JPH07110227B2 - 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 - Google Patents
哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現Info
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- JPH07110227B2 JPH07110227B2 JP6161369A JP16136994A JPH07110227B2 JP H07110227 B2 JPH07110227 B2 JP H07110227B2 JP 6161369 A JP6161369 A JP 6161369A JP 16136994 A JP16136994 A JP 16136994A JP H07110227 B2 JPH07110227 B2 JP H07110227B2
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
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Description
【０００１】
【発明の分野】発現のために異種宿主に導入される遺伝
子の数が増加している。採用される遺伝子の実質部分は
cDNAから得られている。元の天然の遺伝子が１個以上の
イントロンを有している場合には、イントロンを包含
し、また発現や複製に関係のある調節信号と関連した遺
伝子の操作をさらに複雑化させる大きな DNA細片を扱う
よりも、むしろcDNAを使用する方が大いに都合が良いこ
とがしばしばある。
子の数が増加している。採用される遺伝子の実質部分は
cDNAから得られている。元の天然の遺伝子が１個以上の
イントロンを有している場合には、イントロンを包含
し、また発現や複製に関係のある調節信号と関連した遺
伝子の操作をさらに複雑化させる大きな DNA細片を扱う
よりも、むしろcDNAを使用する方が大いに都合が良いこ
とがしばしばある。
【０００２】イントロンのはたらきはまだ充分には解明
されてはいない。イントロンの除去に関連したスプライ
シング機構の解明は大いに進歩してきたが、転写や翻訳
の過程でイントロンがどのような役割を果たすかについ
てはまだ充分な説明はなされていない。cDNAは容易に発
現させることができるという事実から、イントロンはコ
ード配列の発現には必須ではないことが確証される。
されてはいない。イントロンの除去に関連したスプライ
シング機構の解明は大いに進歩してきたが、転写や翻訳
の過程でイントロンがどのような役割を果たすかについ
てはまだ充分な説明はなされていない。cDNAは容易に発
現させることができるという事実から、イントロンはコ
ード配列の発現には必須ではないことが確証される。
【０００３】細胞宿主におけるポリペプチドやタンパク
の調製と産生に関する重要因子は、ポリペプチドまたは
タンパクの産生効率である。その生存能力を維持するた
め宿主に栄養を補給しつづけねばならないので、栄養物
は問題の産物の産生より、まず宿主の増殖と複製に使わ
れる。従って、所望の産物の生産に栄養が最大限に利用
され、所望の産物の全産生タンパクに対する量を増加さ
せる−これは所望産物が純粋な形で単離される効率を非
常に良好にする−ことが重要となってくる。
の調製と産生に関する重要因子は、ポリペプチドまたは
タンパクの産生効率である。その生存能力を維持するた
め宿主に栄養を補給しつづけねばならないので、栄養物
は問題の産物の産生より、まず宿主の増殖と複製に使わ
れる。従って、所望の産物の生産に栄養が最大限に利用
され、所望の産物の全産生タンパクに対する量を増加さ
せる−これは所望産物が純粋な形で単離される効率を非
常に良好にする−ことが重要となってくる。
【０００４】
【従来の技術】Pennicaら、Nature（1983）301:214-22
1；UK特許出願No.GB 2,119,804は、ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターのためのcDNAの単離およびクロ
ーニングを記述している。Nyら、Proc.Nat'l Acad.Sci.
USA（1984）81:5355-5359は、ヒトの組織型プラスミノ
ーゲンアクチベーター遺伝子、およびエキソン−イント
ロンの関係について記述している。HamerおよびLeder、
Cell（1979）18:1299-1302は、RNAの安定性にイントロ
ンが寄与していることを示唆している。一方、Y.Gluzma
n編集のEukaryotic Viral Vectors,P29-33（1982）、Ge
thingとSambrook著“The Expression of the Influenza
Virus Hemagglutinin Gene from SV-40-HA Recombinan
ts”(SV-40-HA組換体からのインフルエンザウイルスヘ
マグルチニン遺伝子の発現）には逆の実験結果を示して
いる。KaufmanおよびSharp、Molec.and Cell Biol.（19
82）2:1304-1319は、ハイブリッドイントロンはジヒド
ロ葉酸リダクターゼcDNAの発現に使用できることを示し
ている。LauおよびKan、Proc.Nat'l Acad.Sci.USA（198
3）80:5225-5229は、コスミッドベクター、およびそれ
らのCOS細胞と永久細胞系における使用について記述し
ている。
1；UK特許出願No.GB 2,119,804は、ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターのためのcDNAの単離およびクロ
ーニングを記述している。Nyら、Proc.Nat'l Acad.Sci.
USA（1984）81:5355-5359は、ヒトの組織型プラスミノ
ーゲンアクチベーター遺伝子、およびエキソン−イント
ロンの関係について記述している。HamerおよびLeder、
Cell（1979）18:1299-1302は、RNAの安定性にイントロ
ンが寄与していることを示唆している。一方、Y.Gluzma
n編集のEukaryotic Viral Vectors,P29-33（1982）、Ge
thingとSambrook著“The Expression of the Influenza
Virus Hemagglutinin Gene from SV-40-HA Recombinan
ts”(SV-40-HA組換体からのインフルエンザウイルスヘ
マグルチニン遺伝子の発現）には逆の実験結果を示して
いる。KaufmanおよびSharp、Molec.and Cell Biol.（19
82）2:1304-1319は、ハイブリッドイントロンはジヒド
ロ葉酸リダクターゼcDNAの発現に使用できることを示し
ている。LauおよびKan、Proc.Nat'l Acad.Sci.USA（198
3）80:5225-5229は、コスミッドベクター、およびそれ
らのCOS細胞と永久細胞系における使用について記述し
ている。
【０００５】
【発明の概要】少なくとも１個のイントロンが介在して
いる組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)のコー
ド配列を使用することにより、哺乳動物細胞における組
織プラスミノーゲンアクチベーターの発現が改善され
た。野生型組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子
または所望のタンパク産物をコードするキメラ遺伝子を
使用した。活性プロモーターが使用され、これにより組
織プラスミノーゲンアクチベーターの収量があがった。
いる組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)のコー
ド配列を使用することにより、哺乳動物細胞における組
織プラスミノーゲンアクチベーターの発現が改善され
た。野生型組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子
または所望のタンパク産物をコードするキメラ遺伝子を
使用した。活性プロモーターが使用され、これにより組
織プラスミノーゲンアクチベーターの収量があがった。
【０００６】
【特別な実施態様の説明】DNAの構築、およびそれらの
組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)の発現改善
への利用を提供する。ここで、DNAの構築は哺乳動物組
織プラスミノーゲンアクチベーターのコード配列を含
み、そのコード配列に少なくとも１個のイントロンが介
在する。天然に存在するイントロンを１個またはそれ以
上欠如しているキメラ遺伝子またはゲノム遺伝子を哺乳
動物宿主で機能する転写調節配列に連結する。
組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)の発現改善
への利用を提供する。ここで、DNAの構築は哺乳動物組
織プラスミノーゲンアクチベーターのコード配列を含
み、そのコード配列に少なくとも１個のイントロンが介
在する。天然に存在するイントロンを１個またはそれ以
上欠如しているキメラ遺伝子またはゲノム遺伝子を哺乳
動物宿主で機能する転写調節配列に連結する。
【０００７】組織プラスミノーゲンアクチベーターをコ
ードするのに用いられる遺伝子は、成熟組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター、組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターのプロフォームまたは前駆体−Ｎ末端配列の消失
を意図している−、または分泌を供するリーダー配列を
含むプレプロフォームをコードすると考えられる。
ードするのに用いられる遺伝子は、成熟組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター、組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターのプロフォームまたは前駆体−Ｎ末端配列の消失
を意図している−、または分泌を供するリーダー配列を
含むプレプロフォームをコードすると考えられる。
【０００８】使用するtPAコード配列は、最低約100bp、
普通は最低約300bpで約５kbpよりは大きくない、普通は
約４kbpよりは大きくないイントロンを少なくとも１個
有していることを特徴とする。使用されるイントロン
は、組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子と関係
のある天然イントロン、ベータグロブリンのような異な
った哺乳動物遺伝子に由来するイントロン、またはKauf
manおよびSharp(前出）のよって記述されたようなdhfr
cDNA を発現するのに用いられるアデノウイルス免疫グ
ロブリンハイブリッドイントロンのようなハイブリッド
イントロン類である。
普通は最低約300bpで約５kbpよりは大きくない、普通は
約４kbpよりは大きくないイントロンを少なくとも１個
有していることを特徴とする。使用されるイントロン
は、組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子と関係
のある天然イントロン、ベータグロブリンのような異な
った哺乳動物遺伝子に由来するイントロン、またはKauf
manおよびSharp(前出）のよって記述されたようなdhfr
cDNA を発現するのに用いられるアデノウイルス免疫グ
ロブリンハイブリッドイントロンのようなハイブリッド
イントロン類である。
【０００９】どちらかといえば、天然イントロンを元か
ら存在する場所で使うのが望ましい。遺伝子は一般に、
天然に存在するより少ないイントロンを有するであろ
う。遺伝子は１〜13個のイントロン、一般には２〜１３
個のイントロン、好ましくは２〜６個のイントロンまた
は９〜１３個のイントロン、特に、その開示がここで参
考として組み込まれているNyら（前出）の表現法を用い
るとイントロン“Ｆ”から“Ｍ”のあいだのイントロン
を有しているかもしれない。ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター遺伝子をコードし、イントロンを含有
する DNA断片は、最低約2.5kbpで約30kbpよりは大きく
ないであろう。イントロンはその末端に適当なスプライ
シング信号をもっていると考えらえる。
ら存在する場所で使うのが望ましい。遺伝子は一般に、
天然に存在するより少ないイントロンを有するであろ
う。遺伝子は１〜13個のイントロン、一般には２〜１３
個のイントロン、好ましくは２〜６個のイントロンまた
は９〜１３個のイントロン、特に、その開示がここで参
考として組み込まれているNyら（前出）の表現法を用い
るとイントロン“Ｆ”から“Ｍ”のあいだのイントロン
を有しているかもしれない。ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター遺伝子をコードし、イントロンを含有
する DNA断片は、最低約2.5kbpで約30kbpよりは大きく
ないであろう。イントロンはその末端に適当なスプライ
シング信号をもっていると考えらえる。
【００１０】哺乳動物細胞で活性のある多くの種々のプ
ロモーター領域が使用できる。SV40（初期または後
期）、アデノウイルス（初期または後期）またはレトロ
ウイルス(LTR)のような哺乳動物ウイルスから異種プロ
モーターが得られることもある。これらに代わって、調
節可能なプロモーター、例えばヒトまたはマウスのメタ
ロチオネインＩおよびII、熱ショックタンパクなどに由
来するプロモーターも使用できる。これらプロモーター
については、Hamerら（1983）による"Eukaryotic Viral
Vectors"（Y.Gluzman編集、p7-12）、Mayoら、Cell（1
982）29:99-108,およびKarinら、Nature（1984）308:51
3-519に記述されている。
ロモーター領域が使用できる。SV40（初期または後
期）、アデノウイルス（初期または後期）またはレトロ
ウイルス(LTR)のような哺乳動物ウイルスから異種プロ
モーターが得られることもある。これらに代わって、調
節可能なプロモーター、例えばヒトまたはマウスのメタ
ロチオネインＩおよびII、熱ショックタンパクなどに由
来するプロモーターも使用できる。これらプロモーター
については、Hamerら（1983）による"Eukaryotic Viral
Vectors"（Y.Gluzman編集、p7-12）、Mayoら、Cell（1
982）29:99-108,およびKarinら、Nature（1984）308:51
3-519に記述されている。
【００１１】あらゆる好都合なポリアデニル化部位、例
えばプロモーター領域と関係があるもの、組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター遺伝子に元々備わっているも
の、または他の哺乳動物遺伝子に由来するもの、が使用
できる。
えばプロモーター領域と関係があるもの、組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター遺伝子に元々備わっているも
の、または他の哺乳動物遺伝子に由来するもの、が使用
できる。
【００１２】特に興味深いのは、SV-40エンハンサーと
初期プロモーター領域の組み合わせ、並びにＴ抗原を含
まない複製システムをＴ抗原を含むCOS細胞と組み合わ
せたものである。
初期プロモーター領域の組み合わせ、並びにＴ抗原を含
まない複製システムをＴ抗原を含むCOS細胞と組み合わ
せたものである。
【００１３】組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝
子はどの哺乳動物宿主からでも得られるが、特に霊長目
（例えばヒト）、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、ネコ、げつ
歯類などから得られる。
子はどの哺乳動物宿主からでも得られるが、特に霊長目
（例えばヒト）、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、ネコ、げつ
歯類などから得られる。
【００１４】普通イントロン含有遺伝子に隣接している
転写および翻訳の開始および終結調節配列を含む、5'と
3'の翻訳されない領域を含む発現カセットが調製される
と、このカセットは哺乳動物細胞宿主の形質転換のため
のベクターに連結される。ある場合には、転写調節領
域、例えばエンハンサー、はイントロンの内に含まれて
いるかもしれない。
転写および翻訳の開始および終結調節配列を含む、5'と
3'の翻訳されない領域を含む発現カセットが調製される
と、このカセットは哺乳動物細胞宿主の形質転換のため
のベクターに連結される。ある場合には、転写調節領
域、例えばエンハンサー、はイントロンの内に含まれて
いるかもしれない。
【００１５】これらの部分が合体される場合の特別な順
序は主題発明の重要要素にはなっていない。それゆえ、
隣接領域は、遺伝子挿入に先立って、マーカーや他の領
域、例えばエンハンサー、転写調節領域など、を含む複
製システムに先に結合していてもよい。種々の断片を合
体させる方法は、構築の容易さ、制限部位の選択、特殊
断片の入手の難易性、その他の種々の要因に依存してい
る。
序は主題発明の重要要素にはなっていない。それゆえ、
隣接領域は、遺伝子挿入に先立って、マーカーや他の領
域、例えばエンハンサー、転写調節領域など、を含む複
製システムに先に結合していてもよい。種々の断片を合
体させる方法は、構築の容易さ、制限部位の選択、特殊
断片の入手の難易性、その他の種々の要因に依存してい
る。
【００１６】複製システムの選択には、部分的には、一
時的な発現を望んでいるかまたは安定な発現を望んでい
るかにかかっている。一時的な発現については、ウイル
ス配列（例えばSV-40）を基盤にしたエピソーム因子
（複製のオリジンを含む）が使用される。安定な発現
は、エピソーム因子（例えば、ウシの乳頭腫ウイルスに
基づくベクター）またはゲノムに組み込まれた配列を使
って達成され得る。
時的な発現を望んでいるかまたは安定な発現を望んでい
るかにかかっている。一時的な発現については、ウイル
ス配列（例えばSV-40）を基盤にしたエピソーム因子
（複製のオリジンを含む）が使用される。安定な発現
は、エピソーム因子（例えば、ウシの乳頭腫ウイルスに
基づくベクター）またはゲノムに組み込まれた配列を使
って達成され得る。
【００１７】これら多数のウイルス配列が、遺伝子gp
t、neoおよびdhfrのようなマーカーに結合される。これ
らのマーカーは、ベクターを含有する細胞の選択や、組
み込まれた外来配列の増幅を可能にする。必要に応じ
て、組織プラスミノーゲンアクチベーターの生産性をさ
らにあげるために、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーカセットがdhfr、メタロチオネインなどのような遺伝
子の発現カセットとタンデムに並んだようなタンデム型
構築物を調製することによって遺伝子を増幅することが
できる。あるいは、細胞は、tPA発現カセットを含むあ
る構築物と選択性マーカーを含む第２の独立した構築物
とにより共同形質転換することもできる。
t、neoおよびdhfrのようなマーカーに結合される。これ
らのマーカーは、ベクターを含有する細胞の選択や、組
み込まれた外来配列の増幅を可能にする。必要に応じ
て、組織プラスミノーゲンアクチベーターの生産性をさ
らにあげるために、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーカセットがdhfr、メタロチオネインなどのような遺伝
子の発現カセットとタンデムに並んだようなタンデム型
構築物を調製することによって遺伝子を増幅することが
できる。あるいは、細胞は、tPA発現カセットを含むあ
る構築物と選択性マーカーを含む第２の独立した構築物
とにより共同形質転換することもできる。
【００１８】宿主は、スプライシング可能で培養によっ
て効率よく組織プラスミノーゲンアクチベーターを発現
できる哺乳動物細胞ならどれでも都合のよいものを使っ
てよい。細胞にはCHO細胞、COS細胞、LTK細胞、HeLaお
よびCV-1のように広範な種類の細胞がある。これらの細
胞は充分確立された細胞系統の例として示したまでで、
主題発明をいずれかの特殊な確立された細胞系に限定す
るものでははく、現在確立されている他の細胞系や将来
確立されるであろう細胞系に都合よく適用されてよい。
て効率よく組織プラスミノーゲンアクチベーターを発現
できる哺乳動物細胞ならどれでも都合のよいものを使っ
てよい。細胞にはCHO細胞、COS細胞、LTK細胞、HeLaお
よびCV-1のように広範な種類の細胞がある。これらの細
胞は充分確立された細胞系統の例として示したまでで、
主題発明をいずれかの特殊な確立された細胞系に限定す
るものでははく、現在確立されている他の細胞系や将来
確立されるであろう細胞系に都合よく適用されてよい。
【００１９】ゲノム組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー遺伝子は、Nyら（前出）が記述した方法で得ることが
でき、また、cDNA遺伝子はPennicaら（前出）あるいはU
K特許出願No. 2,119,804に従って得ることができる。こ
れらの配列は種々のやり方で使用できる。遺伝子全体を
使用して、適当な調節配列を有する発現ベクターに挿入
し、宿主ゲノムへの組み込みを助ける DNAまたは複製シ
ステム、あるいはその両方に連結される発現カセットと
して供してもよい。あるいはまた、Nyら（前出）および
Pennicaら(前出）によって作製された制限地図にもとづ
いて、cDNAやゲノムDNA遺伝子配列から種々の断片を得
て、そして合体して一部分はcDNA遺伝子由来でまた一部
はゲノム遺伝子由来というようなハイブリッド遺伝子を
供することもできる。ハイブリッド遺伝子は、ゲノム遺
伝子の一部をcDNA断片で置換したり、またはこの反対を
行って調製することができる。ここで、このハイブリッ
ド遺伝子はcDNAまたはゲノム DNAを端に持っているか、
または組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子の１
つの5'−近傍部分がもう一つの遺伝子の3'−近傍部分に
結合している。
ー遺伝子は、Nyら（前出）が記述した方法で得ることが
でき、また、cDNA遺伝子はPennicaら（前出）あるいはU
K特許出願No. 2,119,804に従って得ることができる。こ
れらの配列は種々のやり方で使用できる。遺伝子全体を
使用して、適当な調節配列を有する発現ベクターに挿入
し、宿主ゲノムへの組み込みを助ける DNAまたは複製シ
ステム、あるいはその両方に連結される発現カセットと
して供してもよい。あるいはまた、Nyら（前出）および
Pennicaら(前出）によって作製された制限地図にもとづ
いて、cDNAやゲノムDNA遺伝子配列から種々の断片を得
て、そして合体して一部分はcDNA遺伝子由来でまた一部
はゲノム遺伝子由来というようなハイブリッド遺伝子を
供することもできる。ハイブリッド遺伝子は、ゲノム遺
伝子の一部をcDNA断片で置換したり、またはこの反対を
行って調製することができる。ここで、このハイブリッ
ド遺伝子はcDNAまたはゲノム DNAを端に持っているか、
または組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子の１
つの5'−近傍部分がもう一つの遺伝子の3'−近傍部分に
結合している。
【００２０】発現カセットは、リン酸カルシウム沈澱DN
A、トランスフェクション、形質導入などのいずれか都
合の良い方法で宿主に導入することができる。特別な方
法は本発明では重要でなく、そして一旦そのDNAが宿主
細胞に導入されるとその手法はくり返す必要はない。そ
れゆえ、発現カセットの宿主への導入が高効率であるこ
とが望ましいが、必ずしも必要ではない。
A、トランスフェクション、形質導入などのいずれか都
合の良い方法で宿主に導入することができる。特別な方
法は本発明では重要でなく、そして一旦そのDNAが宿主
細胞に導入されるとその手法はくり返す必要はない。そ
れゆえ、発現カセットの宿主への導入が高効率であるこ
とが望ましいが、必ずしも必要ではない。
【００２１】次にこの哺乳動物細胞を、ウシ胎児血清を
10〜20％含有するダルベコの改良イーグル培地(DMEM)の
ような適切な培地、またはこれらの細胞を安定に維持で
きる他の培地で増殖させる。リーダー配列が保持されて
いて、産物が分泌可能である（産物が細胞外に生産され
る場合）か否かによって、培地を連続的または繰り返し
交換し、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク
またはプロフォームを培地から単離する。リーダーが保
持されておらず、組織プラスミノーゲンアクチベーター
が細胞内に保持されている場合は、細胞を回収し、殺
し、溶解して組織プラスミノーゲンアクチベーターを単
離する。
10〜20％含有するダルベコの改良イーグル培地(DMEM)の
ような適切な培地、またはこれらの細胞を安定に維持で
きる他の培地で増殖させる。リーダー配列が保持されて
いて、産物が分泌可能である（産物が細胞外に生産され
る場合）か否かによって、培地を連続的または繰り返し
交換し、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク
またはプロフォームを培地から単離する。リーダーが保
持されておらず、組織プラスミノーゲンアクチベーター
が細胞内に保持されている場合は、細胞を回収し、殺
し、溶解して組織プラスミノーゲンアクチベーターを単
離する。
【００２２】単離および精製の技法としては、アフィテ
ィークロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLC、電気泳動、
抽出、ゲル浸透クロマトグラフィーなど種々のものが知
られている。主題発明の発現構築物を使用することによ
り、組織プラスミノーゲンアクチベーターの収量は、cD
NA遺伝子−これは既に原核細胞、真核細胞の両細胞で使
用されていた−を用いた場合と比較して実質的に増え
た。
ィークロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLC、電気泳動、
抽出、ゲル浸透クロマトグラフィーなど種々のものが知
られている。主題発明の発現構築物を使用することによ
り、組織プラスミノーゲンアクチベーターの収量は、cD
NA遺伝子−これは既に原核細胞、真核細胞の両細胞で使
用されていた−を用いた場合と比較して実質的に増え
た。
【００２３】次の実施例は説明のために揚げられたもの
で、これらに限定されない。
で、これらに限定されない。
【００２４】
１．tPA ハイブリッド遺伝子を含む発現ベクターの構築 バクテリオファージラムダCharon 4AのＥｃｏＲＩ部位
でクローン化された、ヒトDNAのHaeIII部分分解物から
成るヒトのゲノムDNA ライブラリー（T.Maniatis から
入手可能）を、Pennicaら（前出）によって番号がつけ
られたcDNA配列の約1270から2540塩基を含有するtPA cD
NAクローン23で選別した。約100万個のプラークを選別
し、tPA配列について陽性であった12個のクローンを得
た。さらに、ヌクレオチド76〜95；1129〜1148および11
74〜1793（これらはそれぞれPennica cDNA配列の5'、中
央および3'領域に相当）のそれぞれに相当する３個のtP
Aオリゴマーで選別した。この選別により、３個のプロ
ーブ全部とハイブリダイズした２種のクローン、λgt P
A8とλgt PA9を同定した。配列について地図作製したと
ころ、Nyら（前出）に記載されているtPAゲノムクロー
ンと一致することが判明した。主題のゲノムクローンの
5'末端は、5'の翻訳されない配列26bpと先行のイントロ
ン少なくとも30bpとをコードする完全な第２のエクソン
を含有している。ポリアデニル化部位までのそしてこれ
を含む残りのtPA配列はすべて存在している。
でクローン化された、ヒトDNAのHaeIII部分分解物から
成るヒトのゲノムDNA ライブラリー（T.Maniatis から
入手可能）を、Pennicaら（前出）によって番号がつけ
られたcDNA配列の約1270から2540塩基を含有するtPA cD
NAクローン23で選別した。約100万個のプラークを選別
し、tPA配列について陽性であった12個のクローンを得
た。さらに、ヌクレオチド76〜95；1129〜1148および11
74〜1793（これらはそれぞれPennica cDNA配列の5'、中
央および3'領域に相当）のそれぞれに相当する３個のtP
Aオリゴマーで選別した。この選別により、３個のプロ
ーブ全部とハイブリダイズした２種のクローン、λgt P
A8とλgt PA9を同定した。配列について地図作製したと
ころ、Nyら（前出）に記載されているtPAゲノムクロー
ンと一致することが判明した。主題のゲノムクローンの
5'末端は、5'の翻訳されない配列26bpと先行のイントロ
ン少なくとも30bpとをコードする完全な第２のエクソン
を含有している。ポリアデニル化部位までのそしてこれ
を含む残りのtPA配列はすべて存在している。
【００２５】cDNAの801から1273の位置に広がっている
ゲノムＥｃｏＲＩ断片を含み、ゲノム配列の2.6kbを含
有しているM13サブクローンは、制限エンドヌクレアー
ゼによる地図作製と部分DNA配列分析によって詳細にそ
の特徴がしらべられた。これらの分析によって、クロー
ンの両端にある２個のＥｃｏＲＩ部位はcDNAの中に存在
する２つの部位であることが判明した。cDNAのＥｃｏＲ
Ｉ断片の代わりにゲノムＥｃｏＲＩ断片をもってくる
と、天然イントロン３個を含むハイブリッド遺伝子が得
られるであろう。
ゲノムＥｃｏＲＩ断片を含み、ゲノム配列の2.6kbを含
有しているM13サブクローンは、制限エンドヌクレアー
ゼによる地図作製と部分DNA配列分析によって詳細にそ
の特徴がしらべられた。これらの分析によって、クロー
ンの両端にある２個のＥｃｏＲＩ部位はcDNAの中に存在
する２つの部位であることが判明した。cDNAのＥｃｏＲ
Ｉ断片の代わりにゲノムＥｃｏＲＩ断片をもってくる
と、天然イントロン３個を含むハイブリッド遺伝子が得
られるであろう。
【００２６】次の手法はハイブリッド遺伝子を含有する
発現ベクターの調製に用いられた：プラスミド pSV7tPA
2は、HindIIIで分解することによってM13クローニング
ベクターから完全長のtPA cDNAを切り出し、突出部分を
DNAポリメラーゼＩのクレノー断片とdNTPによって埋
め、次いでBalＩで分解することにより構築した。得ら
れた約2100bp断片をゲルにより精製した。pSV7b、即ちp
ML（LuskyおよびBotchan、Nature（1981）293:79-81）
に基づくプラスミドは、SV40オリジン、初期プロモータ
ーとポリアデニル化部位、およびプロモーターとポリア
デニル化部位のあいだに BglII部位とSmaＩ部位とを含
むポリリンカーを有している。このプラスミドをBglII
とSmaＩで分解し、BglII部位はDNAポリメラーゼＩ（ク
レノー断片）とdNTPで埋めた。2100bp tPA cDNAをpSV7b
に連結し、連結されたDNAを反応能のあるエセリシア・
コリ（E.coli）HB101に形質転換し、アンピシリン耐性
クローンを選択して増殖させ、小規模のDNA 調製液を正
確な挿入について選別した。微細構造制限マッピングに
より、tPA cDNAと隣接配列は検出可能なほどには欠失さ
れたり再配列されてはいないことが判明した。DNA配列
はtPA挿入の5'末端についても確立された。この結果生
じたプラスミドが pSV7tPA2である。
発現ベクターの調製に用いられた：プラスミド pSV7tPA
2は、HindIIIで分解することによってM13クローニング
ベクターから完全長のtPA cDNAを切り出し、突出部分を
DNAポリメラーゼＩのクレノー断片とdNTPによって埋
め、次いでBalＩで分解することにより構築した。得ら
れた約2100bp断片をゲルにより精製した。pSV7b、即ちp
ML（LuskyおよびBotchan、Nature（1981）293:79-81）
に基づくプラスミドは、SV40オリジン、初期プロモータ
ーとポリアデニル化部位、およびプロモーターとポリア
デニル化部位のあいだに BglII部位とSmaＩ部位とを含
むポリリンカーを有している。このプラスミドをBglII
とSmaＩで分解し、BglII部位はDNAポリメラーゼＩ（ク
レノー断片）とdNTPで埋めた。2100bp tPA cDNAをpSV7b
に連結し、連結されたDNAを反応能のあるエセリシア・
コリ（E.coli）HB101に形質転換し、アンピシリン耐性
クローンを選択して増殖させ、小規模のDNA 調製液を正
確な挿入について選別した。微細構造制限マッピングに
より、tPA cDNAと隣接配列は検出可能なほどには欠失さ
れたり再配列されてはいないことが判明した。DNA配列
はtPA挿入の5'末端についても確立された。この結果生
じたプラスミドが pSV7tPA2である。
【００２７】pSV7tPA2をＥｃｏＲＩで分解し、上記のcD
NAの位置801から1273に広がっている2.6kbのゲノムＥｃ
ｏＲＩ断片をcDNA内に置換した。この結果生じたプラス
ミド pSV7tPA2Iを単離し、制限マッピングによりしらべ
た結果、正確な構造を有していることが判明した。
NAの位置801から1273に広がっている2.6kbのゲノムＥｃ
ｏＲＩ断片をcDNA内に置換した。この結果生じたプラス
ミド pSV7tPA2Iを単離し、制限マッピングによりしらべ
た結果、正確な構造を有していることが判明した。
【００２８】２．tPAに対する検定 tPAについて使用される検定には２つのタイプがあり、
これらはいずれもGranelli-PipernoおよびReich（197
8）J.Exp.Med.148:223-234に記載されている。このうち
最初のものは、カゼイン−寒天−プラスミノーゲン オ
ーバーレイを使用して直接生きた細胞を試験している。
この検定をCOS細胞またはCHO細胞に使用すると、tPA発
現プラスミドでトランスフェクションされ、検定で検出
されるレベルの遺伝子を発現している細胞を同定確認す
ることができる。２つのタイプの細胞のトランスフェク
ション効率は文献に記されており、一定であるので（CO
S細胞については５〜15％、CHO細胞については１×10-4
／μg）、この検定により異なった構築についての相対
的発現効率を測定することができる。結果はtPAを発現
している細胞上の透明ゾーンのサイズと数の差でわか
る。
これらはいずれもGranelli-PipernoおよびReich（197
8）J.Exp.Med.148:223-234に記載されている。このうち
最初のものは、カゼイン−寒天−プラスミノーゲン オ
ーバーレイを使用して直接生きた細胞を試験している。
この検定をCOS細胞またはCHO細胞に使用すると、tPA発
現プラスミドでトランスフェクションされ、検定で検出
されるレベルの遺伝子を発現している細胞を同定確認す
ることができる。２つのタイプの細胞のトランスフェク
ション効率は文献に記されており、一定であるので（CO
S細胞については５〜15％、CHO細胞については１×10-4
／μg）、この検定により異なった構築についての相対
的発現効率を測定することができる。結果はtPAを発現
している細胞上の透明ゾーンのサイズと数の差でわか
る。
【００２９】寒天オーバーレイはミルク、プラスミノー
ゲン、及び血清の入っていない栄養培地を含み、次のよ
うにして調製される（６cm皿につき）： 0.2ml 2.5％ Difco寒天 0.125ml ８％ミルク（水溶中30分沸騰） 0.25ml DMEMまたは0.25mlの２倍濃度（２×）DMEM 0.025ml 7.5U/mlプラスミノーゲン、滅菌濾過したもの 成分を順に45〜50℃で混合し、ピペットで計量して細胞
の上に移す（そこからは培地は吸引されている）。細胞
は、曇ったオーバーレイ中にできた透明スポットをしら
べることにより、tPAの産生をモニターする。37℃で２
〜６時間保温したのち写真をとる。COS細胞検定は写真
で記録をとり、透明ゾーンを計数した；CHO細胞は透明
ゾーンの数を記録し、個々のクローンを拡大するため検
定プレートからマイクロウェルプレートへ直接拾い上げ
た。
ゲン、及び血清の入っていない栄養培地を含み、次のよ
うにして調製される（６cm皿につき）： 0.2ml 2.5％ Difco寒天 0.125ml ８％ミルク（水溶中30分沸騰） 0.25ml DMEMまたは0.25mlの２倍濃度（２×）DMEM 0.025ml 7.5U/mlプラスミノーゲン、滅菌濾過したもの 成分を順に45〜50℃で混合し、ピペットで計量して細胞
の上に移す（そこからは培地は吸引されている）。細胞
は、曇ったオーバーレイ中にできた透明スポットをしら
べることにより、tPAの産生をモニターする。37℃で２
〜６時間保温したのち写真をとる。COS細胞検定は写真
で記録をとり、透明ゾーンを計数した；CHO細胞は透明
ゾーンの数を記録し、個々のクローンを拡大するため検
定プレートからマイクロウェルプレートへ直接拾い上げ
た。
【００３０】検定の第２部は定量で、CHO細胞の永久発
現系の細胞１個についてのtPA産生を測定するのに使わ
れる。24時間または48時間保温後、上澄液を産生細胞の
培地から取り除き、細胞をトリプシン処理によって取り
出し、血球計算盤で計数する。上澄液は希釈せずにまた
は希釈して用い、カゼイン−アガロース−プラスミノー
ゲン プレートにあけた穴に適用した。透明になる放射
状ゾーンのサイズはサンプル中のtPAの濃度に比例す
る。
現系の細胞１個についてのtPA産生を測定するのに使わ
れる。24時間または48時間保温後、上澄液を産生細胞の
培地から取り除き、細胞をトリプシン処理によって取り
出し、血球計算盤で計数する。上澄液は希釈せずにまた
は希釈して用い、カゼイン−アガロース−プラスミノー
ゲン プレートにあけた穴に適用した。透明になる放射
状ゾーンのサイズはサンプル中のtPAの濃度に比例す
る。
【００３１】カゼイン−プラスミノーゲン−アガロース
プレートは、アガロース（3.5％）4.25ml、2×DMEM（血
清無添加）6.2ml、ミルク（水に８％になるように無脂
肪ドライミルク粉末をとかし、沸騰水溶中で30分加熱）
3.75ml、およびプラスミノーゲン（7.5U/ml）0.2mlを48
℃で混合し、混合液をガラスプレート上にピペットで注
ぎ入れ、均一の厚さの平らな表面のゲルを作ることによ
り、調製する。約５分間冷却して固くなったところで金
属パンチを使って等間隔で寒天に穴をあけ、吸引で穴を
取り除く、このようにして調製したプレートを使用まで
４℃の湿った雰囲気中で保存する（８時間以内）。試料
は、Pipettemanを使用して１ウェルにつき５μリットル
入れる。ウロキナーゼストック（1700IU／バイアル）を
蒸留水またはPBS340μリットルに溶解して最終濃度5000
IU／mlにする。このストック（5000IU／ml）4μリット
ルをPBSまたはDMEM（これらの緩衝液に差異はない）の
希釈剤16μリットルに加えて希釈する（1/5希釈）。1/5
ストック10μリットルを希釈剤90μリットルに加えて1/
50希釈を作る。1/50希釈液50μリットルを希釈剤50μリ
ットルに加えて1/100希釈を調製する。それ以後の２倍
希釈はすべてこの方法で行う。ウロキナーゼの希釈液
は、４℃でPBS中に保存したストックから、各実験日に
新しく調製する。標準溶液は新しく溶解したウロキナー
ゼ粉末と２週間毎に比較して活性の損失をモニターす
る。試験試料は標準品と同じ希釈剤で２倍に希釈する。
プレートを湿気チェンバー中37℃で保温し、ポラロイド
写真撮影で時間の関数としてモニターする。物差しを使
って写真サイズと実物のサイズの関係をしらべ、測定し
たサイズを実際のサイズに変換する。
プレートは、アガロース（3.5％）4.25ml、2×DMEM（血
清無添加）6.2ml、ミルク（水に８％になるように無脂
肪ドライミルク粉末をとかし、沸騰水溶中で30分加熱）
3.75ml、およびプラスミノーゲン（7.5U/ml）0.2mlを48
℃で混合し、混合液をガラスプレート上にピペットで注
ぎ入れ、均一の厚さの平らな表面のゲルを作ることによ
り、調製する。約５分間冷却して固くなったところで金
属パンチを使って等間隔で寒天に穴をあけ、吸引で穴を
取り除く、このようにして調製したプレートを使用まで
４℃の湿った雰囲気中で保存する（８時間以内）。試料
は、Pipettemanを使用して１ウェルにつき５μリットル
入れる。ウロキナーゼストック（1700IU／バイアル）を
蒸留水またはPBS340μリットルに溶解して最終濃度5000
IU／mlにする。このストック（5000IU／ml）4μリット
ルをPBSまたはDMEM（これらの緩衝液に差異はない）の
希釈剤16μリットルに加えて希釈する（1/5希釈）。1/5
ストック10μリットルを希釈剤90μリットルに加えて1/
50希釈を作る。1/50希釈液50μリットルを希釈剤50μリ
ットルに加えて1/100希釈を調製する。それ以後の２倍
希釈はすべてこの方法で行う。ウロキナーゼの希釈液
は、４℃でPBS中に保存したストックから、各実験日に
新しく調製する。標準溶液は新しく溶解したウロキナー
ゼ粉末と２週間毎に比較して活性の損失をモニターす
る。試験試料は標準品と同じ希釈剤で２倍に希釈する。
プレートを湿気チェンバー中37℃で保温し、ポラロイド
写真撮影で時間の関数としてモニターする。物差しを使
って写真サイズと実物のサイズの関係をしらべ、測定し
たサイズを実際のサイズに変換する。
【００３２】３．トランスフェクションとtPA 発現レベ
ル GrahamおよびVan der Eb、Virology（1973）52:456-467
に記載された方法の改良法を使用して、プラスミドpSV7
tPA2とpSV7tPA2Iの両方で COS-7細胞（Gluzman、Cell
（1981）23:175）をトランスフェクションした。試料を
２通りに分けて皿に添加して、CO2インキュベーター中
（37℃）、６時間保温して細胞上に定着するようにし
た。６時間後、上澄液を吸引し、細胞をカルシウムおよ
びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS-
CMF）で緩やかに洗う。皿をアジュバントとしてのグリ
セロールに3.5〜４分間さらし、洗浄し、グルコース4.5
mg／ml、炭酸水素ナトリウム3.7mg／ml、グルタミン292
μg／ml、ピルビン酸ナトリウム110μg／ml、ペニシリ
ン100U／ml、ストレプトマイシン100U／mlおよびウシ胎
児血清（FCS）10％を添加したDMEM培地を供給する。ア
ジュバントショック後、種々の時期に、培地をウシ胎児
血清を含まない培地で置換する。血清除去12時間後、前
述の如くカゼイン−プラスミノーゲン−寒天オーバーレ
イを使用して、tPAの発現について細胞を検定した。発
現の最大はトランスフェクション開始後36時間と48時間
の間に観察された。
ル GrahamおよびVan der Eb、Virology（1973）52:456-467
に記載された方法の改良法を使用して、プラスミドpSV7
tPA2とpSV7tPA2Iの両方で COS-7細胞（Gluzman、Cell
（1981）23:175）をトランスフェクションした。試料を
２通りに分けて皿に添加して、CO2インキュベーター中
（37℃）、６時間保温して細胞上に定着するようにし
た。６時間後、上澄液を吸引し、細胞をカルシウムおよ
びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS-
CMF）で緩やかに洗う。皿をアジュバントとしてのグリ
セロールに3.5〜４分間さらし、洗浄し、グルコース4.5
mg／ml、炭酸水素ナトリウム3.7mg／ml、グルタミン292
μg／ml、ピルビン酸ナトリウム110μg／ml、ペニシリ
ン100U／ml、ストレプトマイシン100U／mlおよびウシ胎
児血清（FCS）10％を添加したDMEM培地を供給する。ア
ジュバントショック後、種々の時期に、培地をウシ胎児
血清を含まない培地で置換する。血清除去12時間後、前
述の如くカゼイン−プラスミノーゲン−寒天オーバーレ
イを使用して、tPAの発現について細胞を検定した。発
現の最大はトランスフェクション開始後36時間と48時間
の間に観察された。
【００３３】pSV7tPA2Iによってトランスフェクション
した皿中の透明ゾーンの数はpSV7tPA2による場合より２
〜３倍高い（表Ｉ）。
した皿中の透明ゾーンの数はpSV7tPA2による場合より２
〜３倍高い（表Ｉ）。
【００３４】
【表１】
【００３５】COS細胞に於けるトランスフェクションの
頻度は一定であるので、この結果はイントロンを含む構
築において発現が良好であることを示している。この２
つの構築のあいだの相違点はイントロンのみであるの
で、この改善はイントロンの存在に帰すると考えられ
る。
頻度は一定であるので、この結果はイントロンを含む構
築において発現が良好であることを示している。この２
つの構築のあいだの相違点はイントロンのみであるの
で、この改善はイントロンの存在に帰すると考えられ
る。
【００３６】CHO dhfr-細胞（UrlaubおよびChasin、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA（1980）77:4216）を、トランスフ
ェクションの前日に、栄養培地（炭酸水素ナトリウム1.
18mg/ml、グルタミン292μg／ml、ピルビン酸ナトリウ
ム110μg／ml、ペニシリン100U／ml、ストレプトマイシ
ン100U／ml、プロリン150μg／mlおよびFCS10％を添加
したF12）に５×105〜106細胞／10cm皿の密度でまい
た。細胞は、COS細胞をトランスフェクションするのに
用いたのと同じ方法によってトランスフェクションされ
た。但し、選択マーカーとして、アデノウイルス主要後
期プロモーターによって駆動されるdhfr遺伝子をもって
いるプラスミドと、tPA発現プラスミド（pSV7tPA2また
はpSV7tPA2I）とを混合し、これらのプラスミドをリン
酸カルシウムで共沈させる。dhfr遺伝子を持っているプ
ラスミドは、アデノウイルス−２からの主要後期プロモ
ーター（Ad-MLP,地図単位16〜17.3）をマウスのdhfr cD
NAに5'末端位置で融合することにより構築される。SV40
の小ｔ抗原とSV40の初期領域ポリアデニル化部位に対す
るイントロンをコードするDNAは、SouthernおよびBer
y、J.Mol.Appl.Genet.（1982）1:327-341に記載のpSV2-
neoから得られ、そしてdhfrcDNAの3'末端に融合され
た。これらの３つの区分をpBR322にサブクローン化し、
プラスミド Ad-dhfrを得た。このプラスミドは機能的に
はKaufmanおよびSharp(前出）に記述のdhfrプラスミド
に類似している。細胞にDNAを添加して48時間後、細胞
を選択培地（上記の如くプロリンとウシ胎児血清を添加
した、または透析したウシ胎児血清を添加したDMEM）に
１：20で分割添加した。選択培地中で１〜２週間増殖さ
せたのち、出現したコロニーをカゼイン−プラスミノー
ゲン−寒天オーバーレイ検定によりtPA産生についてし
らべ、カゼイン−アガロース−プラスミノーゲン プレ
ートで定量した。
c.Natl.Acad.Sci.USA（1980）77:4216）を、トランスフ
ェクションの前日に、栄養培地（炭酸水素ナトリウム1.
18mg/ml、グルタミン292μg／ml、ピルビン酸ナトリウ
ム110μg／ml、ペニシリン100U／ml、ストレプトマイシ
ン100U／ml、プロリン150μg／mlおよびFCS10％を添加
したF12）に５×105〜106細胞／10cm皿の密度でまい
た。細胞は、COS細胞をトランスフェクションするのに
用いたのと同じ方法によってトランスフェクションされ
た。但し、選択マーカーとして、アデノウイルス主要後
期プロモーターによって駆動されるdhfr遺伝子をもって
いるプラスミドと、tPA発現プラスミド（pSV7tPA2また
はpSV7tPA2I）とを混合し、これらのプラスミドをリン
酸カルシウムで共沈させる。dhfr遺伝子を持っているプ
ラスミドは、アデノウイルス−２からの主要後期プロモ
ーター（Ad-MLP,地図単位16〜17.3）をマウスのdhfr cD
NAに5'末端位置で融合することにより構築される。SV40
の小ｔ抗原とSV40の初期領域ポリアデニル化部位に対す
るイントロンをコードするDNAは、SouthernおよびBer
y、J.Mol.Appl.Genet.（1982）1:327-341に記載のpSV2-
neoから得られ、そしてdhfrcDNAの3'末端に融合され
た。これらの３つの区分をpBR322にサブクローン化し、
プラスミド Ad-dhfrを得た。このプラスミドは機能的に
はKaufmanおよびSharp(前出）に記述のdhfrプラスミド
に類似している。細胞にDNAを添加して48時間後、細胞
を選択培地（上記の如くプロリンとウシ胎児血清を添加
した、または透析したウシ胎児血清を添加したDMEM）に
１：20で分割添加した。選択培地中で１〜２週間増殖さ
せたのち、出現したコロニーをカゼイン−プラスミノー
ゲン−寒天オーバーレイ検定によりtPA産生についてし
らべ、カゼイン−アガロース−プラスミノーゲン プレ
ートで定量した。
【００３７】pSV7tPA2でトランスフェクションされた場
合よりも、pSV7tPA2Iでトランスフェクションさせた細
胞のプレートの方に陽性クローンが多く見られ、透明ゾ
ーンが大きかった。個々のクローン系を増殖させ、tPA
産生について検定して、細胞当りの発現レベル（pg／細
胞）を比較した。現在までに単離されたクローン系に対
する結果を表IIに要約した。
合よりも、pSV7tPA2Iでトランスフェクションさせた細
胞のプレートの方に陽性クローンが多く見られ、透明ゾ
ーンが大きかった。個々のクローン系を増殖させ、tPA
産生について検定して、細胞当りの発現レベル（pg／細
胞）を比較した。現在までに単離されたクローン系に対
する結果を表IIに要約した。
【００３８】
【表２】
【００３９】表IIに示す如く、産生されたtPAのレベル
（１細胞当りについて測定）は、pSV7tPA2系よりもpSV7
tPA2Iにおける方が、著しく高い。増加巾は1.5〜16.5倍
である。
（１細胞当りについて測定）は、pSV7tPA2系よりもpSV7
tPA2Iにおける方が、著しく高い。増加巾は1.5〜16.5倍
である。
【００４０】上記の結果から、最低１個、好ましくは複
数個のイントロンを含む遺伝子を使用すると、tPA産生
が著しく増大することが明らかである。イントロンの必
要性に関する文献で種々の結果が報告されており、これ
らの結果はイントロンがメッセンジャーRNAの安定性に
寄与していると説明されているので、発現が増加し、生
産性のトランスフェクションの効率が増大した今回のよ
うな結果は先行技術からは予想できなかった。それゆ
え、主題発明は、重要な哺乳動物タンパク、組織プラス
ミノーゲンアクチベーターを高収率で産生し、従って生
産と精製の能率を高め、経済性を向上させる、改善され
た方法を提供する。
数個のイントロンを含む遺伝子を使用すると、tPA産生
が著しく増大することが明らかである。イントロンの必
要性に関する文献で種々の結果が報告されており、これ
らの結果はイントロンがメッセンジャーRNAの安定性に
寄与していると説明されているので、発現が増加し、生
産性のトランスフェクションの効率が増大した今回のよ
うな結果は先行技術からは予想できなかった。それゆ
え、主題発明は、重要な哺乳動物タンパク、組織プラス
ミノーゲンアクチベーターを高収率で産生し、従って生
産と精製の能率を高め、経済性を向上させる、改善され
た方法を提供する。
【００４１】上述の発明は明確に理解されることを願っ
て図と実施例を使ってある程度詳細に述べてきたが、添
付の請求範囲内で変更や改変が行われてもよいことは明
らかである。
て図と実施例を使ってある程度詳細に述べてきたが、添
付の請求範囲内で変更や改変が行われてもよいことは明
らかである。
【００４２】プラスミドpSV7tPA2Iは1985年２月14日に
寄託され、受理番号はA.T.C.C.Accession Number 40163
である。
寄託され、受理番号はA.T.C.C.Accession Number 40163
である。
【図１】図は２つの関連プラスミドを示している。その
１つが本主題発明の実施態様である。図の最上に、tPA
cDNA発現プラスミドpSV7tPA2の概略図を示す。斜線領域
は5'と3'の翻訳されない配列を示し、黒い領域はプレプ
ロtPAのコード配列を示している。SV40オリジンを円で
示し、SV40の初期プロモーター(EP)と初期領域ポリアデ
ニル化配列（ポリ(A)）の大体の位置を書き留めた。位
置801と1273のEcoRI部位も示されている。このプラスミ
ドの下にキメラ tPA遺伝子を有するプラスミドpSV7tPA2
I を示した。上記と同様、黒い部分はゲノムtPA遺伝子
にイントロン（白い箱部分）が介在しているコード配列
を示している。最下部に描かれているゲノムtPA遺伝子
の概略図は、位置801と1273の間でcDNAと置きかえるた
めにゲノムクローンから切り出される領域を示してい
る。Eco RI(E)、Bam HI(B)およびNruI(N)に対する制限
部位はゲノム地図に記入されている。
１つが本主題発明の実施態様である。図の最上に、tPA
cDNA発現プラスミドpSV7tPA2の概略図を示す。斜線領域
は5'と3'の翻訳されない配列を示し、黒い領域はプレプ
ロtPAのコード配列を示している。SV40オリジンを円で
示し、SV40の初期プロモーター(EP)と初期領域ポリアデ
ニル化配列（ポリ(A)）の大体の位置を書き留めた。位
置801と1273のEcoRI部位も示されている。このプラスミ
ドの下にキメラ tPA遺伝子を有するプラスミドpSV7tPA2
I を示した。上記と同様、黒い部分はゲノムtPA遺伝子
にイントロン（白い箱部分）が介在しているコード配列
を示している。最下部に描かれているゲノムtPA遺伝子
の概略図は、位置801と1273の間でcDNAと置きかえるた
めにゲノムクローンから切り出される領域を示してい
る。Eco RI(E)、Bam HI(B)およびNruI(N)に対する制限
部位はゲノム地図に記入されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 哺乳動物宿主中で安定に維持され得る発
現ベクターを有する動物細胞であって、該発現ベクター
はＤＮＡ構築物を含有し、該ＤＮＡ構築物は哺乳動物宿
主中で機能する転写開始調節配列およびポリアデニル化
調節配列を含有し、少なくとも該転写開始調節配列は野
生型組織プラスミノーゲンアクチベーター転写開始調節
配列以外のものであり、遺伝子は組織プラスミノーゲン
アクチベーターをコードするコード配列を有し、ここで
該遺伝子には、該哺乳動物宿主内で適切な読み取り枠を
有するｍＲＮＡにスプライシングされ得る少なくとも１
個のイントロンが介在しているＤＮＡ構築物である、動
物細胞。 - 【請求項２】 前記組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーがヒト由来で、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩゲノム断片が
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする
ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ領域内に置換され
る、請求項１に記載の動物細胞。 - 【請求項３】 染色体に取り込まれたＤＮＡ構築物を有
する動物細胞であって、該ＤＮＡ構築物が、哺乳動物宿
主中で機能する転写開始調節配列およびポリアデニル化
調節配列を含有し、少なくとも該転写開始調節配列は野
生型組織プラスミノーゲンアクチベーター転写開始調節
配列以外のものであり、遺伝子は組織プラスミノーゲン
アクチベーターをコードするコード配列を有し、ここで
該遺伝子には、該哺乳動物宿主内で適切な読み取り枠を
有するｍＲＮＡにスプライシングされ得る少なくとも１
個のイントロンが介在しているＤＮＡ構築物である、動
物細胞。 - 【請求項４】 前記組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーがヒト由来で、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩゲノム断片が
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする
ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ領域内に置換されて
おり、前記ＤＮＡ構築物が染色体に取り込まれている、
請求項３に記載の動物細胞。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US71523785A | 1985-03-22 | 1985-03-22 | |
| US715,237 | 1985-03-22 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61501987A Division JPH0740942B2 (ja) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767632A JPH0767632A (ja) | 1995-03-14 |
| JPH07110227B2 true JPH07110227B2 (ja) | 1995-11-29 |
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Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP61501987A Expired - Lifetime JPH0740942B2 (ja) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 |
| JP6161369A Expired - Lifetime JPH07110227B2 (ja) | 1985-03-22 | 1994-07-13 | 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 |
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|---|---|---|---|
| JP61501987A Expired - Lifetime JPH0740942B2 (ja) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | 哺乳動物細胞におけるｔＰＡの発現 |
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| JP (2) | JPH0740942B2 (ja) |
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-
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- 1986-03-20 WO PCT/US1986/000577 patent/WO1986005514A1/en active IP Right Grant
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| EP0215923A1 (en) | 1987-04-01 |
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| WO1986005514A1 (en) | 1986-09-25 |
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| JPS62502585A (ja) | 1987-10-08 |
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