JPH0574346B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生物学的に活性なヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子およびその誘導体を、特に
組換え懸濁宿主細胞培養物から製造するための方
法に関する。

先行技術 ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子はプラ
スミノーゲンをプラスミンに変換する。こうして
生成したプラスミンは、血餅の骨格を構成してい
るフイブリンマトリツクスをタンパク質加水分解
的に切断する。ヒト組織型プラスミノーゲン活性
化因子はこのようにして血餅の溶解に関与し、従
つて種々の血栓疾患の治療に有用である。

ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の略号
「ｔ−PA」は、血栓症および止血に関する国際委
員会XX（the XX Meeting of the Ｉ
nternational Committee on Thrombosis and
Hemostatis；Bergamo、Ｉ taly、27 July
1982）に提案された後、採用されたものである。
本明細書中で用いる場合、「ヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子」、「ヒト ｔ−PA」、「ｔ−
PA」、「ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子」
または「組織プラスミノーゲン活性化因子」とな
る語句は、ヒトの外因性（組織型）プラスミノー
ゲン活性化因子を意味し、これは、たとえば天然
原料の抽出および精製［コーレン等（Collen et
al.）；欧州特許出願No.41766（1980年６月11日の最
初の出願に基いて1981年12月16日公開）、および
リジケン等（Rijken et al.、Journal of Biol.
Chem.、2567035（1981））を参照］、ならびに組換
え細胞培養システム［たとえば欧州特許出願公開
No.93619（1982年５月５日の最初の出願に基いて
1983年11月９日公開）に、アミノ酸配列および分
子のその他の性質とともに記載されている］によ
つて調製される。またこの語句には、全体の配列
中、１またはそれ以上のアミノ酸、およびグリコ
シル化パターン（これは、使用する特定の培養条
件およびヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
を与える宿主の性質に依存すると考えられてい
る）が異なつている生物学的に活性なヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子等価物も含まれる。

本出願人等は、通常はヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子と結合しているタンパク質を実質
的に含まないヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子を、組換えDNA法によつて原核および真核
宿主中に産生させた（上記EPA93619を参照）。
いくつかの理由から、ヒト組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子を組換え真核宿主（たとえば、哺乳
動物細胞など）中で製造するのが好ましい。一般
に真核宿主は、天然においては通常グリコシル化
されるヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子分
子中の特定のアミノ酸残基を認識してグリコシル
化し、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子分
子の種々のシステイン残基間に天然の共有結合架
橋を生成させ、そして天然のヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子の全体の立体構造により密接
に近似させる能力に優れている。これらの特徴
は、生物学的に活性であり、かつ安全なヒト組織
型プラスミノーゲン活性化因子産物を製造するの
に重要であると考えられている。

しかし、組換え宿主細胞からのヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子の製造には付随する問題
がないわけではない。すなわち、ヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子を産生する細胞は慣習
上、血清、血液あるいは他の動物組織由来の種々
のフラクシヨン、またはそれらの加水分解物の存
在下で培養されるため、収量が限定されるという
難題が生じることがわかつた。結果として、この
ような細胞が分泌するヒト組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子は、大量の血清タンパク質およびそ
の他の血清成分にさらされる。これらの成分のあ
るものは、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子分子との間に分離することが困難な結合し集合
した複合体を形成するので、常に、無傷のヒト組
織型プラスミノーゲン活性化因子を薬学的に許容
しうる形態へ精製するのを困難にすることがわか
つた。また、これらの集合体はヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子分子の生物学的な活性を阻
害し、従つて生物学的に活性な無傷のヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子の通常予想される収
量を全体に減少させる。また、血清成分を加える
と、精製して除去しなければならない不純物の量
が増加する。さらに、これらの成分の多くは組織
型プラスミノーゲン活性化因子をタンパク質加水
分解的に分解する。所望のヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子をこれらの系から精製しようと
すると技術的な難題が生じ、従つてさらに高価に
つく方法が必要となる。

これらの観察と合致して、培養細胞が分泌する
内生プラスミノーゲン活性化因子を製造および精
製する際の問題を避けるために血清を含まない培
地が提案された。たとえば、(1)欧州特許出願公開
No.113319（1982年12月30日の最初の出願に基いて
1984年７月11日公開；これには、内生ヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子を分泌する血清−非
依存性の天然ヒト細胞セルラインの調製が開示さ
れている）、(2)米国特許No.4232124、(3)米国特許No.
4328314、(4)米国特許No.4317882、および(5)ガツサ
ー等［Gasser et al.、In Vitro Cellular and
Developmental Biology、21558（1985）］を参
照。これらの文献はいずれも高密度細胞増殖、お
よび特に組換え懸濁宿主細胞培養物に関係してい
ない。一方、欧州特許出願公開No.112940（1982年
12月30日の最初の出願に基いて1984年７月11日公
開）は血清のタンパク質成分であるアルブミンを
追加することを包含する、ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子の製造方法に関する。

また細胞培養物を分別して、たとえば血清成分
を除去するための種々の方法が知られている。た
とえばフアン・レイズ等［Van Reis et al.、
The Journal of Immunology、133758（1984）］
は、白血球細胞培養物から血漿タンパク質レベル
を減少させ、それによつて粗製の内生ヒトγ−イ
ンターフエロンの不純物を減少させた［フアン・
レイズ等（Van Reis et al.、Methods in
Enzymology、19977）をも参照］。1982年11月、
フロリダ州マイアミでのインターフエロン研究の
第３回国際会議（Third Annual International
Congress for Interferon Research）において、
フアン・レイズ等は、ヒト細胞培養物から内生ヒ
トγインターフエロンを回収する際に、交差フロ
ー濾過（cross−flow filtration）を用いてオー
トロガスな（自己の）血漿タンパク質のレベルを
減少させることについて報告した。しかし、製造
中にさらに除去しても回収インターフエロン量を
増加させることができなかつた。

発明の概要 本発明の目的は、ヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子を産生する宿主細胞の培養物から、生
物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲン活性
化因子を製造（大スケールで）し、回収するため
の方法を提供することである。さらに詳しくは、
本発明の目的は、実質的にタンパク質加水分解、
脱グリコシル化、各種プロテアーゼ阻害剤による
阻害、および血清成分との集合および汚染のない
生物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子を製造するための方法を提供することで
ある。

ｔ−PAを産生する宿主細胞、たとえばヒト組
織型プラスミノーゲン活性化因子をコードしてい
るDNAを機能的（オペラブリー）に含有してい
る組換えベクターでトランスフエクシヨンした宿
主細胞を、好ましくは、細胞増殖は促進するがし
かし発現したヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子産物の回収および活性に有害である。１また
はそれ以上の成分を含有している増殖用培地にお
いて増殖させる。実質的にこのような成分のすべ
てを、培養前に除去するか、または培地交換、好
ましくは交差フロー濾過によつて培養中に増殖用
培地から除去する。除去後、この宿主細胞培養物
は、それ以上の細胞複製を必要とするかまたは必
要とすることなく発現能力を保持している。

これ以後、生物学的に活性なヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子が、有害成分を実質的に含
まない宿主細胞培養物中に保持された細胞内で発
現によつて産生される。次いで、この生物学的に
活性なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を
細胞から単離し、医学投与に適するようにさらに
精製する。

予想外にも、本発明方法は、これまで達成でき
ると考えられていなかつた収率で、純粋かつ無傷
のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を製造
することを可能にする。さらに、本発明方法は、
少なくとも50％が１本鎖形である組成の生物学的
に活性なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
を与える（これに対し、本方法以前に得られてい
た産物の組成では１本鎖形が実質的にこれより少
ない）。このことは、種々の切断部位でのタンパ
ク質加水分解が実質的に起こつていない産物が本
方法によつて得られるということを示しているの
で、予想外であると同時に重要であると考えられ
る。さらに、１本鎖形に富んだ物質は、少なくと
も２本鎖物質と同じ効力を有するようであり、比
較的少ないフイブリノーゲン分解を示し、これら
の結果は臨床応用に重要となろう。

詳細な説明 哺乳動物宿主細胞培養物の場合、代表的な有害
培地成分は、増殖用培地に始めに存在している血
液またはその他の動物組織由来のプラテアーゼ
類、ノイラミニダーゼ（neuramididase）等のグ
リコシダーゼ類、プロテアーゼ阻害剤類、アルブ
ミンなどである。

「生物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子」なる語句は、生体内でのフイブリ
ン血餅の溶解に関与し得る上記ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子を意味する。

「宿主細胞培養物」なる語句は、ｔ−PA産生
宿主細胞、たとえば組織型プラスミノーゲン活性
化因子をコードしているDNAを機能的に含有し
ている発現ベクターでトランスフエクシヨンした
宿主細胞の培養物を意味する。「組換え宿主細胞
培養物」とは、組織型プラスミノーゲン活性化因
子をコードしているDNAを機能的に含有してい
る発現ベクターでトランスフエクシヨンした「宿
主細胞培養物」のことである。「組換え懸濁宿主
細胞培養物」システムが好ましい。

多種多様の宿主細胞を本発明に用いることがで
きる。適当な宿主細胞としては、ヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子をコードしているDNA
を機能的に含有している組換えベクターでトラン
スフエクシヨンすることができ、発現によつて生
物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲン活性
化因子を産生することができ、そして懸濁培養物
中での増殖および維持が可能であるものが好まし
い。従つて、ｔ−PAを産生し、そして／または
組換え操作を行つて組換えヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を産生させ得るすべての宿主細
胞が本発明の範囲内に含まれる。好ましい宿主細
胞は哺乳動物細胞であり、これには組換えヒト組
織型プラスミノーゲン活性化因子を分泌するチヤ
イニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞（ATC
Ｃ No.CCL61；上記EPA93619を参照）が含まれ
る。

本発明方法においては、ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を産生し得る宿主細胞を、始め
に「増殖用培地」において増殖懸濁液として増殖
させる。この増殖用培地は、ヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子の産生用に用いる特定セルラ
インを培養するための、当分野で知られている通
常の培地またはその誘導体のどれであつてもよ
い。たとえば、ATCC培地ハンドブツクを参照
［ATCC Media Handbook.Ed：Cote et al.、
American Type Culture Colletion、
Rockville、MD（1984）］。哺乳動物細胞のための
増殖用培地は、たとえば血清追加物（ウシ胎児血
清など）、または細胞の増殖および分裂を促進す
るために通常用いられるその他の追加成分（動物
の肉あるいは乳の加水分解物、組織あるいは器官
の抽出物、血餅分解物あるいはその抽出物など）
を含有していることが好ましい。この最初の増殖
用培地は、宿主細胞の増殖および維持、ならびに
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の発現が
可能である培地であつてもよい。さらに、グリシ
ンおよび／あるいはヒポキサンチンおよび／ある
いはチミジンを欠き、そして／またはメトトレキ
セートを含有している標準増殖培地を用いて、メ
トトレキセートに対する結合親和力が低いジヒド
ロ葉酸還元酵素、ならびにヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を発現し得る発現ベクターを含
有している組換えCHO細胞のための選択圧を維
持してもよい。その他の選択可能な、および／ま
たは増幅可能なマーカーを用いてもよい。その他
の適当な培地成分には、たとえばトランスフエリ
ン、インスリンおよび各種金属が含まれる。

ある態様においては、宿主細胞を適当な細胞密
度（たとえば、CHO細胞では約１×10⁶／ml〜３
×10⁷／ml）まで増殖させた後、増殖用培地中の
有害成分を培地交換、好ましくは「交差フロー濾
過（cross−flow filtration）」によつて除去す
る。交差フロー濾過とは、ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を産生する細胞の懸濁液が、細
胞以外の懸濁液成分を透過し得るフイルターに実
質的に平行して流れる濾過様式を意味する。

この交差フロー濾過は、Re＝レイノルズ数、
γ_W＝壁剪断速度、ΔP＝圧力降下、およびTMP
＝膜内外圧力差、を含む一群の流体力学パラメー
ターで特徴づけられる。Re、γ_WおよびΔPは濾過
システムの幾何配置、流動条件および流動体の性
質に依存するであろう。たとえば、中空繊維濾過
システムを用いる場合、これらのパラメーターは
以下のようにして計算することができる： Re＝2ρQ_S／η_Snπr_h γ_W＝4Q_S／nπr_h ³ ΔP＝8Q_SLη_S／nπr_h ⁴ ［式中の各文字はそれぞれ、ρ＝細胞懸濁液密
度、Q_S＝懸濁液循環速度、η_S＝懸濁液の粘度係
数、ｎ＝中空繊維の数、r_h＝中空繊維の内部半
径、Ｌ＝中空繊維の長さ、を表す］。

同様の式をその他の流路幾何配置について得る
ことができる。平均の膜内外圧力差は以下のよう
にして計算することができる： TMP＝P_io−P_f−ΔP／２＝Q_fRη_f／Ａ ［式中の各文字はそれぞれ、P_io＝流入側圧力、
P_f＝濾液側圧力、Q_f＝濾過速度、Ｒ＝膜抵抗、Ａ
＝膜面積、η_f＝濾液の粘度係数、を表す］。好ま
しい態様では、流路の幾何配置および稼働パラメ
ーターは、濾過膜への細胞を沈積が最小になるよ
うに選ばれ、こうして分離工程の効率を高め、剪
断によつて引き起こされる細胞の損傷を最小にす
る。細胞の沈積は経験上以下のようにして求めら
れる： DP＝ν^1/2Uλ／r_c ²γ^3/2 ［式中の各文字はそれぞれ、DP＝沈積パラメー
ター、ν＝動粘度、Ｕ＝濾過速度、λ＝細胞濃度
の経験関数、C_cおよびr_c＝細胞半径、を表す］。
従つて、交差フロー濾過工程は、細胞懸濁液
（ρ、η_s、η_f、ν、C_cおよびr_c）、膜の選択および
流れの幾何（ｎ、r_h、Ｌ、ＲおよびＡ）によつ
て、ならびに稼働パラメーターの制御（Q_sおよ
びQ_f）によつて決まる。好ましい態様では、流
路幾何配置および稼働条件は、Re＜2100および
DP＜0.35となるように選ばれる。

有害成分の濃度は、交差フロー濾過工程（細胞
懸濁液が濾過装置を循環している）によつて減少
し、流れの一部は細胞を含まない濾液として取り
出される。有害成分を含有しない培地を加えるこ
とによつて、一定の細胞懸濁体積を維持すること
ができる。有害成分の最終的な残存割合は、以下
のようにして計算することができる： C_p＝C_pV_xe^(-Vm/Vx)／V_p ［式中の各文字はそれぞれ、C_p＝製造懸濁液中
の有害成分の濃度、C_p＝細胞増殖懸濁液中の有害
成分の初期濃度、V_x＝培地交換時の細胞懸濁液
の体積、ｅ＝自然対数の底、V_n＝交換培地の体
積、V_p＝製造懸濁液の最終体積、を表す］。

有害成分の濃度を予め決めたレベルまで低下させ
るのに必要な交換培地の量は以下のようにして計
算することができる： V_n＝V_xln（C_pV_x／C_pV_p） ［式中、lnは自然対数を表す］。

この式から、本発明の好ましい態様が、上記の一
定体積の培地交換に先立つて、始めに細胞懸濁液
を最小のV_x値まで濃縮することを包含するもの
であることが明らかである。すなわち、有害成分
濃度の希釈は、(i)細胞増殖懸濁液を最初の体積
V_pからV_xまで濃縮し、(ii)一定体積培地交換を行
い、そして(iii)V_x＜V_pならさらに希釈を行うこと
によつて達成される。

従つて、たとえば培地交換前の最初の細胞培養
物の体積が100であるときは、細胞懸濁液を10
まで濃縮し、45の培地を用いて培地交換を行
い、そして1000の製造体積を用いることによつ
て、有害成分濃度を全体で10000倍に希釈するこ
とができる。

このようにして、培地交換中の最初の増殖用培
地の希釈因子を定量的に求めて、得られた宿主細
胞懸濁液中の有害成分量を予め決めた濃度以下に
し、こうして有害成分の逆効果を最小にすること
ができる。このような希釈因子を増殖培地の各バ
ツチについて決めることもできる。たとえば、哺
乳動物増殖培地に追加した血清の濃度が異なれ
ば、所望ではない成分の量を、薬学的に許容しう
るヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造
が可能である機能的に等しい濃度まで低下させる
ための希釈因子は異なるであろう。従つて、最終
的な哺乳動物発現培地中の血清量が、たとえば最
初に用いた合計量の約１％以下になるように希釈
因子を選択してもよい。

本発明で用いる濾過メンブラン（膜）は、本発
明のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子産生
細胞を保持する一方で各種有害成分を透過させう
る適当な膜性能および形状を有する、当分野で既
知の膜から選択することができる。すなわち、選
択した流体力学条件下で細胞を保持することがで
きるが、その一方で有害成分を透過させて除去す
ることができる適当な膜のどれかを用いることが
できる。孔の大きさの上限は約５ミクロン、下限
は約0.1ミクロンが適当であろう。

新鮮な交換培地は有害成分を実質的に含んでい
ない。たとえば、有意量の有害成分（プロテアー
ゼ類、ノイラミニダーゼ類、プロテアーゼ阻害剤
類など）を全く含んでいない。もちろんこのよう
な培地は、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を産生させるために用いる細胞の種類によつて
異なり、たとえば当分野で用いられているものか
ら選択することができる。これは最終的な発現培
地と同じであつてもよいし（簡便化のため）、富
み方が幾分少ない培地、たとえば緩衝化した等張
食塩水培地などであつてもよい。

本明細書に記載のヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子産生CHO細胞に対しては、たとえば
ウシ胎児血清を追加していないCHO細胞培養用
の標準培地から最終の発現培地を調製してもよ
い。この最終の発現培地の例としては、ダルベツ
コの改良イーグル（Dulbecco−modified
Eagles）培地（高グルコース）とハム（Ham）
のＦ−12培地の等量部混合物が挙げられる。

他の態様では、培養前に有害成分を培地から除
去あるいは実質的に除去してもよいし、また、た
とえば遠心あるいは沈澱法によつて除去してもよ
い。

このヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を
発現培地から単離し、次いで精製し、種々の血管
症状または疾患の治療用薬剤として用いる。

好ましい態様においては、ヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子を産生することができる
CHO細胞を、ウシ胎児血清を追加したCHO培地
中の懸濁物として、予め決めた細胞密度まで増殖
させる。次いでこの細胞懸濁液を交差フロー濾過
によつて濃縮する。これ以後、血清は一定量の交
差フロー濾過（血清含有培地が除去される速度と
常に同じ速度で血清不含培地を加える）によつて
濃縮懸濁液から除去される。次いで、この血清不
含発現培地中の懸濁CHO細胞が活性なヒト組織
型プラスミノーゲン活性化因子を産生する。
CHO細胞は、こうして産生したヒト組織型ピラ
スミノーゲン活性化因子を発現培地中に分泌し、
これを常法によつて分離することができる。

種々の容量の培養容器を用いてCHO細胞懸濁
物を増殖させる。各培養容器を、多数並んでいる
多孔性の接線方向のフローフイルターの接続し
（その入口を経て）、次にこれを培養器に接続する
（培養器に戻る出口を経て）。増殖させた後、
CHO細胞と血清含有培地の懸濁液をこの多数並
んでいる多孔性の接線方向のフローフイルターに
ポンプで送り込み、始め懸濁液を濃縮し、次いで
培地交換中に懸濁液から血清成分を除去する。こ
のCHO細胞懸濁液を、フイルターと培養容器間
で循環させ、一部の古い培地および血清成分を除
去する。血清を含まない新鮮な滅菌発現培地をこ
の細胞懸濁液に供給し、培養容器中の名目体積を
維持する。このように、継続的な培地交換によつ
て予め決めた濃度まで血清濃度を低下させた後、
血清不含の発現培地が入つている別の容器に滅菌
管を用いて細胞を移し、この培地中にヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子を分泌させる。次い
で常法によりヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子を取り出すことができる。

実施例 Ａ 細胞増殖、培地交換および製造段階 発現ベキターpETPFR（上記PO 93619を参照）
でトランスフエクシヨンし、従つて組換えｔ−
PAを発現するチヤイニーズ・ハムスター卵巣
（CHO）細胞（ATCC No.CCL61）を、液体窒素
貯蔵品から再生し、ハムのF12培地およびダルベ
ツコの改良イーグル培地の１：１混合物からなる
培地で増殖させた。この混合物はヒポキサンチま
たはチミジンを含有していなかつた。この培地
に、透析または透過濾過したウシ胎児血清（７％
ｖ／ｖ）およびメトトレキシセイト（500nMま
で）を加えた。この細胞を、約37℃でインキユベ
ートしたガラス容器中、懸濁培養で増殖させた。
３〜５日毎にこの培地で細胞を継代培養し、その
数を増加させた。十分量の細胞が蓄積したら、こ
れを10のステンレス発酵槽に移し、さらに約３
日間増殖させた。この増殖期には、より良好な細
胞収量が得られるように培地組成を変え、ヒポキ
サンチンおよびチミジンの両者を含有させたがメ
トトレキセイトは含有させなかつた。この培地
に、透析していないウシ胎児血清を導入し（２％
ｖ／ｖ）、３日間の増殖期の間に細胞密度を約
0.25×10⁶細胞／mlから約1.0×10⁶細胞／mlまで増
加させた。

次いで、血清を含まない製造培地中に懸濁させ
る前に、上記のようにして90時間、細胞を培地交
換にかけた。この培地交換は以下のようにして行
つた。

中空繊維の接線方向のフローフイルターならび
にこれに接続している入口および出口のシリコン
ゴム管をオートクレーブで滅菌し、水蒸気滅菌し
うる接続部を介して10の製造容器に接続した。
フイルターとしては、内径が0.75mmであり、その
長さ方向に名目上0.1μｍの孔を有する280の中空
繊維を含有しているポリスルホン中空繊維ユニツ
ト［A.G.テクノロジー社（A.G.Technology、Ｉ
nc.）製：フイルター＃1BZE100801AL］を用
いた。このユニツトは4.15ft²の濾過面積有してい
た。ワトソン・マロウ２葉ポンプ（Watson
Marlow two lobed pump）を用いて、この中
空繊維と容器の間で細胞を循環させた。循環速度
は約3.5／分であり、これと同時に液体の一部
を、透明な濾液として約211ml／分の速度で流出
させ、これを廃棄した。このようにして、細胞を
維持し、培養物体積を約5.2まで減少させた。
この時点で、新鮮かつ滅菌した血清不含培地（上
記で用いたものと同じ配合であるが、ウシ血清ま
たはそれから誘導される成分を含んでいない）
を、約211ml／分の速度で培養容器にポンプで送
り込み、こうして古い培地を継続的に希釈除去し
ながら体積を維持した。

この系に新鮮な血清不含培地55をポンプで送
り込み、その細胞懸濁液の一部を別の10ステン
レス発酵槽中の新鮮な血清不含培地に加えたとき
に血清濃度が計算値で約190000倍まで希釈されて
いるようにした（または、体積0.0001％以下にな
るように）。次いでこの細胞を、製造段階用に37
℃で約90時間インキユベートした。この培養物か
ら資料を採取し、遠心して透明にし、後に行う分
析用に−20℃で保存した。

これと同様にして行つた第２の実施例では、中
空繊維フイルター以外については、用いた条件、
細胞および培値はすべて同様であつた。ここでの
フイルターは290の中空繊維を含有し、4.3ft²の濾
過面積を有しているが、それ以外は上記のものと
同様であつた（A.G.テクノロジー社製：フイル
ター＃1810902AL）。

Ｂ 分析方法 試料を処理し、分析して、これらの実施例で用
いたCHO細胞が産生するｔ−PA対してウシ血清
が及ばす有害効果を証明した。血清不含の製造段
階からの透明化した細胞培養試料を解凍し、β−
メルカプトエタノールで希釈し、レムリの不連続
系［Ｌ aemmli、Nature、227680（1970）］を用
いてS.D.S.電気泳動にかけた。このようにして分
離したタンパク質を銀染色にかけるか［モリツセ
イ（Morrissey、Anal.Biochem.、117307
（1981））］、またはニトロセルロースシートに移行
させた［トウビン等（Towbin et al.、PNAS、
766350（1979））の方法を用い、８℃、0.5アンペ
アで４時間、0.45μｍニトロセルロースに移行さ
せる］。ｔ−PAタンパク質、タンパク質フラグメ
ントおよびｔ−PAを含有する高分子量複合体を、
下記の間接酵素結合の免疫検定法によつて、この
ニトロセルロースシート上で見えるようにした。
すなわち、始めに結合ｔ−PAタンパク質とウサ
ギ抗ｔ−PA抗体を反応させ、ついで第２の抗体
で処理した。この第２の抗体は西洋ワサビペルオ
キシダーゼ結合の抗ウサギIgG（ヤギを用いて得
られた）であつた。この反応の後、過酸化水素お
よびPBS中の発色団４−Cl−ナフトールを加え
ると、結合した抗体のところで発色し、これによ
つてｔ−PAおよび関連タンパク質の電気泳動パ
ターンが明らかになつた。すなわちこれらの方法
を用いて、粗製の培養液中のｔ−PAの状態をさ
らに精製することなく測定することができる。

Ｃ 結果 ウシ胎児血清がｔ−PAに及ぼす有害効果を証
明するため、製造段階からの試料をリン酸緩衝食
塩水（PBS）と、または0.175％ｖ／ｖあるいは
1.75％ｖ／ｖウシ胎児血清とともに22時間または
46時間（上記のようにして分析する前に）インキ
ユベートした。この結果を、銀染色ゲル（第１
図）および対応する免疫ブロツト（第２図）で示
す。

第１図は、上記のようにして得たｔ−PA試料
の銀染色ゲルを示す。

第２図は、第１図のゲルと同じゲルの免疫ブロ
ツトである。

図中のレーン番号はそれぞれ以下に示す試料に
対応している。

レーン番号 試 料 １ 分子量の標準［92.5キロダルトン(K)、
66.2K、45K、31K、21.5K、
14.4K］ ２ 真正ｔ−PA対照標準 ３ ｔ−PA含有の細胞培養液（実験室対照） ４ 製造段階の試料からの細胞培養液 ５ 製造段階試料；リン酸緩衝食塩水（PBS）
とともに37℃で22時間インキユベ
ートした ６ 製造段階試料；PBSとともに37℃で46
時間インキユベートした ７ 空レーン ８ 製造段階試料；0.175％（ｖ／ｖ）ウシ
胎児試料（FBS）とともに37℃
で22時間インキユベートした ９ 製造段階試料；0.175％（ｖ／ｖ）FBS
とともに37℃で46時間インキユベ
ートした 10 0.175％（ｖ／ｖ）FBS単独；37℃で22
時間インキユベートした 11 0.175％（ｖ／ｖ）FBS単独；37℃で46
時間インキユベートした 12 製造段階試料；1.75％（ｖ／ｖ）FBSと
ともに37℃で22時間インキユベー
トした 13 製造段階試料；1.75％（ｖ／ｖ）FBSと
ともに37℃で46時間インキユベー
トした 14 1.75％（ｖ／ｖ）FBS単独；37℃で22時
間インキユベートした 15 1.75％（ｖ／ｖ）FBS単独；37℃で46時
間インキユベートした 第１図および第２図のレーン２および３は、ｔ
−PAの対照標準である（１本鎖ｔ−PAはより高
分子量のバンドとして、２本鎖ｔ−PAはより低
分子量のバンドとして示される）。

ウシ胎児血清（FBS）が存在していることに
よつて観察される有害効果は、(a)タンパク質加水
分解によつて切断された種々の形態およびそれら
のフラグメントを付随的に蓄積しながら無傷のｔ
−PAの消失を引き起こすこと（第２図のレーン
８および９を参照）、および(b)90〜200キロダルト
ンの範囲のより高分子量の複合物質を生成するこ
と（第２図のレーン１２および１３を参照）であ
る。

また、上記のような「細胞増殖、培地交換およ
び製造段階」を経て得られた血清不含細胞培養液
がPBSの存在下で22または46時間インキユベー
トされたときには実質的に変化しないままである
ということが結果からわかる（第１図および第２
図のレーン５および６を参照）。すなわち、ウシ
胎児血清が製造段階の細胞培養物培地に残つてい
ると、ｔ−PAの高分子量複合物の生成およびタ
ンパク質加水分解の両方が起こる。従つて、本明
細書中に記載した培地交換工程によつて血清を除
去すると、その有害効果が実質的に取り除かれ
る。

上記に特定の好ましい態様について記載した
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
当分野で通常の知識を有する者は、ここに開示し
た態様に種々の修飾を加えることもあるであろう
が、このような修飾は本発明の範囲内に含まれる
べきものである。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、本発明方法またはその
他の対照方法によつて得たｔ−PAについて電気
泳動を行い、そしてそれぞれ銀染色および免疫ブ
ロツトしたゲルの模写図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 組換え発現によつて生物学的に活性なヒト組
   織型プラスミノーゲン活性化因子を産生し得る組
   換え宿主細胞懸濁培養物において生物学的に活性
   な組織型プラスミノーゲン活性化因子を製造する
   方法であつて、 (a) 組換えによつてトランスフエクシヨンされた
   宿主細胞を、該宿主細胞の増殖および維持が可
   能な増殖用培地を用いる懸濁培養において増殖
   させ、 (b) 適当なメンブランを装備した濾過装置を用い
   る交差フロー濾過法により、細胞培養懸濁液が
   該濾過装置を再循環して該細胞培養懸濁液の均
   質性を保持しながら培地の一部が細胞不含の濾
   液として除去されるようにして、宿主細胞の発
   現能力を保持しながら、該培養物培地からヒト
   組織型プラスミノーゲン活性化因子の回収およ
   び生物学的活性に有害な培地成分を除去し、 (c) 該濾液を、ヒト組織型プラスミノーゲン活性
   化因子の回収および活性に有害な成分を含まな
   い培地と交換し、そして (d) 培地交換した培養物中の該生物学的に活性な
   ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子発現産
   物を集めること、 を特徴とする方法。 ２ 該交差フロー濾過が平らな濾過メンブランを
   介して行なわれる第１項記載の方法。 ３ 該交差フロー濾過が多孔性中空繊維の壁を介
   して行なわれる第１項記載の方法。 ４ 該交差フロー濾過が螺旋型のメンブランを介
   して行なわれる第１項記載の方法。 ５ 該増殖および細胞複製用培地の成分が血液、
   組織またはそれらの誘導体から得られるものであ
   る第１項記載の方法。 ６ 該宿主細胞がヒト組織型プラスミノーゲン活
   性化因子を産生し得る哺乳動物細胞からなる第１
   項記載の方法。 ７ 該哺乳動物細胞が組換えによつてトランスフ
   エクシヨンされたCHO細胞からなる第６項記載
   の方法。 ８ 該宿主細胞が増幅可能なマーカーとヒト組織
   型プラスミノーゲン活性化因子を発現し得る発現
   ベクターを含有しており、工程(d)の前に該細胞
   を、該増幅可能なマーカーの多数のコピーを含有
   している細胞に対する選択圧を維持するように選
   んだ培地において培養することをさらに包含する
   第１項記載の方法。 ９ 該増幅可能なマーカーがメトトレキセートに
   対する結合親和性の低いジヒドロ葉酸還元酵素で
   あり、選択圧を維持するように選んだ培地がメト
   トレキセートを含んでいる第８項記載の方法。 １０ 該交差フロー濾過法がレイノルズ数Reを
   含む一群の流体力学パラメーターおよび細胞沈積
   パラメーターDPによつて特徴づけられ、Re＜
   2100およびDP＜0.35となるように細胞懸濁液、
   濾過装置および濾過装置の操作条件が選ばれる第
   １項記載の方法。