JPS62158220A - 変異株ｋｙｍ−ｅ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト横紋筋肉種変異株に関し、更に詳しくは
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を著量生産する
ヒト横紋筋肉種変異株ＫＹＭ−Ｈに関する。

〔従来の技術〕

いわゆるプラスミノーゲン活性化因子は、動物の肺、腎
臓、卵巣Ｍｉ織の抽出物に検出されるフィブリン溶解物
質である（文献１）。これらのプラスミノーゲン活性化
因子は、免疫学的特徴の差に基づいてウロキナーゼ型プ
ラスミノーゲン活性化因子および組織型ブラスミノーゲ
ン活性化因子の２つ型に分けることができる。

ヒト由来の組織型プラスミノーゲン活性化因子（以下ｔ
−ＰＡと称す）は、ヒトメラノーマセルラインから単離
されたものが正常ヒトＭｉ織から単離されたものと区別
できない性質を持っていることが示されて以来（文献２
〜３）、研究が急速に進んでいる。

ｔ−ＰＡのフィブリンを溶解する性質は、既に市販され
ている２種の蛋白質製剤ストレプトキナーゼおよびウロ
キナーゼと同様であることが判明した。これらの蛋白質
の効能は心筋梗塞、冠動脈閉塞、肺塞栓症、胸部静脈血
栓症および、その他の血栓症に及ぶものである。これら
は不活性前駆体プラスミノーゲンをプラスミンに変換し
、このプラスミンが前記症例の原因となる血栓を構成す
るフィブリンを溶解する。ｔ−ＰＡはフィブリンに対す
る高い親和性を有しており、溶解したいフィブリンと結
合しているプラスミノーゲンを優先的に活性化する（文
献４〜５）。これに対してストレプトキナーゼとウロキ
ナーゼはこれを優先的に活性化させる事がない。このた
め、生成するプラスミンの多くは血栓に到達する前に中
和されてしまい、これにより有効な血栓溶解能を失う。

さらに、これらの化合物はフィブリンに結合したプラス
ミンよりも循環するプラスミンを形成させるため循環し
ている他の血液凝固因子、例えばフィブリノーゲン、第
■因子、第■因子も活性化された蛋白質により作用を受
け、その結果内出血の副作用の可能性を生ずる。また、
ストレプトキナーゼはヒト由来ではないため、強度に免
疫原性であり、高抗体価を有する患者には投与できない
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来、ｔ−ＰＡの産生細胞としては、ヒト内皮細胞、ヒ
ト子宮細胞などの正常細胞や、ヒトメラノーマ、乳癌細
胞などが知られている（文献１．６〜１０）。

しかしながら、正常組繊細胞では継代数に限界があるこ
とからその大量生産には不利であるばかりでなく、細胞
あたりのｔ−ＰＡ産生もごく微量であり、また、腫瘍細
胞などからライン化した細胞株、例えばヒトメラノーマ
セルラインなどにおいてもこれまでのところごく微量に
しかｔ−ＰＡは検出されていない（文献２）。

そこで、これまでｔ−ＰＡを著量生産する細胞の開発が
望まれてきた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、プラスミノーゲン活性化因子を産生ずる
細胞を求めて研究したところ、ヒト横絞筋肉腫から分離
されたＫＹＭ−１（東京大学医科学研究所の関口守正氏
より穣受）のクローンに微量ではあるがプラスミノーゲ
ン活性化因子を産生ずる変異株があることを見い出した
。

なお、前記菌株ＫＹＭ−１は（財）発酵研究所にＩＦＯ
：５００５Ｂとして寄託（寄託者　明治乳業株式会社）
されている。

そして、本発明者らは、更に研究を重ねた結果、このＫ
ＹＭ−１にネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドｐ
ｓＶ２ｎｅｏ　（文献１３）とサルウィルスＳＶ４０（
Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ４０）の複製オリジン欠損遺
伝子である９ＭＫ１６（文献１５）をコトランスフェク
ションし、ネオマイシンの一種である０４１Ｂ　ＣＧ　
Ｉ　ＢＣＯ社）で選択して得たクローンの中からｔ−Ｐ
Ａの発現レベルの極めて高い変異株ＫＹＭ−Ｅを見い出
した。

次に変異株ＫＹＭ−Ｅの調製法を説明する。

＋１）　　プラスミドｐＳＶ２　ｎｅｏのトランスフェ
クション 動物細胞内で遺伝子を発現させるためには遺伝子発現プ
ロモーターが必要であり、−ａ的なものとしてＳＶ４０
遺伝子発現プロモーター（ＳＶ４０ｏｒｉ）が使用され
る。

更に、トランスフェクションした細胞をセレクトするた
めのマーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子を使用す
ることが望ましく、この細胞は、ネオマイシンの一種で
ある０４１８（ＧＩＢＣＯ社）によって選択できる。

そこで、バクテリアのトランスポゾン由来のネオマイシ
ン耐性遺伝子にＳＶ４０遺伝子発現用プロモーターを結
合し更に大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２（文献１１）に
組み入れることにより調製されたｐＳＶ２　ｎｅｏ　（
文献１３）（第１図）を使用した。なお、ｐＢＲ３２２
は、大腸菌内で発現するアンピ°シリン耐性遺伝子（Ａ
ｍｐｒ）を持っている。このｐＳＶ２ｎｅｏは大腸菌内
で大量に増殖することができ、かつ動物細胞内で発現す
ることができる性質をもっている。

（２）　　プラスミドｐＭＫ１６のトランスフェクショ
ン次に、動物細胞の物質生産、特にプラスミノーゲン活
性化因子の産生は、細胞のトランスフオームによってみ
られるようになるという報告がある（文献１１）。

ＳＶ４０は、腫瘍抗原として働き、細胞をトランスフオ
ームさせる因子として有効である（文献１４）。

そこでＳＶ４０の複製オリジン欠損遺伝子を大腸菌プラ
スミドｐＢＲ３２２に組みこむことにより調製された９
ＭＫ１６（文献１５）（第１図）を細胞をトランスフオ
ームさせる目的で使用した。ＳＶ４０の複製オリジン欠
損遺伝子を使用することの長所は複製オリジンを欠損し
ているためにウィルスが完全な形で複製されることがな
いことにある。９ＭＫ１６は大腸菌内で大量に増殖する
ことができ、かつ動物細胞をトランスフオームさせる性
質をもっている。

（３）　　Ｋ　Ｙ　Ｍ　−１のｐＳＶ２　ｎｅｏと９Ｍ
Ｋ１６のコトランスフェクション この２種類のプラスミドｐＳＶ２　ｎｅｏとｐ■１６を
リン酸カルシウム法によりＫＹＭ−１にコトランスフエ
クションした。得られた細胞をＧ４１８で選択した結果
、Ｉ）ＳＶ２　ｎｅｏと９ＭＫ１６の両方が組込まれた
クローンか、少なくともｐＳＶ２　ｎｅｏが組み込まれ
たクローンを数多く得た。この２つのプラスミドはいず
れも、複数でも組み込まれ得る。

（４）ｔ−ＰＡ産生レベルの高い変異株ＫＹＭ−Ｅの選
択 得られたクローンについて、そのｔ−ＰＡの産生量を調
べた結果、このクローンの中に１−ＰＡの発現レベルが
極めて高い変異株ＫＹＭ−Ｅを見い出した。このＫＹＭ
−Ｅは、浮遊型と接着型の性格を併せ持っており、シャ
ーレで培養すると浮遊状態で増殖する細胞と底面に接着
して増殖する細胞との双方が出現する。そして更に浮遊
性の強いクローンまたは接着性の強いクローンを各々採
取し５〜１０回継代を繰り返すと、浮遊攪はん培養に適
した細胞株（以下ＫＹＭ−ＥＳと称す）または接着培養
に適した細胞（以下ＫＹＭ−ＥＭと称す）かえられる。

本発明の変異株ＫＹＭ−Ｅの性質は次の通りである。

■、浮遊型と接着型の性格を併せもち、培養器中で双方
の細胞が出現する。

■、細胞の形態は、浮遊性のものは屈折性に富む球形を
、接着性のものは上皮細胞様である。

■、浮遊型のクローンを採取し継代することにより、浮
遊はん拌培養に適した変異株ＫＹＭ−ＥＳがえられる。

■、接着型のクローンを採取し継代することにより、接
着培養に適した変異株ＫＹＭ−ＥＭかえられる。

■、　１，０００，０００個の変異株ＫＹＭ−Ｅをヌー
ドマウスの皮下またはＡＬＳ投与ハムスターの類のう内
に移植すると腫粒を形成する。

■、染色体 変異株ＫＹＭ−Ｅ染色体数を細胞遺伝子学の常法に従っ
て決定したところ、最頻染色体数は４６と４７で、その
付近に多少の幅をもつ分布を示す。

■　変異ＫＹＭ−Ｅは、ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子を著量生産する。

本発明の変異株ＫＹＭ−Ｅ及びそのクローンを培養した
液より精製されたプラスミノーゲン活性化因子の理科学
的性質は次の通りである。

ａ）分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で６２．００
０〜７３．０００の間にバンドを示す。メラノーマ（Ｒ
ｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ　Ｕｎｉｖ、叶、Ｄ、Ｂ、Ｒｉｆ
−に１ｎより入手）（文献２．１６）由来の１末鎖ｔ−
ｐＡと２本領ｔ−ＰＡを同時に電気泳動にかけたところ
異なる分子量を示す（第２図）。各々のｔ−ＰＡの還元
型のものを同様に電気泳動にかけたものは第３図に示す
。還元型についても明らかにメラノーマ由来のｔ−ＰＡ
と異なったバンドを示す。

ｂ）作用及び基質特異性 不活性前駆体プラスミノーゲンをプラスミンに変換しフ
ィブリンを溶解する。Ｒ４ｊｋｅｎｅｔ、ａｌ、の方法
（文献９）の改良法により、フィブリンに対する親和性
の検討を行ったところ、表−１の通り市販の酵素製剤ウ
ロキナーゼと比ベフィブリンに対する高い親和性を示す
。ウロキナーゼは８％フィブリンに結合するにすぎない
が本発明物質は８９．２％が結合し、ウロキナーゼに比
べ高い親和性を示す。

（本頁以下余白） 表−１ また、Ｓ−２２８８で酵素活性を測定したところ表−２
の値かえられる。

表−２ Ｓ−２２８８でのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　Ｐ
ｌｏｔは第４図で示される。

Ｃ）至適９Ｈ至適ｐＨは、約ｐＨ７−１１で第５図で示
される。

ｄ）安定ｐＨ３７℃、９０分のインキュベートでの安定
ｐＨよ、ｐＨ４，５−１１で 残存活性％は、第６図で示さ れる。

ｅ）作用適温　　３０−４５℃、作用温度曲線は、第７
図で示される。

ｆ）温度耐性　　９０分の加熱処理で５０℃までは殆ど
失活しない。残存活性は、 第８図で示される。

ｇ）紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍに極大吸収あり、第９ 図で示される。

ｈ）溶剤に対する溶解度 塩類溶液に対する溶解度は約 ５０μｇノーでそれ以上の場合は 溶解促進剤例えば１．６Ｍカリ ラムチアシアネート等が必要 である。有機溶媒には不溶で ある。

ｉ）物質性状　　凍結乾燥品は白色粉末である。

ｊ）呈色反応　　ＰＡＳ反応で糖蛋白に特異的なピンク
色を呈する。

コンカナバリンＡアガロース 樹脂に親和性がある。

ｋ）等電点　　　ｐＨ７，５−８，０ 以上の理化学的性質より、本変異株ＫＹＭ−Ｅより産生
されるプラスミノーゲン活性化因子は、従来報告されて
いるヒト組繊細胞や細胞株のｔ−ＰＡとよく似た物質で
あり、又従来報告されているｔ−ＰＡ、特にメラノーマ
由来のｔ−ＰＡ　（文献２及び図２）とは分子量におい
て差が認められる。又、本発明のＫＹＭ−Ｅ及びそのク
ローンであるＫＹＭ−ＢＳ、ＫＹＭ−ＥＭが産生するＫ
ＹＭ−ＴＰＡは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を用いて比較したところ同じ位置にバンドがあられ
れること（図１０参照）から同一物質と考えられる。

本発明の変異株ＫＹＭ−Ｅはシャーレで継代培養できる
が、浮遊型と接着型の性格を併せもつため双方の細胞が
出現する。この為、大量培養を行なうためにはその浮遊
型クローンである変異株ＫＹＭ−ＥＳを用いて浮遊攪は
ん培養を行うか、もしくはその接着型クローンである変
異株ＫＹＭ−ＥＭを用いて接着培養を行うかのいずれで
もよく、またそのいずれでも効率的に行われる。従って
、変異株ＫＹＭ−ＥＳを用いる場合は、シャーレで培養
し適当な細胞数に達した時点で、スピナーフラスコまた
はタンクによる浮遊攪はん培養が行われ、変異株ＫＹＭ
−ＥＭを用いる場合は、シャーレで培養し適当な細胞数
に達した時点で、ローラーボトル、マイクロキャリア等
による接着培養が行われる。ｔ−ＰＡを生産する為には
、変異株ＫＹＭ−ＥＳ。

変異株ＫＹＭ−ＥＭいずれの細胞も血清添加培地で培養
し、細胞の増殖が定常期に入る時点で無血清培地に交換
するのが好ましい。使用する培地の例としては、血清添
加培地としては、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　（Ｆｌｏ−社）等にヒ
トトランスフェリン、モノエタノールアミン、亜セレン
酸を添加したものに、牛脂児血清０．２％以上加えたも
のが、無血清培地としてはＲＰ　Ｍ　Ｉ　Ｓ、Ｆ　１２
（Ｆｌｏ−社）等、又はその混合培地にヒトトランスフ
ェリン、モノエタノールアミン、亜セレン酸等を添加し
たものがあげられる。

培養温度は特に規定されるものでないが３７℃前後が好
ましい。また、気相条件は５％程度の炭酸ガスを含有す
る空気が適当である。

培養は、回分式でもよいが、細胞が十分生育すれば、培
地を連続的に交換するかもしくは５日以内の間隔で培地
を交換して約１ケ月以上にわたってｔ−ＰＡを含有する
培地を連続的に取得する方法が好ましい。また培地供給
は栄養条件を十分にするために、循環方式を用いること
ができる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例　変異株ＫＹＭ−Ｅの継代培養 変異株ＫＹＭ−Ｅを培養し継代するには、培地１１当り
重炭酸ナトリウム２．０ｇ、Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸１．１９２ｇ
、硫酸カナマイシン９０■、ヒトトランスフェリン（Ｓ
ｉｇｍａ社）　　１　ｔｒｙ、エタノールアミン４．６
■、亜セレン酸１３μ已を含み更に熱不活性化した牛脂
児血清（ＧＩＢＣＯ社）を最終濃度０．２５％加えたＲ
　Ｐ　Ｍ　１−１６４０培地（ｊｌＩ社）を用いる。

この培地を入れたプラスチックシャーレに変異株ＫＹＭ
−Ｅを５Ｘ１０’細胞／ｍ１程度に接種し、温度３７℃
、５％炭酸ガス含有空気の存在下に培養し、培地中の細
胞数が８Ｘ１５’細胞／ｒｎｌに達した時点で、細胞を
回収し別のプラスチックシャーレに植え継ぎをする。

尚、牛胎児血清濃度は０．２％以上であれば十分な増殖
を示すが、維持用培地としては５−１０％程度を含む方
が望ましい。

〔発明の効果〕

ヒト横絞筋肉腫から分離されたＫＹＭ−１にｐＳＶ２　
ｎｅｏとｐＭＫ１６でコトランスフエクションすること
によりヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を著量生
産するヒト横絞筋肉腫変異株ＫＹＭ−Ｅを得た。

参考文献 文献１　＾、Ｊ、Ｂａｒｒｅｔｔ。

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Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、４８１５　　Ｍ
、Ｂ、Ｓｍａｌｌ　　ｅｔ、ａｌ。

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Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　　１３９１３１７−１３２８（
１９７４）

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｉ）ＳＶ２　ｎｅｏと９ＭＫ１６を示す。第
２図は、本発明のｔ−ＰＡとメラノーマ由来の１−ＰＡ
を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結
果を示す。分子量マーカーとしては、ウシ血清アルブミ
ン、卵白アルブミン、カルボニックアンヒドラーゼを使
用している。第３図は本発明のｔ−ＰＡのメラノーマ由
来のｔ−ＰＡの還元型を電気泳動にかけた結果を示す。 分子量マーカーとしては、ホスホリラーゼｂ、ウシ血清
アルブミン、卵白アルブミン、カルボニックアンヒドラ
ーゼを使用している。第４図は、本発明のｔ−ＰＡのＳ
−２２８８におけるＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　
ｐｌｏｔを示す。第５図は、各ｐｉ（の作用曲線を示す
。第６図は、各ｐＨの残存活性を示す。第７図は、作用
温度曲線を示す。第８図は、各温度に於ける残存活性を
示す。第９図は、紫外線吸収スペクトルをしめす。第１
０図は、ＫＹＭ−Ｅ、ＫＹＭ−４Ｓ、ＫＹＭ−ＥＭ由来
のｔ−ＰＡを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけた結果を示す。 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 第１図　ｐ　Ｓ　Ｖ２ｎｅｏ及び９ＭＫ１６（Ｐ、　　
５ｏｕｔｈｅｒｎ、　　Ｐ、　　Ｂｅｒｇ　　　　Ｊ、
　　Ｍｏ１．　　Ａｐｐｌ、　　Ｇｅｎセ、　１９８２
）（Ｍ、Ｂ、Ｓｍａｌｌ　ｅｔ、ａｌ、　　　Ｎａｔｕ
ｒｅ　　１９８２）第２図 、７＼＞　　（ｆ３＞　　（Ｃ）　　＋％）　　（Ｅ）
四′　■’　　（Ｃ）’　　（Ｄ）’　　ζ）′ｒ゛？
Ａ　　ｔＰｇ　　も−ＰＡ 第７図作用温度曲線 温度（′Ｃ） （Ａ）’　　（６＞　（Ｃ）’

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の性質を有するヒト横紋筋肉腫変異株ＫＹＭ−Ｅ １、浮遊型と接着型の性格を併せもち、培養器中で双方
   の細胞が出現する。 ２、細胞の形態は、浮遊型のものは屈折性に富む球形を
   、接着性のものは上皮細胞様である。 ３、浮遊型のクローンを採取し継代することにより、浮
   遊撹はん培養に適した変異株ＫＹＭ−ＥＳがえられる。 ４、接着型のクローンを採取し継代することにより、接
   着培養に適した変異株ＫＹＭ−ＥＭがえられる。 ５、１，０００，０００個の変異株ＫＹＭ−Ｅをヌード
   マウスの皮下またはＡＬＳ投与ハムスターの類のう内に
   移植すると腫粒を形成する。 ６、染色体 変異株ＫＹＭ−Ｅの染色体数を細胞遺伝学 の常法に従って決定したところ、最頻染色体数は４６と
   ４７で、その付近に多少の幅をもつ分布を示す。 ７、変異株ＫＹＭ−Ｅ及びそのクローンは、ヒト組織型
   プラスミノーゲン活性化因子を著量生産する。