JPS60231611A - プラズミノ−ゲンアクチベ−タ−の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト細胞を用いて低コストで大量に組織プラズ
ミノーゲンアクチベーターを製造する方法に関するもの
である。

更に詳細には１本発明はヒト細胞、例えばビト横紋筋腫
由来の細胞株を用いて血清を使用せず低コストで浮遊攪
拌培養又は接着培養によって、大量に組織プラズミノー
ゲンアクチベーターを製造する方法に関するものである
。

近年、血栓に起因する疾病が重要な問題としてクローズ
アップされ、その治療にストレプトキナーゼ、ウロキナ
ーゼ等が使用されてきた。しかし。

それらはいずれも目的とする血栓溶解ばかりでなく、循
環血中の凝固因子等をも分解し、出血傾向を呈すること
が知られている。その原因として、ストレプトキナーゼ
、ウロキナーゼ等は溶解すべき血栓との親和性に乏しく
、循環血中に於て、血液凝固因子等を分解してしまうと
考えられている。

従って、血栓に対する親和性が高く、出血傾向等の副作
用が少ない血栓溶解剤の開発がめられたのである。

そこで、血栓を溶解し、副作用の少ないとされるプラズ
ミノーゲンアクチベーター（以下ＰＡということが多い
）についての研究が行なわれ、これに関する発表も行な
われている。ヒト由来のＰＡに関しては、内皮細胞及び
子宮などの正常組織、さらに腫瘍組織およびその培養細
胞などから得られた酵素について詳細な研究がなされて
いる。

（参考文献としてはウィルソンらによるキャンサーリサ
ーチ誌、赳９３３−９３８（１９８０）及びリッケンと
フランによるジャーナルオブバイオロジ力ルケミストリ
ー誌刀狙７０３５−７０４１（１９８１）を主要文献と
してあげることができる）。

従来、ヒト内皮細胞、ヒト子宮細胞などの正常組繊細胞
やヒトメラノーマ、乳癌細胞などの腫瘍細胞がＰＡを生
産することはよく知られている。

しかしながら、正常組繊細胞ではやがて死滅してしまう
ので工業生産に使用することはできない。

また、従来知られているヒトメラノーマ、乳癌細胞など
の腫瘍細胞の培養はビンなどへの接着培養によるだけで
あり、ＰＡの生産性もきわめて低く、工業的に大量生産
できるというものではなかった。

そこで、本発明者らは、先に、浮遊攪拌培養できる腫瘍
細胞をめて研究した結果、ヒト横絞・筋腫から分離され
た細胞ＫＹＭ−Ｉ　（東京大学医科学研究所　関口守正
氏より譲受）の培養物から浮遊して増殖できる変異株を
見出し、単離することに成功したのである。この変異株
は変異株ＫＹＭ−Ａと名づけられた。また、この変異株
ＫＹＭ−Ａは、主として浮遊状態で増殖するが、条件に
よっては接着培養も可能である。

更に、上記細胞ＫＹＭ−Ｉ培養物からシャーレなどに接
着性の高い細胞を選択し継代培養することによって変異
株ＫＹＭ−Ｂを単離することに成功した。変異株ＫＹＭ
−Ｂは、主として、接着状態で増殖するので、シャーレ
−、ローラーボトル、マイクロキャリヤー等を用いた接
着状態に適している。

更に研究を進めた結果、この変異株ＫＹＭ−ＡやＫＹＭ
−Ｂを培養すれば、培養液中に著量のＰＡを生産蓄積す
ることがわかったのである。このＰＡはＰＡ−ＫＹＭと
名づけられた。

一般に、ヒトには主として２種類のＰＡが存在するもの
と考えられている。すなわち、１種類はフィブリンに対
する親和性の乏しいウロキナーゼ型であり、残る１種類
はフィブリンに対して高い親和性を示す、いわゆる組織
プラズミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）型である。

そして、腫瘍細胞でＴＰＡ型のＰＡを産生する細胞株と
しては従来メツラーマ細胞が良く知られている。メツラ
ーマ細胞は、主としてＴＰＡ型のＰＡのみを産生ずるこ
とから注目をあびている。

一方、他の種類の腫瘍細胞でＴＰＡ型のＰＡのみを産生
するものとしては例外的に乳癌細胞が報告されているだ
けである。また、これまでの検索では横絞筋腫細胞はウ
ロキナーゼ型のＰＡのみを産生ずると考えられてきた。

変異株ＫＹＭ−ＡやＫＹＭ−Ｂの培養液中にはウロキナ
ーゼ型のＰＡは検出できない。

従って、先に得られたＰＡ−ＫＹＭはヒト横絞筋腫細胞
から生産されるところから、由来において新規であり、
また、その理化学的性質からＴＰＡ型の新規ＰＡと認め
られるものである。

本発明で使用する例示株として変異株ＫＹＭ−Ａがある
が、変異株ＫＹＭ−Ａは、ヒト横絞筋腫から分離された
ＫＹＭ−Ｉの培養細胞集団から分離選択培養を重ねて見
出された変異株で、浮遊攪拌培養によってＰＡ−ＫＹＭ
を著量生産することによってきわめて特徴的である。

変異株ＫＹＭ−Ａの性質は次の通りである。

１、個々の細胞は屈折性に富む球形を呈している。

２．細胞は単離して浮遊細胞として存在する場合もある
が、連鎖状または、球形の集合体を形成する場合もある
。集合体に含まれる細胞数は約２〜１００個である。

３、　プラスチックシャーレ−の中で培養した場合、ま
たはタンクによる攪拌培養をした場合本変異株は大部分
浮遊細胞として増殖することができる。

４、本変異株は浮遊攪拌培養によって継代培養すること
ができる。

５、本変異株は馴化培地（Ｃｃｉｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　
ｍｅｄｉｕｍ）等によって接着性細胞に変化する。

変化した細胞は上皮細胞様の形態を示す。

馴化培地としては、本変異株以外の細胞の培養上澄液で
、適当な基礎培地を用いて適当な細胞を１〜１００時間
培養し、その培養液より細胞やその断片を除去した溶液
である。本変異株以外の細胞としては例えば、ヒトの肝
癲細胞（ＨｕＨ−６ｃ　Ｑ　−５株、ＨｕＨ−７株）（
中材ほか、キャンサーリサーチ、ｖｏｌ　４２３８５８
−３８６３１９８２）などを用いることができる。

本変異株を接着性に変えるためには、上記の馴化培地を
使用する以外にフィブロネクチンを含んだ培地を使用し
たり、シャーレ−などの接着面を。

コラーゲン、ゼラチン、ポリーＬ−リジンまたは卵白リ
ゾチームなどの塩基性タンパク質などで処理することに
よって本変異株の接着培養が可能となる。

６、　１０’ケの本変異株細胞をヌードマウスの皮下ま
たはＡＬＳ投与ハムスターの類のう内に移植すると腫瘤
を形成する。

７、染色体 染色体数を細胞遺伝学の常法に従って決定したところ最
頻染色体数は４６と４７で、その付近に多少の巾を持つ
分布を示す。

８、　本変異株はＰＡ−ＫＹＭを著量生産する。

次に、本発明で使用する別の例示様として変異株ＫＹＭ
−Ｂがあるが、その性質は基本的には変異株ＫＹＭ−Ａ
と同じであり、特徴的性質は次に示される。

１、細胞はプラスチックシャーレ−などの表面に接着し
て増殖する。

２、　細胞は上皮細胞様の形態を示す。

３、本変異株はＰＡ−ＫＹＭを著量生産する。

次に、本発明で得られるＰＡの例示として、変異株ＫＹ
Ｍ−Ａ、変異株ＫＹＭ−Ｂの生産するＰＡ−ＫＹＭの理
化学性的性質を示す。

ａ、　ヒト横絞筋腫細胞変異株ＫＹＭ−Ａ又はＫＹＭ−
Ｂの生産物である。

ｂ０分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した
非還元型の本物質は分子量約５６，０００から６２．０
００の間に近接した２本のバンドを有している。

また、同様の方法で測定した還元型の本物質は、分子量
約３２，０００及び３６，０００に２本のバンドを有し
ている。

Ｃ０作用及び基質特異性 本物質はプラズミノーゲンの存在下でフィブリンの溶解
反応を引き起す酵素蛋白質であり、この反応にはプラズ
ミノーゲンの存在が必要であることから典型的なプラズ
ミノーゲンアクチベーターと呼ばれる物質群に属し、ウ
ロキナーゼと比較した場合ウロキナーゼよりはるかに強
力なフィブリンに対する結合能力を示す。

また合成基質Ｓ−２４４４を基質として用いた場合のＫ
ｍは１．３２Ｘ１０−３Ｍであり、Ｖｍａｘは０．０４
６　ＩＵ／ｍｉｎ・ｍＡである。

ｄ、　至適ｐＨ 至適ｐＨは約８〜１０で、作用曲線は第１図に示される
。

ｅ、　安定ｐ）！ 安定ｐＨは約５〜１１で、残存活性％は第２図゛に示さ
れる。

ｆ３作用適温の範囲 ３０〜４５℃で作用温度曲線は、第３図に示される。

ｇ、　温度耐性 ９０分間の加熱処理で５０℃まではほとんど失活しない
が、６０℃以上で残存活性は６０％以下になる。残存活
性％は第４図に示される。

ｈ、　阻害 各阻害剤０．１ｍＭ、１ｍＭ、及び１抛Ｎで残存活性を
調べ表１の結果を得る。

表　１ 薬剤無添加の試量の活性を１００％として、阻害および
活性化の検討を行なった。

ｉ、　アミノ酸組成 酵素蛋白質である本物質を６Ｎ塩酸で加水分解をし、ア
ミノ酸分析に付すと、表２の結果を、得た。アミノ酸組
成は、全アミノ酸残基数に対する％で示した。

表　２ ◎　システィン及びトリプトファンの定量は行なわなか
った。

Ｊ、紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第５図に示す
通りである。

ｋ、溶剤に対する溶解度 水、リン酸緩衝液などの塩類溶液に対する溶解度は約５
０μｇ／ｍ　Ｑで、それ以上の濃度の溶液を調製すると
きは溶解促進剤、例えば１．６Ｍのカリウムチオシアネ
ートの存在を必要とする。

エタノールやエーテルなどの有機溶媒には不溶である。

１、物質の性状 凍結乾燥標品は白色粉末である。

ｍ、呈色反応 ５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行特有なピ
ンク色の呈色を示し、糖蛋白質であることが示された。

また本物質はコンカナバリンＡ−アガロース樹脂に親和
性を示すことからも糖蛋白質であることが示唆された。

ｎ０等電点 本物質を８Ｍ尿素の存在下でクロマトフオーカシング法
で分析したところ主成分の等電点はｐＨ７，５乃至８．
０であり、副成分の等電点けＰＨ７，０乃至７．５であ
り、弱塩基性蛋白質の混合物であることが示された。

本発明における培養は接着培養又は浮遊攪拌培養のいず
れでもよい。

変異株ＫＹＭ−Ａ、変異株ＫＹＭ−Ｂはプラ゛スチック
シャーレーやガラスシャーレ−に接着し。

増殖するためＰＡ−ＫＹＭの生産の目的で、ローラーボ
トルや、マイクロキャリヤーを利用した接着培養を行な
うことは可能である。

しかし、工業的な生産に適しているのは浮遊攪拌培養で
ある。浮遊培養法の方が生産効率上、利点が大きい。本
発明に使用する変異株ＫＹＭ−Ａは浮遊培養株であり、
この点で利点がある。

一般に、動物細胞の培養において、最も重要な原料は血
清であり、血清の培地中への添加がほとんどすべての動
物細胞の培養増殖に必要であるとされており一般的に１
０％程度の牛脂児血清が広く用いられている。本発明に
使用する変異株ＫＹＭ−Ａ、変異株ＫＹＭ−Ｂも例外で
はなく、従来、少なくとも増殖培養には牛脂児血清を必
要としていた。

しかし、この血清を用いる方法は、原料が高価であるこ
と、品質が一定したものが得にくいこと、精製が困難に
なるなどが問題となっており、研究だけでなく工業生産
面で大きな障害となってきている。

本発明者らは、無血清培養を目的に研究した結果、本発
明において無血清培地でＰＡを製造することに成功した
ものである。

従来、無血清培地としては、基本培地としてＲＰＭｌ、
ＭＥＭ等の基本培地にインシュリン、トランスフェリン
、エタノールアミン、脂肪酸、セレン、バナジウムなど
のグロスファクターや栄養素を添加する方法がとられて
いるが、血清添加と同程度の細胞の増殖を得ることは困
難なことであった・ 発明者らは培養肝癌細胞が種々の増殖因子を産生ずるこ
と−に着目し、肝癌由来の細胞株を用いて調製した無血
清培地培養物を血清培地の代替物として、開発すること
を試みた。

即ち、ヒト肝癌細胞株Ｈｕｔ（−６ｃ　Ｑ−５およびＨ
ｕＨ−７（岡山大学医学部付属癌源研究施設、佐藤二部
氏より譲与を受く）が、数年間にわたって、無血清培地
中で継代培養が可能であり、このことは上記二種の肝癌
細胞株は培地に高価な増殖因子を加える必要がないこと
を意味している。

本発明に用いる異種のヒト細胞株の無血清培地培養物と
しては、上記肝癌細胞の無血清培地培養物が好適である
。

即ち、上記肝癌細胞無血清培地培養物上澄液を培地とし
て変位株ＫＹＭ−Ａを培養すると、最良のもので１０％
牛脂児血清添加培地と程度の細胞増殖を示し、継代培養
しても、同じ結果であることを確認したのである。

肝癌細胞の培養にはＲＰＭＩｌＭＥＭなどを基本培地と
し、重炭酸ナトリウム、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、亜セレン酸、リ
ノール酸やオレイン酸などの脂肪酸を添加したものを用
いるが、更に、その上にモリブデン酸アンモニウム、硫
酸鉄、塩化マンガンやヴアナジン酸アンモニウムを加え
たものを用いてもよい。

無血清培地培養物の調製には常法のトリプシン及びＥＤ
ＴＡ処理により剥離したヒト肝癌細胞を０．５　Ｘ　１
０’〜５ｘｔｏ’細胞／ｃｍ２の密度でシャーレに播く
が、低密度で播種する場合は上記無血清培地と無血清培
地培養物の１対１の混合溶液を用い細胞のシャーレへの
接着を促すと良好な増殖が得られる。その後隔日に培地
交換を行うと細胞は対数増殖を行い、細胞密度が４Ｘ１
０５乃至１０６細胞／ｃＩ１１２程度にまで増殖して飽
和密度に到達し、数培地培養物としては細胞密度が１０
５細胞／ａｍ２以上の培養物の上澄液を回収してこれを
用いる。培養物は４℃で保存しても良いが凍結保存する
ことも可能である。

サイトデックス（ファルマシア社）、スーパービーズ（
フローラボラトリー社）等のマイクロキャリアを使用し
、１〜９ｍｇマイクロキャリア／ｍＱの培養濃度でＨｕ
Ｈ−６ｃ　Ｑ−５かＨｕＨ−７の培養を行ない無血清培
地培養物を得ることも可能である。

この様にして得られた無血清培地培養物をＰＡ生産の培
養に用いる場合には、特に前処理を必要としない。しか
し、培養条件をより良く設定する為には、アミノ酸や糖
などの栄養成分を毎回一定にするのが好ましい。更に無
血清培地培養物は細胞増殖因子を含む肝癌細胞が産生じ
た種々の蛋白質成分を含むので、培養に用いる前に蛋白
質濃度を決定し、毎回同じ条件下で培地として利用する
ことが望ましい。アミノ酸や糖などの栄養成分を調整す
るには、不足する成分を適宜追加しても良いが、透析な
どの方法で均一化するのが簡便である。すなわち、ＲＰ
　ＭＪやＭＥＭなどの基本培地に対して重炭酸ナトリウ
ム（Ｌ３ｇ／培地ρ程度）、Ｎ　−’　２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（１，
２ｇ／培地Ｑ程度）を添加した溶液に対して、上記のよ
うにして得られた無血清培地培養物を透析するとアミノ
酸や糖などの低分子量の栄養成分に関しては新鮮培地と
同一となり、しかも肝癌細胞が産生した高分子量（分子
量１万以上）の増殖因子を得ることができる。

また、透析に際して、亜セレン酸、リノール酸、オレイ
ン酸、モリブデン酸アンモニウム、硫酸鉄、塩化マンガ
ンやヴアナジン酸アンモニウムを加えた溶液に対して透
析しても良い。無血清培地培養物の蛋白質含有量はほぼ
２０〜５０μｇ／ｍＱである。

ＰＡ生産ヒト細胞株の細胞の増殖を１４〜４００μｇ／
ｍΩの蛋白質を含む無血清培地培養物を用いて検討した
ところ、増殖速度は蛋白質濃度に依存し、最適の増殖は
蛋白質濃度が２５μｇ／＋＋１以上で得られる。従って
稀薄な溶液に関しては透析に先立って、限外ろ過などの
方法で濃縮することが望ましい。

また、本発明においては、ヒト肝癌細胞株とＫＹＭ−Ａ
またはＫＹＭ−Ｂを混合培養して無血清培地培養物の代
替とすることができる。

本発明において、ＰＡの生産のための培養は接着状態で
培養するローラーボトル培養、マイクロキャリヤー培養
などや工業的な生産に適している浮遊攪拌培養などがあ
る。次に、浮遊攪拌培養について述べる。

変異株ＫＹＭ−Ａ細胞のＰＡ−ＫＹＭの生産を目的とし
て、細胞株を、プラスチックシャーレ−で浮遊培養し、
適当な細胞数に達した時点で、スピナーフラスコによる
浮遊攪拌培養を開始する°。

スピナーフラスコは、１００ｍ　Ｑ乃至８０００ｍ　Ｑ
の容量が好ましい。また、接種細胞密度は１０４乃至１
０５細胞／ｍ’Ｑが好ましく、５ｘｉｏ”乃至２Ｘ１０
Ｇ細胞／ｍｆｌの密度で定常期に達する。培養温度は特
に規定されるものではないが、約３０〜４０℃が適し、
特に３７℃前後が好ましい。また、気相としては１００
％空気または、５〜１０％の炭酸ガスを含有する空気、
または、５〜９５％酸素を含む空気などが好ましい。

培養は回分式でも良いが、細胞が十分生育すれば、１〜
４日間の間隔で培地を連続的に交換して培養を開始後１
ケ月前後にわたってＰＡ−ＫＹＭを含有する培養液を取
得することができる。

ここに得られるＰＡ−ＫＹＭは、プラスミノーゲンをプ
ラスミンに活性化する酵素で、蛋白質に属することから
、蛋白質の精製に応用される一般な方法はいずれも適用
され得る。一般には塩析、吸着、アフィニティークロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふ
るいなどによって精製することができる。

本発明によって得られるプラズミノーゲンアクチベータ
ーはＴＰＡ型であり、血栓溶解活性が高く、医薬品とし
て供すること可能である。

以下、実施例によって本発明を更に詳絹に説明する。

実施例１ 肛煉ゑ■薗小価面遺槙抽÷立芙蚤険箇箋制ＨｕＨ−６ｃ
　Ｑ−５及びＨｕＨ−７細胞株の培養の培地を次の様に
調製した。

ＲＰＭ　Ｉ　−１６４０（米国フローラホトリーズ社）
ＩＱあたり下記の成分を添加し、無血清培地を製造する
。

重炭酸ナトリウム　１．３ｇ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン　１．１９ｇ亜セ
レン酸（Ｈ２５ｅ０３　）　３．８７μｇリノール酸　
０，８４μｇ オレイン酸　０・８５μｇ モリブデン酸アンモニウム（（ＮＨ４）６　Ｎｏ□０２
４）　３．７１μｇ硫酸鉄（ＦｅＳＯ４・７ｆ（２０）
　２７．８　μｇ塩化マンガン（ＭｎＣＱ２　・４ｈ　
Ｏ）　０．０５９７ｚｇ’ヴアナジン酸アンモニウム（
ＮＨ４ＶＯ３）　１．１７μｇＨｕＨ−６ｃ　Ｑ−５ま
たはＨｕＨ−７細胞の培養を開始する為に、常法のトリ
プシン処理によってはく離した細胞を０．５　Ｘ　１０
４乃至５Ｘ１０’細胞／ｃｍ２の密度でシャーレ−に播
き、隔日に培地交換をした。細胞密度が１ＯＳ細胞／Ｃ
ｍ２以上の培養物の上澄液を回収し、培養物（Ｃｏｎｄ
ｉｔｉｏｎｅｄ　ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ）
とする。培養物の蛋白質含有量は２０〜５０μｇ／ｍＱ
であった。

実施例２　ＫＹＭ−Ａ株細胞の調製 ＫＹＭ−Ａ株細胞としては常法に従って、１０％牛脂児
血清を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地で継代培養したも
のを用いた。約５ＸＬＯ’ケの細胞を含む培養成約５ｍ
ρを採取し、低速遠心分離法によって細胞を回収した。

この細胞を１０ｍρのリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌ、１ｎｅ）に懸濁し
、これを同様の遠心分離法に供する。この操作を合計３
回繰返すことによって、牛胎児血清成分を完全に除去し
たＫＹＭ−Ａ株細胞を得た。

実施例３　ＫＹＭ−Ａ株の培養 実施例２で得られた牛胎児血清成分を含まない細胞を、
次の培地に５ＸＩＯ４細胞／ｍＱの濃度に懸濁し、表面
積８ｃｍ２のシャーレに播き６日間３７℃で培養した。

その結果を第６図に示す。

第６図において培養に供した培地は次の通りである。

■　濃厚な無血清培地培養物（実施例“１で得られた無
血清培地培養物を限外ろ過により蛋白質濃度を３５０μ
ｇ／ｍＱにした液） ：第６図のＣＭに該当 ■　稀薄な無血清培地培養物（実施例１で得られた無血
清培地培養物を限外ろ過により蛋白質濃度を７０μｇ／
ｍ　Ｑにした液） ：第６図の１１５ＣＭに該当 ０１０％の牛脂児血清を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０
培地 ：第６図のＦＣ３に該当 ■　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０培地のみ：第６図のＲＰ
ＭＩに該当 更に、動物細胞の無血清培地に増殖因子として一般に添
加されているヒトのトランスフェリン（５μｍ／ｍＱ）
、エタノールアミン（５μＭ）及び亜セレン酸（１０−
８Ｍ）（第６図のＴＥＳに該当）を上記■■■の３種類
の培地にそれぞれ添加した。

以上の実験から次のことが明らかになった。

１）培地に血清成分や無血清培地培養物が含まれない場
合はＫＹＭ−Ａ株細胞の増殖は見られない。

２）無血清培地培養物を用いた場合の細胞増殖は牛脂児
血清を用いた場合の増殖とほぼ同程度である。

３）無血清培地培養物の濃度差は細胞増殖に大きな影響
を与えない。但し別の実験から蛋白質濃度が１４μｇ／
ｍＱの無血清培地培養物中では余り、顕著な細胞増殖が
得られなかったが２０μｇ／ｍＱ程度の蛋白質濃度があ
れば増殖促進効果がある結果が得られている。

４）無血清培地培養物にトランスフェリン、エタノール
アミン、亜セレン酸及びインスリンを添加した場合、わ
ずかであるが増殖促進が見られた。

５）　これらの無血清培地培養物添加培地で増殖させた
ＫＹＭ−Ａａ、１４Ｂ胞を同じ条件下で継代培養したと
ころ、第６図とほぼ同様の結果が得られた。

以上の結果より、ヒト肝癌細胞より調製した無血清培地
培養物はＫＹＭ−Ａ株細胞の増殖に必要な因子を含んで
いることが明らかになった。

従って、この方法を用いてＫＹＭ−Ａ株細胞の無血清培
養が可能となった。

また、無血清培地培養物の代りに肝癌細胞を用いてＫＹ
Ｍ−Ａ細胞と混合培養する場合は、肝癌細胞をマイクロ
キャリアなど適当な担体に接着させ、ＫＹＭ−Ａ、！Ｉ
Ｉ胞の浮遊攪拌培養によってＰＡ−ＫＹＭを生産させる
ことができる。

実施例４ 実施例１で得られた無血清培地培養物を限外ろ過により
蛋白質濃度を１４０μｇ／ｍ　ｆｌにした液５０ｍｆｌ
と実施例１の無血清培地５０ｍＱを混合して培地とする
。この培地を添加したプラスチックシャーレにＫＹＭ−
Ａ細胞を播種して、増殖の結果約１．０ＯｒＩｌρの細
胞＠濁液が得られた時点で、同培地を入れたスピナーフ
ラスコを用いた浮遊攪拌培養を開始する。スピナーフラ
スコのサイズを次第に大きくすることによって、８Ｑの
浮遊攪拌培養が可能である。各段階の播種初密度は、１
０４乃至１０５細胞／ｍＱである。

細胞密度が５ｘｉｏ″乃至２Ｘ１０’細胞／ｍＱに達し
た時点で同培地を交換する。同培地中で浮遊攪拌培養を
１乃至４日間行ない、これを、４乃至ＩＯ回繰り返して
、濾過、取得した回収液を精製に供する。

得られた回収液をそれぞれ合一しアプロチニン、Ｔｖｅ
ｅｎ　８０および窒化ナトリウムを、それぞれ最終濃度
が２０ＫＩＵ／ｍｕ　、　０．０１および０．０２％に
なるように加える。（以下すべての緩衝液にはこの３種
類の薬品をこの濃度に添加する。）この試料を以下の方
法で精製した。

（ａ）　Ｐｐｒａｔｈらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏ
ｌ　２５８５９８−５９９、１９７５）で調整した亜鉛
キレートアガロースカラム（９ｃｎ＋φＸ２１ｃｍ）を
Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０５）で十分緩衝化した後、培養濾液３０Ωを
負荷する。負荷終了後、同緩衝液を３０００ｍ　Ｑ流し
、カラムを洗浄する。通過した培養濾液およびカラムの
洗浄液にはＰＡ−ＫＹＭ活性は認められなかった。続い
て同緩衝液１５００ｍＱと同緩衝液に１５０ｍＭイミダ
ゾールを含ませた緩衝液（ｐＨ７，３）とでグラジェン
ト溶出を行い、１フラクシヨン１５ＩＩＩＱの割合で分
画する。各フラクションについてＰＡ−ＫＹＭ活性を測
定すると分画番号で１２５番を中心としてＰＡ−ＫＹＭ
活性が顕著であった。この活性画分を透析チューブに集
め、ポリエチレングリコール２０，０００の粉末をふり
かけ４℃で濃縮する。濃縮後、０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，７）に対して４℃で２４時間外液を交換しつ
つ透析を行う。透析終了後、チューブ内溶液を遠心分離
（１０、ＯＯＯｒｐｍ、１０ｍ１ｎ）　Ｌ／上澄液を得
る。

（ｂ）このようにして得られたＰＡ−ＫＹＭを含む溶液
１３０ｍ　Ｑを予め０．’ＯＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
，７）で十分緩衝化したコンカナバリンＡセファロース
カラム（Ｉ　Ｘ　２０　ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ’ｌｓ社）に負荷する。負荷
を終了後、同一の緩衝液１００ＩＩＩＱで洗浄する。つ
づいて、同緩衝液（１５０ｍ　Ｑ　）と、それに０．６
Ｍカリウムチオシアネートおよび３Ｍα−メチルマンノ
シドを含む緩衝液（１５０ｍ　Ｑ　）とで形成した直接
勾配で溶出を行なう。分画は、３．５ｍ１２ずつ集め、
分画番号３２番を中心として、ＰＡ−ＫＹＭ活性が認め
られた。

この両分を集めたのち、ポリエチレングリコール２０，
０００を用いて５ｍＱに濃縮し、これを４０℃で生理食
塩水に対して２４時間、透析外液を交換しつつ透析する
。透析中に酵素溶液は白濁し、遠心分離（１５，００Ｏ
ｒｐｍ、３０分）をすると、沈殿分画にＰＡ−ＫＹＭ活
性が回収される。この段階で、ゲル口過法ではＰＡ−Ｋ
ＹＭより高分子と認められる蛋白質を中心とした混在蛋
白質の除去が可能であった。遠心分離で得られた沈殿物
を、２ｍＱの１．６Ｎカリウムチオシアネートを含む０
．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，７）に溶解する。完全
に溶解し得ない残渣を遠心分離によって除去した後、Ｐ
Ａ−ＫＹＭ活性を含有する上清液を得る。ここに得られ
た液を１．６Ｎカリウムチオシアネートを含む０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，７）で充分に緩衝化したセフ
ァデックスＧ　−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎ
ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のカラム（１，６Ｘ　８５ｃ
ｍ）に負荷し、同一の緩衝液で展開する。分画は２．４
ｍＱずつ分取すると、分画番号３５番を中心ρして、Ｐ
Ａ−ＫＹＭ活性が認められる。

以上のように、分別沈殿法を含めて４段階の方法でＰＡ
−ＫＹＭの精製標品が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＡ−ＫＹＭの各ｐＨの作用曲線を示す図で、
第２図はｐＨの残存活性を示す図で、第３図は作用温度
曲線を示す図で、第４図は各温度における残存活性を示
す図で、第５図は紫外線吸収スペクトルを示す図である
。第６図はＫＹＭ−Ａ株を５Ｘ１０’細胞／ｍＱを各々
の培地に懸濁し３７℃で５％の炭酸ガスを含有する空気
中で６日間培養した場合の時系列的な各培地に於けるＫ
ＹＭ−Ａ細胞数を示す。 ＣＭ：肝ガン細胞由来（ＨｕＨ）無血清培地培養物、蛋
白濃度３５０μｇ／ｍ　Ｑ　。 １１５ＣＭ：蛋白濃度がＣＭの１１５．７０　ｐ　ｇ／
ｍ　ＱＦＣ８Ｃ牛胎児血清ｌＯ％濃度 ＴＥＳ：ヒトのトランスフェリン、エタノールアミン、
亜セレン酸 ＲＰＭ　Ｉ　：　ＲＰＭ　Ｉ　−１６４０代理人　弁理
士　戸　１）親　男

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）プラズミノーゲンアクチベーターを産生ずるヒト
   細胞株を無血清培地で培養する方法において、異種の細
   胞株の無血清培地培養物もしくはその処理物を存在せし
   めることを特徴とするプラズミノーゲンアクチベーター
   の製造法。
2. （２）無血清培地培養物の調製に用いる細胞株がヒト肝
   癌細胞株であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   の製造法。
3. （３）プラズミノーゲンアクチベーターを産生ずるヒト
   細胞株が浮遊状態で増殖するヒト横絞筋腫細胞変異株Ｋ
   ＹＭ−Ａであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の製造法。
4. （４）プラズミノーゲンアクチベーターを産生ずるヒト
   細胞株が主として接着状態で増殖するヒト横絞筋腫細胞
   変異株ＫＹＭ−Ｂである特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。
5. （５）ヒト肝癌の細胞株の無血清培地培養物の存在が、
   ヒト横絞筋腫細胞変異株との混合培養であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１．３．４項記載の製造法。
6. （６）プラズミノーゲンアクチベーターを産生ずるヒト
   細胞株の無血清培地での培養が浮遊攪拌培養又は接着培
   養であることを特徴とする特許請求の範囲第１．２，３
   ，４．５項記載の製造法。