DE69938130T2

DE69938130T2 - Neue peptide

Info

Publication number: DE69938130T2
Application number: DE69938130T
Authority: DE
Inventors: Raphael Gorodetsky; Gerard New York MARX
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co; Vi Technologies Inc New York; VI Technologies Inc
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co; Vi Technologies Inc New York; VI Technologies Inc
Priority date: 1998-05-27
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2019-05-27
Also published as: EP1082126A1; AU4203199A; IL139604A; ATE385805T1; CA2343317A1; WO1999061041A1; EP1082126B1; AU766679B2; EP1082126A4; IL139604A0; DE69938130D1; JP2003517809A

Description

GEBIET UND HINTERGRUND
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Peptide und insbesondere neuartige Peptide, die zu einem Teil den Carboxytermini von Fibrinogen homolog sind, sowie potenzielle Verwendungen dieser Peptide.
Fibrinogen ist das Plasmaprotein, das das Gerinnsel bildet, wenn Blut koaguliert. Viele Studien waren auf die Aminosäuresequenzen und die Struktur von Fibrinogen gerichtet (Mosesson, M. und Doolittle, R. (Eds.) "The biology of fibrinogen and fibrin", Ann. N. Y. Acad. Sci., 408, 1983, Henschen, A. et al., "Structure of fibrinogen", Ann. N. Y. Acad. Sci., 408, 1983, Spraggon, G. et al., "Crystal structure of fragment D from human fibrinogen and its cross-linked counterpart from fibrin", Nature, 389: 455–462, 1997, Murakawa, M. et al., "Diversity of primary structures of the carboxy-terminal regions of mammalian fibrinogen Aa-chains", Thromb. & Haemostat., 69: 351–360, 1993). Normalerweise weist Fibrinogen selbst ein Molekulargewicht von 340 kDa auf und es besteht aus zwei Sätzen aus jeweils drei Peptidketten, die α, β und γ genannt werden. Die einzelnen Ketten des Fibrinogens sind zwischen den Arten hoch konserviert. Neuere Arbeiten haben auch ein Fibrinogen Protein mit längerer α Kette beschrieben, das αE Fibrinogen genannt wird und begleitend ein höheres Molekulargewicht von 420 kDa aufweist und eine Rolle in der Entwicklung spielt (Fu, Y. und Grieninger, G. "Fib420: A normal human variant of fibrinogen with two extended a chains", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2625–2628, (1994), Fu, Y, et al., "Carboxyterminal-extended variant of the human fibrinogen α subunit: A novel exon conferring marked homology to β and γ subunits" Biochem., 31: 11968–11972, (1992)). Daraus ergeben sich vier Typen von Fibrinogenketten, α, β, γ und αE, jeweils mit 610, 410, 391 bzw. 1096 Aminosäuren.
Fibringerinnsel werden in vivo an Bereichen von verletztem Gewebe gebildet, basierend auf der Reaktion von Fibrinogen und Thrombin in Gegenwart von Calciumionen. Diese Gerinnsel spielen eine Hauptrolle bei der Hämostase. Nach der Gerinnselbildung dient Fibrin als provisorische Matrix für die Rekrutierung von Zellen in das Wundbett. Normaler weise sind die ersten Zellen, die in das Wundbett mobilisiert werden, Entzündungszellen, so wie Leukozyten und insbesondere Makrophagen. Als Begleiterscheinung ihrer Durchdringung in das Fibrin nehmen diese Entzündungszellen bei der Lyse des Fibrins durch Erzeugen von Plasmin, Metalloproteinasen (MIPS) und/oder freien Radikalen teil. Daher enthält das Wundbett beträchtliche Mengen von Peptiden A und B (FPA und FPB), die während des Fortschreitens der Koagulation durch Thrombin freigesetzt werden, gefolgt von zahlreichen Abbauprodukten, die durch lytische Enzyme oder freie Radikale erzeugt wurden (Gray, A. J., Reeves, J. T., Harrison, N. K., Winlove, P. und Laurent, G. J., "Growth factors for human fibroblasts in the solute remaining after clot formation", J. Cell Sci., 96: 271–274, (1990), Marx G. "Immunological monitoring of Fenton fragmentation of fibrinogen", Free Radicals Res. Comm. 12: 517–520 (1991), Francis, C. W., Marder, V. J. und Barlow, G. H., "Plasmic degradation of cross-linked fibrin", J. Clin Invest., 66: 1033–1043, (1980), Cottrell, B. A. und Doolittle, R. F. "The amino acid sequence of a 27-residue peptide released from a-chain carboxy-terminus during the Plasmic digestion of human fibrinogen", Acad. Press., 71: 754–766, (1976)).
Anschließend folgt den Entzündungszellen die Migration von Zellen der mesenchymalen Linie, so wie Fibroblasten, die das Fibrin weiter verdauen und es mit extrazellulärer Matrix (ECM) ersetzen. Endothelzellen infiltrieren ebenfalls das Wundbett und erzeugen Mikrokapillarstrukturen. Letztendlich ersetzen diese Zellen die provisorische Fibrinmatrix mit Granulationsgewebe, das durch parenchymale Zellen und dem Gefäßsystem innerhalb der ECM bevölkert wird.
Die Anhaftungs- bzw. Anlagerungs- und die migratorischen Antworten von Zellen werden durch spezifische Rezeptoren (Integrine) oder intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAM) gesteuert, die mit den Zellmembranrezeptoren interagieren, die entweder migratorische Reaktionen oder Zelladhäsion an die Matrix auslösen. Diese Interaktionen können andere regulatorische Mechanismen der Zellaktivität, Migration oder Proliferation auslösen. Wachstumsfaktoren und Cytokine aktivieren diese Zellrezeptoren dadurch, dass sie an ihnen binden und dadurch diese zellulären Antworten auslösen.
Cytokine unterschiedlicher Klassen regulieren die zelluläre Aktivität und Antworten, steuern das Überleben der Zelle, deren Wachstum und Differenzierung. Abgesehen von klassischen endokrinen Hormonen umfassen Cytokine die Familien der Zellregulatoren, die abwechselnd als Wachstumsfaktoren, Interleukine, Lymphokine und Interferone bekannt sind.
Alle bisher beschriebenen Cytokine bestehen aus mehr als 50 Aminosäuren (aa), die meisten sind 100 aa lang. Basierend auf Röntgenkristallstrukturanalysen zeigen Cytokine acht strukturelle Gruppen (Nathan C. & Sporn M., "Cytokines in context", J. Cell. Biol. 113: 981–986 (1991)) und binden an eine Vielzahl von zellulären Rezeptoren so wie an Integrine oder an Interferon Rezeptoren. Das Binden an Zellrezeptoren löst eine Kaskade von Ereignissen aus, die zu einer intrazellulären Phosphorylierung von Proteinen führt, die in Genexpression, Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Veränderungen in der Zellform, Beweglichkeit und Apoptose umgewandelt wird. Deshalb spielen Cytokine bei physiologischen Prozessen wie der Entwicklung und der Wundheilung eine wichtige Rolle.
Humane Fibroblasten sind die zellulären Hauptgebilde, die für die Regeneration der extrazellulären Matrix innerhalb des Wundbetts verantwortlich sind. Humane Fibroblasten exprimieren auch spezifische Membranrezeptoren für Fibrinogen und Thrombin. Im Fall von Hautwunden gestalten Fibroblasten die Matrix der Dermis neu. Beispielsweise werden humane Fibroblasten während des Heilungsverlaufs einer Schnittwunde der Haut aus dem umgebenden Gewebe mobilisiert und begeben sich in das Fibringerinnsel, unterstützen beim Auflösen des Gerinnsels und erzeugen dann die Kollagene in der extrazellulären Matrix und gestalten sie ebenfalls neu. Basierend auf diesen Eigenschaften der humanen Fibroblasten wurde vorgeschlagen, dass Fibroblast-Implantate das Heilungsverfahren verletzter bzw. beschädigter Haut ergänzen können (Gorodetsky, R. et al., Radiat. Res., 125: 181–186, 1991).
Ein Beispiel dieses Ansatzes ist die Verwendung von Blättern bzw. Schichten bzw. Folien mit benzoylierter Hyaluronsäure (HA), die Löcher oder Poren als Träger für Fibroblasten und Keratinozyten zur Wundheilung aufweisen (Andreassi, L., et al., Wounds, 3: 116–126, 1991). Insbesondere wurden HA-Folien mit derartigen Zellen kultiviert, die innerhalb der Porenstruktur wuchsen. Diese Folien wurden dann auf den Ort bzw. die Stelle der Brandverletzung angeheftet, wo die Zellen aus der Folie herauswanderten und letztendlich die Wundheilungsrate beschleunigten. Ein Hauptproblem mit implantierten HA-Folien liegt jedoch darin, dass sie durch Gewebe nicht verstoffwechselt werden, mechanisch schwer zu verabreichen sind und auf lange Sicht unerwünschte immunologische Wirkungen hervorrufen können.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben vor kurzem herausgefunden, dass Fibrinmikrokügelchen (FMB) chemotaktische und proliferative Wirkungen in Bezug auf bestimmte Typen von Zellen besitzen. Diese Zellen beinhalten Fibroblasten und Endothelzellen glatter Muskulatur, aber typischerweise nicht Keratinozyten. Es wurde gezeigt, dass die Zellen mittels Chemotaxis in diese Kügelchen wandern und dann innerhalb der Kügelchen proliferieren. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Zellen über ausgedehnte Zeiträume stabil blieben, wenn sie innerhalb der Fibrin-Mikrokügelchen kultiviert wurden. Daher scheinen die Fibrin-Mikrokügelchen sowohl die Chemotaxis der Zelle, als auch das Zellwachstum zu stimulieren.
Jedoch weisen die Fibrin-Mikrokügelchen selbst aufgrund ihrer Struktur inhärent Begrenzungen auf. Mit anderen Worten sind die Fibrin-Mikrokügelchen insbesondere nur als dreidimensionale Strukturen aus vernetztem Fibrin(ogen) nützlich. Falls andere Strukturen erwünscht wären und insbesondere falls die Abwesenheit eben dieser Struktur erwünscht wäre, wären Fibrin-Mikrokügelchen nicht besonders nützlich. Des Weiteren waren Fibrin-Mikrokügelchen beim Meiden der Verwendung von Plasmaproteinen nicht besonders nützlich.
Ein nützlicherer Ansatz würde die kleinsten Fibrin(ogen)-Komponenten identifizieren, die für die erwünschten chemotaktischen und Haptotaxis Eigenschaften verantwortlich sind. Es wurde versucht, diese kleinen Komponenten innerhalb des größeren Fibrin(ogen)moleküls zu finden. Es existiert sehr viel Literatur, die die Bindung von Fibrinogen (γ 400–411) an Thrombozyten durch den GPIIb/IIIa Rezeptor (siehe beispielsweise Savage B., Bottini E. & Ruggeri ZM., "Interaction of integrin alpha IIb beta with multiple fibrinogen domains during platelet adhesion", J. Biol. Chem. 270: 28812–7 (1995)) und die Anhäufungsaktivität des Amino-Bβ 15-42-Terminus beschreibt, der nach der Freisetzung von Fibrinopeptid B freigelegt wird. Zusätzlich wurde ein Peptid synthetisiert, das die 16 Aminosäuren der Sequenz des g-Carboxyterminus von Fibrinogen enthält, und es wurde herausgefunden, dass es an das Integrin der Thrombozyten bindet (D'Souza, S. E. et al., J. Biol. Chem., 265: 3440–3446, 1990). Jedoch wurden die biologischen Aktivitäten von lediglich einigen wenigen anderen Fibrinogen-Abbauprodukten untersucht. Die Aktivität dieser verschiedenen Abbauprodukte scheint weitgehend variabel zu sein.
Beispielsweise wurde berichtet, dass Fragment E angiogene Eigenschaften aufzeigt und die Wanderung von Endothelzellen in einem chemotaktischen Assay bzw. Test mit einer Boydenkammer inhibiert (Thompson, W. D., Smith, E. B., Stirk, C. M., Marshall, F. I., Stout, A. J. und Kocchar, A., "Angiogenic activity of fibrin degradation products is located in fibrin fagment E", J. Pathol., 168: 47–53 (1992)). Es wurde berichtet, dass Fragment D die Ablösung von kultivierten Endothelzellen von dem Substrat der extrazellulären Matrix (ECM) in einem Prozess verursacht, der sowohl konzentrations- als auch zeitabhängig war (Savage B., Bottini E. & Ruggeri ZM., "Interaction of integrin alpha IIb beta with multiple fibrinogen domains during platelet adhesion", J. Biol. Chem. 270: 28812–7 (1995)). Es wurde beobachtet, dass isolierte Bestandteilketten von Fibrinogen (Aα1, Aα2 und Bβ), die nach der Aktivierung des Fibrinogens durch Thrombin frei gesetzt wurden, die Fibroblastenproliferation um 23 bis 31% gegenüber den Kontrollen steigern, wohingegen die isolierte γ-Kette keine Wirkung aufzeigte (Gray, A. J., Bishop, J. E., Reeves, J. T. und Laurent, G. J.; "Aα and Bβ Chains of fibrinogen stimulate proliferation of human fibroblasts", J. Cell Sci., 104: 409–413, (1993)). Es wurde gezeigt, dass humane polymorphkernige Leukozyten (PMN) mit Fibrin(ogen) beschichtete Oberflächen über einen Typ 3 (CD11b/CD18) komplementären Rezeptor, der homolog zu dem GPIIb/IIIa Rezeptor ist, durch ein Dekamer des γ-Ketten Carboxyterminus (LGGAKQAGDV) binden. Es wurden vasoaktive Peptide identifiziert, die den Resten 43–47 der Bβ-Kette und 220–230 der Aα-Kette entsprechen (Gray, A. J., Bishop, J. E., Reeves, J. T. und Laurent, G. J.; "Aα and 130 Chains of fibrinogen stimulate proliferation of human fibroblasts"; J. Cell Sci., 104: 409–413, (1993)).
Fibrinogen selbst beeinflusste die Zellproliferation nicht signifikant, wenn es an Sepharose-Kügelchen gebunden war, übte allerdings haplotaktische bzw. haptotaktische/adhäsive Aktivität mit humanen (HF) oder Maus-(MF)Fibroblasten, Endothelzellen (EC) und glatten Muskelzellen (SMC) aus. Eine Thrombinbehandlung von Fibrinogen-Sepharosekügelchen (FB), die das Carboxyende des Moleküls nicht beeinflussen würden, veränderte die zellulären Antworten nicht, obwohl Plasmin, das die gamma-Carboxyenden abknipst und D-Domänensequenzen verdaut, nahezu die gesamten Zellen anziehenden Eigenschaften von FB aufhob.
Es wurde angenommen, dass bestimmte Teile bzw. Bereiche des Fibrinmoleküls Zellbindende Eigenschaften aufzeigen. Jedoch wurde die Identität aller Segmente, die für die chemotaktischen und Zell proliferativen Wirkungen von Fibrin(ogen) verantwortlich sind, nicht bestimmt. Die Identifizierung derartiger Segmente würde einen spezifischeren Eingriff in den Wundheilungsprozess und in die Entwicklung von neuen therapeutischen Zusammensetzungen oder Einrichtungen erlauben. Des Weiteren könnten neue diagnostische Versuche potenziell entwickelt werden, die beispielsweise auf der Antwort oder auf einem Ausbleiben der Antwort von Zellen auf die Wirkungen derartiger Segmente basieren. Daher hätte die Identifizierung dieser spezifischen Segmente oder Peptide, die eine zelluläre Aktivität aufzeigen, einen großen Nutzen.
Daher gibt es einen anerkannten Bedarf an einem Peptid oder Peptiden mit spezifisch bestimmten zellulären Wirkungen, so wie auf Zellen proliferative und chemotaktische Eigenschaften, die nicht die Anwesenheit des gesamten Fibrinmoleküls erfordern, um die zellulären Wirkungen zu entfalten, und es wäre höchst vorteilhaft ein derartiges Peptid oder derartige Peptide zu haben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Peptide mit neuartigen Aminosäuresequenzen bereitzustellen, die in den Carboxytermini von Fibrinogen vorkommen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung derartige Peptide bereitzustellen, die für pharmazeutische Zusammensetzungen nützlich sind.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung derartige Peptide bereitzustellen, die für Zellkulturen und die Zelltrennung nützlich sind.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung derartige Peptide bereitzustellen, die für neuartige Zellstrukturen nützlich sind, einschließlich biomedizinischen Einrichtungen.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden Beschreibung, den Figuren und den Ansprüchen detaillierter beschrieben.
Die neuartigen Peptidsequenzen der vorliegenden Erfindung sind homolog zu Bereichen des Fibrinmoleküls, bewahren allerdings gewünschte Eigenschaften des gesamten Moleküls, so wie beispielsweise auf Zellen adhäsive Wirkungen. Diese Peptide sind KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ (Peptid-09) und haptotaktische Fragmente davon.
Gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid bereitgestellt, das von Fibrinogen abgeleitet ist und aus einer Kette aus Aminosäuren besteht, die die Sequenz KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ aufweist oder ein haptotaktisches Fragment davon ist.
Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die das Peptid umfasst. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Ebenfalls bevorzugt umfasst die Zusammensetzung weiterhin ein biologisches Agenz bzw. Mittel, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Arzneistoffen, Vitaminen, Vitaminderivaten, Wachstumsfaktoren, Glucocorticosteroiden, Steroiden, Antibiotika, Toxinen, Enzymen, Enzyminhibitoren bzw. -hemmstoffen, Immunmodulatoren, Immunglobulinen und Fragmenten davon, Fettsäurederivaten, Polysacchariden, Zellrezeptor-Bindemoleküle, Antientzündlichen bzw. Anti-entzündlichen Mitteln, Nukleinsäuren und Polynukleotiden.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung weiterhin eine Zelle, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten, Endothelzellen, Chondrozyten, Neuroblastomzellen, Nierenzellen, Leberzellen, Pankreaszellen, Thyroid- bzw. Schilddrüsenzellen, Gliazellen, glatten Muskelzellen, Mammacarcinomzellen der Maus, Knochen- oder Knorpel bildenden Zellen und Kombinationen davon. Vorzugsweise wird der Zelltyp ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten, glatten Muskelzellen, Endothelzellen, Chondrozyten und Kombinationen davon. Mehr bevorzugt ist die Zelle ein Fibroblast.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Förderung der Heilung einer Wunde in einem Subjekt bzw. Individuum, welches die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Zusammensetzung, die das Peptid aufweist und (b) Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge der Zusammensetzung an die Wunde des Individuums. Vorzugsweise beinhaltet die Zusammensetzung weiterhin ein biologisches Agenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arzneistoffen, Vitaminen, Vitaminderivaten, Wachstumsfaktoren, Glucocorticosteroiden, Steroiden, Antibiotika, Toxinen, Enzymen, Enzyminhibitoren, Immunmodulatoren, Immunglobulinen und Fragmenten davon, Fettsäurederivaten, Polysacchariden, Zellrezeptor-Bindemoleküle, Anti-entzündlichen, Nukleinsäuren und Polynukleotiden.
Ebenfalls bevorzugt beinhaltet die Zusammensetzung weiterhin eine Zelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten, Endothelzellen, Chondrozyten, Neuroblastomzellen, Nierenzellen, Leberzellen, Pankreaszellen, Thyroidzellen, Gliazellen, glatten Muskelzellen, Mammacarcinomzellen der Maus, Knochen oder Knorpel bildenden Zellen und Kombinationen davon.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung der Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments für die Begünstigung bzw. Förderung der Heilung einer Wunde in einem Individuum.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zellstruktur bereitgestellt, umfassend: (a) das Peptid, (b) eine an das Peptid gebundene Zelle, und (c) eine Struktur zum Stützen der Zelle, wobei das Peptid an der Struktur angebracht bzw. angehaftet ist, so dass die Zelle durch die Struktur gestützt wird. Vorzugsweise ist die Struktur eine biomedizinische Einrichtung. Mehr bevorzugt ist die biomedizinische Einrichtung eine Prothese. Ebenfalls mehr bevorzugt ist die Struktur ein Gel. Alternativ und mehr bevorzugt ist die Struktur eine Folie bzw. Schicht aus Kollagen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zum Abschätzen der Bindung an einen Rezeptor bereitgestellt, umfassend: (a) das Peptid und (b) einen Reporter bzw. Übermittler zum Übertragen eines Signals, worin eine Fähigkeit des Peptids an den Rezeptor zu binden gemäß dem Signal bestimmt wird, das durch den Reporter übertragen bzw. übermittelt wird. Vorzugsweise wird der Reporter ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem fluoreszenten Rest und einem radioaktiven Rest. Ebenfalls bevorzugt ist der Reporter ein Protein. Ebenfalls bevorzugt ist der Reporter ein integraler Teil einer Zelle.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Bindung eines Peptids an einen Rezeptor bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen des mit einem Reporter zur Übertragung eines Signals markierten Peptids, (b) in Kontakt bringen des Peptids mit dem Rezeptor und (c) Bestimmen der Bindung des Peptids an den Rezeptor gemäß dem durch den Reporter übertragenen Signal.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Abtrennung bzw. zum Separieren einer Zelle aus einem Gemisch bereitgestellt, wobei die Zelle in der Lage ist, an ein Peptid zu binden, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Inkubieren des Gemisches mit dem Peptid, so dass sich die Zelle an das Peptid bindet und (b) Entfernen des Peptids aus dem Gemisch auf eine derartige Weise, dass die Zelle aus dem Gemisch separiert wird. Vorzugsweise ist das Peptid an einem Stützelement bzw. Träger angebracht, so dass der Schritt des Entfernens des Peptids ausgeführt wird, indem das Stützelement und das Gemisch separiert werden. Mehr bevorzugt ist das Stützelement eine Gelchromatographiematrix.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform wird ein System zum Kultivieren bzw. zur Bildung einer Kultur einer Zelle bereitgestellt, die in der Lage ist, an ein Peptid zu binden, umfassend: (a) eine Struktur zum Befestigen des Peptids, so dass die Zelle an das Peptid bindet und auf der Struktur wächst und (b) ein Kulturmedium zum in Kontakt bringen mit der Zelle, um der Zelle die Ernährung bzw. Versorgung bereitzustellen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Polymer bereitgestellt, umfassend: (a) mehrere Untereinheiten, wobei jede Untereinheit mindestens ein derartiges Peptid aufweist und (b) mehrere Verbindungsreste bzw. Verbindungsanteile, um jede der mehreren Untereinheiten an einer anderen der mehreren Untereinheiten zu befestigen bzw. anzubringen und damit das Polymer zu bilden. Vorzugsweise umfasst die Untereinheit mindestens ein Peptid, so dass das Polymer ein Peptidpolymer ist.
Nachstehend betrifft der Begriff "Wundheilungszellen" solche Zellen, die die Heilung einer Wunde fördern, einschließlich aber nicht begrenzt auf Fibroblasten, Endothelzellen, der glatten Muskulatur und Keratinozyten.
Der Begriff "Fibrin(ogen)" ist im Stand der Technik als ein Gemisch aus Fibrin und Fibrinogen bekannt und er wird hier gemäß dieser Definition verwendet. Nachstehend betrifft der Begriff "biologisch aktiv" Moleküle oder Komplexe davon, die in der Lage sind, eine Wirkung in einem biologischen System auszuüben. Nachstehend betrifft der Begriff "Fragment" einen Teil eines Moleküls oder eines Komplexes davon, in dem der Teil im Wesentlichen weniger als die Gesamtheit des Moleküls oder des Komplexes davon beinhaltet.
Nachstehend betrifft der Begriff "Aminosäure" sowohl natürliche, als auch synthetische Moleküle, die in der Lage sind, untereinander eine peptidische Bindung zu bilden. Nachstehend betrifft der Begriff "natürliche Aminosäure" alle natürlich auftretenden Aminosäuren, einschließlich sowohl reguläre als auch nicht reguläre Aminosäuren. Nachstehend betrifft der Begriff "reguläre natürliche Aminosäure" solche Aminosäuren, die normalerweise als Komponenten eines Proteins verwendet werden. Nachstehend betrifft der Begriff "nicht reguläre Aminosäure" natürlich vorkommende Aminosäuren, die von Säugetieren oder Nicht-Säugetier Eukaryoten, oder von Prokaryoten hergestellt werden, die normalerweise nicht als Komponente eines Proteins von Eukaryoten oder von Prokaryoten verwendet werden. Nachstehend betrifft der Begriff "synthetische Aminosäure" alle Moleküle, die künstlich hergestellt werden und die in Eukaryoten oder Prokaryoten nicht natürlich vorkommen, die aber die vorstehend definierten erforderlichen Eigenschaften einer Aminosäure erfüllen. Nachstehend beinhaltet der Begriff "Peptid" sowohl eine Kette einer Sequenz aus Aminosäuren, als auch Analoge und Mimetika, die eine im Wesentlichen ähnliche oder identische Funktionalität davon aufweisen, einschließlich Analoge, die synthetische oder natürliche Aminosäuren aufweisen. Wie nachstehend in Tabelle 1 gezeigt ist, weist das Peptid-07 die Aminosäuresequenz des C-Terminus der alpha-Kette von Fibrinogen auf.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird hier lediglich als Beispiel mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, worin:
1 das Ausbleiben der proliferativen Wirkung von Peptiden der vorliegenden Erfindung auf Mausfibroblasten (MF) zeigt, wobei 1A das Ausbleiben der Wirkung für Peptid-07 zeigt, 1B für Peptid-09, 1C für Peptid-71 und 1D für Peptid 70;
2 die haptotaktische Wirkung (Anhaftung) der kovalent an Sepharose-Kügelchen (SB) gebundenen Peptide der vorliegenden Erfindung für verschiedene Zelltypen zeigt, wobei 2A den Grad der Anhaftung von SB-07, SB-09, SB-Fibronektin oder SB-Albumin an Maus- und humanen Fibroblasten zeigt, 2B die haptotaktische Wirkung von SB-07, SB-09, SB-Fibronektin oder SB-Albumin auf glatte Muskelzellen zeigt und 2C die haptotaktische Wirkung von SB-07 oder SB-71 auf glatte Muskelzellen und humane Fibroblasten zeigt;
3 die prozentualen Anhaftungen von verschiedenen Zelltypen zeigt, die an SB-Peptiden der vorliegenden Erfindung getestet wurden;
4 die Bindung und die Aufnahme durch Fibroblasten des Menschen von mit FITC markiertem Peptid-71 nach einer Stunde (4A und 4B) und zwei Stunden (4C-E) Inkubation, sowie die Konzentrationsabhängigkeit der Aufnahme von mit FITC markiertem Peptid-09 von EC-Zellen zeigt; und
5 die FACS Analyse von mit FITC markierten Peptiden-09 (5A–5C), 70 (5E), 71 (5D) und 07 (5F) zeigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Peptide und Nukleotidsequenzen und insbesondere neuartige Peptidaminosäuresequenzen und äquivalente Nukleotidsequenzen, sowie die potenziellen Verwendungen dieser Sequenzen. Beispielsweise weisen diese Peptidsequenzen potenzielle medizinische Verwendungen auf, so wie für therapeutische und diagnostische Verwendungen. Die Peptidsequenzen sind homolog zu Bereichen des Fibrinmoleküls, bewahren allerdings gewünschte Eigenschaften des gesamten Moleküls, so wie beispielsweise Zell-adhäsive bzw. an Zellen anhaftende bzw. adhäsive Wirkungen.
Insbesondere sind diese Peptide carboxyterminale Fibrinogensequenzen, besonders die terminalen 20 Aminosäuren der Carboxyenden der α, β und γ-Ketten von normalem Fibrin(ogen), sowie die der vor kurzem gefundenen αE-Kette, dem so genannten verlängerten αE-Segment (αE) (Fu, Y. und Grieninger, G. "Fib₄₂₀: A normal human variant of fibrinogen with two extended α chains", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2625–2628, (1994)). Sequenzen derartiger Peptide sind im Folgenden in Tabelle 1 wiedergegeben. Sequenz 09 ist erfindungsgemäß, die anderen sind Vergleiche. Tabelle 1. Synthetische Peptide, die den Carboxytermini von Fibrinogen entsprechen.
Nachstehend betrifft der Begriff "Peptid" die Peptide-09, 70 oder 71, die eine Sequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ, LTIGEGQQHHLGGAKQAGDV oder RGADYSLRAVRMKIRPLVTQ, sowie Analoge Äquivalente oder Peptidmimetika davon oder Fragmente davon, die eine im Wesentlichen identische oder ähnliche funktionale Aktivität aufweisen, wie eine der vorstehend aufgeführten Sequenzen. Der Begriff "Peptide der vorliegenden Erfindung" betrifft Peptide, wie sie in und durch die anhängigen Ansprüche definiert sind, sowie Vergleichspeptide.
Die mitogenen Effekte bzw. Wirkungen dieser Peptide wurden in Zellkultursystemen getestet. Mit Peptid-07 wurden keine Effekte beobachtet. Außerdem wies lediglich Peptid-71 proliferative Effekte auf. Diese Peptide wurden ebenfalls hinsichtlich ihrer adhäsiven Eigenschaften bewertet, während sie an Sepharose-Kügelchen (SB) gebunden waren, die auf nahezu konfluenten bzw. zusammenfließenden Zellkulturen angeordnet wurden. Besonders Peptid-09 wies die höchste adhäsive Fähigkeit auf. Die nächst wirksamere Peptid/Kügelchen Kombination wies Peptid-71 auf. Peptid-70 schien haptotaktisch für EC zu sein. Daher wurde deutlich gezeigt, dass die Peptide mit Ausnahme von Peptid-07 adhäsive Wirkungen aufweisen und ein Peptid zeigte außerdem proliferative Wirkungen auf Zellen, wenn die Peptide in Zellkultursystemen getestet wurden.
Die zwei wirksamsten Peptide, Peptide 09 und 71, haben eine unterstrichene Sequenz von YSXRXXMKIRPXXXQ gemeinsam. Die gemeinsame Sequenz selbst, möglicherweise mit dem Zusatz eines Abstandhalterrestes oder Restes für eine angemessene geometrische Konfiguration, wird ebenfalls als Peptid der vorliegenden Erfindung angesehen.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind für viele verschiedene Verwendungen vorgesehen. Therapeutische Verwendungen beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf die Behandlung des Wundbetts. Verfahren für die Behandlung des Wundbetts mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung werden in folgendem Beispiel 3 ausführlicher dargestellt. Zusätzlich werden im folgenden Beispiel 4 therapeutische Zusammensetzungen ausführlicher aufgeführt, die die Peptide der vorliegenden Erfindung beinhalten.
Zusätzliche Verwendungen der Peptide der vorliegenden Erfindung beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf das Wachstum und den Transport von Zellen in Zellkultursystemen, die Abtrennung bzw. Separation von unterschiedlichen Zelltypen aus gemischten Zellkulturen und die Transplantation von Zellen in Gewebe oder Zellkulturen. Diese Verwendungen werden im folgenden Beispiel 2 detaillierter beschrieben. Des Weiteren können die Peptide der vorliegenden Erfindung auch als Werkzeug für biologische Analysen und für weitere Untersuchungen und Entwicklungen verwendet werden, wie im folgenden Beispiel 5 detaillierter beschrieben ist.
Diese vorgesehenen Verwendungen der Peptide der vorliegenden Erfindung sind lediglich als anschauliche Darstellungen beabsichtigt und sollen in keinster Weise begrenzend sein.
Zusätzlich zu diesen Verwendungen der Peptide werden die äquivalenten Nukleotidsequenzen ebenfalls betrachtet, als weisen sie eine Verwendung auf. Der Begriff "äquivalenten Nukleotidsequenz" betrifft die Sequenz eines Polynukleotids, die mindestens eine der Aminosäuresequenzen der Peptide der vorliegenden Erfindung codieren könnte. Ein derartiges Polynukleotid könnte beispielsweise eine DNA (Desoxyribonukleinsäure) oder RNA (Ribonukleinsäure) Sequenz sein. Die äquivalente Nukleotidsequenz könnte in einem diagnostischen Kit verwendet werden, beispielsweise, um die Unfähigkeit eines Individuums zu diagnostizieren, Gerinnsel richtig zu entwickeln und aufzulösen. Daher weisen die äquivalenten Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung ebenfalls eine Verwendung im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung auf.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf neuartige Peptidsequenzen von Fibrin und davon verwandte Nukleotidsequenzen gerichtet. Verfahren der Verwendung der peptidischen und Nukleotidsequenzen werden ebenfalls vorgesehen, einschließlich Verfahren für die Förderung der Wundheilung sowie diagnostische Verfahren. Diese peptidischen Sequenzen bewahren gewünschte Eigenschaften, die das gesamte Molekül aufzeigt, so wie beispielsweise Zell-Adhäsion.
Die Prinzipien und der Einsatz derartiger peptidischer Aminosäuresequenzen von Fibrin und verwandter Nukleotidsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können mit Bezug auf die folgenden nicht begrenzenden anschaulichen Darstellungen besser verstanden werden.
Beispiel 1
Synthese und Analyse der Wirkungen von Peptidfragmenten
Die Peptide der vorliegenden Erfindung wurden synthetisiert und in Zellkultursystemen, wie nachstehend beschrieben, getestet. Der experimentelle Ablauf ist in dem mit "Experimentelle Abläufe" betitelten Abschnitt beschrieben. Die Ergebnisse sind in dem Abschnitt "Ergebnisse" aufgeführt.
Hauptsächlich wurden Peptide synthetisiert, die als Peptid-07, Peptid-09, Peptid-70 und Peptid-71 bezeichnet werden, und sie wurden kovalent an Sepharose-Kügelchen angebracht, um SB-07, SB-09, SB-70 bzw. SB-71 zu bilden. Fibrinogen wurde ebenfalls kovalent an Sepharose-Kügelchen angebracht, um SB-Fib zu bilden. Die Kügelchen-Peptid Kombination wurde dann mit kultivierten Zellen inkubiert. Die Daten sind in dem nachstehenden "Ergebnis" Teil aufgeführt. Zusammengefasst schien SB-09 am wirksamsten für eine Bindung zu sein und es zeigte sogar eine größere Wirksamkeit als SB-Fib für alle Zelllinien, die Fibrin(ogen) binden. Alle getesteten Zelllinien banden unter diesen Bedingungen an SB-09, mit Ausnahme von OV-1063, Keratinozyten und Zellen, die aus einer Leukozytenlinie abstammen. Die nächst wirksamste Peptid-Kügelchen Kombination war SB-71, da eine starke Bindung von SB-71 für die folgenden Zelllinien beobachtet wurde: HF, MF, EC und EMT-6. Es wurde ebenfalls eine schwache Bindung von SMC-Zellen an SB-71 beobachtet. SB-70 schien für EC spezifisch zu sein, obwohl eine unbeständige bzw. variable Bindung beobachtet wurde, vermutlich aufgrund des Abbaus bzw. der Degradation eines spezifischen Rezeptors während der Passage und der Handhabung dieser Zellen. An SB-07 wurde keine Zellbindung beobachtet.
Interessanter Weise schien von den vier getesteten Peptiden lediglich Peptid-71 die Zellproliferation zu induzieren. Des Weiteren waren die mit FITC markierten Peptide 71 und 09 deutlich in der Lage, an die Zellmembran zu binden und sie akkumulierten nach einer längeren Exposition in dem Zytoplasma und wanderten in den perinukleären Bereich und in die granulären Körperchen.
Experimentelle Abläufe
Herstellung der Peptide
Es wurden Peptidanaloge der Carboxytermini des Fibrinogens gemäß Standardverfahren (Synthetic Peptide Corp., Dublin, California, USA) synthetisiert. Die Aminosäuresequenzen diese Analoge sind in der vorstehend erwähnten Tabelle 1 aufgeführt. Jedes Peptid wurde mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert, die entweder Fluorescein oder EACA (Epsilonaminocarponsäure) darstellte. Das Markieren wurde gemäß von im Stand der Technik wohl bekannter Verfahren, beispielsweise während der Synthese des Peptides selbst, ausgeführt.
Präparation von Sepharose-Kügelchen mit gebundenen Peptiden oder Proteinen
Peptide oder Fibrinogen wurden unter Verwendung von vorher verwendeten Verfahren zum Binden von Albumin, Fibrinogen und Thrombin, an mit CNBr aktivierten Sepharose-Kügelchen (SB) (Pharmacia, Piscataway, NJ) kovalent gebunden. Kurz, es wurde dem durch den Hersteller bereitgestellten Protokoll folgend CNBr aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) mit 1N HCl gewaschen, und in einem Kopplungspuffer (pH-Wert 8,3) suspendiert. Die Peptide wurden gegen den Kopplungspuffer dialysiert, um Tris zu entfernen. Die Peptide (1 mg) waren nicht in hohem Maße in Wasser löslich. Die Peptide wurden in 1 mL 70% Ethanol oder Dimethylformamid gelöst, und wurden anschließend in dem Kopplungspuffer vermischt, der 1 mL CNBr aktivierte Sepharose beinhaltete. Die Suspension wurde sanft über Nacht gerührt, und anschließend bei 500 × g zentrifugiert, um die Kügelchen zu packen. Mit diesem Verfahren werden mehr als 95% Fibrinogen oder Peptide-07 und 09 an die Kügelchen kovalent gebunden, was durch Abs₂₈₀ Messungen bzw. Ablesungen der Lösungen bestimmt wurde. Die Konzentrationen von an SB gebundenen Peptiden betrugen: Peptid 07 betrug 7 mg/mL, Peptid 09 betrug 5,2 mg/mL, Peptide 70 betrug 9,6 mg/mL, Peptid 71 betrug 6,0 mg/mL. Die Kügelchen wurden mit einem Puffer einer Tris-Salzlösung gewaschen und bei 4°C mit 0,1% Azid gelagert. Vor der Verwendung wurden die Kügelchen 3-mal in steriler Salzlösung gewaschen, um alle Spuren von Azid zu entfernen.
Nach einer Inkubation mit Zellen wurden Proben von Kügelchen für die Scanning-Elektronenmikroskopie (SEM) durch Fixieren mit 4% Glutaraldehyd, kritischer Punkttrocknung hergestellt und wurden mit Osmiumtetroxid beschichtet, Sputter- bzw. Sprühbeschichtet mit Au/Pd und anschließend mit einem Hitachi S-530 Scanning-Mikroskop untersucht.
Präparation von Zellkulturen
Alle Zellkulturen wurden, wie vorstehend beschrieben, präpariert. Es wurden normale menschliche Hautfibroblasten (HF) von Hautbiopsien von jungen menschlichen Subjekten isoliert. Die Hautschicht der Außenhaut wurde zerhackt und für 1 Stunden mit 0,25% Trypsin/Versen verdaut. Die isolierten Zellen wurden gewaschen und auf Petrischalen aus Kunststoff mit DMEM ausplattiert, das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Antibiotika und Glutamin ergänzt war. Die Platten wurden nach 10 Std. gewaschen, um die besser anhaftenden bzw. angehefteten bzw. befestigten Fibroblasten auszuwählen. Nach der 3–4 Passage bestanden die Zellen nach mikroskopischer Beurteilung aus homogenen Populationen von Fibroblasten. Eine Immunhistologie mit monoklonalen Anti-Mensch Fibroblastenoberflächenproteinen bestätigte, dass dieses Verfahren eine homogene Fibroblastenkultur (Ronnov-Jessen L, Celis JE, Van-Deurs B, Petersen OW: "A fibroblast-associated antigen: characterization in fibroblasts and immuno-reactivity in smooth muscle differentiated stromal cells", J. Histochem. Cytochem. 40: 475–486 (1992)) ergibt bzw. hervorbringt. Normale Fibroblasten aus der Maus (MF) wurden aus der Haut von 2–3 Tage alten Neugeborenen C3H Mäusen durch einen 3-Schrittverdau, jeweils für 2 Std. mit Trypsin/Versen, isoliert. Die Verwendung von Neugeborenen Mäusen mit sich gering vernetzendem Kollagen diente dazu die hohe Ausbeute von Zellen während des proteolytischen Verdaus zu erhöhen. Die Einzelheiten des übrigen Protokolls sind ähnlich zu denen, die für die Isolation und das Wachstum von HF verwendet wurde. Jene Zellen konnten für mindestens 12–14 Passagen gezüchtet werden, bevor irgendeine Abnahme der Proliferationsrate auftrat. Es wurden Zellen von der vierten bis zur zehnten Passage verwendet.
Glatte Muskelzellen vom Schwein (SMC) wurden von Aorten der Brust junger Tiere isoliert und wurden mit einem zweimal wöchentlichen Mediumwechsel in Kultur gehalten und einmal in 1–2 Wochen aufgeteilt bzw. gesplittet. Es wurden Zellen von bis zu 10 Passagen verwendet. Die Reinheit der SMC-Kultur wurde durch eine Immunhistologie mit monoklonalem Anti-Muskel spezifischem Aktin HHF-35 (Bar-Shavit R, Benezra M, Eldor A, Hy-Am E, Fenton JW, Wilner GD & Vlodavsky I: "Thrombin immobilized to extracellular matrix is a potent mitogen for vascular smooth muscle cells: non-enzymatic mode of action", Cell Regul. 1: 453–463, 1990) bestätigt. Andere Zelllinien wurden von unterschiedlichen Quellen erhalten und unter deren Standardbedingungen kultiviert, wie es in den folgenden Referenzen beschrieben ist: Fibroblasten-Linie (3T3) der Maus und normale Keratinozyten des Menschen (Ben-Bassat H, Eldad A, Chaouat M, Livoff A, Ron N, Neeman Z, and Wexler MR: "Structural and functional evaluation of modifications in the composite skin graft: cryo-preserved dermis and cultured keratinocytes", Plastic & reconstructive Surgery 89: 510–520 (1992); Mastzellen der Maus (MC-9) (Razin E, and Marx G., "Thrombin-induced degranulation of cultured bone marrow-derived mast cells", J. Immunol. 133: 3282–3285 (1984)); normale Endothelzellen der Rinderaorta (BAEC) (Vlodavsky I, Greenburg G, Johnson LK and Gospodarowicz D: "Vascular endothelial cells maintained in the absence of fibroblast growth factor undergo structural and functional alterations that are incompatible with their in vivo differentiated properties", J. Cell Biol. 83: 468486,1979); glatte Muskelzellen vom Schwein, die, wie vorhergehend beschrieben, isoliert und kultiviert wurden (Bar-Shavit R, Benezra M, Eldor A, Hy-Am E, Fenton JW, Wilner GD & Vlodavsky I: "Thrombin immobilized to extracellular matrix is a potent mitogen for vascular smooth muscle cells: non-enzymatic mode of action", Cell Regul. 1: 453–463, 1990); Leukämiezellen der Maus (P-388) (Ramu A, Ramu N. & Gorodestsky R, "Reduced oubain resistant potassium entry as a possible mechanism of multidrug-resistance in p388 cells", Biochem. Parmacol., 42: 1699–1704 (1992)); Eierstock-Carcinomzellen des Menschen wurden aus einem primären Tumor isoliert und anschließend wie vorhergehend beschrieben gehalten (Horowitz AT, Treves AJ, Voss R, Okon E, Fuks Z, Davidson L, and Biran S., "A new human carcinoma cell line: establishment and analysis of tumor associated markers", Oncology 42: 332–337 (1985)); Mamma-Adenomcarcinomzellen der Maus (EMT-6) wurden unter den Standardbedingungen (Rockwell S., "Cytotoxic and radio-sensitizing effects of hypoxic cell sensitizers an EMT6 mouse mammary tumor cells in vivo and in-vitro", Br J Cancer 37: 212–215 (1978)) gezüchtet, und die Makrophagen ähnlichen Zellen der Maus (J774.2) (Ringel R, Roy SN, and Horwitz SB., "A phosphor-glycoprotein associated with taxol resistance in J774.2 cells", Cancer Res. 45: 3856–3863 (1985)).
Alle Komponenten der Kulturmedien wurden von biologischen Industriebetrieben (Geit-HaEmek, Israel) erworben und das fötale Kälberserum wurde von GIBCO (Grand Island, New York, NY, USA) geliefert. Die Zellkulturen wurden bei 37°C in einem Außenwandwasser CO₂ Inkubator gehalten und durch eine Trypsin-/Versen-Lösung geerntet, mit 1–2 Passagen pro Woche mit einem Aufteilungsverhältnis von 1:10 für schnell wachsende transformierte Zellen und 1:4 für normale Zelltypen.
Tests bzw. Assays für die Zellproliferation
Die Zellproliferation wurde durch Erfassen der Zelldichte als eine Funktion der Zeit durch zwei unterschiedliche kolorimetrische Tests bewertet. Der MTS kolorimetrische Test (CellTitre 96 Aqueous Assay by Promega) basiert auf der Umsetzung durch die Dehydrogenase von MTS (Methyltetrazolium-Salz) zu gefärbtem Tetrazoliumsalz (Ge M., Tang, G., Ryan, T. J. and Malik, A. B., "Fibrinogen degradation product fragment D induces endothelial cell detachment by activation of cell-mediated fibrinolysis", J. Clin. Inves., 90: 2508–2516 (1992)) durch lebende Zellen; der Methylenblau-Test (MB) basiert auf der Färbung von Monolayer-Zellen nach deren Fixierung und Auslesen des Absorptionsvermögens des absorbierten Farbstoffs.
Der MTS Test für lebende Zellen wurde wie folgt ausgeführt: es wurden 30 μL frisch hergestellten MTS/PMS zu jedem Loch zugegeben; nach 2 Std. Inkubation bei 37°C wurden die Platten auf einem durch einen Computer angetriebenen Mikroplattenlesegerät (Anthos HAT-II, Salzburg, Österreich) angeordnet, der dazu programmiert war die Platte für 1 Minute vor dem Lesen bzw. Messen der optischen Dichte (OD) des Farbstoffs bei 490 nm, zu schütteln. Die Erfassungen wurden nach 4 und 6 Stunden der Inkubation wiederholt.
Für den MB Test wurden Zellen an dem Ende des Experiments durch die Zugabe von 50 μL 2,5% Glutaraldehyds für 10–15 Min. fixiert. Die Platte wurde anschließend 10-mal mit deionisiertem Wasser gewaschen, einmal mit Borat-Puffer (0,1 M pH-Wert 8,5), getrocknet und mit MB (100 μL einer 1% Lösung in Borat-Puffer) gefärbt, und für 2 Stunden bei Raum- bzw. Umgebungstemperatur inkubiert. Die Zellen wurden gründlich gespült, um nicht gebundenen Farbstoff zu entfernen und wurden luftgetrocknet. Der an die Zellen in jedem Loch gebundene MB-Farbstoff wurde durch Inkubieren mit 200 μL einer 0,1 N HCl für 1 Std. bei 37°C extrahiert, und bei 620 nm ausgelesen. Für jedes Experiment wurden für jede getestete Bedingung 3 Löcher verwendet. Vorhergehend wurde gezeigt, dass die Nettoabsorption durch den Methylen-Blau Test mit der Zelldichte auf der Platte korreliert (r>0,99). Jeder Punkt von jedem Experiment stellte die durchschnittliche Auslesung von 3 Löchern dar, wobei die Datenpunkte in der graphischen Darstellung 2–3 wiederholte Experimente von beiden Tests darstellen.
Typisch für beide Tests war, dass die Wirkung von zugegebenen Peptiden relativ zu Kontrollen bei 72 und 96 Stunden ähnlich war und gemittelt werden konnte.
Test einer Zelladhäsion an Peptide, die an Sepharose-Kügelchen (SB) gebunden sind
Die Migrations-/Adhäsions-Antwort von Zellen auf Proteine (wie beispielsweise Fibrinogen) oder Peptide, die an SB kovalent gebunden vorlagen, wurde wie folgt erfasst. Zellen wurden in 6 oder 12 Lochplatten bis nahe zur Konfluenz oder in Suspension gezüchtet, bis sie ungefähr ½ oder 1/3 der Platteoberfläche bedeckten. Zu diesem Zeitpunkt wurden ungefähr 20–150 mL einer Suspension, die 50% V/V SB beinhaltete, die mit dem Test-Protein oder Peptid beschichtet waren, zu der Platte zugegeben und durch sanftes Schütteln für 1 Minute dispergiert. Die Platte wurde anschließend in den Inkubator zurückgestellt und zu unterschiedlichen Zeiten durch Umkehrphasen-Mikroskopie untersucht.
Die SB (beschichtet oder unbeschichtet) sedimentierten in die nahezu konfluenten Zellschichten und machten gelegentlich Kontakt mit Zellmembranen an der Platte (zugeschrieben der Braunschen Bewegung oder Mikrokonvektionsströmen). In einem positiv reagierenden System führte dies zu dem Anbinden bzw. Halten von SB an die Zellschicht, was durch visuelle Inspektion zu unterschiedlichen Zeitpunkten detektiert werden konnte. Gewöhnlich wurden 300 Kügelchen (jedoch nicht weniger als 200) in jedem Loch gezählt und wobei das Verhältnis von an Zellen gebundenem SB relativ zu der Gesamtanzahl von SB berechnet werden konnte. Berechnen des Prozentanteils von an der Zelloberfläche anhaftenden SB zu unterschiedlichen Zeitintervallen stellte einen quantitativen Test der Kinetik der Anhaftung von beschichteten Kügelchen an Zellen dar. Es wurden Negativ-Kontrollen mit nicht beschichteten SB oder Positiv-Kontrollen mit SB-Fibrinogen verwendet, wobei jeweils mindestens 3 Löcher für jede erfasst wurden. Es wurde der statistische Fehler aus der Quadratwurzel der Gesamtzählungen berechnet.
Elektronenmikroskopie
Es wurden Proben der Zellen mit anhaftenden Sepharose-Kügelchen, wie vorhergehend beschrieben, fixiert, und anschließend mit einem Hitachi S-530 Scanning-Elektronenmikroskop (SEM) untersucht.
Fluoreszenzmikroskopie
Die untersuchten Zellen wurden in 6-Lochplatten auf Deckgläsern gezüchtet, um nahezu eine Konfluenz zu erreichen. Zu dem Zeitpunkt der Untersuchung werden die Deckgläser umgedreht und auf einen Mikroskopobjektträger gelegt, der durch 2 dünne Abstandshalter so gestützt wird, dass ein dünne Lücke (~2 mm) zwischen den Zellen auf dem Deckglas und dem Objektträger bleibt. Diese wird mit Kulturmedium gefüllt. Um die Aufnahme zu verfolgen, wurden 10 μg/mL FITC markiertes Peptid (09) in das Kultur medium in der Lücke gegeben. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt und die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Olympus Fluoreszenz Mikroskopsystems beobachtet und photographiert.
Ergebnisse
Anhaftung von mit Fibrinogen oder Peptid beschichteten Sepharose-Kügelchen an Zellen
SB-Fibrinogen oder Peptid beschichtete Kügelchen wurden mit nahezu konfluenten Zellen inkubiert. "Nackte" SB Kontrolle interagierte nicht mit den Zellschichten und schwamm bzw. floatete sogar nach verlängerter Inkubation frei in dem Zellkulturmedium, was zu einer nullprozentigen Anhaftung an die Zellen führte. Der an den Zellen (an Tag 4) anhaftende prozentuale Anteil von SB-Fib/Peptid wird in Spalten 2–6 von Tabelle 2 angegeben.
Sepharose-Kügelchen, die mit Fibrinogen oder einem der synthetischen Peptidanaloge der vier Carboxytermini von Fibrinogen beschichtet waren, waren, wie in Tabelle 2 und
2 gezeigt wird, beim Anziehen und Binden von den Zellen der meisten getesteten Zelllinien aktiv. Beispielsweise banden mit Peptid 09 (SB-09) beschichtete Sepharose-Kügelchen bis zu 5 von 6 Zelllinien und mit höherer Wirksamkeit als SB-Fib. Sepharose-Kügelchen, die mit Peptid 71 (SB-71) beschichtet waren, banden bis 4 von 6 Zelllinien.
Sepharose-Kügelchen, die mit Peptid 07 (SB-07) beschichtet waren, banden keine. In einigen Fällen wurde eine starke Bindung an Endothelzellen (EC) beobachtet, wobei jedoch diese Reaktion nicht reproduziert werden konnte. Tabelle 2.% Bindung von mit Peptid beschichteten SB an normale kultivierte Zellen

(Tag 4)

Peptide

Zelllinie SB-Fib SB-07 SB-09 SB-70 SB71

HF 71 0 100 2 52

MF 81 0 89 0 61

SMC 74 0 100 1 8

EC 70 0 94 2 bis 93* 43

EMT-6 1 99 2 64

OV-1063 0 4 0 0

* Antwort variierte mit verschiedenen Zellchargen.

2 zeigt die haptotaktische Wirkung (Anhaftung) der Peptide der vorliegenden Erfindung für verschiedene Zelltypen. 2A zeigt die Wirkung von SB-07, SB-09, SB-Fibronektin oder SB-Albumin auf Fibroblasten der Maus und des Menschen. 2B zeigt die Wirkung von SB-07, SB-09, SB-Fibronektin oder SB-Albumin auf glatte Muskelzellen. 2C zeigt die Wirkung von SB-70 oder SB-71 auf glatte Muskelzellen und Fibroblasten des Menschen. Fibronektin ist bekannt haptotaktisch zu sein, während Albumin es nicht ist. SB-Albumin und SB-07 binden nicht an beliebige Zelltypen. SB-09 und SB-Fibronektin banden an alle getesteten Zelltypen. SB-71 band an menschliche Fibroblasten, obwohl mit etwas weniger Aktivität als SB-09, band jedoch lediglich vorübergehend an glatte Muskelzellen. SB-70 wies lediglich ein geringes Bindungsverhalten gegenüber menschlichen Fibroblasten und glatten Muskelzellen auf.
3 zeigt den prozentualen Anteil der Anhaftung von verschiedenen Zelltypen an SB-Peptide der vorliegenden Erfindung. SB-07 band erneut nicht an beliebige Zelltypen. SB-09 band an alle getesteten Zelltypen, ausgenommen von der OV-1063 Zelllinie und den Mastzellen. SB-70 band lediglich an Endothelzellen. SB-71 band an alle Zelltypen, die SB-09 banden, jedoch zu einem geringeren Ausmaß.
Wirkung der Peptide auf die Zellproliferation
Es wurden Peptide mit bis zu 1 μg/mL oder 100 μg/mL Fibrinogen oder Thrombin (Endkonzentrationen) zu dem Kulturmedium zugegeben und die Zellzahlen wurden unter Verwendung des MTS-Tests an Tag 3 untersucht. Die Änderung in der Zellzahl wurde mit der gegenüber einer Salzlösungskontrolle verglichen. Die proliferative Wirkung der getesteten Peptide, des Fibrinogens und des Thrombins wurde mit dem MTS kolorimetrischen Test untersucht. Von den bei Dosierungen von bis zu 1 μg/mL (ungefähr äquimolar zu 100 μg/mL Fibrinogen) getesteten 4 Peptiden konnte Peptid-71 die Zellproliferation zu von HF und MF fördern, während die übrigen Peptide auf die Zellproliferation eine geringe Wirkung ausübten (Tabelle 3 und 1). Tabelle 3. Proliferative Wirkungen von Fibrinogen und Peptiden auf kultivierte Zellen

Zelle

Verbindung Kette HF MF SMC

Thrombin NA + + +

Fibrinogen α, β, γ - –+ +

7 α - - -

9 β - - -

70 γ - - -

71 αE - - +–
Aufnahme von FITC-09 und FITC-71 durch Zellen
Werden kultivierte menschliche Fibroblastenzellen einer Lösung von 10 mikromolar Peptid FITC-71 ausgesetzt, so führte dies, wie durch Fluoro-Mikroskopie gezeigt, zu einer Aufnahme durch menschliche Fibroblasten bei einer Inkubation von einer (4A und 4B) und zwei Stunden (4C–E). Es wurde eindeutig eine Anreicherung bzw. Ansammlung des FITC-Peptids in dem Zytoplasma und um den Kern beobachtet.
Werden kultivierte HF, EC und SMC Zellen Lösungen von 10 mikromolar Peptid FITC-09 ausgesetzt, dann führt dies zu einer signifikanten Aufnahme ähnlich der, die mit dem Peptid-71 gesehen wurde. Nach einer kurzen Exposition der Zellen gegenüber 5–10 mikromolar von Peptid FITC-09, wurde beobachtet, dass das FITC-Peptid an die Zellmembran bindet. Nach einer längeren Exposition von mehr als 1 Stunde oder mit fixierten Zellen war eine Ansammlung der FITC-Peptide in dem Zytoplasma und um den Kern eindeutig zu beobachten (Daten nicht gezeigt). In den meisten Fällen wurde die Fluoreszenz in diskreten bzw. separaten zytoplasmatischen Vesikeln konzentriert. Es wurde gezeigt, dass die Aufnahme für EC Zellen (4F) konzentrationsabhängig war.
FACS-Analyse von mit FITC markierten Peptiden-09, 71, 70 und 07
Es wurden Einschichten bzw. Monolayer von EC und HF Zellen gewaschen und anschließend mit Trypsin-Versen inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Wachstumsmedium gewaschen und in Medium mit 0,1% Albumin resuspendiert. Mit FITC markiertes Peptid-09 wurde mit 5 × 10⁵ EC Zellen (10 Mikrogramm/mL oder 100 Mikrogramm/mL) oder mit 2,5 × 10⁵ HF Zellen (100 Mikrogramm/mL) in Medium mit 0,1% Albumin inkubiert. Mit FITC markiertes Peptid-71, 07 und 70 (10 Mikrogramm/mL) wurde mit 5 × 10⁵ EC Zellen in Medium mit 0,1% Albumin inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS und 1% Albumin gewaschen. Die Zellen wurden in PBS und 1% Albumin resuspendiert und anschließend für eine FACS Analyse, bei der die FITC Fluoreszenz für jede Zelle erfasst wurde, durch ein Siebgewebe bzw. Netz filtriert.
5 zeigt eine FACS Analyse von mit FITC markierten Peptiden-09 (5A–5C), 70 (5E), 71 (5D) und 07 (5F). Die X-Achse zeigt die Fluoreszenz in willkürlichen Einheiten und die Y-Achse zeigt die Anzahl der Zellen. Die Kontrolle besteht aus nicht mit FITC markiertem Peptid (Hintergrundfluoreszenz). Es wurde mit FITC markierten Peptid-09 eine ähnliche Bindung an EC und HF Zellen gesehen. Es band eine geringere Konzentration von mit FITC markiertem Peptid-09 mit größerer Aktivität an EC, gefolgt durch mit FITC markiertem Peptid-71. FITC markiertes Peptid-70 zeigte ein geringes Bindungsverhalten an EC-Zellen und 07 band nicht spezifisch an EC Zellen.
Beispiel 2
Strukturierte Zellsysteme, die die Peptide der vorliegenden Erfindung verwenden
Die Peptide der vorliegenden Erfindung könnten als Teil von strukturierten Zellsystemen, beispielsweise für eine Gewebetechnologie, verwendet werden. Das Zellsystem der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens einen Zelltyp, der an mindestens ein Peptid der vorliegenden Erfindung gebunden war. Geeignete Zelltypen schließen beliebige Zellen ein, die dazu befähigt sind mindestens ein Peptid der vorliegenden Erfindung zu binden. Beispiele derartiger Zellen können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fibroblasten, Endothelzellen, Chondrozyten, Neuroblastomzellen, Melanomzellen, Nierenzellen, Leberzellen, Pankreaszellen, Schilddrüsenzellen, Gliazellen, glatte Muskelzellen, Mammacarcinomzellen der Maus, Knochen oder Knorpel formende Zellen und Kombinationen davon.
Das Zellsystem der vorliegenden Erfindung könnte ebenfalls dazu verwendet werden Zellen als Teil eines Zellkultursystems zu kultivieren. Mindestens ein Zelltyp würde an das Peptid der vorliegenden Erfindung binden können. Die Zellen würden dann in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen für die Zellkultur gezüchtet werden. Der Vorteil eines derartigen Zellkultursystems besteht darin, dass das Peptid der vorliegenden Erfindung an einer geeigneten Struktur, wie beispielsweise einem Sepharose-Kügelchen oder einer beliebig anderen geometrisch geeigneten Struktur anhaften könnte. Der Ausdruck "Struktur" umfasst hier, ist jedoch nicht beschränkt auf den Ausdruck "Matrix".
Die Zellen würden anschließend vielmehr an dieser Struktur als an einer herkömmlichen Petrischale gezüchtet werden. Falls die Zellen von dem Kulturmedium entfernt werden müssen, dann würde folglich die Struktur selbst ohne wesentliches Trauma der Zellen entfernt werden. Im Gegensatz dazu erfordern herkömmliche Verfahren zum Entfernen von Kulturmedium häufig eine Trypsinierung, die bestimmte Rezeptoren auf den Zellen schädigen und auf andere Weise den Zellen ein Trauma verursachen können. Die Fähigkeit Zellen von einer Umgebung zu einer anderen zu übertragen, indem eine derartige Struktur oder Matrix bewegt wird, führt ebenfalls dazu, dass die Zellen mit minimaler Schädigung an den Zellen in frischem Medium erneut ausgesät werden können.
Ein derartiges Zellkultursystem, das die Peptide der vorliegenden Erfindung umfasst, könnte ebenfalls dazu verwendet werden, um Zellen bei einer höheren Dichte als bei herkömmlichen Zellkulturen zu kultivieren. Derartig hoch dichte Zellkulturen sind insbesondere für die Herstellung von rekombinanten Proteinen und für andere Typen von Zellkulturprodukten nützlich. Das Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung könnte dazu verwendet werden transformierte oder mit unterschiedlichen Vektoren, Viren, Nukleinsäuren und dergleichen transfizierte Zellen zu kultivieren, um die Produktion dieser Zellkulturprodukte zu erleichtern.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung könnten ebenfalls dazu verwendet werden Zellen, die dazu befähigt sind an eines oder mehrere dieser Peptide zu binden von jenen Zellen zu trennen, die nicht dazu befähigt sind ein derartiges/derartige Peptid(e) zu binden. Beispielsweise könnte ein Peptid der vorliegenden Erfindung an einer, wie vorstehend beschriebenen, Matrix oder Struktur anhaften bzw. angeheftet sein. Diese Struktur oder Matrix könnte dann mit einem Gemisch von Zellen in Lösung unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, um jenen Zellen, die die Peptide binden können, ein Binden zu ermöglichen. Die Struktur oder Matrix könnte anschließend entfernt werden und mit ihr die gebundenen Zellen. Die Zellen, die nicht an die Peptide binden können, ob jene Zellen von dem Typ sind, die nicht binden können oder ob die Zellen in einer Weise beschädigt wurden, würden noch dableiben. Als ein zusätzliches Beispiel könnte ein Peptid der vorliegenden Erfindung an einen wesentlich immobilen Träger (wie beispielsweise die Oberfläche einer prosthetischen Gruppe) angeheftet bzw. angehaftet sein, und wobei die Lösung von Zellen mit dem bzw. diesem in Kontakt angeordnet werden könnte. Jene Zellen, die das Peptid binden können, würden an dem Träger gebunden bleiben, während die anderen Zellen entfernt würden. Folglich könnten die Peptide der vorliegenden Erfindung für eine Trennung bzw. Abtrennung von Zellen und zum Beschichten der Oberfläche einer derartigen Einrichtung verwendet werden.
Ein derartiges Trennen kann sich ebenfalls als für diagnostische Zwecke nützlich erweisen. Beispielsweise könnte die Anwesenheit oder Abwesenheit eines bestimmten Zelltyps, oder einer bestimmten Zellfunktion durch ein Untersuchen bestimmt werden, ob die Zelle an das Peptid gebunden vorliegt. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von im wesentlichen einem beliebigen Zelltyp, der an ein oder mehrere der Peptide der vorliegenden Erfindung bindet, könnte in einem derartigen Test (wie beispielsweise einer Fluoreszenz-Zellsortierer-Analyse) bestimmt werden. Beispiele von zu diagnostizierenden Zellfunktionen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die Befähigung auf ein chemotaktisches oder ein Anhaftungssignal zu antworten bzw. zu reagieren.
Diese Funktionen würden durch die Bestimmung einer Zellbindung an die mit Peptid beschichtete Struktur bewertet werden. Die Bestimmung einer Zellbindung könnte, wie vorstehend beschrieben, durch die Fähigkeit die Zelle aus einer Lösung oder einem Gemisch unterschiedlicher Zelltypen zutrennen, ausgeführt werden.
Alternativ und vorzugsweise könnte das Peptid mit einem Reporter, wie beispielsweise einem fluoreszenten oder radioaktiven Rest, markiert werden. Der Reporter würde dazu verwendet werden, ob das Peptid an eine der beliebigen Zellen gebunden hat, wodurch folglich die vorliegende Erfindung die zu bestimmende Anwesenheit oder Abwesenheit des Zelltyps, oder einer bestimmten Zellfunktion ermöglicht.
Beispiele von geeigneten fluoreszenten Resten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf FITC (Fluorescein), Rhodamin und Texas-Rot. Beispiele von geeigneten radioaktiven Resten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf ³²Phosphor, ¹³¹Jod und Tritium. Der Reporter könnte während einer Synthese oder alternativ nach der Synthese gemäß von im Stand der Technik wohl bekannter Verfahren an das Peptid angehaftet bzw. angebracht werden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls dazu vorgesehen für die Bildung einer therapeutischen Struktur von Zellen nützlich zu sein. Beispiele der therapeu tischen Struktur umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf ein Gel, eine prosthetische Einrichtung, und ein(e) Kollagensheet bzw. -blatt bzw. -schicht bzw. -folie. Zumindest ein Peptid der vorliegenden Erfindung würde an der therapeutischen Struktur anhaften, beispielsweise durch eine kovalente Bindung, die mit einem chemischen Vernetzungsreagenz, wie es im Stand der Technik wohl bekannt ist, oder mit Fibrinkleber ausgebildet wird. Die Zellen würden dann an das Peptid auf der therapeutischen Struktur binden können, beispielsweise durch Zellkultur oder durch die vorstehend beschriebenen Abtrennungs- bzw. Trennungsverfahren. Die Wahl der Zellen wird von dem Gewebetyp, mit dem sie in Kontakt gebracht werden und der gewünschten therapeutischen Struktur abhängig sein und könnten möglicherweise einen beliebigen Zelltyp umfassen, der an mindestens ein Peptid der vorliegenden Erfindung binden kann.
Beispiel 3
Verfahren zur Behandlung mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung
Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind für eine Behandlung eines Subjektes mit einem Erkrankungszustand als nützlich vorgesehen, bei dem der Zustand durch Zellchemotaxis oder Proliferation, oder durch Transplantation von Zellen zumindest teilweise verbessert oder geheilt werden kann. Beispiele eines derartigen Zustands umfasst, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Anwesenheit einer Wunde und Erkrankungen, die durch eine Abwesenheit eines Zellproduktes gekennzeichnet sind. Der Ausdruck "Wunde" umfasst eine/einen beliebige(n) Zerreißung bzw. Störung bzw. Riss der normalen Integrität eines Organs des Subjektes. Beispiele umfasst ein derartiges Organs, ist jedoch nicht beschränkt auf die Haut, die Bauchhöhle, den Darm, das Herz, die Lungen, ein beliebiges Blutgefäß, einen beliebigen Knochen, den Pankreas, die Leber, eine Niere, die Reproduktionsorgane oder den Magen.
Die Wunde kann als die Folge eines chirurgischen Eingriffs oder als die Folge eines nicht chirurgischen Eingriffs vorhanden sein. Der chirurgische Eingriff kann entweder geplant sein oder als die Folge eines medizinischen Notfalls auftreten. Der nicht chirurgische Eingriff kann eine Verbrennung, ein Geschwür, eine Fleisch- bzw. Schnittwunde oder ein beliebiger Typ einer zufälligen Verletzung oder eines Traumas sein.
Die Verfahren einer Behandlung mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung für einen chirurgischen Eingriff könnten ein Anordnen von einem oder mehreren der Peptide an der Stelle des chirurgischen Eingriffs umfassen, um die Wirksamkeit des Prozesses der Wundheilung zu erhöhen. Das eine oder die mehreren Peptide könnten an der Stelle des chirurgischen Eingriffs vor der Operation, insbesondere bei einer Notfalloperation, während einer Operation oder nach einer Operation, angeordnet werden. Das eine oder die mehreren Peptide könnten in einer therapeutischen Zusammensetzung, wie nachfolgend in Beispiel 4 beschrieben, umfasst sein.
Verfahren einer Behandlung von nicht chirurgischen Eingriffen würden ein Anordnen eines oder mehrerer Peptide an der Stelle des nicht chirurgischen Eingriffs umfassen, um die Wirksamkeit des Prozesses der Wundheilung zu erhöhen. Das eine oder die mehreren Peptide könnten ebenfalls, wie nachfolgend in Beispiel 4 beschrieben, in einer therapeutischen Zusammensetzung umfasst sein.
Das eine oder die mehreren Peptide der vorliegenden Erfindung könnten abhängig von dem Typ und der Schwere der Wunde, die erlitten wurde, an der Stelle des chirurgischen oder des nicht chirurgischen Engriffs einmal oder wiederholt angeordnet werden. Die Konzentration und Geschwindigkeit einer Behandlung, falls wiederholt, kann einfach durch einen Fachmann bestimmt werden.
Beispiele von Erkrankungen, die durch eine Abwesenheit eines Zellproduktes gekennzeichnet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Diabetes mellitus, Hämophilie A (Faktor VIII Mangel) und Hämophilie B (Faktor IX Mangel). Diese Erkrankungen können durch Einbringen bzw. Einführen von Zellen in das Subjekt, welche das notwendige Zellprodukt oder Produkte erzeugen, verbessert bzw. gelindert oder geheilt. Diese Zellen können durch Einbringen eines Vektors hergestellt werden, der die Nukleinsäuresequenz beinhaltet, die für ein Protein oder Peptid kodiert, wie es im Stand der Technik wohl bekannt ist. Das Peptid oder Protein könnte selbst das erwünschte Zellprodukt sein, wie beispielsweise Insulin. Alternativ und bevorzugt könnte das Protein die Zelle dazu veranlassen das erwünschte Zellprodukt, beispielsweise durch eine enzymatische Reaktion oder Reaktionen, zu produzieren. Auf jeden Fall würde dann nach einer derartigen Präparation die Zelle das erwünschte Zellprodukt produzieren können.
Sobald hergestellt, würden die Zellen an ein Peptid der vorliegenden Erfindung gebunden vorliegen, was wiederum, wie in Beispiel 2 beschrieben, in eine geeignete Zellstruktur eingefügt würde. Die Zellstruktur würde einem Subjekt verabreicht werden und würde dann das notwendige Zellprodukt produzieren. Der Vorteil einer derartigen Zellstruktur gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Zellen im wesentlich lokalisiert bleiben würden, obwohl die Zellprodukte, falls erwünscht, in den Blutstrom eintreten bzw. übertreten könnten. Folglich könnte unter Verwendung des Peptides der vorliegenden Erfindung die Zellstruktur verwendet werden, um den Erkrankungszustand mit dem/den notwendigen Zellprodukt oder Produkten zu behandeln.
Beispiel 4
Geeignete Formulierungen zur Verabreichung der Peptide
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können einem Subjekt auf verschiedene Art und Weise, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, verabreicht werden. Hier bezieht sich der Ausdruck "Subjekt" auf den Menschen oder ein niederes Tier, dem das Peptid verabreicht wurde. Beispielsweise kann eine Verabreichung topisch (einschließlich ophthalmisch, vaginal, rektal, intranasal), oral, oder parenteral, beispielsweise durch einen intravenösen Tropf oder eine intraperitoneale, subkutane oder intramuskuläre Injektion, erfolgen.
Die Formulierungen für eine topikale Verabreichung können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Lotionen, Salben, Gele, Cremes, Zäpfchen, Tropfen, Flüssigkeiten, Sprays, und Pulver. Herkömmliche pharmazeutische Träger, wässrige, Pulver oder ölige Basen, Verdickungsmittel und dergleichen können notwendig oder wünschenswert sein.
Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung umfassen Pulver oder Körnchen, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nicht wässrige Medien, Sachets, Kapseln oder Tabletten. Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Aromastoffe, Dispergierungshilfen, Emulgatoren oder Binder können wünschenswert sein.
Die Formulierungen für eine parenterale Verabreichung können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf sterile wässrige Lösungen, die ebenfalls Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusatzstoffe beinhalten können.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auf dem Wundbett als Teil einer Zusammensetzung für eine Wundbehandlung angeordnet werden. Die Zusammensetzung für eine Wundbehandlung kann einen geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Beispielsweise kann das Peptid in gelasertes bzw. mit Laser behandeltes oder erhitztes Albumin eingefügt sein, um eine Wundheilung zu beschleunigen, eine Narbenbildung zu minimieren, die Rate einer Ablagerung von neuer extrazellulärer Matrix zu beschleunigen und eine Angiogenese zu verstärken.
Als ein anderes Beispiel könnte ein Polymer aus Untereinheiten von mindestens einem der Peptide der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, so dass mehrere dieser Peptide verbunden wären, um das Peptidpolymer zu bilden. Die Peptide könnten beispielsweise mit einem chemischen Vernetzungsrest verbunden sein. Mehr als eines der Peptide der vorliegenden Erfindung könnte dazu verwendet werden das Polymer zu bilden. Alternativ könnte mindestens eines der Peptide der vorliegenden Erfindung erneut durch einen geeigneten Vernetzungsrest an ein biologisch verträgliches synthetisches Polymer geheftet bzw. angebracht sein, um ein Ko-Polymer zu bilden. Auf jeden Fall kann das erhaltene Peptidpolymer oder Ko-Polymer dazu verwendet werden Mikropartikel bzw. Mikroteilchen herzustellen, die entweder in einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein könnten, oder andernfalls, wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben, dazu verwendet werden könnten Zellstrukturen zu bilden.
Die Zusammensetzung zur Wundbehandlung kann ebenfalls mindestens ein biologisch aktives Mittel umfassen. Geeignete biologisch aktive Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Arzneimittel, neurologische Mittel, Vitamine, Vitaminderivate, Wachstumsfaktoren, Glucocorticosteroide, Steroide, Antibiotika, antibakterielle Verbindungen einschließlich bakteriziden und bakteriostatischen Verbindungen, anti-parasitische Verbindungen, tumorizide Verbindungen, tumorstatische Verbindungen, Toxine, Enzyme, Enzymhemmstoffe, Proteine, Peptide, Mineralien, Neurotransmitter, Lipoproteine, Glycoproteine, Immunmodulatoren, Immunglobuline und Fragmente davon, Fettsäurederivate, Polysaccharide, Zellrezeptor bindende Moleküle, Anti-entzündliche, Anti-Glaukom Verbindungen, mydriatische bzw. die Mydriasis betreffende Verbindungen, Anästhetika, Nukleinsäuren, Polynukleotide und dergleichen.
Die therapeutischen Zusammensetzungen könnten mindestens einen Zelltyp in einem strukturierten Format, wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben, umfassen. Beispielsweise könnte die vorstehend beschriebene Folien- bzw. Schichtstruktur für eine Zellkultur auf der Wunde angeordnet werden, um sowohl die Wunde während des Heilungsprozesses zu schützen, als auch um die Wundheilung selbst zu fördern. Die Struktur könnte ebenfalls das vorstehend beschriebene Gel darstellen, das zum Transplantieren der Zellen auf die Stelle der Wunde angeordnet würde, und dann den Wundheilungsprozess fördern können würde. Andere Beispiele von derartigen strukturierten Zellsystemen könnten ebenfalls als Teil der therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für eine Wundheilung verwendet werden. Wird es zur Wundheilung verwendet, dann umfassen geeignete Zelltypen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fibroblasten, glatte Muskelzellen, Chondrozyten, Knochen oder Knorpel bildende Zellen, und Kombinationen davon.
Kombinationen von beliebigen zwei oder mehreren von diesen unterschiedlichen Komponenten von therapeutischen Zusammensetzungen sind ebenfalls als therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung möglich.
Eine Dosierung ist von der Schwere der Symptome und von der Reaktionsfähigkeit des Subjekts auf das Peptid oder die Fragmente der vorliegenden Erfindung abhängig. Der Fachmann kann optimale Dosierungen, Dosierungsverfahren und Wiederholungsraten einfach bestimmen.
Beispiel 5
Analyse, die mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurden
Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls als Werkzeuge zum Ausführen von Analysen anderer Systeme, und für die weitere Forschung und Entwicklung vorgesehen. Beispielsweise könnten die Peptide dazu verwendet werden Zellrezeptoren zu identifizieren und zu isolieren. Wie vorstehend beschrieben, könnte das Peptid mit einem Reporter, wie beispielsweise einem fluoreszenten oder radioaktiven Rest, markiert werden. Der Reporter würde verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Peptid an eine beliebige der Zellen gebunden hat, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit des Zelltyps, oder einer bestimmten Zellfunktion bestimmt werden kann.
Beispiele von geeigneten fluoreszenten Resten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf FITC (Fluorescein), Rhodamin und Texas-Rot. Beispiele von geeigneten radioaktiven Resten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf ³²Phosphor, ¹³¹Jod und Tritium. Der Rezeptor könnte während der Synthese oder alternativ nach der Synthese gemäß im Stand der Technik wohl bekannter Verfahren an das Peptid angeheftet bzw. angebracht werden. Folglich könnte die Fähigkeit des Peptids an einen neuen Rezeptor oder anderes Protein zu binden entsprechend eines Bindungstests bestimmt werden.
Außerdem könnten die Peptide der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden Analoge, wie beispielsweise Nicht-Peptid-Mimetika, von diesen Peptiden zu gestalten. Derartige Nicht-Peptid-Mimetika könnten beispielsweise zu therapeutischen Zwecken verwendet werden. Nicht-Peptid-Verbindungen sind möglicherweise einfacher zu verabreichen, da Peptide vorzugsweise, beispielsweise nasal oder parenteral, verabreich werden, während Nicht-Peptid-Verbindungen möglicherweise oral verabreicht werden könnten. Weiterhin könnten bestimmte Eigenschaften von jedem Peptid durch Gestalten eines spezifischen Analogs ausgewählt oder verstärkt werden. Folglich könnten die Peptide der vorliegenden Erfindung möglicherweise zahlreiche neue und unterschiedliche Typen von therapeutischen Medikamenten ergeben. SEQUENCE LISTING

Claims

Aus Fibrinogen gewonnenes Peptid, bestehend aus einer Kette von Aminosäuren mit einer Sequenz von KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ oder einem haptotaktischen Fragment derselben.
Zusammensetzung, die ein aus Fibrinogen gewonnenes Peptid aufweist, welches aus einer Kette von Aminosäuren mit einer Sequenz von KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ oder einem haptotaktischen Fragment derselben besteht, und die außerdem einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die außerdem ein biologisches Agens aufweist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Arzneimitteln, Vitaminen, Vitaminderivaten, Wachstumsfaktoren, Glukokortikosteroiden, Steroiden, Antibiotika, Toxinen, Enzymen, Enzyminhibitoren, Immunmodulatoren, Immunglobulinen und Fragmenten von diesen, aus Fettsäurederivaten, Polysacchariden, Zellrezeptor-Bindungsmolekülen, entzündungshemmenden Agenzien, Nukleinsäuren und Polynukleotiden besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die außerdem eine Zelle aufweist, welche ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Fibroblasten, Endothelialzellen, Chondrozyten, Neuroblastomzellen, Nierenzellen, Leberzellen, pankreatischen Zellen, Schilddrüsenzellen, Gliazellen, glatten Muskelzellen, Mammakarzinomzellen der Maus, knochenbildenden oder knorpelbildenden Zellen und Kombinationen hieraus besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, bei der der Zelltyp ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Fibroblasten, glatten Muskelzellen, Endothelialzellen, Chondrozyten und Kombinationen hieraus besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, bei der der Zelltyp ein Fibroblast ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2–6 für die Herstellung eines Medikaments, mit dem die Heilung einer Wunde bei einem Patienten gefördert wird.
Zellmatrix, mit: a) einem aus Fibrinogen gewonnenen Peptid, bestehend aus einer Kette von Aminosäuren mit einer Sequenz von KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ oder einem haptotaktischen Fragment derselben; b) einer mit dem Peptid verbundenen Zelle; und c) einer Struktur zum Stützen der Zelle, wobei das Peptid so an der Struktur befestigt wird, dass die Zelle von der Struktur gestützt wird.
Zellmatrix nach Anspruch 8, bei der die Struktur eine biomedizinische Vorrichtung ist.
Zellmatrix nach Anspruch 9, bei der die biomedizinische Vorrichtung eine Prothese ist.
Zellmatrix nach Anspruch 8, bei der die Struktur ein Gel ist.
Zellmatrix nach Anspruch 8, bei der die Struktur eine Schicht aus Collagen ist.
Zusammensetzung zur Beurteilung einer Bindung eines Peptids an einen Rezeptor, mit: a) einem aus Fibrinogen gewonnenen Peptid, bestehend aus einer Kette von Aminosäuren mit einer Sequenz von KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ oder einem haptotaktischen Fragment derselben; und b) einem Reporter zur Übertragung eines Signals, wobei das Peptid mit dem Reporter markiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, bei der der Reporter ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus einem fluoreszierenden Anteil und einem radioaktiven Anteil besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, bei der der Rezeptor ein Protein ist.
Verfahren zur Bestimmung der Bindung eines Peptids an einen Rezeptor, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Bereitstellen des Peptids, das mit einem Reporter markiert ist, um ein Signal zu übertragen, wobei das Peptid ein aus Fibrinogen gewonnenes Peptid ist, das aus einer Kette von Aminosäuren mit einer Sequenz von KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ oder einem haptotaktischen Fragment derselben besteht; b) In-Kontakt-Bringen des Peptids mit dem Rezeptor; und c) Bestimmen der Bindung des Peptids an den Rezeptor gemäß dem Signal, das von dem Reporter übermittelt wird.
Verfahren zum Separieren einer Zelle aus einer Mischung, wobei die Zelle in der Lage ist, sich an ein Peptid zu binden, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Inkubieren der Mischung mit dem Peptid, wobei das Peptid ein aus Fibrinogen gewonnenes Peptid ist, das aus einer Kette von Aminosäuren mit einer Sequenz von KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ oder einem haptotaktischen Fragment derselben besteht, so dass sich die Zelle an das Peptid bindet; und b) Entfernen des Peptids aus der Mischung auf eine solche Weise, dass die Zelle aus der Mischung separiert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Peptid so an einem Stützelement befestigt ist, dass der Schritt des Entfernens des Peptids ausgeführt wird, indem das Stützelement und die Mischung separiert werden.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Stützelement eine Gel-Chromatographiematrix ist.
System zur Bildung einer Kultur einer Zelle, die in der Lage ist, sich an ein Peptid zu binden, mit: a) einer Struktur zur Befestigung des Peptids, wobei das Peptid ein aus Fibrinogen gewonnenes Peptid ist, das aus einer Kette von Aminosäuren mit einer Sequenz von KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ oder einem haptotaktischen Fragment derselben besteht, so dass sich die Zelle an das Peptid bindet und auf der Struktur wächst; und b) einem Kulturmedium, das mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, damit die Zelle ernährt wird.
Polymer mit: a) einer Vielzahl von Untereinheiten, wobei in jeder Untereinheit mindestens ein aus Fibrinogen gewonnenes Peptid vorkommt, das aus einer Kette von Aminosäuren mit einer Sequenz von KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ oder einem haptotaktischen Fragment derselben besteht; und b) einer Vielzahl von Verbindungsanteilen, um jede der mehreren Untereinheiten an einer anderen der mehreren Untereinheiten zu befestigen und damit das Polymer zu bilden.
Polymer nach Anspruch 21, bei dem die Untereinheit aus dem mindestens einen Peptid besteht, so dass das Polymer ein Peptidpolymer ist.
Polymer nach Anspruch 21, bei dem das mindestens eine Peptid an der Untereinheit befestigt ist, so dass das Polymer ein Copolymer ist.