DE3718939A1 - Verfahren zur herstellung von biologisch aktivem plasminogenaktivator - Google Patents

Verfahren zur herstellung von biologisch aktivem plasminogenaktivator

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktivem Human-Gewebe-Plasminogenaktivator und dessen Derivaten, insbesondere aus rekombinanten Suspensions-Wirtzellkulturen.
Human-Gewebe-Plasminogenaktivator bewirkt eine Umwandlung von Plasminogen in Plasmin. Das auf diese Weise gebildete Plasmin spaltet proteolytisch Fibrinmatrices, die das Gerüst von Blutgerinnseln bilden. Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ spielt somit eine vermittelnde Rolle bei der Auflösung von Blutgerinnseln und eignet sich daher zur Behandlung von verschiedenen thrombotischen Störungen.
Die Abkürzung "t-PA" wurde gemäss einem Vorschlag, der auf dem XXVIII. Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemostatis, Bergamo, Italien, 27. Juli 1982, gemacht wurde, für den Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ eingeführt. Die hier verwendeten Ausdrücke "Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ", "human-t-PA", "t-PA", "Human-Gewebe- Plasminogenaktivator" oder "Gewebe-Plasminogenaktivator" bezeichnen den humanen, exogenen (Gewebe-Typ) Plasminogenaktivator, der beispielsweise aus natürlichen Quellen durch Extraktion und Reinigung (vgl. Collen et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 41 766 (veröffentlicht am 16. 12. 1981, Anmeldetag 11. 6. 1980) und Rÿken et al., Journal of Biol. Chem., Bd. 256 (1981), S. 7035) und durch rekombinante Zellkultursysteme, die zusammen mit der Aminosäuresequenz und anderen charakteristischen Eigenschaften des Moleküls beispielsweise in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 93 619 (veröffentlicht am 9. 11. 1983, Anmeldetag 5. 5. 1982) beschrieben worden sind, erhältlich ist. Die vorstehenden Ausdrücke umfassen auch biologisch aktive Äquivalente des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ, die sich in den Glycosylierungsmustern, von denen man annimmt, dass sie von den speziellen Kulturbedingungen und der Art des Wirts, aus dem der Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ erhalten wird, abhängen, und in bezug auf eine oder mehrere Aminosäuren in der Gesamtsequenz unterscheiden.
In den Laboratorien der Anmelderin wurde Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ, der im wesentlichen frei von üblicherweise damit assoziierten Proteinen ist, durch rekombinante DNA-Technik in prokaryotischen und eukaryotischen Wirten hergestellt (vgl. die vorerwähnte EP-A 93 619). Es gibt verschiedene Gründe zur bevorzugten Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ in rekombinanten eukaryontischen Wirten, z. B. Säugetierzellen. Eukaryotische Wirte zeichnen sich im allgemeinen durch folgende Fähigkeiten aus: Erkennung und Glycosylierung von speziellen Aminosäureresten im Molekül des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ, die üblicherweise im nativen Zustand glycosyliert sind; Bildung der natürlicherweise auftretenden kovalenten Vernetzungen zwischen verschiedenen Cysteinresten des Moleküls des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ; und genauere Annäherung an die Gesamtkonformationsstruktur des nativen Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ. Diese Eigenschaften werden als wichtig für die Bildung von biologisch aktiven und sicheren Plasminogenaktivator- Produkten vom Human-Gewebe-Typ angesehen.
Jedoch ist die Bildung von Plasminogenaktivator vom Human- Gewebe-Typ aus rekombinanten Wirtszellen nicht ohne Schwierigkeiten. Es wurde festgestellt, dass die Ausbeute begrenzende Schwierigkeiten auftreten, da die den Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ bildenden Zellen im allgemeinen in Gegenwart von Serum, verschiedenen aus Blut stammenden Fraktionen oder anderen tierischen Geweben oder Hydrolysaten davon gezüchtet werden. Infolgedessen wird der durch derartige Zellen ausgeschiedene Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ grossen Mengen an Serumproteinen und anderen Serumbestandteilen ausgesetzt. Es wurde festgestellt, dass bestimmte dieser Bestandteile in unveränderlicher Weise die Reinigung eines intakten Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ erschweren, so dass es nicht möglich ist, eine pharmazeutisch annehmbare Darreichungsform zu erhalten, da diese Bestandteile schwierig abzutrennende gebundene Aggregatkomplexe mit dem Molekül des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ bilden. Diese Aggregate können auch die biologische Aktivität des Moleküls des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ beeinträchtigen, wodurch die im allgemeinen erwarteten Ausbeuten an biologisch aktivem Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe- Typ verringert werden. Der Zusatz von Serumbestandteilen erhöht auch die Menge an Verunreinigungen, die während des Reinigungsvorgangs entfernt werden müssen. Ferner führen zahlreiche dieser Bestandteile zu einem proteolytischen Abbau des Plasminogenaktivators vom Gewebe-Typ. Die Reinigung des gewünschten Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ aus diesen Systemen bringt technische Schwierigkeiten mit sich, was teurere Verfahren erforderlich macht.
In Anbetracht dieser Befunde wurden zur Vermeidung von Schwierigkeiten bei der Bildung und Reinigung von durch gezüchtete Zellen endogen gebildeten und sekretierten Plasminogenaktivatoren die Verwendung von serumfreien Medien vorgeschlagen; vgl. z. B. 1) EP-A 1 13 319 (Veröffentlichungstag 11. 7. 1984, Anmeldetag 30. 12. 1982), die die Herstellung von serumunabhängigen natürlichen Humanzellinien, die endogen gebildeten Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ sekretieren, beschreibt; 2) US-PS 42 32 124; 3) US-PS 43 28 314; 4) US-PS 43 17 882 und 5) Gasser et al., In Vitro Cellular and Developmental Biology, Bd. 21 (1985), S. 588. Keine dieser Druckschriften betrifft hochdichtes Zellwachstum und insbesondere rekombinante Suspensions-Wirtszellkulturen. Andererseits ist die EP-A 1 12 940 (Veröffentlichungstag 11. 7. 1984, Anmeldetag 30. 12. 1982) auf ein Verfahren zur Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ abgestellt, wobei Albumin, d. h. eine Proteinkomponente des Serums, zugesetzt wird.
Es sind verschiedene Massnahmen zur Fraktionierung von Zellkulturen bekannt, um beispielsweise Serumbestandteile zu entfernen; vgl. Van Reis et al., The Journal of Immunology, Bd. 133 (1984), S. 758, wonach die Plasmaproteinspiegel von Leukozytenzellkulturen verringert werden und dadurch der Gehalt an Verunreinigungen von rohem, endogen gebildetem Human- γ-interferon vermindert wird; vgl. auch Van Reis et al., Methods in Enzymology, Bd. 119, S. 77. Im November 1982 berichteten Van Reis et al. beim Third Annual International Congress for Interferon Research, Miami, Florida, über die Anwendung der Querstromfiltration (cross-flow filtration) zur Verringerung der Konzentrationen an autologem Plasmaprotein bei der Gewinnung von endogen gebildetem Human-γ-interferon aus einer menschlichen Zellkultur. Jedoch konnte die gewonnene Interferonmenge durch weitere Entfernung während der Herstellung nicht erhöht werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur grosstechnischen Herstellung und Gewinnung von biologisch aktivem Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ aus Wirtszellen, die diesen Aktivator bilden, bereitzustellen. Erfindungsgemäss soll ein Verfahren angegeben werden, bei dem biologisch aktiver Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ anfällt, der im wesentlichen frei von proteolytischem Abbau, Deglycosylierung, Hemmung durch verschiedene Proteaseinhibitoren sowie Verunreinigung und Aggregation mit Serumbestandteilen ist.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktivem Human-Gewebe-Plasminogenaktivator in Wirtszellkulturen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man aus dem Kulturmedium im wesentlichen sämtliche Mediumbestandteile, die für die Gewinnung und Aktivität des Human-Gewebe- Plasminogenaktivators schädlich sind, entfernt, während die Expressionsfähigkeit der Wirtszellen erhalten bleibt.
t-PA bildende Wirtszellen, z. B. solche, die mit rekombinanten Vektoren, die in wirksamer Weise für Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ kodierende DNA beinhalten, transfiziert sind, werden in einem das Wachstum unterstützenden Medium gezüchtet, das vorzugsweise einen oder mehrere Bestandteile enthält, die zwar das Zellwachstum erleichtern, jedoch für die Gewinnung und die Aktivität des gebildeten exprimierten Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ nachteilig sind. Erfindungsgemäss werden im wesentlichen alle diese Bestandteile vor der Züchtung ausgeschlossen oder aus dem Wachstumsmedium durch Mediumaustausch, vorzugsweise durch Querstromfiltration, während der Züchtung entfernt. Nach der Entfernung behält die Wirtszellkultur ihre Expressionsfähigkeit mit oder ohne Notwendigkeit einer weiteren Zellreplikation.
Anschließend wird biologisch aktiver Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ durch Expression in den Zellen, die in der Wirtszellkultur im wesentlichen frei von schädlichen Bestandteilen gehalten werden, durch Expression gebildet. Der biologisch aktive Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ wird sodann aus den Zellen isoliert, bevor eine weitere Reinigung entsprechend der pharmazeutischen Verabreichung vorgenommen wird.
Überraschenderweise ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren die Herstellung von gereinigtem, intaktem Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ in bisher nicht für möglich gehaltenen Ausbeuten. Ferner liefert das erfindungsgemässe Verfahren biologisch aktiven Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe- Typ, wobei das Produkt mindestens zu 50 Prozent einkettig ist, während bei den herkömmlichen Verfahren ein wesentlich geringerer einkettiger Anteil erhalten wird. Dieser Befund wird abgesehen davon, dass er überraschend ist, deswegen für wichtig gehalten, da er anzeigt, dass das erfindungsgemässe Verfahren ein Produkt liefert, das im wesentlichen frei von proteolytischem Abbau an den verschiedenen Spaltungsstellen ist. Ferner besitzt Material, das vorwiegend in einkettiger Form vorliegt, offensichtlich eine mindestens ebenso gute Wirksamkeit wie zweikettiges Material und bewirkt einen geringeren Fibrinogenabbau. Diese Ergebnisse können bei der klinischen Anwendung von Bedeutung sein.
Nachstehend wird das erfindungsgemässe Verfahren näher erläutert.
A. Allgemeine Bemerkungen
Im Fall von Säugetier-Wirtszellkulturen handelt es sich bei den schädlichen Bestandteilen der Medien typischerweise um aus Blut oder anderem tierischen Gewebe abgeleitete Proteasen, Glycosidasen, wie Neuraminidase, Proteaseinhibitoren, Albumin und dergl., die ursprünglich im Wachstumsmedium vorhanden sind.
Der Ausdruck "biologisch aktiver Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ" bezieht sich auf den vorerwähnten Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ, der in der Lage ist, in vivo eine vermitteltende Rolle bei der Auflösung von Fibrin- Blutgerinnseln zu spielen.
Der Ausdruck "Wirtszellkultur" bezieht sich auf eine Kultur von t-PA bildenden Wirtszellen, beispielsweise von Zellen, die mit einem Expressionsvektor, der in wirksamer Weise für Plasminogenaktivator vom Gewebe-Typ kodierende DNA beinhaltet, transfiziert sind. Unter einer "rekombinanten Wirtszellkultur" ist eine "Wirtszellkultur" zu verstehen, die mit einem Expressionsvektor, der in wirksamer Weise für Plasminogenaktivator vom Gewebe-Typ kodierende DNA beinhaltet, transfiziert ist. "Rekombinante Suspensions-Wirtszellkultur"-Systeme werden bevorzugt.
Verschiedenste Wirtszellen können verwendet werden. Geeignete Wirtszellen sind vorzugsweise dazu in der Lage, mit rekombinanten Vektoren, die in wirksamer Weise für Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ kodierende DNA beinhalten, transfiziert zu werden, biologisch aktiven Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ bilden und in Suspensionskulturen gezüchtet und aufrechterhalten werden können. Demzufolge können erfindungsgemäss beliebige Wirtszellen verwendet werden, die t-PA bilden und/oder zur rekombinanten Gentechnik unter Bildung von rekombinanten Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe- Typ geeignet sind. Bei den Wirtszellen handelt es sich vorzugsweise um Säugetierzellen. Hierzu gehören den Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ sekretierende Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen); vgl. die vorerwähnte EP-A 93 619 (ATCC Nr. CCL61).
Im erfindungsgemässen Verfahren werden Wirtszellen, die zur Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ in der Lage sind, zuerst als Wachstumssuspension in einem "Wachstumsmedium" (growth supporting medium) gezüchtet. Bei diesem Wachstumsmedium kann es sich um beliebige bekannte Standardmedien oder Variationen davon handeln, die die Züchtung der zur Bildung des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ verwendeten speziellen Zellinie unterstützen; vgl. z. B. ATCC Media Handbook, Hrsg. Cote et al., American Type Culture Collection, Rockville, MD, 1984. Ein Wachstumsmedium für Säugetierzellen enthält z. B. vorzugsweise einen Serumzusatz, z. B. fötales Kälberserum oder andere herkömmlicherweise verwendete Zusatzbestandteile, die zur Erleichterung des Zellwachstums und der Zellteilung eingesetzt werden, wie Hydrolysate von tierischem Fleisch oder Milch, Gewebe- oder Organextrakte, aufgeschlossene Gerinnsel oder deren Extrakte und dergl. Beim anfänglichen Wachstumsmedium kann es sich auch um eine Medium handeln, das das Wachstum und die Aufrechterhaltung der Wirtszellen sowie die Expression von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ ermöglicht. Ferner kann ein Standardwachstumsmedium mit einem Mangel an Glycin und/oder Hypoxanthin und/oder Thymidin und/oder einem Gehalt an Methotrexat verwendet werden, um einen selektiven Druck in bezug auf rekombinante CHO-Zellen aufrechtzuerhalten, die einen zur Expression von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ fähigen Expressionsvektor sowie Dihydrofolat-reduktase mit geringer Bindungsaffinität für Methotrexat enthalten. Weitere selektierbare und/oder amplifizierbare Marker können ebenfalls verwendet werden. Weitere geeignete Mediumbestandteile sind z. B. Transferrin, Insulin und verschiedene Metalle.
Gemäss einer Ausführungsform werden nach dem Wachstum der Wirtszellen bis zu einer geeigneten Zelldichte, z. B. etwa 1 × 106 /ml bis 3 × 107 /ml für CHO-Zellen, die schädlichen Bestandteile in den Wachstumsmedien durch Mediumaustausch, vorzugsweise durch "Querstromfiltration", entfernt. Unter Querstromfiltration ist eine Filtrationsart zu verstehen, bei der eine Suspension von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ bildenden Zellen im wesentlichen parallel zu einem Filter, der für einen Bestandteil der Suspension, nicht aber für die Zellen durchlässig ist, strömt.
Das Querstromfiltrationsverfahren ist durch eine Gruppe von dynamischen Fluidparametern charakterisiert, einschliesslich Re = Reynolds-Zahl, γ w = Wandschergeschwindigkeit, Δ P = Druckabfall und TMP = Transmembrandruck. Re, γ w und Δ P hängen von der Geometrie des Filtrationssystems, den Strömungsbedingungen und den Flüssigkeitseigenschaften ab. Beispielsweise lassen sich bei Anwendung eines Hohlfaser-Filtrationssystems diese Parameter folgendermassen berechnen:
Re = 2ρ Q s /η s n f r h
γ w = 4Q s /n π r h 3
Δ P = 8Q s L η s /n π r h 4
wobei ρ = Zellsuspensionsdichte, Q s = Rezirkulationsströmungsgeschwindigkeit -der Suspension, h s = dynamische Viskosität der Suspension, n = Anzahl der Hohlfasern, r h = Innenradius der Hohlfasern und L = Länge der Hohlfasern. Ähnliche Gleichungen lassen sich für andere Strömungsgeometrien ableiten. Der durchschnittliche Transmembrandruck lässt sich folgendermassen berechnen:
TMP = P in -P f -Δ P/2 = Q f R η f /A
wobei P in = Einlaßdruck, P f = Filtratdruck, Q f = Filtrationsgeschwindigkeit, R = Membranwiderstand, A = Membranfläche und η f = dynamische Viskosität des Filtrats. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden die Strömungsgeometrie und die Betriebsparameter so gewählt, dass die Zellabscheidung auf der Filtrationsmembran möglichst gering gehalten wird, wodurch die Wirksamkeit des Trennverfahrens verstärkt und die durch Schereinwirkung hervorgerufene Zellschädigung möglichst gering gehalten wird. Die Zellabscheidung lässt sich empirisch folgendermassen festlegen:
DP = ν 1/2 U λ/r c 2 g 3/2
wobei DP = Abscheidungsparameter, ν = kinematische Viskosität, U = Filtrationsgeschwindigkeit, λ = empirische Funktion der Zellkonzentration C c und R c = Zellradius. Somit wird das Querstromfiltrationsverfahren durch die Zellsuspension (ρ, η s , η f , ν, C c und r c ), die Wahl der Membran und die Strömungsgeometrie (n, r h , L, R und A) sowie durch die Kontrolle der Betriebsparameter (Q s und Q f ) definiert. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden die Strömungsgeometrie und die Betriebsbedingungen so gewählt, dass Re ≦ωτ 2100 und DP ≦ωτ 0,35.
Die Konzentration der schädlichen Bestandteile wird durch ein Querstromfiltrationsverfahren verringert, bei dem man die Zellsuspension durch die Filtrationsvorrichtung rezirkuliert und einen Teil des Stroms als zellfreies Filtrat entnimmt. Ein konstantes Zellsuspensionsvolumen kann aufrechterhalten werden, indem man Medien, die keine schädlichen Bestandteile enthalten, zusetzt. Der endgültige Restanteil an schädlichen Bestandteilen lässt sich folgendermassen berechnen:
wobei C p = Konzentration der schädlichen Bestandteile in der Herstellungssuspension, C o = ursprüngliche Konzentration der schädlichen Bestandteile in der Zellwachstumssuspension, V x = Volumen der Zellsuspension während des Mediumaustausches, e = Basis des natürlichen Logarithmus, V m = Volumen der Austauschmedien und V p = endgültiges Volumen der Herstellungssuspension. Das Volumen der erforderlichen Austauschmedien, um die Konzentration der schädlichen Bestandteile auf einen vorbestimmten Wert zu verringern, lässt sich folgendermassen berechnen:
V m = V x ln(C o V x / C p V p )
wobei ln = natürlicher Logarithmus. Aus dieser Gleichung geht hervor, dass bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine ursprüngliche Konzentration der Zellsuspension vor dem vorerwähnten Medienaustausch bei konstantem Volumen auf einen Minimalwert V x gebracht wird. Die Verringerung der Konzentration der schädlichen Bestandteile wird somit erreicht, indem man I) die Zellwachstumssuspension von ihrem ursprünglichen Volumen V o auf V x einengt; II) einen Medienaustausch mit konstantem Volumen durchführt; und III) eine weitere Verringerung erzielt, wenn V x ≦ωτ V p .
Beträgt somit beispielsweise das Volumen der ursprünglichen Zellkultur vor dem Mediumaustausch 100 Liter, so lässt sich eine insgesamt 10 000-fache Verringerung der Konzentration an schädlichen Bestandteilen erreichen, indem man die Zellsuspension auf 10 Liter einengt, einen Medienaustausch unter Verwendung von 45 Liter an Medien durchführt und ein Produktionsvolumen von 1000 Liter anwendet.
Somit ist es möglich, den Verdünnungsfaktor des ursprünglichen Wachstumsmediums während des Mediumaustausches quantitativ so festzulegen, dass der Anteil an schädlichen Bestandteilen in der erhaltenen Wirtszellsuspension unter einer vorbestimmten Konzentration liegt, wodurch die nachteiligen Wirkungen dieser Bestandteile auf einem Minimum gehalten werden. Diese Verdünnungsfaktoren lassen sich für jeden einzelnen Ansatz des Wachstumsmediums festlegen. Beispielsweise können mit unterschiedlichen Konzentrationen an Serum ergänzte Säugetierwachstumsmedien unterschiedliche Verdünnungsfaktoren erforderlich machen, um den Anteil an unerwünschten Bestandteilen auf funktionell äquivalente Konzentrationen zu verringern, die die Bildung eines pharmazeutisch annehmbaren Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ ermöglichen. Demgemäss kann der Verdünnungsfaktor so gewählt werden, dass die Serummenge im endgültigen Säugetierexpressionsmedium beispielsweise weniger als 1 Prozent der ursprünglich verwendeten Gesamtmenge beträgt.
Die erfindungsgemäss verwendeten Filtrationsmembranen können unter beliebigen herkömmlichen Produkten gewählt werden, die in bezug auf Membranart und Konfiguration so beschaffen sind, dass sie die den Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ bildenden Zellen zurückhalten, während die verschiedenen schädlichen Bestandteile hindurchgehen. Somit kann man beliebige geeignete Membranen verwenden, die die Zellen unter den gewählten dynamischen Strömungsbedingungen zurückhalten, während die schädlichen Bestandteile passieren und dadurch entfernt werden. Eine Obergrenze für die Porengrösse von etwa 5 µm und eine Untergrenze von etwa 0,1 µm sind geeignet.
Das frische Austauschmedium ist im wesentlichen frei von schädlichen Bestandteilen. Beispielsweise enthält es keine signifikanten Mengen an schädlichen Bestandteilen, wie Proteasen, Neuraminidasen, Proteaseinhibitoren und dergl. Derartige Medien variieren selbstverständlich je nach dem zur Bildung des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ verwendeten Zelltyp. Sie können unter den bekannten, zur Verfügung stehenden Medien ausgewählt werden. Es kann sich um das gleiche Medium wie beim endgültigen Expressionsmedium (aus Zweckmässigkeitsgründen) oder um ein weniger reiches Medium, beispielsweise ein gepuffertes, isotonisches Kochsalzmedium, handeln.
Für die hier beschriebenen, Plasminogenaktivator vom Human- Gewebe-Typ bildenden CHO-Zellen kann ein endgültiges Expressionsmedium aus einem Standardmedium zum Züchten von CHO- Zellen, das nicht mit fötalem Kälberserum ergänzt ist, gebildet werden. Ein Beispiel für das endgültige Expressionsmedium ist ein Gemisch aus gleichen Teilen aus Dulbecco-modifiziertem Eagles-Medium (hoher Glucosegehalt) und Ham's F-12-Medium.
Gemäss anderen Ausführungsformen lassen sich die schädlichen Bestandteile aus dem Medium vor der Züchtung ausschliessen oder in wesentlichen ausschliessen oder sie können beispielsweise durch Zentrifugations- oder Absetztechniken entfernt werden.
Der Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ wird isoliert und anschliessend aus dem Expressionsmedium gereinigt. Sodann wird er zur Behandlung von verschiedenen vaskulären Zuständen oder Erkrankungen als pharmazeutischer Wirkstoff verwendet.
B. Bevorzugte Ausführungsform
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden CHO-Zellen, die zur Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ in der Lage sind, als Suspension in einem CHO-Medium, das mit fötalem Kälberserum ergänzt ist, bis zu einer vorbestimmten Zelldichte gezüchtet. Die Zellsuspension wird sodann durch Querstromfiltration eingeengt. Anschliessend wird Serum aus der konzentrierten Suspension durch Querstromfiltration bei konstantem Volumen unter ständiger Zugabe von serumfreiem Medium entsprechend der Geschwindigkeit, in der das serumhaltige Medium entfernt wird, entfernt. Aktiver Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ wird anschliessend gebildet, indem die CHO-Zellen in einem serumfreien Expressionsmedium suspendiert werden. Der auf diese Weise gebildete Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ wird durch die CHO-Zellen in das Expressionsmedium sekretiert und kann nach üblichen Verfahren abgetrennt werden.
Züchtungsgefässe von unterschiedlichem Fassungsvermögen werden zur Züchtung der Suspensionen von CHO-Zellen verwendet. Die einzelnen Züchtungsgefässe werden über Einlassöffnungen mit einer Anordnung von porösen Tangentialstromfiltern verbunden, die ihrerseits über Auslassöffnungen eine Rückverbindung mit der Züchtungskammer aufweisen. Nach dem Wachstum werden die Suspensionen der CHO-Zellen und das Serum enthaltende Medium durch die Anordnung von porösen Tangentialstromfiltern gepumpt, um zunächst die Suspension einzuengen und um anschliessend die Entfernung der Serumbestandteile aus der Suspension während des Mediumaustausches zu ermöglichen. Die CHO-Zellsuspension wird durch die Filter und das Züchtungsgefäss im Kreislauf geführt, wobei ein Teil des alten Mediums und der Serumbestandteile entfernt werden. Eine Zufuhr von frischem sterilem Expressionsmedium, das kein Serum enthält, wird zu der Zellsuspension gegeben, um ein Nennvolumen im Züchtungsgefäss aufrechtzuerhalten. Nachdem die Serumkonzentration auf diese Weise durch kontinuierlichen Mediumaustausch auf einen vorbestimmten Wert verringert worden ist, werden die Zellen über sterilisierte Leitungen in ein anderes Gefäss mit einem Gehalt an serumfreiem Expressionsmedium übertragen, worin Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ sekretiert wird. Anschliessend kann der Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe- Typ durch übliche Techniken entfernt werden.
C. Ausführungsbeispiele Zellwachstum, Mediumaustausch und Produktion
Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) (ATCC Nr. CCL61), die mit dem Expressionsvektor pETPFR (vgl. die vorgenannte EP-A 93 619) transfiziert sind und daher rekombinanten t-PA exprimieren, wurden nach Lagerung über flüssigem Stickstoff revitalisiert und in einem Medium, das aus einem 1 : 1-Gemisch aus Hams F12 und Dulbecco-modifiziertem Eagles- Medium bestand, gezüchtet. Dieses Gemisch enthielt kein Hypoxanthin oder Thymidin. Dialysiertes oder diafiltriertes fötales Rinderserum (7% Vol./Vol.) und Methotrexat (auf 500 nanomolar) wurden zu dem Medium gegeben. Die Zellen wurden in Suspensionskultur in bei etwa 37°C inkubierten Glasgefässen gezüchtet. Die Zellen wurden in diesem Medium alle 3 bis 5 Tage einer Subkultivation und Populationserweiterung unterzogen. Nachdem sich eine ausreichende Zellmenge angereichert hatte, wurden die Zellen für eine weitere Wachstumsperiode von etwa 3 Tagen in einen 10 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl übertragen. Für diese Wachstumsphase wurde zur Erzielung besserer Zellausbeuten die Mediumzusammensetzung insofern geändert, als sowohl Hypoxanthin als auch Thymidin aber kein Methotrexat enthalten waren. Dieses Medium war mit nicht-dialysiertem fötalem Rinderserum (2% Vol./Vol.) versetzt. Während der 3-tägigen Züchtungsphase stieg die Zellpopulationsdichte von etwa 0,25 × 106 Zellen/ml auf 1,0 × 106 Zellen/ml.
Die Zellen wurden sodann gemäss den vorstehenden Ausführungen einem Mediumaustausch unterzogen, bevor sie in serumfreiem Produktionsmedium für etwa 90 Stunden resuspendiert wurden. Der Mediumaustausch wurde auf die nachstehend beschriebene Weise durchgeführt.
Ein Hohlfaser-Tangentialstromfilter und damit verbundene Einlass- und Auslass-Siliconkautschukschläuche wurden in einem Autoklaven sterilisiert und sodann über dampfsterilisierbare Verbindungsstücke mit dem 10 Liter fassenden Produktionsgefäss verbunden. Bei dem verwendeten Filter handelte es sich um eine Polysulfone-Hohlfasereinheit (Hersteller A. G. Technology Inc., Filter Nr. 1BZE100801AL) mit einem Gehalt an 280 Hohlfasern von 0,75 mm Innendurchmesser und in Längsrichtung angeordneten Poren mit einer Nenngrösse von 0,1 µm. Diese Einheit wies eine Filtrationsfläche von 0,385 m2 auf. Die Zellen wurden unter Verwendung einer Watson-Marlow-Zweibogenpumpe durch die Hohlfasern in das Gefäss zurückgeführt. Eine Rezirkulationsgeschwindigkeit von etwa 3,5 Liter/min wurde angewandt, wobei gleichzeitig ein Teil der Flüssigkeit abgezogen und als klares Filtrat in einer Geschwindigkeit von etwa 211 ml/min verworfen wurde. Auf diese Weise blieben die Zellen erhalten, während das Züchtungsvolumen auf etwa 5,2 Liter verringert wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde frisches, steriles, serumfreies Medium (gleiche Zusammensetzung wie das vorstehende Medium, aber ohne Gehalt an Rinderserum oder daraus abgeleiteten Bestandteilen) in das Züchtungsgefäss mit einer Geschwindigkeit von etwa 211 ml/min gepumpt, wodurch das Volumen bei gleichzeitiger Verdünnung des alten Mediums konstant gehalten wurde.
55 Liter frisches, serumfreies Medium wurden durch das System gepumpt, was eine berechnete Verringerung der Serumkonzentration auf das etwa 190 000-fache (oder weniger als 0,0001 Volumenprozent) ergab. Eine Aliquotmenge der Zellsuspension wurde zu frischem, serumfreien Medium in einem getrennten, 10 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl gegeben. Diese Zellen wurden sodann etwa 90 Stunden bei 37°C zur Durchführung der Produktionsphase inkubiert. Proben wurden aus der Kultur entfernt, durch Zentrifugation geklärt und bis zur anschliessenden Analyse bei -20°C gelagert.
In einem zweiten, parallel durchgeführten Beispiel wurden sämtliche Bedingungen, Zellen und Medien beibehalten, wobei lediglich das nachstehend angegebene Hohlfaserfilter verwendet wurde. Das Filter enthielt 290 Hohlfasern und wies eine Filtrationsfläche von 0,390 m2 (4,3 ft2) auf, entsprach aber im übrigen dem vorstehend beschriebenen Filter (Hersteller A. G. Technology, Inc., Filter Nr. 1810902AL).
Analysenmethoden
Die Proben wurden zum Nachweis der schädlichen Einwirkungen von Rinderserum auf das von den in diesen Beispielen verwendeten CHO-Zellen gebildete t-PA behandelt und analysiert. Proben der geklärten Zellkulturflüssigkeit aus der serumfreien Produktionsphase wurden aufgetaut, mit β-Mercaptoethanol reduziert und der SDS-Elektrophorese unter Verwendung des diskontinuierlichen Systems gemäss Laemmli (Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680) unterworfen. Die auf diese Weise abgetrennten Proteine wurden der Silber-Färbung (Morrissey, Anal. Biochem., Bd. 117 (1981), S. 307) unterzogen oder wurden auf eine Nitrocellulosefolie übertragen (Übertragung von 4 Stunden bei 8°C und 0,5 A auf 0,45 µm Nitrocellulose unter Anwendung des Verfahrens gemäss Towbin et al., PNAS, Bd. 76 (1979), S. 6350). Die t-PA-Proteine, Proteinfragmente und höhermolekulare Komplexe mit einem Gehalt an t-PA wurden auf der Nitrocellulosefolie durch den nachstehend beschriebenen ELISA-Test (enzyme linked immunoassay) sichtbar gemacht: Einer ursprünglichen Reaktion von gebundenen t-PA-Proteinen und Kaninchen-anti-t-PA-Antikörper folgte die Behandlung mit einem zweiten Antikörper. Hierbei handelte es sich um mit Meerrettichperoxidase markiertes anti-Kaninchen-IgG (in Ziegen gewonnen). Nach dieser Reaktion ergab die Zugabe von chromophorem 4-CL- Naphthol in H2O2 und PBS eine Farbentwicklung in den Bereichen, wo gebundener Antikörper vorlag. Dabei wurden die elektrophoretischen Muster von t-PA und assoziierten Proteinen sichtbar gemacht. Unter Anwendung dieser Technik konnte der Zustand in bezug auf t-PA in rohen Kulturflüssigkeiten ohne weitere Reinigung bestimmt werden.
Ergebnisse
Zum Nachweis der schädlichen Einwirkungen von fötalem Rinderserum auf t-PA wurden Proben aus der Produktionsphase mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder mit 0,175% Vol./ Vol. oder 1,75% Vol./Vol. fötalem Rinderserum 22 Stunden oder 46 Stunden inkubiert, wonach die vorstehend beschriebene Analyse durchgeführt wurde. Die Ergebnisse hiervon sind in Form des mit Silber angefärbten Gels von Fig. 1 und des entsprechenden Immunoblots von Fig. 2 dargestellt.
Fig. 1 ist ein mit Silber gefärbtes Gel der auf die vorstehende Weise erhaltenen t-PA-Proben.
Fig. 2 stellt ein Immunoblot des gleichen Gels wie in Fig. 1 dar.
In diesen Figuren haben die einzelnen Bahnen folgende Bedeutungen:
Bahn-Nr.Probe
 1Molekulargewichtsstandard (92,5 Kilodalton (K), 66,2K, 45K, 31K, 21,5K, 14,4K)  2Authentische t-PA-Referenzstandards  3Zellkulturflüssigkeit mit einem Gehalt an t-PA (Laborstandard)  4Zellkulturflüssigkeit aus einer Probe der Produktionsphase  5Probe der Produktionsphase; 22 h bei 37°C mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) inkubiert  6Probe der Produktionsphase; 46 h bei 37°C mit PBS inkubiert  7Leere Bahn  8Probe der Produktionsphase; 22 h bei 37°C mit 0,175% (Vol./Vol.) fötalem Kälberserum (FBS) inkubiert  9Probe der Produktionsphase; 46 h bei 37°C mit 0,175% (Vol./Vol.) FBS inkubiert 100,175% (Vol./Vol.) FBS allein; 22 h bei 37°C inkubiert 110,175% (Vol./Vol.) FBS allein; 46 h bei 37°C inkubiert 12Probe der Produktionsphase; 22 h bei 37°C mit 1,75% (Vol./Vol.) FBS inkubiert 13Probe der Produktionsphase; 46 h bei 37°C mit 1,75% (Vol./Vol.) FBS inkubiert 141,75% (Vol./Vol.) FBS allein; 22 h bei 37°C inkubiert 151,75% (Vol./Vol.) FBS allein; 46 h bei 37°C inkubiert
In den Fig. 1 und 2 sind die Bahnen 2 und 3 t-PA-Referenzstandards (einkettiger t-PA erkennbar an der Bande mit höherem Molekulargewicht und zweikettiger t-PA erkennbar an den Banden mit geringerem Molekulargewicht).
Die beobachteten schädlichen Wirkungen von fötalem Rinderserum (FBS) sind: a) ein Verschwinden von intaktem t-PA bei gleichzeitiger Anreicherung von verschiedenen proteolytisch gespaltenen Formen und Fragmenten davon (vgl. Bahnen 8 und 9 von Fig. 2) wird verursacht und b) es kommt zur Bildung von höhermolekularem, komplexem Material im Bereich von 90 bis 200 Kilodalton (vgl. Bahnen 12 und 13 von Fig. 2).
Die Ergebnisse zeigen, dass bei Inkubation der gemäss dem vorstehenden Abschnitt "Zellwachstum, Mediumaustausch und Produktion" erhaltenen serumfreien Zellkulturflüssigkeit in Gegenwart von PBS bei einer Züchtungszeit von 22 h oder 46 h die Kulturflüssigkeit im wesentlichen unverändert bleibt (vgl. Bahnen 5 und 6 von Fig. 1 und 2). Somit kommt es sowohl zu einem proteolytischen Abbau als auch zur Bildung von hochmolekularen Komplexen von t-PA, wenn bei der Produktionsphase im Kulturmedium fötales Rinderserum verbleibt. Durch die Entfernung des Serums durch den beschriebenen Mediumaustausch werden die schädlichen Einwirkungen im wesentlichen beseitigt.

Claims (18)

1. Verfahren zur Herstellung von biologisch aktivem Human- Gewebe-Plasminogenaktivator in Wirtszellkulturen, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Kulturmedium im wesentlichen sämtliche Mediumbestandteile, die für die Gewinnung und Aktivität des Human-Gewebe-Plasminogenaktivators schädlich sind, entfernt, während die Expressionsfähigkeit der Wirtszellen erhalten bleibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Bestandteile vor der Züchtung ausgeschlossen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile aus dem Medium während der Züchtung durch Mediumaustausch entfernt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile aus dem Medium während der Züchtung durch Querstromfiltration entfernt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Querstromfiltration durch eine flache Filtrationsmembran durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Querstromfiltration durch die Wand einer porösen Hohlfaser durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Querstromfiltration durch eine in spiraler Form gewundene Membrane durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Wirtszellkultur um eine rekombinante Wirtszellkultur handelt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der rekombinanten Wirtszellkultur um eine rekombinante Suspensions-Wirtszellkultur handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile entfernt werden, indem man die Wirtszellkultur in einem das Wachstum und die Zellreplikation unterstützenden Medium, das einen oder mehrere Bestandteile, die für die Gewinnung und Aktivität von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ schädlich sind, enthält, durchführt, im wesentlichen alle diese schädlichen Bestandteile aus der Wirtszellkultur durch Querstromfiltration entfernt und die Wirtszellkultur mit zusätzlichem Medium versetzt, das im wesentlichen frei von Bestandteilen, die für die Gewinnung und Aktivität von Plasminogenaktivator vom vom Human-Gewebe-Typ schädlich sind, ist und die Expression von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ durch die Wirtszellkultur ohne Notwendigkeit der Unterstützung von weiterer Zellreplikation ermöglicht.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die das Wachstum und die Zellreplikation unterstützenden Mediumbestandteile von Blut, Gewebe oder Derivaten davon abgeleitet sind.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszellkultur Säugetierzellen enthält, die zur Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ in der Lage sind.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszellkultur Säugetierzellen enthält, die zur Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ durch rekombinante Expression in der Lage sind.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Säugetierzellen rekombinant transfizierte CHO-Zellen enthalten.
15. Wirtszellkultur, enthaltend:
  • a) Zellen, die zur Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ in der Lage sind und
  • b) Medium, das
    • I) im wesentlichen frei von Bestandteilen ist, die für die Gewinnung und Aktivität von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ schädlich sind; und
    • II) die Expression von Plasminogenaktivator vom Human- Gewebe-Typ in der Wirtszellkultur ohne Notwendigkeit der Unterstützung weiterer Zellreplikation ermöglicht.
16. Zellkultur nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie rekombinant transfizierte Wirtszellen enthält.
17. Zellkultur nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie rekombinant transfizierte Säugetierzellen enthält.
18. Zellkultur nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Säugetierzellen rekombinant transfizierte CHO-Zellen umfassen.
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