表わされている（平均±ＳＥ、
ｎ＝４〜６）、ｔ−ＰＡはＤＣＡで測定した。 図１６は、種々の時間に、チオグリコール酸（１ｍＭ）
を１度又は２度適用した後、７．５％ＦＣ３含有培地で
培養したＣＨｏ細胞でのｔ−ＰＡ生産の増加を示す。そ
の値は、コントロール（０％）に対するパーセント値で
表わされ、またその値は１　ｍｌの細胞上清についての
ものである（平均±ＳＥ、ｎ＝４〜６）　。ｔ−ＰＡは
、ＤＣＡで測定した。 図１７　（Ａ）　（Ｂ）　、　（Ｃ）は、７．５％ＦＣ
３含有培地で培養したＣ　ＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ合
成に関する１ｍＭチオグリコール酸の影響を示す。 その値は、■×１０６個の細胞についてのもので（−ロ
ー、−〇−１−△−）、それはまた、コントロール培養
（−■−３−・−１−ム−）値と比較して示されている
（平均上ＳＥ、ｎ＝４〜５）。 図１７（Ａ）は、細胞外ｔ−ＰＡ濃度（ＤＣＡ）を示し
、図１７（Ｂ）は、細胞外ｔ−ＰＡ？！度（イライザ法
）を示し、図１７（Ｃ）は、細胞内ｔ−ＰＡ？Ｗ度（イ
ライザ法）を示す。 図１８は、培地交換後、無血清培地で培養した１μＭア
フィジコリン同調ＣＨＯ細胞におけるｔ−ＰＡ生産の増
加を示す。その値は、１−の細胞上清についてのもので
、また、コントロール（０％）に対する％値で表わされ
ている（平均上ＳＥ、ｎ＝４〜９）、ｔ−ＰＡはＤＣＡ
で測定した。 図１９は、無血清培地及び７　ｍＭ〜７　ｐ　Ｍ　ＤＨ
Ｏ条件下で１６８時間まで培養したＣＨｏ細胞における
ｔ−ＰＡ生産の増加を示している。その値はＤＣＡで測
定した。 図２０は、イライザ法での測定以外は図１９と同様にし
て行ったＣＨｏ細胞におけるｔ−ＰＡ生産の増加を示し
ている。 図面の浄？（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ （ＡＪ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（
８２時間　（日）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　時間　（日）時間　（日）　　　　　　　　　　　　
　　　　時間　（ロ）ＦＩＧ、４ 時間　（日） ＦＩＧ　５ 時間　（日） 時間　（日） ＦＩＧ、８ 時間　（日） ＦＩＧ　、　１１ 時間　（日） （ＡＪ 時間　（日） ＣＢ） 時間　（日） ＦＩＧ、１４ 時間　（日） ＦＩＧ、１５ 時間　（日） 時間　（日） ＦＩＧ　、　１８ 時間　（ｈ、　ｎ、　Ｍｗ） ＦＩＧ　、　１９ 濃度μｇ／ｍｌ ■３日　　　ビ羽５日　　　　ロア日 ［ミ］　４日　　　口６日 １、事件の表示　　　昭和６３年特許願第２５６８８２
号２１発明の名称　　　　　タンパク貿の調製法３、補
正をする者 事件との関係　　出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付　　平成元年１月３１日６、補正の
対象　　明細書　　全図面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）使用するタンパク質誘導物質が、チオグリコール
   酸、チオジグリコール酸、Ｌ−システイン、グルタチオ
   ン、臭化ブチリルクロライン、塩化ブチリルクロライン
   、ノナクチン酸、フラン脂肪酸、アスコルビン酸、アフ
   ィジコリン、６−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−３−
   ヘプテン−２−オン、フザリン酸、メバロン酸、トラン
   ス−アンヒドロ−メバロン酸、アンヒドロメバロン酸ラ
   クトン、シスーアンヒドロメバロン酸ラクトン、Ｄ−α
   −ヒドロキシ−置換（Ｃ＿３又はＣ＿４）脂肪族モノ又
   はジカルボン酸又はその塩であることを特徴とする、タ
   ンパク質の生産を誘導する物質を、細胞培養物に添加す
   ることにより、タンパク質を生産する細胞の培養物中の
   タンパク質の生産を増加する方法。 （２）Ｃ＿３−Ｃ＿４脂肪族モノカルボン酸又はその塩
   を、その培養物に添加することを特徴とする、トランス
   ホームしたＣＨＯ細胞培養物からのタンパク質の生産を
   増加する方法。 （３）タンパク質がｔ−ＰＡ又はその変異体であること
   を特徴とする、請求項（２）記載の方法。 （４）トランスホームしたＣＨＯ細胞を培養することを
   特徴とする、請求項（１）記載の方法。 （５）タンパク質がｔ−ＰＡ又はその変異体であること
   を特徴とする、請求項（４）記載の方法。 （６）タンパク質誘導物質として、チオグリコール酸又
   はその塩を使用することを特徴とする、請求項（５）記
   載の方法。 （７）タンパク質誘導物質として、ノナクチン酸又はフ
   ラン脂肪酸又はその塩を使用することを特徴とする、請
   求項（５）記載の方法。 （８）タンパク質誘導物質として、酪酸又はその塩を使
   用することを特徴とする、請求項（２）又は（３）記載
   の方法。 （９）培養を無血清培地で行うことを特徴とする、請求
   項（１）乃至（８）記載の方法。（１０）培養を血清含
   有培地で行うことを特徴とする、請求項（１）乃至（８
   ）のいずれか１項に記載の方法。 （１１）培養物中に、タンパク質誘導物質を、０．００
   ５μＭから５００ｍＭの濃度範囲で添加することを特徴
   とする、請求項（１）乃至 （１０）記載の方法。 （１２）Ｃ＿３−４脂肪族モノカルボン酸又はその塩を
   、１ｍＭから１０ｍＭの濃度範囲で添加することを特徴
   とする、請求項（１１）記載の方法。 （１３）チオグリコール酸、チオジグリコール酸、Ｌ−
   システイン又はグルタチオン又はそれらの塩を、１ｍＭ
   から１０ｍＭの濃度範囲で添加することを特徴とする、
   請求項（１１）記載の方法。 （１４）細胞を、タンパク質誘導物質のうちの１つの存
   在下培養し、その細胞を培養物から取り出し、ついで、
   新しい培養培地に移し、それらの物質のうちの１つの存
   在下培養することを特徴とする、請求項（１）乃至（１
   ３）のいずれか１項に記載の方法。 （１５）アフィジコリンが第１に述べた物質であり、か
   つ、第２の物質が酪酸、プロピオン酸、塩化ブチリル・
   コリン又は、臭化ブチリルコリン又はそれらの塩である
   ことを特徴とする、請求項（１４）記載の方法。 （１６）それらの物質を２つ以上同時に使用することを
   特徴とする、請求項（１）乃至（１３）のいずれか１項
   に記載の方法。 （１７）酪酸及びチオグリコール酸又はそれらの塩を使
   用し、第２の物質として、その培養物に酪酸を添加する
   ことを特徴とする、請求項（１６）記載の方法。