JPH0740942B2 - 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 - Google Patents
哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現Info
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- JPH0740942B2 JPH0740942B2 JP61501987A JP50198786A JPH0740942B2 JP H0740942 B2 JPH0740942 B2 JP H0740942B2 JP 61501987 A JP61501987 A JP 61501987A JP 50198786 A JP50198786 A JP 50198786A JP H0740942 B2 JPH0740942 B2 JP H0740942B2
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- JP
- Japan
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- plasminogen activator
- tissue plasminogen
- gene
- intron
- dna construct
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 発現のために異種宿主に導入される遺伝子の数が増加し
ている。採用される遺伝子の実質部分はcDNAから得られ
ている。元の天然の遺伝子が１個以上のイントロンを有
している場合には，イントロンを包含し，また発現や複
製に関係のある調節信号と関連した遺伝子の操作をさら
に複雑化させる大きなDNA細片を扱うよりも，むしろcDN
Aを使用する方が大いに都合が良いことがしばしばあ
る。
ている。採用される遺伝子の実質部分はcDNAから得られ
ている。元の天然の遺伝子が１個以上のイントロンを有
している場合には，イントロンを包含し，また発現や複
製に関係のある調節信号と関連した遺伝子の操作をさら
に複雑化させる大きなDNA細片を扱うよりも，むしろcDN
Aを使用する方が大いに都合が良いことがしばしばあ
る。
イントロンのはたらきはまだ充分には解明されていな
い。イントロンの除去に関連したスプライシング機構の
解明は大いに進歩してきたが，転写や翻訳の過程でイン
トロンがどのような役割を果たすかについてはまだ充分
な説明はなされていない。cDNAは容易に発現させること
ができるという事実から，イントロンはコード配列の発
現には必須ではないことが確証される。
い。イントロンの除去に関連したスプライシング機構の
解明は大いに進歩してきたが，転写や翻訳の過程でイン
トロンがどのような役割を果たすかについてはまだ充分
な説明はなされていない。cDNAは容易に発現させること
ができるという事実から，イントロンはコード配列の発
現には必須ではないことが確証される。
細胞宿主におけるポリペプチドやタンパクの調製と産生
に関する重要因子は，ポリペプチドまたはタンパクの産
生効率である。その生存能力を維持するため宿主に栄養
を補強しつづけねばならないので，栄養物は問題の産物
の産生より，まず宿主の増殖と複製に使われる。従っ
て，所望の産物の生産に栄養が最大限に利用され，所望
の産物の全産生タンパクに対する量を増加させる−これ
は所望産物が純粋な形で単離される効率を非常に良好に
する−ことが重要となってくる。
に関する重要因子は，ポリペプチドまたはタンパクの産
生効率である。その生存能力を維持するため宿主に栄養
を補強しつづけねばならないので，栄養物は問題の産物
の産生より，まず宿主の増殖と複製に使われる。従っ
て，所望の産物の生産に栄養が最大限に利用され，所望
の産物の全産生タンパクに対する量を増加させる−これ
は所望産物が純粋な形で単離される効率を非常に良好に
する−ことが重要となってくる。
従来技術 Pennica et al,Nature（1983）301:214−221;UK特許出
願No.GB 2,119,804は，ヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターのためcDNAの単離およびクローニングを記
述している。Ny et al.,Proc. Nat′l Acad.Sci.USA（1
984）81:5355〜5359は，ヒトの組織型プラスミノーゲン
アクチベーター遺伝子，およびエキソン−イントロンの
関係について記述している.Hamer and Leder,Cell（197
9）18:1299−1302は,RNAの安定性にイントロンが寄与し
ていることを示唆している。一方,Y.Gluzman編集のEuka
ryotic Viral Vectors,P29〜P33（1982）,GethingとSam
brook著“The Expression of the Influenza Virus Hem
agglutinin Gene from SV−40−HA Recombinants"（SV
−40−HA組換体からのインフルエンザウイルスへマグル
チニン遺伝子の発現）には逆の実験結果を示している。
Kaufman and Sharp,Molec.and Cell Biol.（1982）２:1
304〜1319は，ハイブリッドイントロンはジヒドロ葉酸
塩リダクターゼcDNAの発現に使用できることを示してい
る。Lau and Kan,Proc. Nat′l Acad.Sci.USA（1983）8
0:5225〜5229は，コスミッドベクター，およびそれらの
COS細胞と永久細胞系における使用について記述してい
る。
願No.GB 2,119,804は，ヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターのためcDNAの単離およびクローニングを記
述している。Ny et al.,Proc. Nat′l Acad.Sci.USA（1
984）81:5355〜5359は，ヒトの組織型プラスミノーゲン
アクチベーター遺伝子，およびエキソン−イントロンの
関係について記述している.Hamer and Leder,Cell（197
9）18:1299−1302は,RNAの安定性にイントロンが寄与し
ていることを示唆している。一方,Y.Gluzman編集のEuka
ryotic Viral Vectors,P29〜P33（1982）,GethingとSam
brook著“The Expression of the Influenza Virus Hem
agglutinin Gene from SV−40−HA Recombinants"（SV
−40−HA組換体からのインフルエンザウイルスへマグル
チニン遺伝子の発現）には逆の実験結果を示している。
Kaufman and Sharp,Molec.and Cell Biol.（1982）２:1
304〜1319は，ハイブリッドイントロンはジヒドロ葉酸
塩リダクターゼcDNAの発現に使用できることを示してい
る。Lau and Kan,Proc. Nat′l Acad.Sci.USA（1983）8
0:5225〜5229は，コスミッドベクター，およびそれらの
COS細胞と永久細胞系における使用について記述してい
る。
発明の概要 少なくとも１個のイントロンが介在している組織プラス
ミノーゲンアクチベーター（tPA）のコード配列を使用
することにより，哺乳動物細胞における組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターの発現が改善された。野生型組織
プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子または所望のタ
ンパク産物をコードするキメラ遺伝子を使用した。活性
プロモーターが使用され，これにより組織プラスミノー
ゲンアクチベーターの収量があがった。
ミノーゲンアクチベーター（tPA）のコード配列を使用
することにより，哺乳動物細胞における組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターの発現が改善された。野生型組織
プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子または所望のタ
ンパク産物をコードするキメラ遺伝子を使用した。活性
プロモーターが使用され，これにより組織プラスミノー
ゲンアクチベーターの収量があがった。
図面の簡単な説明 図は２つの関連プラスミドを示している。その１つが本
主題発明の実施態様である。
主題発明の実施態様である。
図の最上に,tPA cDNA発現プラスミドpSV7tPA2の概略図
を示す。斜線領域は５′と３′の翻訳されない発列を示
し，黒い領域はプレプロtPAのコード配列を示してい
る。SV40オリジンを円で示し,SV40の初期プロモーター
（EP）と初期領域ポリアデニル化配列（ポリ（Ａ））の
大体の位置を書き留めた。位置801と1273のEco RI部位
も示されている。このプラスミドの下にキメラtPA遺伝
子を有するプラスミドpSV7tPA2Iを示した。上記と同
様，黒い部分はゲノムtPA遺伝子にイントロン（白い箱
部分）が介在しているコード配列を示している。
を示す。斜線領域は５′と３′の翻訳されない発列を示
し，黒い領域はプレプロtPAのコード配列を示してい
る。SV40オリジンを円で示し,SV40の初期プロモーター
（EP）と初期領域ポリアデニル化配列（ポリ（Ａ））の
大体の位置を書き留めた。位置801と1273のEco RI部位
も示されている。このプラスミドの下にキメラtPA遺伝
子を有するプラスミドpSV7tPA2Iを示した。上記と同
様，黒い部分はゲノムtPA遺伝子にイントロン（白い箱
部分）が介在しているコード配列を示している。
最下部に描かれているゲノムtPA遺伝子の概略図は，位
置801と1273の間でcDNAと置きかえるためにゲノムクロ
ーンから切り出される領域を示している。Eco RI
（Ｅ）,Bam HI（Ｂ）およびNru I（Ｎ）に対する制限部
位はゲノム地図に記入されている。
置801と1273の間でcDNAと置きかえるためにゲノムクロ
ーンから切り出される領域を示している。Eco RI
（Ｅ）,Bam HI（Ｂ）およびNru I（Ｎ）に対する制限部
位はゲノム地図に記入されている。
特別な実施態様の説明 DNAの構築，およびそれらの組織プラスミノーゲンアク
チベーター（tPA）の発現改善への利用を提供する。こ
こで,DNAの構築は哺乳動物組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターのコード配列を含み，そのコード配列に少なく
とも１個のイントロンが介在する。天然に存在するイン
トロンを１個またはそれ以上欠如しているキメラ遺伝子
またはゲノム遺伝子を哺乳動物宿主で機能する転写調節
配列に連絡する。
チベーター（tPA）の発現改善への利用を提供する。こ
こで,DNAの構築は哺乳動物組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターのコード配列を含み，そのコード配列に少なく
とも１個のイントロンが介在する。天然に存在するイン
トロンを１個またはそれ以上欠如しているキメラ遺伝子
またはゲノム遺伝子を哺乳動物宿主で機能する転写調節
配列に連絡する。
組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードするのに
用いられる遺伝子は，成熟組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター，組織プラスミノーゲンアクチベーターのプロ
フォームまたは前駆体−Ｎ末端配列の消失を意図してい
る−，または分泌を供するリーダー配列を含むプレプロ
フォームをコードすると考えられる。
用いられる遺伝子は，成熟組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター，組織プラスミノーゲンアクチベーターのプロ
フォームまたは前駆体−Ｎ末端配列の消失を意図してい
る−，または分泌を供するリーダー配列を含むプレプロ
フォームをコードすると考えられる。
使用するtPAコード配列は，最低約100bp,普通は最低約3
00bpで約5kbpよりは大きくない，普通は約4kbpよりは大
きくないイントロンを少なくとも１個有していることを
特徴とする。使用されるイントロンは，組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター遺伝子と関係のある天然イントロ
ン，ベータグロブリンのような異なった哺乳動物遺伝子
に由来するイントロン，またはKaufmanとSharp（前出）
のよって記述されたようなdhfr cDNAを発現するのに用
いられるアデノウイルス免疫グロブリンハイブリッドイ
ントロンのようなハイブリッドイントロン類である。
00bpで約5kbpよりは大きくない，普通は約4kbpよりは大
きくないイントロンを少なくとも１個有していることを
特徴とする。使用されるイントロンは，組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター遺伝子と関係のある天然イントロ
ン，ベータグロブリンのような異なった哺乳動物遺伝子
に由来するイントロン，またはKaufmanとSharp（前出）
のよって記述されたようなdhfr cDNAを発現するのに用
いられるアデノウイルス免疫グロブリンハイブリッドイ
ントロンのようなハイブリッドイントロン類である。
どちらかといえば，天然イントロンを元から存在する場
所で使うのが望ましい。遺伝子は一般に，天然に存在す
るより少ないイントロンを有するであろう。遺伝子は１
〜13個のイントロン，一般には２〜13個のイントロン，
好ましくは２〜６個のイントロンまたは９〜13個のイン
トロン，特に，その開示がここで参考として組み込まれ
ているNy等（前出）の表現法を用いるとイントロン“F"
から“M"のあいだのイントロンを有しているかもしれな
い。ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子
をコードし，イントロンを含有するDNA断片は，最低約
2.5kbpで約30kbpよりは大きくないであろう。イントロ
ンはその末端に適当なスプライシング信号をもっている
と考えられる。
所で使うのが望ましい。遺伝子は一般に，天然に存在す
るより少ないイントロンを有するであろう。遺伝子は１
〜13個のイントロン，一般には２〜13個のイントロン，
好ましくは２〜６個のイントロンまたは９〜13個のイン
トロン，特に，その開示がここで参考として組み込まれ
ているNy等（前出）の表現法を用いるとイントロン“F"
から“M"のあいだのイントロンを有しているかもしれな
い。ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子
をコードし，イントロンを含有するDNA断片は，最低約
2.5kbpで約30kbpよりは大きくないであろう。イントロ
ンはその末端に適当なスプライシング信号をもっている
と考えられる。
哺乳動物細胞で活性のある多くの種々のプロモーター領
域が使用できる。SV40（初期または後期），アデノウイ
ルス（初期または後期）またはレトロウイルス（LTR）
のような哺乳動物ウイルスから異種プロモーターが得ら
れることもある。これらに代わって，調節可能なプロモ
ーター，例えばヒトまたはマウスのメタロチオネインＩ
およびII,熱ショックタンパクなどに由来するプロモー
ターも使用できる。これらプロモーターについては,Ham
er et al（1983）による“Eukaryotic Viral Vectors"
（Y.Gluzman編集,pp7〜12）,Mayo et al.,Cell（1982）
29:99〜108,およびKarin et al.,Nature（1984）308:51
3〜519に記述されている。
域が使用できる。SV40（初期または後期），アデノウイ
ルス（初期または後期）またはレトロウイルス（LTR）
のような哺乳動物ウイルスから異種プロモーターが得ら
れることもある。これらに代わって，調節可能なプロモ
ーター，例えばヒトまたはマウスのメタロチオネインＩ
およびII,熱ショックタンパクなどに由来するプロモー
ターも使用できる。これらプロモーターについては,Ham
er et al（1983）による“Eukaryotic Viral Vectors"
（Y.Gluzman編集,pp7〜12）,Mayo et al.,Cell（1982）
29:99〜108,およびKarin et al.,Nature（1984）308:51
3〜519に記述されている。
あらゆる好都合なポリアデニル化部位，例えばプロモー
ター領域と関係があるもの，組織プラスミノーゲンアク
チベーター遺伝子に元々備わっているもの，または他の
哺乳動物遺伝子に由来するもの，が使用できる。
ター領域と関係があるもの，組織プラスミノーゲンアク
チベーター遺伝子に元々備わっているもの，または他の
哺乳動物遺伝子に由来するもの，が使用できる。
特に興味深いのは,SV−40エンハンサーと初期プロモー
ター領域の組み合わせ，並びにＴ抗原を含まない複製シ
ステムをＴ抗原を含むCOS細胞と組み合わせたものであ
る。
ター領域の組み合わせ，並びにＴ抗原を含まない複製シ
ステムをＴ抗原を含むCOS細胞と組み合わせたものであ
る。
組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子はどの哺乳
動物宿主からでも得られるが，特に霊長目（例えばヒ
ト），ウシ，ウマ，イヌ，ブタ，ネコ，げつ歯類などか
ら得られる。
動物宿主からでも得られるが，特に霊長目（例えばヒ
ト），ウシ，ウマ，イヌ，ブタ，ネコ，げつ歯類などか
ら得られる。
普通イントロン含有遺伝子に隣接している転写および翻
訳の開始および終結調節配列を含む,5′と３′の翻訳さ
れない領域を含む発現カセットが調製されると，このカ
セットは哺乳動物細胞宿主の形質転換のためのベクター
に連結される。ある場合には，転写調節領域，例えばエ
ンハンサー，はイントロンの内に含まれているかもしれ
ない。
訳の開始および終結調節配列を含む,5′と３′の翻訳さ
れない領域を含む発現カセットが調製されると，このカ
セットは哺乳動物細胞宿主の形質転換のためのベクター
に連結される。ある場合には，転写調節領域，例えばエ
ンハンサー，はイントロンの内に含まれているかもしれ
ない。
これらの部分が合体される場合の特別な順序は主題発明
の重要要素にはなっていない。それゆえ，隣接領域は，
遺伝子挿入に先立って，マーカーや他の領域，例えばエ
ンハンサー，転写調節領域など，を含む複製システムに
先に結合していてもよい。種々の断片を合体させる方法
は，構築の容易さ，制限部位の選択，特殊断片の入手の
難易性，その他の種々の要因に依存している。
の重要要素にはなっていない。それゆえ，隣接領域は，
遺伝子挿入に先立って，マーカーや他の領域，例えばエ
ンハンサー，転写調節領域など，を含む複製システムに
先に結合していてもよい。種々の断片を合体させる方法
は，構築の容易さ，制限部位の選択，特殊断片の入手の
難易性，その他の種々の要因に依存している。
複製システムの選択には，部分的には，一時的な発現を
望んでいるかまたは安定な発現を望んでいるかにかかっ
ている。一時的な発現については，ウイルス配列（例え
ばSV−40）を基盤にしたエピソーム因子（複製のオリジ
ンを含む）が使用される。安定な発現は，エピソーム因
子（例えば，ウシの乳頭腫ウイルスに基づくベクター）
またはゲノムに組み込まれた配列を使って達成され得
る。
望んでいるかまたは安定な発現を望んでいるかにかかっ
ている。一時的な発現については，ウイルス配列（例え
ばSV−40）を基盤にしたエピソーム因子（複製のオリジ
ンを含む）が使用される。安定な発現は，エピソーム因
子（例えば，ウシの乳頭腫ウイルスに基づくベクター）
またはゲノムに組み込まれた配列を使って達成され得
る。
これら多数のウイルス配列が，遺伝子gpt,neoおよびdhf
rのようなマーカーに結合される。これらのマーカー
は，ベクターを含有する細胞の選択や，組み込まれた外
来配列の増幅を可能にする。必要に応じて，組織プラス
ミノーゲンアクチベーターの生産性をさらにあげるため
に，組織プラスミノーゲンアクチベーターカセットがdh
fr,メタロチオネインなどのような遺伝子の発現カセッ
トとタンデムに並んだようなタンデム型構築物を調製す
ることによって遺伝子を増幅することができる。あるい
は，細胞は,tPA発現カセットを含むある構築物と選択性
マーカーを含む第２の独立した構築物とにより共同形質
転換することもできる。
rのようなマーカーに結合される。これらのマーカー
は，ベクターを含有する細胞の選択や，組み込まれた外
来配列の増幅を可能にする。必要に応じて，組織プラス
ミノーゲンアクチベーターの生産性をさらにあげるため
に，組織プラスミノーゲンアクチベーターカセットがdh
fr,メタロチオネインなどのような遺伝子の発現カセッ
トとタンデムに並んだようなタンデム型構築物を調製す
ることによって遺伝子を増幅することができる。あるい
は，細胞は,tPA発現カセットを含むある構築物と選択性
マーカーを含む第２の独立した構築物とにより共同形質
転換することもできる。
宿主は，スプライシング可能で培養によって効率よく組
織プラスミノーゲンアクチベーターを発現できる哺乳動
物細胞ならどれでも都合のよいものを使ってよい。細胞
にはCHO細胞,COS細胞,LTK細胞,HeLaおよびCV−１のよう
に広範な種類の細胞がある。これらの細胞は充分確立さ
れた細胞系統の例として示したまでで，主題発明をいず
れかの特殊な確立された細胞系に限定するものではな
く，現在確立されている他の細胞系や将来確立されるで
あろう細胞系に都合よく適用されてよい。
織プラスミノーゲンアクチベーターを発現できる哺乳動
物細胞ならどれでも都合のよいものを使ってよい。細胞
にはCHO細胞,COS細胞,LTK細胞,HeLaおよびCV−１のよう
に広範な種類の細胞がある。これらの細胞は充分確立さ
れた細胞系統の例として示したまでで，主題発明をいず
れかの特殊な確立された細胞系に限定するものではな
く，現在確立されている他の細胞系や将来確立されるで
あろう細胞系に都合よく適用されてよい。
ゲノム組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子は,N
y等（前出）が記述した方法で得ることができ，また,cD
NA遺伝子はPennica（前出）あるいはUK特許出願No.2,11
9,804に従って得ることができる。これらの配列は種々
のやり方で使用できる。遺伝子全体を使用して，適当な
調節配列を有する発現ベクターに挿入し，宿主ゲノムへ
の組み込みを助けるDNAまたは複製システム，あるいは
その両方に連結される発現カセットとして供してもよ
い。あるいはまた,Ny等（前出）およびPennica等（前
出）によって作製された制限地図にもとづいて,cDNAや
ゲノムDNA遺伝子配列から種々の断片を得て，そして合
体して一部分はcDNA遺伝子由来でまた一部はゲノム遺伝
子由来というようなハイブリッド遺伝子を供することも
できる。ハイブリッド遺伝子は，ゲノム遺伝子の一部を
cDNA断片で置換したり，またはこの反対を行って調製す
ることができる。ここで，このハイブリッド遺伝子はcD
NAまたはゲノムDNAを端に持っているか，またな組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター遺伝子の１つの５′−近
傍部分がもう一つの遺伝子の３′−近傍部分に結合して
いる。
y等（前出）が記述した方法で得ることができ，また,cD
NA遺伝子はPennica（前出）あるいはUK特許出願No.2,11
9,804に従って得ることができる。これらの配列は種々
のやり方で使用できる。遺伝子全体を使用して，適当な
調節配列を有する発現ベクターに挿入し，宿主ゲノムへ
の組み込みを助けるDNAまたは複製システム，あるいは
その両方に連結される発現カセットとして供してもよ
い。あるいはまた,Ny等（前出）およびPennica等（前
出）によって作製された制限地図にもとづいて,cDNAや
ゲノムDNA遺伝子配列から種々の断片を得て，そして合
体して一部分はcDNA遺伝子由来でまた一部はゲノム遺伝
子由来というようなハイブリッド遺伝子を供することも
できる。ハイブリッド遺伝子は，ゲノム遺伝子の一部を
cDNA断片で置換したり，またはこの反対を行って調製す
ることができる。ここで，このハイブリッド遺伝子はcD
NAまたはゲノムDNAを端に持っているか，またな組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター遺伝子の１つの５′−近
傍部分がもう一つの遺伝子の３′−近傍部分に結合して
いる。
発現カセットは，リン酸カルシウム沈澱DNA,トランスフ
ェクション，形質導入などのいずれか都合の良い方法で
宿主に導入することができる。特別な方法は本発明で重
要でなく，そして一旦そのDNAが宿主細胞に導入される
とその手法はくり返す必要はない。それゆえ，発現カセ
ットの宿主への導入が高効率であることが望ましいが，
必ずしも必要ではない。
ェクション，形質導入などのいずれか都合の良い方法で
宿主に導入することができる。特別な方法は本発明で重
要でなく，そして一旦そのDNAが宿主細胞に導入される
とその手法はくり返す必要はない。それゆえ，発現カセ
ットの宿主への導入が高効率であることが望ましいが，
必ずしも必要ではない。
次にこの哺乳動物細胞を，ウシ胎児血清を10〜20％含有
するダルベコの改良イーグル培地（DMEM）のような適切
な培地，またはこれらの細胞を安定に維持できる他の培
地で増殖させる。リーダー配列が保持されていて，産物
が分泌可能である（産物が細胞外に生産される場合）か
否かによって，培地を連続的または繰り返し交換し，組
織プラスミノーゲンアクチベータータンパクまたはプロ
フォームを培地から単離する。リーダーが保持されてお
らず，組織プラスミノーゲンアクチベーターが細胞内に
保持されている場合は，細胞を回収し，殺し，溶解して
組織プラスミノーゲンアクチベーターを単離する。
するダルベコの改良イーグル培地（DMEM）のような適切
な培地，またはこれらの細胞を安定に維持できる他の培
地で増殖させる。リーダー配列が保持されていて，産物
が分泌可能である（産物が細胞外に生産される場合）か
否かによって，培地を連続的または繰り返し交換し，組
織プラスミノーゲンアクチベータータンパクまたはプロ
フォームを培地から単離する。リーダーが保持されてお
らず，組織プラスミノーゲンアクチベーターが細胞内に
保持されている場合は，細胞を回収し，殺し，溶解して
組織プラスミノーゲンアクチベーターを単離する。
単離および精製の技法としては，アフィティークロマト
グラフィー,HPLC,逆相HPLC,電気泳動，抽出，ゲル浸透
クロマトグラフィーなど種々のものが知られている。主
題発明の発現構築物を使用することにより，組織プラス
ミノーゲンアクチベーターの収量は,cDNA遺伝子−これ
は既に原核細胞，真核細胞の両細胞で使用されていた−
を用いた場合と比較して実質的に増えた。
グラフィー,HPLC,逆相HPLC,電気泳動，抽出，ゲル浸透
クロマトグラフィーなど種々のものが知られている。主
題発明の発現構築物を使用することにより，組織プラス
ミノーゲンアクチベーターの収量は,cDNA遺伝子−これ
は既に原核細胞，真核細胞の両細胞で使用されていた−
を用いた場合と比較して実質的に増えた。
次の実施例は説明のために揚げられたもので，これらに
限定されない。
限定されない。
実 験 1.tPAハイブリッド遺伝子を含む発現ベクターの構築 バクテリオファージラムダCharon 4AのEcoRI部位でクロ
ーン化されたヒトDNAのHae III部分分解物から成るヒト
のゲノムDNAライブラリー（T.Maniatisから入手可能）
を,Pennica等（前出）によって番号がつけられたcDNA配
列の約1270から2540塩基を含有するtPA cDNAクローン23
で選別した。約100万個のプラークを選別し,tPA配列に
ついて陽性であった12個のクローンを得た。さらに，ヌ
クレオチド76〜95;1129〜1148および1174〜1793（これ
らはそれぞれPennica cDNA配列の５′，中央および３′
領域に相当）のそれぞれに相当する３個のtPAオリゴマ
ーで選別した。この選別により,3個のプローブ全部とハ
イブリダイズした２種のクローン，λgt PA8とλgt PA9
を同定した。配列について地図作製したところ,Ny等
（前出）に記載されているtPAゲノムクローンと一致す
ることが判明した。主題のゲノムクローンの５′末端
は,5′の翻訳されない配列26bpと先行のイントロン少な
くとも30bpとをコードする完全な第２のエクソンを含有
している。ポリアデニル化部位までのそしてこれを含む
残りのtPA配列はすべて存在している。
ーン化されたヒトDNAのHae III部分分解物から成るヒト
のゲノムDNAライブラリー（T.Maniatisから入手可能）
を,Pennica等（前出）によって番号がつけられたcDNA配
列の約1270から2540塩基を含有するtPA cDNAクローン23
で選別した。約100万個のプラークを選別し,tPA配列に
ついて陽性であった12個のクローンを得た。さらに，ヌ
クレオチド76〜95;1129〜1148および1174〜1793（これ
らはそれぞれPennica cDNA配列の５′，中央および３′
領域に相当）のそれぞれに相当する３個のtPAオリゴマ
ーで選別した。この選別により,3個のプローブ全部とハ
イブリダイズした２種のクローン，λgt PA8とλgt PA9
を同定した。配列について地図作製したところ,Ny等
（前出）に記載されているtPAゲノムクローンと一致す
ることが判明した。主題のゲノムクローンの５′末端
は,5′の翻訳されない配列26bpと先行のイントロン少な
くとも30bpとをコードする完全な第２のエクソンを含有
している。ポリアデニル化部位までのそしてこれを含む
残りのtPA配列はすべて存在している。
cDNAの801から1273の位置に広がっているゲノムEcoRI断
片を含み，ゲノム配列の2.6kbを含有しているM13サブク
ローンは，制限エンドヌクレアーゼによる地図作製と部
分DNA配列分析によって詳細にその特徴がしらべられ
た。これらの分析によって，クローンの両端にある２個
のEcoRI部位はcDNAの中に存在する２つの部位でること
が判明した。cDNAのEcoRI断片の代わりにゲノムEcoRI断
片をもってくると，天然イントロン３個を含むハイブリ
ッド遺伝子が得られるであろう。
片を含み，ゲノム配列の2.6kbを含有しているM13サブク
ローンは，制限エンドヌクレアーゼによる地図作製と部
分DNA配列分析によって詳細にその特徴がしらべられ
た。これらの分析によって，クローンの両端にある２個
のEcoRI部位はcDNAの中に存在する２つの部位でること
が判明した。cDNAのEcoRI断片の代わりにゲノムEcoRI断
片をもってくると，天然イントロン３個を含むハイブリ
ッド遺伝子が得られるであろう。
次の手法はハイブリッド遺伝子を含有する発現ベクター
の調製に用いられた：プラスミドpSV7tPA2は,Hind III
で分解することによってM13クローニングベクターから
完全長のtPA cDNAを切り出し，突出部分をDNAポリメラ
ーゼＩのクレノー断片とdNTPによって埋め，次いでBal
Iで分割することにより構築した。得られた約2100bp断
片をゲルにより精製した。pSV7b,即ちpML（Lusky and B
otchan,Nature（1981）293:79〜81）に基づくプラスミ
ドは,SV40オリジン，初期プロモーターとポリアデニル
化部位，およびプロモーターとポリアデニル化部位のあ
いだにBgl II部位とSma I部位とを含むポリリンカーを
有している。このプラスミドをBgl IIとSma Iで分解し,
Bgl II部位はDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）とdNT
Pで埋めた。2100bp tPA cDNAをpSV7bに連結し，連結さ
れたDNAを反応能のあるエセリシア・コリ（E.coli）HB1
01に形質転換し，アンピシリン耐性クローンを選択して
増殖させ，小規模のDNA調製液を正確な挿入について選
別した。微細構造制限マッピングにより,tPA cDNAと隣
接配列は検出可能なほどには欠失されたり再配列されて
はいないことが判明した。DNA配列はtPA挿入の５′末端
についても確立された。この結果生じたプラスミドがpS
V7tPA2である。
の調製に用いられた：プラスミドpSV7tPA2は,Hind III
で分解することによってM13クローニングベクターから
完全長のtPA cDNAを切り出し，突出部分をDNAポリメラ
ーゼＩのクレノー断片とdNTPによって埋め，次いでBal
Iで分割することにより構築した。得られた約2100bp断
片をゲルにより精製した。pSV7b,即ちpML（Lusky and B
otchan,Nature（1981）293:79〜81）に基づくプラスミ
ドは,SV40オリジン，初期プロモーターとポリアデニル
化部位，およびプロモーターとポリアデニル化部位のあ
いだにBgl II部位とSma I部位とを含むポリリンカーを
有している。このプラスミドをBgl IIとSma Iで分解し,
Bgl II部位はDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）とdNT
Pで埋めた。2100bp tPA cDNAをpSV7bに連結し，連結さ
れたDNAを反応能のあるエセリシア・コリ（E.coli）HB1
01に形質転換し，アンピシリン耐性クローンを選択して
増殖させ，小規模のDNA調製液を正確な挿入について選
別した。微細構造制限マッピングにより,tPA cDNAと隣
接配列は検出可能なほどには欠失されたり再配列されて
はいないことが判明した。DNA配列はtPA挿入の５′末端
についても確立された。この結果生じたプラスミドがpS
V7tPA2である。
pSV7tPA2をEcoRIで分解し，上記のcDNAの位置801から12
73に広がっている2.6kbのゲノムEcoRI断片をcDNA内に置
換した。この経過生じたプラスミドpSV7tPA2Iを単離
し，制限マッピングによりしらべた結果，正確な構造を
有していることが判明した。
73に広がっている2.6kbのゲノムEcoRI断片をcDNA内に置
換した。この経過生じたプラスミドpSV7tPA2Iを単離
し，制限マッピングによりしらべた結果，正確な構造を
有していることが判明した。
2.tPAに対する検定 tPAについて使用される検定には２つのタイプがあり，
これらはいずれもGranelli−Piperno and Reich（197
8）J.Exp.Med.148:223−234に記載されている。このう
ち最初のものは，カゼイン−寒天−プラスミノーゲン
オーバーレイを使用して直接生きた細胞を試験してい
る。この検定をCOS細胞またはCHO細胞に使用すると,tPA
発現プラスミドでトランスフェクションされ，検定で検
出されるレベルの遺伝子を発現している細胞を同定確認
することができる。２つのタイプの細胞のトランスフェ
クション効率は文献に記されており，一定である（COS
細胞については５〜15％,CHO細胞については１×10-4/
μｇ）ので，この検定により異なった構築についての相
対的発現効率を測定することができる。結果はtPAを発
現している細胞上の透明ゾーンのサイズと数の差でわか
る。
これらはいずれもGranelli−Piperno and Reich（197
8）J.Exp.Med.148:223−234に記載されている。このう
ち最初のものは，カゼイン−寒天−プラスミノーゲン
オーバーレイを使用して直接生きた細胞を試験してい
る。この検定をCOS細胞またはCHO細胞に使用すると,tPA
発現プラスミドでトランスフェクションされ，検定で検
出されるレベルの遺伝子を発現している細胞を同定確認
することができる。２つのタイプの細胞のトランスフェ
クション効率は文献に記されており，一定である（COS
細胞については５〜15％,CHO細胞については１×10-4/
μｇ）ので，この検定により異なった構築についての相
対的発現効率を測定することができる。結果はtPAを発
現している細胞上の透明ゾーンのサイズと数の差でわか
る。
寒天オーバーレイはミルク，プラスミノーゲン，及び血
清の入っていない栄養培地を含み，次のようにして調製
される（6cm皿につき）： 0.2ml 2.5％ Difco寒天 0.125ml 8％ミルク（水溶中30分沸騰） 0.25ml DMEMまたは0.25mlの２倍濃度（2x）DMEM 0.025ml 7.5U/mlプラスミノーゲン，滅菌濾過したもの 成分を順に45〜50℃で混合し，ピペットで計量して細胞
の上に移す（そこからは培地に吸引されている）。細胞
は，曇ったオーバーレイ中にできた透明スポットをしら
べることにより,tPAの産生をモニターする。37℃で２〜
６時間保温したのち写真をとる。COS細胞検定は写真で
記録をとり，透明ゾーンを計数した;CHO細胞は透明ゾー
ンの数を記録し，個々のクローンを拡大するため検定プ
レートからマイクロウェルプレートへ直接拾い上げた。
清の入っていない栄養培地を含み，次のようにして調製
される（6cm皿につき）： 0.2ml 2.5％ Difco寒天 0.125ml 8％ミルク（水溶中30分沸騰） 0.25ml DMEMまたは0.25mlの２倍濃度（2x）DMEM 0.025ml 7.5U/mlプラスミノーゲン，滅菌濾過したもの 成分を順に45〜50℃で混合し，ピペットで計量して細胞
の上に移す（そこからは培地に吸引されている）。細胞
は，曇ったオーバーレイ中にできた透明スポットをしら
べることにより,tPAの産生をモニターする。37℃で２〜
６時間保温したのち写真をとる。COS細胞検定は写真で
記録をとり，透明ゾーンを計数した;CHO細胞は透明ゾー
ンの数を記録し，個々のクローンを拡大するため検定プ
レートからマイクロウェルプレートへ直接拾い上げた。
検定の第２部は定量で,CHO細胞の永久発現系の細胞１個
についてのtPA産生を測定するのに使われる。24時間ま
たは48時間保温後，上澄液を産生細胞の培地から取り除
き，細胞をトリプシン処理によって取り出し，血球計算
盤で計数する。上澄液は希釈せずにまたは希釈して用
い，カゼイン−アガロース−プラスミノーゲン プレー
トにあけた穴に適用した。透明になる放射状ゾーンのサ
イズはサンプル中のtPAの濃度に比例する。
についてのtPA産生を測定するのに使われる。24時間ま
たは48時間保温後，上澄液を産生細胞の培地から取り除
き，細胞をトリプシン処理によって取り出し，血球計算
盤で計数する。上澄液は希釈せずにまたは希釈して用
い，カゼイン−アガロース−プラスミノーゲン プレー
トにあけた穴に適用した。透明になる放射状ゾーンのサ
イズはサンプル中のtPAの濃度に比例する。
カゼイン−プラスミノーゲン−アガロース プレート
は，アガロース（3.5％）4.25ml,2x DMEM（血清無添
加）6.2ml,ミルク（水に８％になるように無脂肪ドライ
ミルク粉末をとかし，沸騰水溶中で30分加熱）3.75ml,
およびプラスミノーゲン（7.5U/ml）0.2mlを48℃で混合
し，混合液をガラスプレート上にピペットで注ぎ入れ，
均一の厚さの平らな表面のゲルを作ることにより，調製
する。約５分間冷却して固くなったところで金属パンチ
を使って等間隔で寒天に穴をあけ，吸引で穴を取り除
く，このようにして調製したプレートを使用まで４℃の
湿った雰囲気中で保存する（８時間以内）。試料は,Pip
ettemanを使用して１ウェルにつき５μｌ入れる。ウロ
キナーゼ ストック（1700IU/バイアル）を蒸留水また
はPBS 340μｌに溶解して最終濃度5000IU/mlにする。こ
のストック（5000IU/ml）４μｌをPBSまたはDMEM（これ
らの緩衝液に差異はない）の希釈剤16μｌに加えて希釈
する（1/5希釈）。1/5ストック10μｌを希釈剤90μｌに
加えて1/50希釈を作る。1/50希釈液50μｌを希釈剤50μ
ｌに加えて1/100希釈を調製する。それ以後の２倍希釈
はすべてこの方法で行う。ウロキナーゼの希釈液は,4℃
でPBS中に保存したストックから，各実験日に新しく調
製する。標準溶液は新しく溶解したウロキナーゼ粉末と
２週間毎に比較して活性の損失をモニターする。試験試
料は標準品と同じ希釈剤で２倍に希釈する。プレートを
湿気チェンバー中37℃で保温し，ポラロイド写真撮影で
時間の関数としてモニターする。物差しを使って写真サ
イズと実物のサイズの関係をしらべ，測定したサイズを
実際のサイズに変換する。
は，アガロース（3.5％）4.25ml,2x DMEM（血清無添
加）6.2ml,ミルク（水に８％になるように無脂肪ドライ
ミルク粉末をとかし，沸騰水溶中で30分加熱）3.75ml,
およびプラスミノーゲン（7.5U/ml）0.2mlを48℃で混合
し，混合液をガラスプレート上にピペットで注ぎ入れ，
均一の厚さの平らな表面のゲルを作ることにより，調製
する。約５分間冷却して固くなったところで金属パンチ
を使って等間隔で寒天に穴をあけ，吸引で穴を取り除
く，このようにして調製したプレートを使用まで４℃の
湿った雰囲気中で保存する（８時間以内）。試料は,Pip
ettemanを使用して１ウェルにつき５μｌ入れる。ウロ
キナーゼ ストック（1700IU/バイアル）を蒸留水また
はPBS 340μｌに溶解して最終濃度5000IU/mlにする。こ
のストック（5000IU/ml）４μｌをPBSまたはDMEM（これ
らの緩衝液に差異はない）の希釈剤16μｌに加えて希釈
する（1/5希釈）。1/5ストック10μｌを希釈剤90μｌに
加えて1/50希釈を作る。1/50希釈液50μｌを希釈剤50μ
ｌに加えて1/100希釈を調製する。それ以後の２倍希釈
はすべてこの方法で行う。ウロキナーゼの希釈液は,4℃
でPBS中に保存したストックから，各実験日に新しく調
製する。標準溶液は新しく溶解したウロキナーゼ粉末と
２週間毎に比較して活性の損失をモニターする。試験試
料は標準品と同じ希釈剤で２倍に希釈する。プレートを
湿気チェンバー中37℃で保温し，ポラロイド写真撮影で
時間の関数としてモニターする。物差しを使って写真サ
イズと実物のサイズの関係をしらべ，測定したサイズを
実際のサイズに変換する。
3.トランスフェクションとtPA発現レベル Graham and Van der Eb,Virology（1973）52:456〜467
に記載された方法の改良法を使用して，プラスミドpSV7
tPA2とpSV7tPA2Iの両方でCOS−７細胞（Gluzman,Cell
（1981）23:175）をトランスフェクションした。試料を
２通りに分けて皿に添加して,CO2インキュベーター中
（37℃）,6時間保温して細胞上に定着するようにした。
６時間後，上澄液を吸引し，細胞をカルシウムおよびマ
グネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS−CM
F）で緩やかに洗う。皿をアジュバンドとしてのグリセ
ロールに3.5〜４分間さらし，洗浄し，グルコース4.5mg
/ml,炭酸水素ナトリウム3.7mg/ml,グルタミン292μg/m
l,ピルビン酸ナトリウム110μg/ml,ペニシリン100U/ml,
ストレプトマイシン100U/mlおよびウシ胎児血清（FCS）
10％を添加したDMEM培地を供給する。アジュバントショ
ック後，種々の時期に，培地をウシ胎児血清を含まない
培地で置換する。血清除去12時間後，前述の如くカゼイ
ン−プラスミノーゲン−寒天 オーバーレイを使用し
て,tPAの発現について細胞を検定した。発現の最大はト
ランスフェクション開始後36時間と48時間の間に観察さ
れた。
に記載された方法の改良法を使用して，プラスミドpSV7
tPA2とpSV7tPA2Iの両方でCOS−７細胞（Gluzman,Cell
（1981）23:175）をトランスフェクションした。試料を
２通りに分けて皿に添加して,CO2インキュベーター中
（37℃）,6時間保温して細胞上に定着するようにした。
６時間後，上澄液を吸引し，細胞をカルシウムおよびマ
グネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS−CM
F）で緩やかに洗う。皿をアジュバンドとしてのグリセ
ロールに3.5〜４分間さらし，洗浄し，グルコース4.5mg
/ml,炭酸水素ナトリウム3.7mg/ml,グルタミン292μg/m
l,ピルビン酸ナトリウム110μg/ml,ペニシリン100U/ml,
ストレプトマイシン100U/mlおよびウシ胎児血清（FCS）
10％を添加したDMEM培地を供給する。アジュバントショ
ック後，種々の時期に，培地をウシ胎児血清を含まない
培地で置換する。血清除去12時間後，前述の如くカゼイ
ン−プラスミノーゲン−寒天 オーバーレイを使用し
て,tPAの発現について細胞を検定した。発現の最大はト
ランスフェクション開始後36時間と48時間の間に観察さ
れた。
pSV7tPA2Iによってトランスフェクションした皿中の透
明ゾーンの数はpSV7tPA2による場合より２〜３倍高い
（表Ｉ）。COS細胞に於けるトランスフェクションの頻
度は一定であるので，この結果はイントロンを含む構築
において発現が良好であることを示している。この２つ
の構築のあいだの相違点はイントロンのみであるので，
この改善はイントロンの存在に帰すると考えられる。
明ゾーンの数はpSV7tPA2による場合より２〜３倍高い
（表Ｉ）。COS細胞に於けるトランスフェクションの頻
度は一定であるので，この結果はイントロンを含む構築
において発現が良好であることを示している。この２つ
の構築のあいだの相違点はイントロンのみであるので，
この改善はイントロンの存在に帰すると考えられる。
CHO dhfr-細胞（Urlanb ＆ Chasin Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA（1980）77:4216）を，トランスフェクションの前
日に，栄養培地（炭酸水素ナトリウム1.18mg/ml,グルタ
ミン292μg/ml,ピルビン酸ナトリウム110μg/ml,ペニシ
リン100U/ml,ストレプトマイシン100U/ml,プロリン150
μg/mlおよびFCS10％を添加したF12）に５×105〜106細
胞/10cm皿の密度でまいた。細胞は,COS細胞をトランス
フェクションするのに用いたのと同じ方法によってトラ
ンスフェクションされた。但し，選択マーカーとして，
アデノウイルス主要後期プロモーターによって駆動され
るdhfr遺伝子をもっているプラスミドと,tPA発現プラス
ミド（pSV7tPA2またはpSV7tPA2I）とを混合し，これら
のプラスミドをリン酸カルシウムで共沈させる。dhfr遺
伝子を持っているプラスミドは，アデノウイルス−２か
らの主要後期プロモーター（Ad−MLP,地図単位16〜17.
3）をマウスのdhfr cDNAに５′末端位置で融合すること
により構築される。SV40の小ｔ抗原とSV40の初期領域ポ
リアデニル化部位に対するイントロンをコードするDNA
は,Southern and Bery,J.Mol.Appl.Genet.（1982）１:3
27〜341に記載のpSV2−neoから得られ，そしてdhfr cDN
Aの３′末端に融合された。これらの３つの区分をpBR32
2にサブクローン化し，プラスミドAd−dhfrを得た。こ
のプラスミドは機能的にはKaufmanとSharp（前出）に記
述のdhfrプラスミドに類似している。細胞にDNAを添加
して48時間後，細胞を選択培地（上記の如くプロリンと
ウシ胎児血清を添加した，または透析したウシ胎児血清
を添加したDMEM）に1:20で分割添加した。選択培地中で
１〜２週間増殖させたのち，出現したコロニーをカゼイ
ン−プラスミノーゲン−寒天 オーバーレイ検定により
tPA産生についてしらべ，カゼイン−アガロース−プラ
スミノーゲン プレートで定量した。
i.USA（1980）77:4216）を，トランスフェクションの前
日に，栄養培地（炭酸水素ナトリウム1.18mg/ml,グルタ
ミン292μg/ml,ピルビン酸ナトリウム110μg/ml,ペニシ
リン100U/ml,ストレプトマイシン100U/ml,プロリン150
μg/mlおよびFCS10％を添加したF12）に５×105〜106細
胞/10cm皿の密度でまいた。細胞は,COS細胞をトランス
フェクションするのに用いたのと同じ方法によってトラ
ンスフェクションされた。但し，選択マーカーとして，
アデノウイルス主要後期プロモーターによって駆動され
るdhfr遺伝子をもっているプラスミドと,tPA発現プラス
ミド（pSV7tPA2またはpSV7tPA2I）とを混合し，これら
のプラスミドをリン酸カルシウムで共沈させる。dhfr遺
伝子を持っているプラスミドは，アデノウイルス−２か
らの主要後期プロモーター（Ad−MLP,地図単位16〜17.
3）をマウスのdhfr cDNAに５′末端位置で融合すること
により構築される。SV40の小ｔ抗原とSV40の初期領域ポ
リアデニル化部位に対するイントロンをコードするDNA
は,Southern and Bery,J.Mol.Appl.Genet.（1982）１:3
27〜341に記載のpSV2−neoから得られ，そしてdhfr cDN
Aの３′末端に融合された。これらの３つの区分をpBR32
2にサブクローン化し，プラスミドAd−dhfrを得た。こ
のプラスミドは機能的にはKaufmanとSharp（前出）に記
述のdhfrプラスミドに類似している。細胞にDNAを添加
して48時間後，細胞を選択培地（上記の如くプロリンと
ウシ胎児血清を添加した，または透析したウシ胎児血清
を添加したDMEM）に1:20で分割添加した。選択培地中で
１〜２週間増殖させたのち，出現したコロニーをカゼイ
ン−プラスミノーゲン−寒天 オーバーレイ検定により
tPA産生についてしらべ，カゼイン−アガロース−プラ
スミノーゲン プレートで定量した。
pSV7tPA2でトランスフェクションされた場合よりも,pSV
7tPA2Iでトランスフェクションさせた細胞のプレートの
方に陽性クローンが多く見られ，透明ゾーンが大きかっ
た。個々のクローン系を増殖させ,tPA産生について検定
して，細胞当りの発現レベル（pg/細胞）を比較した。
現在までに単離されたクローン系に対する結果を表IIに
要約した。
7tPA2Iでトランスフェクションさせた細胞のプレートの
方に陽性クローンが多く見られ，透明ゾーンが大きかっ
た。個々のクローン系を増殖させ,tPA産生について検定
して，細胞当りの発現レベル（pg/細胞）を比較した。
現在までに単離されたクローン系に対する結果を表IIに
要約した。
表IIに示す如く，産生されたtPAのレベル（１細胞当り
について測定）は,pSV7tPA2系よりもpSV7tPA2Iにおける
方が著しく高い。増加巾は1.5〜16.5倍である。
について測定）は,pSV7tPA2系よりもpSV7tPA2Iにおける
方が著しく高い。増加巾は1.5〜16.5倍である。
上記の結果から，最低１個，好ましくは複数個のイント
ロンを含む遺伝子を使用すると,tPA産生が著しく増大す
ることが明らかである。イントロンの必要性に関する文
献で種々の結果が報告されており，これらの結果はイン
トロンがメッセンジャーRNAの安定性に寄与していると
説明されているので，発現が増加し，生産性のトランス
フェクションの効率が増大した今回のような結果は先行
技術からは予想できなかった。それゆえ，主題発明は，
重要な哺乳動物タンパク，組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターを高収率で産生し，従って生産と精製の能率を
高め，経済性を向上させる，改善された方法を提供す
る。
ロンを含む遺伝子を使用すると,tPA産生が著しく増大す
ることが明らかである。イントロンの必要性に関する文
献で種々の結果が報告されており，これらの結果はイン
トロンがメッセンジャーRNAの安定性に寄与していると
説明されているので，発現が増加し，生産性のトランス
フェクションの効率が増大した今回のような結果は先行
技術からは予想できなかった。それゆえ，主題発明は，
重要な哺乳動物タンパク，組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターを高収率で産生し，従って生産と精製の能率を
高め，経済性を向上させる，改善された方法を提供す
る。
上述の発明は明確に理解されることを願って図と実施例
を使ってある程度詳細に述べてきたが，添付の請求範囲
内で変更や改変が行われてもよいことは明らかである。
を使ってある程度詳細に述べてきたが，添付の請求範囲
内で変更や改変が行われてもよいことは明らかである。
プラスミドpSV7tPA2Iは1985年２月14日に寄託され，受
理番号はA.T.C.C.Accession Number 40163である。
理番号はA.T.C.C.Accession Number 40163である。
Claims (6)
- 【請求項１】DNA構築物であって、哺乳動物宿主中で機
能する転写開始調節配列およびポリアデニル化調節配列
を含有し、少なくとも該転写開始調節配列は野生型組織
プラスミノーゲンアクチベーターの転写開始調節配列以
外のものであり、遺伝子は組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターをコードするコード配列を有し、ここで該遺伝
子には、該哺乳動物宿主内で適切な読み取り枠を有する
mRNAにスプライシングされ得る少なくとも１個のイント
ロンが介在している、DNA構築物。 - 【請求項２】前記少なくとも１個のイントロンの各々が
天然の部位における天然に存在するイントロンである請
求の範囲第１項に記載のDNA構築物。 - 【請求項３】前記組織プラスミノーゲンアクチベーター
がヒト由来で、Eco RI−Eco RIゲノム断片がヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAのEco
RI−Eco RI領域内に置換される請求の範囲第２項に記載
のDNA構築物。 - 【請求項４】DNA構築物を含有する哺乳動物宿主中で安
定に維持され得る発現ベクターであって、該DNA構築物
は、哺乳動物宿主中で機能する転写開始調節配列および
ポリアデニル化調節配列を含有し、少なくとも該転写開
始調節配列は野生型組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの転写開始調節配列以外のものであり、遺伝子は組織
プラスミノーゲンアクチベーターをコードするコード配
列を有し、該遺伝子には、該哺乳動物宿主内で適切な読
み取り枠を有するmRNAにスプライシングされ得る少なく
とも１個のイントロンが介在しているDNA構築物であ
る、発現ベクター。 - 【請求項５】前記少なくとも１個のイントロンの各々が
天然の部位における天然に存在するイントロンである請
求の範囲第４項に記載のDNA構築物を含有する哺乳動物
宿主中で安定に維持され得る発現ベクター。 - 【請求項６】前記組織プラスミノーゲンアクチベーター
がヒト由来で、Eco RI−Eco RIゲノム断片がヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAのEco
RI−Eco RI領域内に置換される請求の範囲第５項に記載
のDNA構築物を含有する哺乳動物宿主中で安定に維持さ
れ得る発現ベクター。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71523785A | 1985-03-22 | 1985-03-22 | |
| US715237 | 1985-03-22 | ||
| PCT/US1986/000577 WO1986005514A1 (en) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | EXPRESSION OF tPA IN MAMMALIAN CELLS |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6161369A Division JPH07110227B2 (ja) | 1985-03-22 | 1994-07-13 | 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62502585A JPS62502585A (ja) | 1987-10-08 |
| JPH0740942B2 true JPH0740942B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=24873205
Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP61501987A Expired - Lifetime JPH0740942B2 (ja) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 |
| JP6161369A Expired - Lifetime JPH07110227B2 (ja) | 1985-03-22 | 1994-07-13 | 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 |
Family Applications After (1)
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|---|---|---|---|
| JP6161369A Expired - Lifetime JPH07110227B2 (ja) | 1985-03-22 | 1994-07-13 | 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 |
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- 1994-07-13 JP JP6161369A patent/JPH07110227B2/ja not_active Expired - Lifetime
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