EP0975756A1 - Fibroblasten mit einem fremdgen enthaltende zusammensetzung zur behandlung von wunden - Google Patents

Fibroblasten mit einem fremdgen enthaltende zusammensetzung zur behandlung von wunden

Info

Publication number
EP0975756A1
EP0975756A1 EP98919236A EP98919236A EP0975756A1 EP 0975756 A1 EP0975756 A1 EP 0975756A1 EP 98919236 A EP98919236 A EP 98919236A EP 98919236 A EP98919236 A EP 98919236A EP 0975756 A1 EP0975756 A1 EP 0975756A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fibroblasts
composition according
growth factor
gene coding
egf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98919236A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Roland Mertelsmann
Felicia Rosenthal
Peter Kulmburg
Björn G. STARK
Eszter Tanczos
Jürgen c/o familie K.-H. Koop KOPP
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaetsklinikum Freiburg
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Original Assignee
Universitaetsklinikum Freiburg
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaetsklinikum Freiburg, Albert Ludwigs Universitaet Freiburg filed Critical Universitaetsklinikum Freiburg
Publication of EP0975756A1 publication Critical patent/EP0975756A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the treatment of damage to the skin which is difficult to treat.
  • it can be a considerable problem to restore the skin areas destroyed by the damage, in particular if predominant parts of the skin are severely damaged.
  • other diseases such as tumor diseases or chronic skin damage, it is often a very significant problem to restore the damaged skin areas.
  • WO 92/15676 describes the use of gene-transfected fibroblasts for somatic gene therapy.
  • the transfected fibroblasts are fixed in an extracellular collagen matrix and implanted under the skin.
  • the purpose of this application is to treat genetic defects in the human genome.
  • a functionally active "replacement" gene is introduced into a somatic cell and used to compensate for the damage caused by the defective gene. This reference does not address the treatment of wounds or the
  • Cytokines that promote wound healing such as TGF- ⁇ , EGF or b-FGF.
  • the "fibroblast growth factor” mentioned in claim 5 is used as a substance forming blood vessels.
  • keratinocyte growth factor acting on keratinocytes
  • the subject of WO 90/08771 is the genetic engineering provision of growth factor proteins which influence epitelial cells.
  • the human keratinocyte growth factor is used as an essentially pure protein.
  • U.S. Patent 5,302,701 describes the development of an artificial polypeptide that is both cell adhesive and has cell growth promoting activity. It is a combination of fibronectin and Fibroblast Growth Factor (FGF).
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • US Pat. No. 5,196,196 relates to a wound dressing which also comprises a carrier matrix, there is an essential difference from the present invention with regard to the principle of action and the active agent.
  • purified protease Nexin-I (PN-I) is used for the wound dressing. However, this is not a growth factor, but an enzyme with certain properties.
  • the protease Nexin-I is a serine protease inhibitor; a member of the serine protease superfamily that is synthesized and secreted by human fibroblasts in culture.
  • the protein is used in a purified form and not in the form of a gene which is expressed by fibroblasts into which this gene has been incorporated.
  • keratinocyte preparations for example so-called keratinocyte sheets
  • keratinocyte sheets which are very difficult to handle and can often only be used when spatial structures have formed during cell cultivation.
  • allogeneic preparations in particular those which come from different donors and are not characterized are contaminated with viruses (HIV, HCV or viruses that have not yet been characterized) and that the patient to be treated can thereby be infected.
  • the present invention therefore relates to compositions for the treatment of wounds containing fibroblasts which contain at least one foreign gene coding for a cytokine which promotes wound healing and at least one further component which promotes wound healing.
  • the composition according to the invention can have further constituents which are usually used in such compositions.
  • the further component that promotes wound healing can be a so-called fibrin glue.
  • Fibrin adhesives of this type are commercially available and are used in various fields of medicine, in particular in surgery.
  • the fibrin glue contains fibrinogen, which is converted from thrombin to monomeric fibrin. This in turn forms aggregated fibrin through end-to-end or side-to-side attachment.
  • the fibrin glue also contains fibronectin.
  • thrombin activates factor XIII, which is usually present in sufficient quantities in fibrin glue.
  • the fibrin glue contains a thrombin solution as a further component, which is often added together with calcium chloride as a separate component.
  • the fibrin glue can also contain sufficient amounts of albumin or plasminogen.
  • the further component that promotes wound healing can also be a solid component that serves as a carrier matrix.
  • Carriers for "artificial skin” are commercially available (for example Laserskin® or Biobrane®).
  • the solid components can preferably be a matrix of a derivative of hyaluronic acid, preferably a hyaluronic acid ester.
  • Hyaluronic acid is an endogenous component in the connective tissue that is subject to an extremely high turnover rate. If the matrix consists of hyaluronic acid, it is quickly broken down in the wound by the body's own hyaluronidase. Therefore, according to the invention, preference is given to using derivatives of hyaluronic acid which are broken down somewhat more slowly in the body.
  • a particular advantage that can be achieved by using a carrier matrix is that cells can be applied to the wound that do not yet form a cell cluster that has grown together. If keratinocytes are also used in the composition according to the invention, these can be used in the subconfluent state with the aid of the carrier matrix. At this point, they are in their optimal growth phase, still divide very often and react particularly well to the cytokines that are produced by the gene-transfected fibroblasts.
  • the composition according to the invention can also comprise keratinocytes, specifically preferably autologous keratinocytes.
  • the keratinocytes form in particular the outer skin layer, the so-called epidermis.
  • Keratinocyte cultures can be cultivated according to a routine technique known per se [eg Rheinwald et al. Nature 265 (1977) pp. 421-424]. Usually a small piece of the skin is removed by biopsy and then the epidermis and the der is separated. A cell suspension is produced from the epidermis, preferably by treatment with a proteolytic enzyme. The individual cells thus obtained are then grown in culture containers (bottles or dishes) under sterile conditions and detached from the cultivation containers at a suitable time.
  • the composition according to the invention has genetically modified fibroblasts.
  • Fibroblasts are cells from the mesenc ym with a large cell body and a somewhat flattened nucleus.
  • the fibroblasts are particularly involved in the formation of the intercellular substance of the connective tissue.
  • autologous fibroblasts can be used or, in a preferred form, allogeneic fibroblasts are used which originate from another individual, ie not from the patient to be treated.
  • Those fibroblasts that have been selected clonally, that is, derived from a clone, are very particularly preferably used.
  • the gene-transfected fibroblasts have been treated with a dose of ionizing radiation such that the fibroblasts can no longer multiply and die after a certain time.
  • This radiation has the advantage that the gene-transfected cells in the body die after a reasonable time ( ⁇ 3 weeks).
  • Another advantage of using irradiated fibroblasts is that the cells treated in this way continue to express the cytokine well.
  • cells of immortalized fibroblast cell lines are used according to the invention, a cell line which has been given the name KMST-6 having proven particularly useful.
  • Immortalized fibroblast cell lines are advantageous because they can be continuously cultivated and used in a biologically precise manner.
  • other suitable immortalized fibroblast cell lines can also be used without difficulty.
  • a foreign gene which codes for a suitable cytokine is introduced into the fibroblasts used according to the invention.
  • This foreign gene is preferably a gene which codes for a cytokine such as EGF, TGF- ⁇ or KGF.
  • the epidermal growth factor is briefly referred to as EGF. It is a globular protein of approximately 6.2 kDa, which has 53 amino acids. According to the invention, it is not absolutely necessary for the complete gene to be introduced into the transfected fibroblasts; it is sufficient if the part which has the biological activity is introduced.
  • the corresponding cDNA portion is preferably fused in-reading frame with the secretory signal sequence of the human G-CSF.
  • EGF-like proteins such as the transforming growth factor, are also preferred according to the invention
  • TGF- ⁇ (transforming growth factor) TGF- ⁇ , which has a high homology to EGF.
  • the biological activity of EGF and TGF- ⁇ is comparable.
  • Both cytokines have an influence on the epidermal development and the differentiation of the cells.
  • NGF nerve growth factor
  • This cytokine is primarily responsible for the survival, differentiation and functional activity of sensory and sympathetic neurons in the peripheral nervous system.
  • the accelerating effect on wound healing may be due to the ability of NGF to increase the survival and functional activities of various immunocompetent cells, such as granulocytes, mast cells, macrophages and lymphocytes.
  • cytokine is the keratinocyte growth factor (KGF), which in particular stimulates the division of keratinocytes that are capable of division.
  • KGF keratinocyte growth factor
  • Variants of the genes can also be used according to the invention. Such variants can have deletions or additions and the sequence can be changed in a targeted manner. It is also entirely possible to use variants of cytokines which have a higher biological activity than the naturally occurring cytokines, such as, in particular, fusion constructs of two or more cytokines.
  • the fibroblasts used according to the invention contain a foreign gene which codes for a cytokine which promotes wound healing. This foreign gene can preferably come from humans, but also from an animal, such as, for example, mice or cattle. However, the prerequisite is that the cytokine is not species-specific if the foreign gene comes from another species.
  • the foreign gene is required to be introduced into the fibroblasts. This can be accomplished by incorporating the desired gene into a suitable vector and then transfecting it into the fibroblasts.
  • Viral vectors or plasmid vectors are suitable as vectors, the plasmid vectors being particularly preferred, since additional tests have to be carried out on viral vectors to rule out contamination with replication-competent viruses.
  • compositions according to the invention have various advantages over the solutions known from the prior art.
  • the gene-modified fibroblasts which in a preferred embodiment were lethally irradiated, can express the desired cytokine or s for a predetermined time and release them into the tissue. Due to the continuous production of the cytokine, the problems that can be attributed to the short half-life of cytokines with local external application can be avoided.
  • different cell types keratinocytes / fibroblasts
  • the gene-transfected fibroblasts can also contain different cytokines. This enables various growth factors to be introduced into the wound area in a targeted manner. If autologous keratinocytes are used, the histoin incompatibility rejection reaction can be avoided.
  • composition according to the invention without keratinocytes.
  • the gene-modified fibroblasts release the cytokine into the environment and stimulate those keratinocytes of the treated patient that are found, for example, in the marginal areas of the wound.
  • compositions according to the invention are preferably in the form of pharmaceutically acceptable formulations. These can either be suspensions of fibrin glue and gene-transfected fibroblasts, which can be applied to the wound as solutions, suspensions, ointments or in the form of gels. If it is a composition which has a solid component, that is to say a carrier matrix, then these compositions are preferably in the form of sterile units which are preserved in a suitable manner. Such preparations can, for example, be in the form of frozen, sterile pads.
  • Figure 1 shows the structure of the expression vector for human EGF.
  • Part (A) shows the plasmid construction with the chimeric EGF gene.
  • Part (B) shows the sequence of the fusion in the reading frame between the human G-CSF signal sequence (underlined) and the mature region coding for human EGF (Asn Ser Asp ).
  • FIG. 2 shows the secretion of EGF from fibroblasts which were transfected with the plas id pCMV-EGF-IRES-TKNeo. These are fibroblasts from the KMST-6 cell line after irradiation (100 Gy). In the experiment, 2 x 10 were irradiated Cells were seeded in six well culture plates and the EGF concentration was determined in culture supernatants after 24 hours. The values represent average values.
  • Figure 3 shows the bioactivity of EGF chimeric polypeptides obtained from clones # 3 and # 6 from gene transfected KMST-6 fibroblasts.
  • Part (A) shows the bioactivity on mouse keratinocytes from the BALB / MK strain.
  • Part (B) shows the results obtained using human primary keratinocytes.
  • the values give the average results of eight measurements with standard deviation.
  • the dotted bars represent the calibration curve obtained with recombinant EGF.
  • the empty bars represent the control values obtained with fibroblasts from the KMST-6 cell line.
  • the striped and gray bars represent the results obtained with culture supernatants from both clones 3 and 6, respectively.
  • FIG. 4 shows the proliferation of primary human keratinocytes in the culture test with irradiated fibroblasts of the KMST-6 cell line, which were gene-transfected.
  • Part (A) shows the results after four days of co-culture.
  • Part (B) shows the results after 10 days of co-culture.
  • EGF is synthesized as a 130 kDa transme branglycoprotein precursor molecule that is proteolytically cleaved into the biologically active 6.2 kDa EGF peptide with 53 amino acids.
  • a chimeric construct was therefore produced which codes for an in-reading fusion of the mature EGF peptide and the human G-CSF secretory signal sequence.
  • the structure is shown schematically in Figure 1 (A).
  • the resulting DNA fusion fragment was placed under the transcriptional control of the human CMV (cytomegalovirus) promoter and inserted into a dicistronic vector in order to bind the expression of the transgene to that of the selection marker neomycin phosphorus transferase.
  • CMV cytomegalovirus
  • the sequence coding for the mature human EGF peptide was amplified with the aid of PCR technology and the product obtained was subcloned in the vector pBluescript (Stratagene) and then sequenced.
  • the human G-CSF signal sequence from human G-CSF cDNA was amplified using PCR technology, creating an improved Kozak consensus sequence at the 5 'end and a single Nhel restriction site. The relevant sequence is shown in Figure 1 (B).
  • the plasmid thus generated was transfected into human fibroblasts of the KMST-6 cell line and all neomycin-resistant clones secreted human EGF, which was demonstrated by an ELISA test.
  • the control showed that non-transfected human fibroblasts from the KMST-6 cell line did not secrete detectable levels of hEGF either before or after radiation.
  • Irradiation was carried out at room temperature with a 137 CS radiation source at a dose rate of 3 Gy / minute.
  • EGF For optimal wound healing results, EGF must be available for the first few days of treatment.
  • lethal radiation can prevent the uncontrolled in vivo growth of genetically modified cells.
  • the influence of lethal radiation on the expression of EGF was therefore investigated, KMST-6 fibroblasts (clone # 3, transfected with the plasmid pCMV-EGF-IRES-TKNeo) being examined. It was found that EGF secretion slowly decreased after irradiation with 100 Gy, but was detectable in the supernatant for at least seven days in vitro. The results are summarized in Figure 2.
  • Table I shows the hEGF release in pg / ml in vivo in wounds from irradiated KMST6 fibroblasts transfected with the chimeric hEGF gene.
  • Keratinocytes alone (50,000 cells / cm, group III) and 18 whole skin wounds transplanted with non-transfected KMST-6
  • the results in group I continuously showed an almost complete, pronounced epithelialization on day 7 to 12, and a complete epithelialization on day 14.
  • the wounds also showed the best results with regard to the reconstitution quality of the epidermis (cell activity of the epithelium) of group I.
  • the control groups on the other hand, only showed pronounced epithelialization on day 14 and on day 21 they still showed no high-quality epithelialization.
  • Table III shows the epithelialization in a table.
  • Burn wounds (5 cm 2, grade 2a) performed.
  • a pig 7 standardized burns with EGF-transfected KMST-6 cells were transplanted into fibrin glue (therapy group).
  • 7 untreated standardized burns control group I
  • 7 standardized ones were used here Burns treated with fibrin glue (control group III) as a control.
  • two other pigs P2, P3
  • 7 standardized burns with EGF-transfected KMST-6 cells were transplanted into fibrin glue (therapy group).
  • 7 untreated standardized burn wounds control group I
  • 7 standardized burn wounds which were transplanted with non-transfected KMST-6 cells (control group II), served as controls.
  • Table IV shows the group breakdown.
  • one wound was biopsied from each group.
  • 0.8g of wound tissue from the biopsies up to day 10 were homogenized with a Triton-X-PBS buffer.
  • the homogenates were centrifuged and the EGF concentration of the supernatants was evaluated using an anti-human EGF ELISA.
  • the biopsies were also evaluated histologically.
  • Table V shows EGF concentration values in one wound each of the groups.
  • Table V EGF tissue concentrations in pg / ml in the large animal experiment

Abstract

Die vorliegende Erfindung offenbart eine Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden, die Fibroblasten, die wenigstens ein Fremdgen kodierend für ein die Wundheilung förderndes Zytokin enthalten und wenigstens eine weitere die Wundheilung fördernde Komponente umfaßt.

Description

Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur
Behandlung von Wunden
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Behandlung von Schädigungen der Haut, die nur schwer behandelbar sind. Bei großflächigen Verbrennungen kann es ein erhebliches Problem darstellen, die durch die Schädigung zerstörten Hautbereiche wiederherzustellen, insbesondere wenn ganz überwiegende Teile der Haut schwer geschädigt sind. Auch bei anderen Erkrankungen wie beispielsweise Tumorerkrankungen oder chronischen Hautschädigungen stellt es häufig ein ganz erhebliches Problem dar, die geschädigten Hautbereiche wiederherzustellen.
Gentransfizierte Fibroblasten per se sind bereits aus dem Stand der Technik bekannt. In der internationalen Patentanmeldung WO 95/07105 wird ein Verfahren zur Inhibierung oder Verhinderung des Wachstums von Tumorzellen im Zentralnervensystem eines Patienten beschrieben, bei dem die Immunantwort des Patienten stimuliert wird durch Immunisierung mit entweder gentransfizierten Tumorzellen oder unmodifizierten Tumorzellen und gentransfizierten autologen Fibroblasten. Bei den verwendeten Zytokinen handelt es sich in erster Linie um solche, die das Immunsystem stimulieren. Die DE-OS 44 06 073, die ebenfalls im Namen des Klinikums der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg eingereicht wurde, betrifft ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten sowie ein Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten. Nicht offenbart wird in dieser Anmeldung die topische Applikation oder die Gentransfizierung speziell mit solchen Genen, die die Wundheilung fördern.
Die WO 92/15676 beschreibt die Verwendung von gentransfizierten Fibroblasten für die somatische Gentherapie. Dabei werden die transfizierten Fibroblasten in einer extrazellulären Kollagenmatrix fixiert und unter der Haut implantiert. Die Aufgabenstellung dieser Anmeldung zielt darauf hin, genetische Defekte in menschlichen Genom zu therapieren. Dabei wird ein funktioneil aktives "Ersatz"-Gen in eine somatische Zelle eingebracht und dazu verwendet, den durch das defekte Gen entstehenden Schaden auszugleichen. Nicht angesprochen ist in dieser Literaturstelle die Behandlung von Wunden oder die
Wundheilung fördernde Zytokine, wie beispielsweise TGF-α, EGF oder b-FGF. In der Entgegenhaltung werden vor allem Zytokine mit anderen biologischen Eigenschaften erwähnt, wie GM-CSF, TNF oder EPO. Der in Anspruch 5 erwähnte "fibroblast growth factor" wird als Blutgefäße bildende Substanz eingesetzt.
Auch verschiedene auf Keratinozyten einwirkende Wachtumsfaktoren sind bekannt. Gegenstand der WO 90/08771 ist die gentechnologische Bereitstellung von Wachstumsfaktor-Proteinen, die epiteliale Zellen beeinflussen. Bei dieser Anmeldung wird der menschliche Keratinozyten-Wachstumsfaktor aber als im wesentlichen reines Protein eingesetzt.
In der US-Patentschrift 5,302,701 wird die Entwicklung eines künstlichen Polypeptids beschrieben, das sowohl zelladhäsiv ist, wie auch zellwachstu sfordernde Aktivität hat. Es handelt sich hierbei um eine Kombination von Fibronektin und Fibroblast Growth Factor (FGF). Das US-Patent 5,196,196 betrifft zwar eine Wundauflage, die auch eine Trägermatrix umfaßt, jedoch besteht ein wesentlicher Unterschied zu der vorliegenden Erfindung hinsichtlich des Wirkungsprinzips und des aktiven Agens. In dem US-Patent wird bei der Wundauflage gereinigte Protease Nexin-I (PN-I) eingesetzt. Hierbei handelt es sich aber nicht um einen Wachstumsfaktor, sondern um ein Enzym mit bestimmten Eigenschaften. Die Protease Nexin-I ist ein Serin-Protease- Inhibitor; ein Mitglied der Serin-Protease-Superfamilie, die durch menschliche Fibroblasten in Kultur synthetisiert und sekretiert wird. Bei dem US-Patent wird das Protein in gereinigter Form eingesetzt und nicht in der Form eines Gens, das durch Fibroblasten, in die dieses Gen eingebaut wurde, exprimiert wird.
Aus dem Stand der Technik ist weiterhin die Verwendung von kultivierten autologen Keratinozyten, die in Fibrinkleber suspendiert sind, zur Behandlung von großflächigen Verbrennungswunden bekannt [Stark et al., Eur. J.Plast. Surg. (1995) 18, S. 267-271]. Es wurde auch bereits im Schweinemodell versucht, bei der Wundheilung Keratinozyten einzusetzen, die in situ mit Hilfe von Partikel-DNA-Transfer transfiziert wurden [Andree et al . , Proc.Natl .Acad.Sci. USA, (1994) 91, S. 12188- 12192] .
Andreatta-van Leyen et al. [J. Biomedical Materials Res., Vol. 27 (1993), S. 1201-1208] beschreiben eine Wundbandage, die gentransfizierte Keratinozyten umfaßt, die Rinderwachstumshormon (bGH) produzieren.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Lösungsvorschläge greifen zum Teil auf Keratinozytenpräparationen (z.B. sog. Keratinozyten-Sheets) zurück, die sehr schwierig zu handhaben sind und oft erst dann verwendet werden können, wenn sich bei der Zellkultivierung räumliche Strukturen gebildet haben. Es besteht die Gefahr, daß allogene Präparate, insbesondere solche, die von verschiedenen Spendern stammen und nicht charakterisiert sind, mit Viren (HIV, HCV oder noch nicht charakterisierte Viren) kontaminiert sind und, daß dadurch der zu behandelnde Patient infiziert werden kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Zusammensetzungen zur Behandlung von Wunden enthaltend Fibroblasten, die wenigstens ein Fremdgen kodierend für ein die Wundheilung förderndes Zytokin enthalten und wenigstens eine weitere die Wundheilung fördernde Komponente. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung weitere Bestandteile aufweisen, die üblicherweise in derartigen Zusammensetzungen verwendet werden.
Bei der weiteren die Wundheilung fördernden Komponente kann es sich um einen sogenannten Fibrinkleber handeln. Derartige Fibrinkleber sind kommerziell erhältlich und werden in verschiedenen Bereichen der Medizin, insbesondere in der Chirurgie eingesetzt.
Bei der Fibrinklebung wird im Prinzip die letzte Phase der Blutgerinnung benutzt. Der Fibrinkleber beinhaltet Fibrinogen, das vom Thrombin zum monomeren Fibrin umgesetzt wird. Dieses wiederum bildet durch End-zu-End- bzw. Seit-zu-Seit-Anlagerung aggregiertes Fibrin. Außerdem beinhaltet der Fibrinkleber in bevorzugter Ausführungsform Fibronectin. Gleichzeitig aktiviert Thrombin den Faktor XIII, der üblicherweise bei dem Fibrinkleber in ausreichender Menge vorhanden ist. Der Fibrinkleber beinhaltet als weitere Komponente eine Thrombinlösung, die häufig zusammen mit Kalziumchlorid als separate Komponente zugefügt wird.
Darüber hinaus kann der Fibrinkleber auch ausreichende Mengen an Albumin oder Plasminogen enthalten.
Bei der weiteren die Wundheilung fördernden Komponente kann es sich in einer bevorzugten Ausführungsform auch um einen festen Bestandteil handeln, der als Trägermatrix dient. Derartige Träger für "künstliche Haut" sind kommerziell erhältlich (beispielsweise Laserskin® oder Biobrane®). Bei den festen Komponenten kann es sich bevorzugt um eine Matrix aus einem Derivat der Hyaluronsäure handeln, vorzugsweise um einen Hyaluronsäureester. Bei der Hyaluronsäure handelt es sich um einen körpereigenen Bestandteil im Bindegewebe, der einer außerordentlich hohen Umsatzrate unterliegt. Wenn also die Matrix aus Hyaluronsäure besteht, wird sie in der Wunde sehr rasch von der körpereigenen Hyaluronidase abgebaut. Daher werden erfindungsgemäß bevorzugt solche Derivate der Hyaluronsäure eingesetzt, die etwas langsamer im Körper abgebaut werden.
Ein besonderer Vorteil, der durch die Verwendung einer Trägermatrix erzielt werden kann, ist, daß Zellen auf die Wunde aufgebracht werden können, die noch keinen zusammengewachsenen Zellverband bilden. Wenn bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auch Keratinozyten eingesetzt werden, können diese mit Hilfe der Trägermatrix im subkonfluenten Zustand verwendet werden. Zu diesem Zeitpunkt befinden sie sich in ihrer optimalen Wachstumsphase , teilen sich noch sehr häufig und reagieren besonders gut auf die Zytokine, die von den gentransfizierten Fibroblasten produziert werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in einer bevorzugten Ausführungsfor auch Keratinozyten, und zwar bevorzugt autologe Keratinozyten umfassen. Die Keratinozyten bilden insbesondere die äußere Hautschicht, die sogenannte Epidermis. Keratinozytenkulturen können nach einer an sich bekannten Routinetechnik kultiviert werden [z.B. Rheinwald et al. Nature 265 (1977) S. 421-424]. Hierbei wird üblicherweise ein kleines Stück der Haut mittels Biopsie entfernt und dann werden Epidermis und Der is voneinander getrennt. Aus der Epidermis wird eine Zellsuspension hergestellt, vorzugsweise durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym. Die so erhaltenen einzelnen Zellen werden dann in Kulturbehältern (Flaschen oder Schalen) unter sterilen Bedingungen angezogen und zu einem geeigneten Zeitpunkt von den Kultivierungsbehältern abgelöst. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung weist genetisch veränderte Fibroblasten auf. Fibroblasten sind dem Mesenc ym entstammende Zellen mit einem großen Zelleib und einem etwas abgeplatteten Kern. Die Fibroblasten sind insbesondere an der Bildung der Interzellularsubstanz des Bindegewebes beteiligt. Erfindungsgemäß können entweder autologe Fibroblasten eingesetzt werden oder in einer bevorzugten Form werden allogene Fibroblasten verwendet, die von einem anderen Individuum, also nicht dem zu behandelnden Patienten stammen. Ganz besonders bevorzugt werden solche Fibroblasten eingesetzt, die klonal selektiert wurden, d.h. von einem Klon abstammen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die gentransfizierten Fibroblasten mit einer derartigen Dosis ionisierender Strahlen behandelt worden, daß sich die Fibroblasten nicht mehr vermehren können und nach einer gewissen Zeit absterben. Diese Bestrahlung hat den Vorteil, daß die gentransfizierten Zellen im Körper absterben, und zwar nach einer überschaubaren Zeit (< 3 Wochen). Ein weiterer Vorteil der Verwendung bestrahlter Fibroblasten besteht darin, daß die so behandelten Zellen das Zytokin weiterhin gut exprimieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäß Zellen von immortalisierten Fibroblastenzellinien verwendet, wobei sich eine Zellinie, die die Bezeichnung KMST-6 erhalten hat, besonders bewährt hat. Immortalisierte Fibroblastenzellinien sind vorteilhaft, da sie kontinuierlich kultiviert und biologisch genau charakterisiert verwendet werden können. Ohne Schwierigkeiten können aber auch andere geeignete immortalisierte Fibroblastenzellinien verwendet werden.
In die erfindungsgemäß eingesetzten Fibroblasten wird ein Fremdgen, das für ein geeignetes Zytokin kodiert, eingebracht. Bevorzugt handelt es sich bei diesem Fremdgen um ein Gen, das für ein Zytokin wie EGF, TGF-α oder KGF kodiert. Der epidermale Wachstumsfaktor (epidermal growth factor) wird kurz als EGF bezeichnet. Es handelt sich hierbei um ein globuläres Protein von etwa 6,2 kDa, das 53 Aminosäuren aufweist. Erfindungsgemäß ist es nicht unbedingt erforderlich, daß das vollständige Gen in die transfizierten Fibroblasten eingebracht wird; es ist ausreichend, wenn derjenige Teil eingeführt wird, der die biologische Aktivität aufweist. Um eine Sekretion des biologisch aktiven Peptids zu ermöglichen, ist der entsprechende cDNA-Anteil bevorzugt In-Leserahmen mit der sekretorischen Signalsequenz des humanen G-CSF fusioniert. Erfindungsgemäß werden bevorzugt auch EGF-ähnliche Proteine, wie beispielsweise der transformierende Wachstumsfaktor
( transforming growth factor) TGF-α, der eine hohe Homologie zu EGF aufweist, eingesetzt. Die biologische Aktivität von EGF und TGF-α ist vergleichbar. Beide Zytokine haben einen Einfluß auf die epidermale Entwicklung und die Differenzierung der Zellen.
Bevorzugt eingesetzt werden kann auch NGF (nerve growth factor). Dieses Zytokin ist vor allem verantwortlich für das Überleben, die Differenzierung und die funktioneile Aktivität von sensorischen und sympathischen Neuronen im peripheren Nervensystem. Der beschleunigende Effekt auf die Wundheilung dürfte auf die Fähigkeit von NGF zurückzuführen sein, das Überleben und die funktionellen Aktivitäten verschiedener immunkompetenter Zellen, wie Granulozyten, Mastzellen, Makrophagen und Ly phozyten zu steigern.
Ein weiteres bevorzugt eingesetztes Zytokin ist der Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), der insbesondere die Teilung von teilungsfähigen Keratinozyten stimuliert. Erfindungsgemäß können auch Varianten der Gene eingesetzt werden. Derartige Varianten können Deletionen oder Anfügungen aufweisen und die Sequenz kann gezielt verändert sein. Es ist auch durchaus möglich, solche Varianten von Zytokinen einzusetzen, die eine höhere biologische Aktivität aufweisen als die natürlich vorkommenden Zytokine, wie insbesondere Fusionskonstrukte von zwei oder mehr Zytokinen. Die erfindungsgemäß eingesetzten Fibroblasten enthalten ein Fremdgen, das für ein die Wundheilung förderndes Zytokin kodiert. Dieses Fremdgen kann bevorzugt vom Menschen, aber auch von einem Tier, wie beispielsweise Maus oder Rind stammen. Voraussetzung ist aber, daß das Zytokin dann nicht Speziesspezifisch ist, wenn das Fremdgen von einer anderen Spezies herstammt.
Es ist erforderlich, daß das Fremdgen in die Fibroblasten eingebracht wird. Dies kann dadurch bewirkt werden, daß das gewünschte Gen in einen geeigneten Vektor eingebaut wird und dann in die Fibroblasten transfiziert wird. Als Vektoren eignen sich virale Vektoren oder Plasmidvektoren, wobei die Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind, da bei viralen Vektoren zusätzliche Untersuchungen zum Ausschluß von Kontamination mit replikationskompetenten Viren durchgeführt werden müssen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weisen verschiedene Vorteile auf gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen.
Durch die genveränderten Fibroblasten, die in bevorzugter Ausführungsform lethal bestrahlt wurden, kann für eine vorbestimmte Zeit das oder die gewünschten Zytokine exprimiert und in das Gewebe abgegeben werden. Aufgrund der kontinuierlichen Produktion des Zytokins können die Probleme umgangen werden, die auf die kurze Halbwertszeit von Zytokinen bei lokaler externer Applikation zurückzuführen sind. Bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können verschiedene Zelltypen (Keratinozyten/Fibroblasten) miteinander kombiniert werden, wobei die gentransfizierten Fibroblasten auch unterschiedliche Zytokine beinhalten können. Dadurch können gezielt verschiedene Wachstumsfaktoren in den Wundbereich eingebracht werden. Wenn autologe Keratinozyten verwendet werden, kann die Histoinkompatibilitätsabstoßungsreaktion vermieden werden. Es ist auch denkbar, zusätzlich Gene für Wachstumsfaktoren einzuführen, die auf weiße Blutkörperchen wirken, wie beispielsweise G-CSF oder GM-CSF, um dadurch die körpereigene Immunabwehr in den Wundbereichen zu stimulieren. Dadurch kann die körpereigene Abwehr gegenüber Infektionen gestärkt werden, was insbesondere bei Verbrennungswunden relevant ist.
Es ist auch durchaus möglich, die erfindungsgemäße Zusammensetzung ohne Keratinozyten einzusetzen. In diesem Fall wird durch die genveränderten Fibroblasten das Zytokin in die Umgebung abgegeben und es werden diejenigen Keratinozyten des behandelten Patienten stimuliert, die sich beispielsweise in den Randbereichen der Wunde finden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen liegen bevorzugt in Form von pharmazeutisch annehmbaren Formulierungen vor. Hierbei kann es sich entweder um Suspensionen von Fibrinkleber und gentransfizierten Fibroblasten handeln, die als Lösungen, Suspensionen, Salben oder in Form von Gelen auf die Wunde aufgebracht werden können. Wenn es sich um eine Zusammensetzung handelt, die eine feste Komponente, also eine Trägermatrix aufweist, dann liegen diese Zusammensetzungen bevorzugt in Form von sterilen Einheiten vor, die in geeigneter Art und Weise konserviert werden. Derartige Präparate können beispielsweise in Form von tiefgefrorenen, sterilen Auflagen vorliegen.
Beschreibung der Figure
Figur 1 zeigt die Struktur des Expressionsvektors für humanes EGF. Teil (A) zeigt die Plasmidkonstruktion mit dem Chimären EGF-Gen. Teil (B) zeigt die Sequenz der Fusion im Leserahmen zwischen der humanen G-CSF-Signalsequenz (unterstrichen) und der reifen für humanes EGF kodierenden Region (Asn Ser Asp ...).
Figur 2 zeigt die Sekretion von EGF von Fibroblasten, die mit dem Plas id pCMV-EGF-IRES-TKNeo transfizierten wurden. Es handelt sich hierbei um Fibroblasten der Zellinie KMST-6 nach Bestrahlung (100 Gy) . Bei dem Versuch wurden 2 x 10 bestrahlte Zellen in Kulturplatten mit sechs Löchern ausgesät und die EGF- Konzentration wurde in Kulturüberständen nach 24 Stunden bestimmt. Die Werte stellen Durchschnittswerte dar.
Figur 3 zeigt die Bioaktivität von chimären EGF-Polypeptiden, die von den Klonen #3 und #6 von gentransfizierten KMST-6- Fibroblasten erhalten wurden.
Teil (A) zeigt die Bioaktivität an Mäusekeratinozyten vom Stamm BALB/MK.
Teil (B) zeigt die Ergebnisse, die mit Hilfe von menschlichen primären Keratinozyten erhalten wurden. Die Werte geben die Durchschnittsergebnisse von acht Messungen mit Standardabweichung an. Die gepunkteten Balken stellen die Eichkurve dar, die mit rekombinantem EGF erhalten wurden. Die leeren Balken stellen die Kontrollwerte dar, erhalten mit Fibroblasten der Zellinie KMST-6. Die gestreiften und grauen Balken stellen die Ergebnisse dar, die mit Kulturüberständen beider Klone 3 bzw. 6 erhalten wurden.
Figur 4 zeigt die Proliferation von primären menschlichen Keratinozyten im Kulturtest mit bestrahlten Fibroblasten der Zellinie KMST-6 , die gentransfiziert wurden.
Teil (A) zeigt die Ergebnisse nach vier Tagen Co-Kultur.
Teil (B) zeigt die Ergebnisse nach 10 Tagen Co-Kultur.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend aufgeführten Beispiele weiter erläutert:
Beispiel 1
Konstruktion eines Plasmids enthaltend ein Gen für EGF und Transfektion In den meisten menschlichen Zellen wird EGF als ein 130 kDa Transme branglycoprotein-Precursormolekül synthetisiert, das proteolytisch gespalten wird in das biologisch aktive 6,2 kDa EGF-Peptid mit 53 Aminosäuren. Erfindungsgemäß wurde daher ein chimäres Konstrukt hergestellt, das für eine In-Leserah en-Fusion des reifen EGF-Peptids und die menschliche G-CSF sekretorische Signalsequenz kodiert. Der Aufbau ist schematisch in Figur 1 (A) dargestellt. Das dabei entstandene DNA-Fusionsfragment wurde unter die transkriptioneile Kontrolle des menschlichen CMV (Cytomegalievirus) -Promotors gestellt und in einen dicistronischen Vektor eingebaut, um die Expression des Transgens an die des Selektionsmarkers Neomycin-Phosphor- Transferase zu binden.
Bei der Klonierung wurde die für das reife menschliche EGF- Peptid kodierende Sequenz mit Hilfe der PCR-Technologie amplifiziert und das dabei erhaltene Produkt in dem Vektor pBluescript (Stratagene) subkloniert und anschließend sequenziert. Ebenso wurde die menschliche G-CSF-Signalsequenz aus menschlicher G-CSF cDNA mit Hilfe der PCR-Technologie amplifiziert, wobei eine verbesserte Kozak-Konsensus-Sequenz am 5 ' -Ende und eine einzelne Nhel Restriktionsschnittstelle geschaffen wurden. Die relevante Sequenz ist in Figur 1 (B) dargestellt.
Das so erzeugte Plasmid wurde in menschliche Fibroblasten der Zellinie KMST-6 transfiziert und alle Neomycin-resistenten Klone sekretierten menschliches EGF, was durch einen ELISA-Test nachgewiesen wurde. Die Kontrolle zeigte, daß nicht transfizierte menschliche Fibroblasten der Zellinie KMST-6 keine nachweisbare Mengen an hEGF sowohl vor als auch nach Bestrahlung sekretierten.
Für die weiteren Untersuchungen wurden die Klone #3 und #6 verwendet, die 37 bzw. 8 ng EGF/106 Zellen und 24 Stunden sekretierten. Die Sekretion von menschlichem EGF in den Überstand durch transfizierte Fibroblasten wurde mit Hilfe der ELISA-Technik (Quantikine, R & D Systems) bestimmt. Es wurde der Überstand von bestrahlten oder nicht bestrahlten Ausgangszellen oder EGF-gentransfizierten Zellen nach 24 Stunden entnommen und hinsichtlich der EGF-Produktion untersucht, nachdem die Anzahl der lebensfähigen Zellen bestimmt wurde.
Eine Bestrahlung wurde bei Raumtemperatur mit einer 137Cs- Bestrahlungsquelle mit einer Dosisrate von 3 Gy/Minute durchgeführt.
Beispiel 2
Einfluß einer lethalen Bestrahlung auf die Expression von chimärem EGF-Protein durch gentransf izierte Fibroblasten
Für optimale Wundheilungsergebnisse ist es erforderlich, daß EGF in den ersten Tagen der Behandlung zur Verfügung steht. Andererseits kann durch eine lethale Bestrahlung das unkontrollierte in vivo-Wachstum von genetisch modifizierten Zellen verhindert werden. Es wurde daher der Einfluß einer lethalen Bestrahlung auf die Expression von EGF untersucht, wobei KMST-6 Fibroblasten (Klon #3, transfiziert mit dem Plasmid pCMV-EGF-IRES-TKNeo) untersucht wurden. Es wurde gefunden, daß nach Bestrahlung mit 100 Gy die Sekretion von EGF langsam absank, aber im Überstand über mindestens sieben Tage in vitro nachweisbar war. Die Ergebnisse sind in Figur 2 zusammengefaßt.
Beispiel 3
Biologische Aktivität des Chimären EGF-Polypeptids
Um nachzuweisen, daß das EGF-Protein, das von den transfizierten Fibroblasten sekretiert wird, auch tatsächlich die biologische Aktivität aufweist, wurden die Überstände der Medien von den EGF-gentransfizierten Klonen auf die mitogene Aktivität überprüft an permanenten Mäusekeratinozyten-Zellinien und an primären humanen Keratinozyten. Zur Kontrolle wurden verschiedene Konzentration von rekombinantem humanem EGF eingesetzt. Beide Zelltypen wurden sowohl durch das rekombinante Protein als auch durch die Kulturüberstände der Klone #3 und #6 in dosisabhängiger Weise stimuliert. Eine optimale Stimulation der Mäusekeratinozyten wurde bei einer Konzentration zwischen 2 und 20 ng/ml rekombinantem hEGF beobachtet. Dies entspricht der Stimulation, erreichbar durch eine 1:5 Verdünnung des Kulturüberstandes. Die Ergebnisse sind in Figur 3 (A) dargestellt.
Bei Verwendung von primären humanen Keratinozyten war die effektive Dosis geringfügig niedriger und es wurde eine optimale Proliferation bereits bei 0,2 ng/ml an rEGF und bei einer 1:50 Verdünnung des Kulturüberstandes des Klons pCMV-EGF-IRES- TKNeo/KMST6#3 beobachtet. Die Ergebnisse sind in Figur 3 (B) dargestellt. Bei beiden Tests konnte die Tendenz beobachtet werden, daß das Zellwachstu bei höheren Konzentrationen inhibiert wurde. Kulturüberstände von nicht transfizierten Fibroblasten der Zellinie KMST-6 zeigten keine Stimulierung der Proliferation im Vergleich mit Zellkulturüberständen ohne zugesetzten Wachstumsfaktor. Um die therapeutische Wirksamkeit bei der Wundheilung genauer zu untersuchen, wurden lethal bestrahlte EGF-gentransfizierte Fibroblasten in vitro co- kultiviert mit primären humanen Keratinozyten. Bei den Versuchen zeigte sich, daß nach einer Inkubationszeit von vier Tagen mit verschiedenen Konzentrationen von bestrahlten EGF sezernierenden Fibroblasten eine dosisabhängige Stimulation der Keratinozytenproliferation ähnlich derjenigen erhalten werden konnte, die durch rekombinanten Wachstumsfaktor induziert wurde. Dies ist in Figur 4 dargestellt, wobei Figur 4 (A) die Werte zeigt nach vier Tagen Co-Kultivierung und die Figur 4 (B) zeigt die Werte nach 10 Tagen Co-Kultivierung. Beispiel 4
Nachweis der in vivo EGF -Produktion durch in vitro liposomal transfizierte KMST-6 Zellen
Versuchsauf bau
1,5 x 1,5 cm große Vollhautwunden wurden auf dem Rücken von 42 Nacktmäusen erzeugt. 9,4 x 10 hEGF-transfizierte und letal bestrahlte KMST-6 Zellen wurden in 2,8 ml Fibrinkleber suspendiert und auf die Vollhautwunden von 14 Nacktmäusen
2 transplantiert (300 000 Zellen/cm , Gruppe I).
Als Kontrollen dienten 14 Vollhautwunden, transplantiert mit untransfizierten KMST-6 Zellen (300 000 Zellen/cm2, Gruppe II) sowie 14 unbehandelte Vollhautwunden (Gruppe III).
Am Tag 1, 2, 3, 4, 5, 7 und 14 wurden aus jeder Gruppe jeweils zwei Tiere nekropsiert und 0,8 g Wundgewebe mit einem Triton-X- PBS Puffer homogenisiert. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF-Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti- human-EGF ELISA ausgewertet.
.Ergebnisse
In vivo waren in der Gruppe I (erfindungsgemäß) am Tag 1 470 pg/ml detektierbar, verglichen mit 18 pg/ml in Gruppe II und 1,3 pg/ml in Gruppe III. An den Tagen 2-7 sanken die EGF- Konzentrationen in der Gruppe I, waren jedoch significant höher als in den Kontrollgruppen. Am Tag 14 war kein EGF in allen drei Gruppen detektierbar.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß in vitro EGF- transfizierte Fibroblasten in einer Fibrinkleber-Suspension erfolgreich transplantiert werden konnten. Das transgene Protein war zumindest bis Tag 7 in vivo nachweisbar. Die bei dem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßt.
Tabelle I
Tage pCMV-EGF-IRES- KMST6 unbehandelte TKNeo/KMST6#3 Kontrolle Vollhaut¬
(transplantiert wunden erfindungsgemäß mit untransfizierten (Gruppe III)
KMST6-Zellen,
Gruppe II )
1 470 18 1,3
2 393 58 1,6
3 330 28 2,3
4 150 8 6,5
5 180 8,5 8
7 140 8,3 2,6
14 0,4 0 0
Tabelle I zeigt die hEGF-Freisetzung in pg/ml in vivo in Wunden durch bestrahlte KMST6-Fibroblasten, die mit chimärem hEGF-Gen transfiziert wurden.
Beispiel 5
Wundheilungs fördernder Effekt nach Transplantation von in vitro EGF -transf izierten KMST-6 Zellen in Kombination mit humanen Keratinozyten (Mischzelltransplantation)
Versuchsaufbau
1,5 x 1,5 cm große Vollhautwunden wurden auf den Rücken von 72 Nacktmäusen erzeugt. 1,0125 x 10 EGF-transfizierte und letal bestrahlte KMST-6 Zellen wurden in Kombination mit 2,025 x 10 humanen Keratinozyten in 3,6 ml Fibrinkleber suspendiert und auf Vollhautwunden von 18 Nacktmäusen transplantiert (Ratio 1:2, 75 000 Zellen/cm2, Gruppe I). Als Kontrolle dienten 18 Vollhautwunden, transplantiert mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen alleine (25 000 Zellen/cm, Gruppe II), 18 Vollhautwunden, transplantiert mit humanener
2
Keratinozyten alleine (50 000 Zellen/cm , Gruppe III) sowie 18 Vollhautwunden transplantiert mit nicht transfizierten KMST-6
Zellen in Kombination mit humaner Keratinozyten (Ratio 1:2, 7 755 000000 ZZeelllleenn//ccm2, Gruppe IV). Tabelle II zeigt die Gruppenaufteilung.
Tabelle II
Am Tag 1, 3, 5, 7, 10 und 12 wurde aus jeder Gruppe jeweils ein Tier nekropsiert und 0 , 8g Wundgewebe mit einem Triton-X-PBS Puffer homogenisiert. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF-Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti-human- EGF ELISA ausgewertet. Die andere Hälfte der Biopsien wurde beginnend mit Tag 5 für die histologischen Untersuchungen verwendet .
An den post-OP-Tagen 7, 10, 12, 14, 17 und 21 wurden jeweils Biopsien von zwei weiteren Tieren aus jeder Gruppe histologisch untersucht.
Ergebnisse
Es war in der Gruppe I und II EGF detektierbar, jedoch nicht in Gruppe III und IV.
Bezüglich des Wundverschlusses zeigten die Ergebnisse in Gruppe I am Tag 7 bis 12 kontinuierlich eine fast komplette, ausgeprägte, ab Tag 14 eine komplette Epithelialisation. Die besten Ergebnisse bezüglich der Rekonstitutionsqualitat der Epidermis (Zellagigkeit des Epithels) zeigten auch die Wunden der Gruppe I. Die Kontrollgruppen dagegen zeigten erst am Tag 14 eine ausgeprägte Epithelialisation und am Tag 21 zeigten sie noch immer keine hochwertige Epithelialisation. In der Tabelle III ist die Epithelialisation tabellarisch dargestellt.
Tabelle III: Tabellarische Darstellung der Epithelialisation
Epithelialisation / Differentiation
keine Epithelialisation nachweisbar + beginnende Epithelialisation
++ ausgeprägte aber nicht vollständige Epithelialisation +++ vollständige Epithelialisation
Beispiel 6
Wundheilungsfördernder Effekt nach Transplantation von in vitro EGF-transf izierten KMST-6 Zellen im Großtiermodell
Versuchsaufbau
In einem Großtierversuch wurden Versuche an insgesamt 3 Schweinen (Pl, P2 , P3 ) mit insgesamt je 21 standardisierten
Verbrennungswunden (5 cm 2 groß, Grad 2a) durchgeführt. Bei einem Schwein (Pl) wurden 7 standardisierte Verbrennungswunden mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen in Fibrinkleber transplantiert (Therapiegruppe). Hier dienten 7 unbehandelte standardisierte Verbrennungswunden (Kontrollgruppe I) sowie 7 standardisierte Verbrennungswunden, die mit Fibrinkleber behandelt wurden (Kontrollgruppe III), als Kontrolle. Bei zwei weiteren Schweinen (P2, P3) wurden ebenfalls je 7 standardisierte Verbrennungswunden mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen in Fibrinkleber transplantiert (Therapiegruppe). Als Kontrolle dienten je 7 unbehandelte standardisierte Verbrennungswunden (Kontrollgruppe I) sowie je 7 standardisierte Verbrennungswunden, die mit nicht transfizierten KMST-6 Zellen transplantiert wurden (Kontrollgruppe II). Tabelle IV zeigt die Gruppenaufteilung.
Tabelle IV
Am Tag 1, 3, 5, 7, 10, 21 und 35 wurde aus jeder Gruppe jeweils eine Wunde biopsiert. 0,8g Wundgewebe von den Biopsien bis Tag 10 wurden mit einem Triton-X-PBS Puffer homogenisiert. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti-human-EGF ELISA ausgewertet. Weiterhin wurden die Biopsien histologisch ausgewertet.
Ergebnisse
Tabelle V zeigt EGF-Konzentrationswerte in von jeweils einer Wunde der Gruppen. Tabelle V EGF-Gewebekonzentrationen in pg / ml im GroBtierversuch

Claims

Patentansprüche
1) Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden, die Fibroblasten, die wenigstens ein Fremdgen kodierend für ein die Wundheilung förderndes Zytokin enthalten und wenigstens eine weitere die Wundheilung fördernde Komponente umfaßt.
2) Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die Wundheilung fördernde Komponente ein Fibrinkleber ist.
3) Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Fibrinkleber Fibrinogen und Fibronectin sowie gegebenen alls Albumin, Faktor XIII und Plasminogen umfaßt.
4) Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere die Wundheilung fördernde Komponente eine feste Komponente ist, die als Trägermatrix dient.
5) Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Komponente eine aus einem Hyaluronsäureester bestehende Trägermatrix ist.
6) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie auch Keratinozyten umfaßt.
7) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das für das Zytokin kodierende Gen ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend das Gen kodierend für den transformierenden Wachstums faktor α (TGF-α) , das Gen kodierend für den epidermalen Wachstums faktor (EGF), das Gen kodierend für den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF), das Gen kodierend für den Nervenwachstumsfaktor (NGF) und das Gen kodierend für den Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF) . 8) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten wenigstens ein weiteres Fremdgen, kodierend für ein Zytokin, das auf Blutzellen wirkt, umfaßt.
9) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das für das Zytokin kodierende Gen mit Hilfe eines Plasmidvektors in die Fibroblasten eingebracht wurde.
10) Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor eine In-Leserahmenfusion des Gens kodierend für das reife Zytokin und eine sekretorische Signalsequenz aufweist.
11) Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der sekretorischen Signalsequenz um die des menschlichen G-CSF Gens handelt.
12) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um autologe Fibroblasten handelt .
13) Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um allogene Fibroblasten handelt.
14) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten bestrahlt wurden.
15) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um klonal-selektierte Fibroblasten handelt.
16) Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den allogenen Fibroblasten um Fibroblasten der Zellinie KMST-6 handelt. 17) Verwendung von Fibroblasten, die wenigstens ein Fremdgen, kodierend für ein die Wundheilung förderndes Zytokin enthalten, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Wunden.
18) Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdgen ausgewählt ist unter den Genen kodierend für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den transformierenden
Wachstumsfaktor α (TGF-α) , den Nervenwachstumsfaktor , den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF) und den Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) .
EP98919236A 1997-04-17 1998-04-08 Fibroblasten mit einem fremdgen enthaltende zusammensetzung zur behandlung von wunden Withdrawn EP0975756A1 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19716098 1997-04-17
DE19716098A DE19716098A1 (de) 1997-04-17 1997-04-17 Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden
PCT/EP1998/002038 WO1998048012A1 (de) 1997-04-17 1998-04-08 Fibroblasten mit einem fremdgen enthaltende zusammensetzung zur behandlung von wunden

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0975756A1 true EP0975756A1 (de) 2000-02-02

Family

ID=7826816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98919236A Withdrawn EP0975756A1 (de) 1997-04-17 1998-04-08 Fibroblasten mit einem fremdgen enthaltende zusammensetzung zur behandlung von wunden

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0975756A1 (de)
JP (1) JP2002501491A (de)
AU (1) AU739125B2 (de)
CA (1) CA2286548A1 (de)
DE (1) DE19716098A1 (de)
IL (1) IL131636A0 (de)
WO (1) WO1998048012A1 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277368B1 (en) 1996-07-25 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Cancer immunotherapy using autologous tumor cells combined with cells expressing a membrane cytokine
AU5301100A (en) 1999-05-28 2000-12-18 Pacgen Technologies Llc A method of using autologous fibroblasts to promote healing of wounds and fistulas
DE10025609A1 (de) * 2000-05-24 2001-12-13 Univ Ludwigs Albert Transfektionssystem
WO2014105913A1 (en) * 2012-12-26 2014-07-03 The Regents Of The University Of California Cellular compositions for tissue engineering

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4609551A (en) * 1984-03-20 1986-09-02 Arnold Caplan Process of and material for stimulating growth of cartilage and bony tissue at anatomical sites
AU589438B2 (en) * 1985-08-26 1989-10-12 Hana Biologics, Inc. Transplantable artificial tissue and process
US5196196A (en) * 1986-06-03 1993-03-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Use of protease nexin-I in wound dressings
EP0555205B1 (de) * 1989-01-31 2000-11-29 RUBIN, Jeffrey S Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor
WO1992015676A1 (en) * 1991-03-08 1992-09-17 The Salk Institute For Biological Studies Somatic cell gene therapy
JP2829405B2 (ja) * 1991-10-14 1998-11-25 寳酒造株式会社 機能性ポリペプチド
EP0721351A4 (de) * 1993-09-07 1998-08-19 Sidney Kimmel Cancer Ct Dem haplotypangepasste, cytokine sekretierende zellen und methoden zum stimulieren einer immunantwort
DE4406073A1 (de) * 1994-02-24 1995-08-31 Univ Ludwigs Albert Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten, Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten und so erhaltene Fibroblasten

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9848012A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE19716098A1 (de) 1998-10-22
JP2002501491A (ja) 2002-01-15
AU7215098A (en) 1998-11-13
CA2286548A1 (en) 1998-10-29
WO1998048012A1 (de) 1998-10-29
IL131636A0 (en) 2001-01-28
AU739125B2 (en) 2001-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69435096T2 (de) Zusammensetzung zur in vivo erzeugung von therapeutischen produkten
DE69233022T2 (de) Rekombinante knochenmorphogenetische protein heterodimere, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung
Li et al. Nerve conduit filled with GDNF gene‐modified schwann cells enhances regeneration of the peripheral nerve
EP1699915B1 (de) Verwendung des erythropoietins zur regeneration von lebergewebe
Liu et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells expressing the bFGF transgene promote axon regeneration and functional recovery after spinal cord injury in rats
RU2001133453A (ru) Композиции, содержащие кондиционированную клеточную культуральную среду, и способы их использования
DE69836139T2 (de) Verfahren zur behandlung von vaskulären proliferativen erkrankungen mit p27 und fusionen davon
EP1100878A2 (de) Genetisch modifizierte cd34-negative, adhärent wachsende stammzellen und deren verwendung in der gentherapie
DE69532857T2 (de) Neurotrophischer AL-1 Faktor, einer Ligand verwandt mit dem EPH Tyrosine Kinase Receptor
DE69534165T2 (de) Adenovirus mit glutathion peroxydate gene
WO2003015803A1 (de) Zellzusammensetzungen zur behandlung von osteoarthrose, sowie verfahren zu deren herstellung
EP0893493A2 (de) Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen
DE69531712T2 (de) Hybridgel, das eine biologisch aktive Substanz sekretiert
EP0748374A1 (de) Verfahren zur herstellung von klonogenen fibroblasten, verfahren zur gentransfizierung von fibroblasten und so erhaltene gentransfizierte fibroblasten
DE69731660T2 (de) Insulinähnlicher wachstumfaktor i (igf-i) expressionssystem und methode zur verwendung
DE69821793T2 (de) Neuronale verwendungen des bmp-11
DE69632967T2 (de) Verfahren zur Verhinderung der Transplantabstoßung bei einer Transplantation und zur Herstellung einer universalen Gentherapie-Wirtszelle unter Anwendung von Lymphocyten-Aktivierungsgen (LAG-3)
EP0121764A2 (de) Polypeptide
DE69732616T2 (de) Erhöhung der Migration oder Proliferation von Keratinocyten
WO1998048012A1 (de) Fibroblasten mit einem fremdgen enthaltende zusammensetzung zur behandlung von wunden
DE69938130T2 (de) Neue peptide
DE69832880T2 (de) Frazzled nukleotidsequenzen, expressionsprodukte, zusammensetzungen und verwendungen
DE60114193T2 (de) Transfektionssystem
De Stefano et al. Therapeutic approaches enhancing peripheral nerve regeneration
DE60208066T2 (de) Promotoren zur kontrolle der zelldifferenzierung

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19990903

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB IE IT LI NL PT SE

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20031001