FI91886C - Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi - Google Patents
Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI91886C FI91886C FI872526A FI872526A FI91886C FI 91886 C FI91886 C FI 91886C FI 872526 A FI872526 A FI 872526A FI 872526 A FI872526 A FI 872526A FI 91886 C FI91886 C FI 91886C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- plasminogen activator
- medium
- cell
- culture
- human tissue
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
91886
Menetelmå biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaat-torin tuottamiseksi Tåmå keksint5 koskee menetelmåå biologisesti ak-5 tiivisen kudosplasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi rekombinantti-isånnån solususpensioviljelmåsså, joka yh-distelmå-DNA:ta ilmentåmållå pystyy tuottamaan biologisesti aktiivista ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoria.
Ihmisen kudostyyppiå oleva plasminogeeniaktivaat-10 tori muuttaa plasminogeenin plasmiiniksi. Nåin muodostu-nut plasmiini pilkkoo proteolyyttisesti fibriini matrii-seja, jotka muodostavat verihyytymien perusrakenteen. Ihmisen kudostyyppiå oleva plasminogeeniaktivaattori ai-heuttaa siten vålillisesti verihyytymien liukenemisen ja 15 on siitå syystå hyOdyllinen erilaisten tromboottisten håiribiden hoidossa.
Lyhennys "t-PA" otettiin kåyttdOn ihmisen kudos tyyppiå olevalle plasminogeeniaktivaattorille sen jålkeen kun sitå oli ehdotettu kokouksessa the XXVIII Meeting of 20 the International Committee on Thrombosis and Hemostasis, Bergamo, Italia, 27.6.1982. Tåsså kåytettynå tarkoitetaan termeillå "ihmisen kudostyyppiå oleva plasminogeeniaktivaattori", "ihmisen t-PA", "t-PA", "ihmisen kudoplasmino-geeniaktivaattori" tai "kudosplasminogeeniaktivaattori" 25 ihmisen ulkoa tulevaa (kudostyyppiå olevaa) plasminogee-niaktivaattoria, joka on tuotettu esimerkiksi eriståmållå ja puhdistamalla luonnon låhteestå (katso Collen et al., EP-patenttihakemus nro 41766 (julkaistu 16.12.1981, pe-rustuen ensimmåiseen jåttåmiseen 11.6.1980) ja Rijken et 30 al., Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), jotka lii-tetåån tåhån viitteenå), ja yhdistelmå-DNA:ta sisåltåvien solujen viljelyn menetelmillå, kuten on kuvattu yhdesså molekyylin aminohappojårjestyksen ja muiden ominaisuuk-sien kanssa esimerkiksi EP-patenttihakemusjulkaisussa nro 2 91886 93619, (julkaistu 9.11.1983, perustuen ensimmaiseen jat-tamiseen 5.5.1982), joka liitetaan tahdn viitteena. Termit koskevat myiSs biologisesti aktiivisia ihmisen kudos-tyyppiå olevan plasminogeeniaktivaattorin vastikkeita, 5 jotka eroavat glykosyloituneisuustavan suhteen, jonka ajatellaan riippuvan kaytetyista erityisista viljelyolo-suhteista ja sen tuottajaisannan laadusta, josta ihmisen kudostyyppia oleva plasminogeeniaktivaattori on saatu, ja eroavat kokonaissekvenssiltaan yhden tai useamman amino-10 hapon osalta.
Assigneen laboratorioiden tutkijat ovat tuottaneet ihmisen kudostyyppia olevaa plasminogeeniaktivaattoria kaytannbllisesti katsoen puhtaana proteiineista, joihin se on tavallisesti liittyneena, yhdistelma-DNA-tekniikan 15 avulla prokaryootti- ja eukaryootti-isannissa. (Katso EPA 93619, supra). On olemassa useita syita, joiden vuok-si ihmisen kudostyyppia olevaa palsminogeeniaktivaattoria tuotetaan mieluimmin eukaryoottisissa yhdistelma DNA:n isannisså, kuten esimerkiksi imettavaisen soluissa. Euka-20 ryootti-isånnåt kykenevat yleensa tehokkaasti tunnista- maan ja glykosyloimaan sellaisia maaråttyja aminohappo-jaannbksiå ihmisen kudostyyppia olevassa plasminogeeniak-tivaattorimolekyylissa, jotka ovat tavallisesti glykosy-loituja luonnon tilassa, ja ne muodostavat luonnossa 25 esiintyvat kovalenttiset ristisidokset eri kysteiinijaan- nttsten valille ihmisen kudostyyppia olevassa plasminogee-niaktivaattorimolekyylissa ja aikaansaavat rakenteelle kokonaiskonformaation, joka muistuttaa lahemmin luonnossa esiintyvaa ihmisen kudostyyppia olevaa plasminogeeniakti-: 30 vaattoria. Naita seikkoja pidetaan tarkeina pyrittaessa tuottamaan biologisesti aktiivista ja turvallista ihmisen kudostyyppia olevaa plasminogeenin aktivaattorituotetta.
Ihmisen kudostyyppia olevan plasminogeeniaktivaattorin tuottaminen yhdistelma-DNA:n isantasolujen avulla li 91886 3 ei kuitenkaan ole ongelmatonta. Niinpa on todettu esiin-tyvSn saantoa rajoittavia vaikeuksia, jotka johtuvat sii-ta, etta lhmlsen kudostyyppia olevaa plasminogeeniakti-vaattorla tuottavia soluja on tapana viljelia seerumin, 5 erilaisten veresta tal mulsta eiainkudoksista saatujen fraktioiden tai niiden hydrolysaattien lasna ollessa. Sen johdosta tailaisten solujen erittama ihmisen kudostyyppia oleva plasminogeeniaktivaattori joutuu kosketuksiin suur-ten maarien kanssa seerumin proteiineja ja muita seerumin 10 komponentteja. On todettu, etta tietyt naista komponen- teista aina vaikeuttavat ehjan ihmisen kudostyyppia ole-van plasminogeeniaktivaattorin puhdistamista farmaseutti-sesti hyvaksyttavaan muotoon, koska ne muodostavat vai-keasti jaettavia sitoutuneita aggregaattikomplekseja ih-15 misen, kudostyyppia olevan, plasminogeeniaktivaattorimo-lekyylin kanssa. Nama aggregaatit hairitsevat myOs ihmisen kudostyyppia olevan plasminogeeniaktivaattorimolekyy-lin biologista aktiivisuutta, vahentaen siten kaiken kaikkiaan tavallisesti odotettuja biologisesti aktiivi-20 sen, ehyen, ihmisen, kudostyyppia olevan plasminogeeniaktivaattorin saantoja. Seerumin komponenttien lisaaminen suurentaa my6s epåpuhtauksien maaraa, joka on poistettava puhdistettaessa. Lisaksi monet naista komponenteista ha-joittavat proteolyyttisesti kudostyyppia olevaa plasmino-25 geenin aktivaattoria. Halutun, ihmisen kudostyyppia olevan plasminogeeniaktivaattorin puhdistamiseen naista sys-teemeista liittyy teknisia vaikeuksia, ja se vaatii siten kalliimpia menetelmia.
Naiden havaintojen vuoksi on ehdotettu kaytetta-: 30 vaksi seerumittomia elatusaineita pyrittaessa vaittamaan ongelmia, jotka liittyvat viljeltyjen solujen erittamien endogeenisesti tuotettujen plasminogeeniaktivaattoreiden tuottamiseen ja puhdistamiseen. Katso esimerkiksi 1) EP-patenttihakemusjulkausua nro 113319 (julkaistu 11.6.1984, 4 91886 perustuen ensimm&iseen jattamiseen 30.12.1982), jossa esiteliaan sellaisten seerumista riippumattomien luonnol-llsten ihmisen solulinjojen valmistaminen, jotka eritta-vat endogeenisesti tuotettua ihmisen kudostyyppia olevaa 5 plasminogeeniaktivaattori, 2) US-patenttia 4 232 124, 3) US-patenttia 4 328 314, 4) US-patenttia 4 317 882 ja 5) Gasser et al., In Vitro Cellular and Developmental Biology 21, 588 (1985). Mikaan naista viitteista ei liity solujen kasvatukseen suurella tiheydelia eika etenkaan 10 yhdistelma-DNA:n isantasolujen suspensioviljelmiin. Toi-saalta EP-patenttihakemusjulkaisu nro 112940 (julkaistu 11.6.1984, perustuen ensimmaiseen jattåmiseen 30.12.1982) koskee sellaista menetelmaa ihmisen kudostyyppia olevan plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi, jossa lisataan 15 albumiinia, erasta seerumin proteiinikomponenttia.
Tunnetaan mybs erilaisia keinoja fraktioida solu-viljelmia esimerkiksi seerumin komponenttien poistamisek-si. Katso esimerkiksi Van Reis et al., The Journal of Immunology 133, 758 (1984), joka vahensi plasman proteii-20 nien maaria leukosyyttisolujen viljelmista vahentaen siten raa'an endogeenisesti tuotetun ihmisen gamma-interfe-ronin epapuhtauksia. (Katso myds Van Reis et al.. Methods in Enzymology 119, 77). Marraskuussa 1982, kokouksessa the Third Annual International Congress for Interferon * 25 Research, Miamissa, Floridassa, Van Reis et al. selosti-vat poikittaisvirtaussuodatuksen kayttoa autologisten plasman proteiinien maarien vahentamiseksi otettaessa talteen endogeenisesti tuotettua ihmisen gammaingerfero-nia ihmisen solujen viljelmasta. Talteen saadun interfe--.30 ronin måaråa ei kuitenkaan voitu suurentaa suorittamalla lisaksi poistamista tuottamisen aikana.
Taman keksinndn eraana tarkoituksena on tarjota kayttOOn menetelmia biologisesti aktiivisen, ihmisen kudostyyppia olevan plasminogeeniaktivaattorin (suuresta ii 5 91S86 mittakaavassa tapahtuvaa) tuottamista j a talteenottoa vårten ihmisen kudostyyppia olevaa plasminogeeniaktivaat-toria tuottavien isdntasolujen viljelmasta. Lisaksi taman keksinnOn tarkoituksena on tarjota kayttOdn tailaisia me-5 netelmia sellaisen biologisesti aktiivisen, ihmisen, kudos tyyppi sen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi, joka on suurin piirtein kokonaan ilman proteolyyttista hajoittumista, deglykosylointia, erilaisten proteaasiin-hibiittorien aiheuttamaa inhibitiota ja epapuhtautena 10 esiintyvia seerumin komponentteja ja tailaisten kanssa aggregoitumista.
KeksinnOn mukaiselle menetelmaile on tunnusomaista se, mita patenttivaatimuksessa 1 esitetaan. t-PA:ta tuot-tavia isdntdsoluja, kuten sellaisilla yhdistelma-DNA-vek-15 toreilla transfektoituja, jotka vektorit sisaitavat toi-mintakykyisena ihmisen kudostyyppia olevan plasminogeeniaktivaattorin koodittavan DNA:n, kasvatetaan kasvua ylia-pitavassa elatusaineessa, joka sisaitaa mieluimmin yhden tai useamman sellaisen komponentin, etta ne helpottavat 20 solujen kasvua, mutta haittaavat ilmennetyn ihmisen, kudostyyppia olevan, plasminogeeniaktivaattori-tuotteen talteen saantia ja aktiivisuutta. Suurin piirtein kaikki sellaiset komponentit suljetaan pois ennen viljelya tai poistetaan kasvua yliapitavasta elatusaineesta elatusai-25 neen vaihdon avulla, joka suoritetaan poikittaisvirtaus-suodatuksen avulla, viljelyn aikana. Poistamisen jdikeen isdntdsoluviljelmd sailyttaa ilment&miskyvyn ja solujen lisddntyminen edelleen joko on tarpeen tai ei ole.
Biologisesti aktiivista ihmisen kudostyyppia ole-. 30 vaa plasminogeeniaktivaattoria tuotetaan sen jaikeen an-tamalla sen ilmentyd soluissa, joita yliapidetaan is&n-tdsoluviljelmdssd suurin piirtein ilman haitallisia kom-ponentteja. Biologisesti aktiivinen ihmisen kudostyyppia oleva plasminogeeniaktivaattori eristetaan sitten soluis- 91886 6 ta ennen lisåpuhdistusta, jonka avulla se saadaan sopi-vaksi farmaseuttista antamista vårten.
YllåttSen on tåm&n keksinndn mukaisella menetel-maiia mahdollista tuottaa, ehjflå ihmisen kudostyyppia 5 olevaa plasminogeeniaktivaattoria saantoina, jollaisia aikaisemmin ei ole pidetty mahdollisina. Lisåksi tåmån keksinnbn mukaisilla menetelmilia saadaan biologisesti aktiivista ihmisen kudostyyppia olevaa plasminogeeniakti-vaattoria, joka on koostumukseltaan vahintaa 50-prosent-10 tisesti yksiketjuista muotoa, kun taas ennen naita mene-telmia on saatu tuotetta, jonka koostumuksessa on ollut oleellisesti vahemman yksiketjuista muotoa. Tata pidetaan merkittåvåna, sen lisaksi etta se on yliattavaa, koska se viittaa siihen, etta tassa kysymyksessa olevilla menetel-15 milla saadaan tuotetta, joka ei ole suurin piirtein ol- lenkaan hajoittunut proteolyyttisesti eri katkaisukohdis-ta. Lisaksi materiaalilla, joka on paaasiallisesti yksiketjuista muotoa, nayttaa olevan vahintaan sama tehokkuus kuin kaksiketjuisella materiaalilla ja eiintyy vahemman 20 fibrinogeenin hajottumista, joilla tuloksilla voi olla merkitystå kliinisissa sovellutuksissa.
A. Yleista
Imettavaisisåntasolujen viljelmien tapauksessa . ovat haitalliset elatusaineen komponentit tyypillisesti ' 25 veresta tai muusta eiainkudoksesta peraisin olevia pro- teaaseja, glykosidaaseja, kuten esimerkiksi neuramididaa-si, proteaasien inhibiittoreita, albumiini jne., jotka ovat alkujaan lasna kasvua yliapitavassa elatusaineessa.
Termilia "biologisesti aktiivinen ihmisen kudos-: 30 tyyppia oleva plasminogeeniaktivaattori" tarkoitetaan ylia kuvattua ihmisen kudostyyppia olevaa plasminogeeniaktivaattoria, joka kykenee vSlillisesti aiheuttamaan fibriiniverihyytymien liukenemisen in vivo.
7
Termilia "isantasoluviljelma" tarkoitetaan t-PA:ta tuottavien isantasolujen viljelmaa, kuten esimer-kiksi sellaisten, jotka on transfektoitu ilmentamisvek-torilla, joka sisaitaa toimintakykyisenS kudostyyppina 5 olevan plasminogeeniaktivaattorin koodittavan DNA:n.
"Yhdistelma-DNA:n sisaltavlen isantasolujen viljelma" on "isantasoluviljelma", joka on transfektoitu kudos-tyyppia olevan plasminogeeniaktivaattorin koodittavan DNA:n toimintakykyisena sisaitavaiia ilmentamisvekto-10 rilla. Parhaina pidetaan "yhdistelma-DNA:n sisaitavien isantasolujen suspensioviljelma" -systeemeja.
Isantasoluina kaytetaan yhdistelma-DNA-tekniikan tuloksena ihmisen kudostyyppiå olevaa plasminogeeniak-tivaattoria erittavia kiinalaisen hamsterin munasarjan 15 (CH0-) soluja (katso EPA 93619, supra). (ATCC nro CCL61).
Taman keksinnttn mukaisessa menetelmåssa kasvate-taan ensin isantasoluja, jotka kykenevat tuottamaan ihmisen kudostyyppiå olevaa plasminogeeniaktivaattoria, 20 kasvususpensiona "kasvua tukevassa elatusaineessa". Tå-ma kasvua tukeva elatusaine voi olla mika tahansa nor-maali alalla tunnettu elatusaine tai sellaisen muunnel-ma, joka yliapitaa ihmisen kudostyyppiå olevan plasmi-nogeenin aktivaattorin tuottamiseen kaytetyn nimenomai-25 sen solulinjan viljelmaa. [Katso esimerkiksi ATCC Media Handbook, toim.: Cote et al., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1984).] Imettavaisen solujen kasvua tukeva elatusaine sisaitaa mieluimmin seerumisa-vayksen, kuten esimerkiksi sikiOkautisen vasikan seeru-: 30 mia, tai muun sellaisen lisatyn komponentin, jollaisia tavallisesti kaytetaan helpottamaan solujen kasvua ja 3 91886 jakautumista, kuten esimerkiksi elaimen lihan hydroly-saatteja tai maitoa, kudos- tai elinuutteita, maseroituja hyytymiå tai niiden uutteita jne. Alkuperåinen kasvua tu-keva elatusaine voi my6s olla elatusaine, jossa on mah-5 dollista kasvattaa ja yllåpitåå isåntåsoluja ja ilmentåå ihmisen kudostyyppiå olevaa plasminogeeniaktivaat.toria. Lisåksi voidaan kåyttåå normaalia viljelyainetta, jossa on riittåmåttomåsti glysiiniå ja/tai hypoksantiinia ja/tai tymidiiniå ja/tai joka sisåltåå metotreksaattia, jotta 10 pidettåisiin ylla valintapainetta sellaisten yhdistelmå-DNA-CHO-solujen hyvåksi, jotka sisåltåvåt ilmentåmisvekto-rin, joka kykenee ilmentfimåfin ihmisen kudostyyppista plasminogeenin aktivaattoria samoin kuin vShSisen sitou-tumisaffiniteetin metotreksaattia kohtaan omaavaa di-15 hydrofolaattireduktaasia. Voidaan kåyttåa myds muita mer-kitsijSitå, joita on mahdollista selektoida ja/tai lisåtå. Muita sopivia elatusaineen komponentteja ovat esimerkiksi transferriini, insuliini ja erilaiset metallit.
Sen jålkeen kun isåntåsolut ovat kasvaneet sopi- 20 vaan solutiheyteen, esim. CHO-solujen kohdalla noin 6 7 tiheyteen 1 x 10 /ml - 3 x 10 /ml, haitalliset kompo-nentit kasvua tukevasta elatusaineesta elatusaineen vaihdon avulla, mieluimmin kåyttåen "poikittaisvir-, taussuodatusta". Poikittaisvirtaussuodatus tarkoittaa 25 suodatustapaa, jossa ihmisen kudostyyppiå olevaa plas-minogeeniaktivaattoria tuottavien solujen suspensio virtaa suurin piirtein yhdensuuntaisesti suodattimen kanssa, joka låpaisee suspension muut komponentit kuin solut.
30 Poikkivirtaussuodatusmenetelmålle on tunnusomainen nesteen dynaamisten parametrien ryhmå, johon kuuluvat Re = Reynoldin luku, Yw = seinamånleikkausnopeus, Δρ = paineen pienentyminen ja TMP = paine kalvon låvitse.
Re, Yw ja ΔΡ riippuvat suodatussysteemin geometriasta, 35 virtausolosuhteista ja nesteen ominaisuuksista. Esimerkik- 91886 9 si jos kåytetåån onttokuitusuodatussysteemiå, voidaan nåmå parametrit laskea seuraavasti:
Be - 2eWi«h rw - 5 ΔΡ - eQgLn^nr^ jossa p = solususpension tiheys, Q = suspension kierrå-tysvirta, η3 = suspension dynaaminen viskositeetti, n = onttojen kuitujen lukumåårå, r^ = onton kuidun sisåsåde ja L = onton kuidun pituus. Samankaltaisia yhtåloitå 10 voidaan johtaa muille virtaamistiegeometrioille. Keski- mååråinen paine kalvon låvitse voidaan laskea seuraavasti:
TOP - Pin-Pf-AP/2 - Q£RryA
jossa Pin = tulopaine, Pf = suodoksen paine, Qf = suoda-15 tusnopeus, R = kalvon vastus, A = kalvon pinta-ala ja = suodoksen dynaaminen viskositeetti. Erityisen hyvånå pidetysså suoritusmuodossa valitaan virtaamistien geomet-ria ja kåyttoparametrit siten, ettå saadaan mahdollisimman våhåiseksi solujen kerrostuminen sudatuskalvolle, mikå 20 lisåå erottamismenetelmån tehokkuutta ja saa mahdollisimman våhåiseksi solujen leikkausvaurioitumisen. Solujen kerrostuminen voidaan måårittåå empiirisesti seuraavan yhtålon mukaisesti: : DP - v1/2UVr_2r3/2 25
jossa DP = kerrostumisparametri, γ = kinemaattinen viskositeetti, U = suodatusnopeus, λ = solukonsentraation C
C
empiirinen funktio ja rc = solun såde. Poikittaisvirtaus-suodatusprosessin mååråå siten solususpensio (P, ng, η£, 30 γ» Cc ja r ), kalvon virtuasgeometrian valinta (n, r^, L, R ja A) kåyttoparametrien kontrolli (Qs ja Qf). Erityisen hyvånå pidetysså suoritusmuodossa valitaan virtaamistien geometria ja kåyttoolosuhteet siten, ettå Re < 2100 ja DP < 0,35.
1 O
91886
Haitallisten komponenttien konsentraatiota pienen-netåån poikittaisvirtaussuodatusmenetelmållå, jossa solu-suspensiota kierråtetåån suodatuslaitteen lavitse ja osa virrasta otetaan pois soluttomana suodoksena. Solususpen-5 sion tilavuus voidaan pitåa vakiona lisSSmSllå elatus-ainetta, joka ei sisaiia haitallisia komponentteja. Haitallisten komponenttien lopullinen jaijelle jåanyt osuus voidaan laskea seuraavasti:
‘-W
CP-W
vp jossa Cp = haitallisten komponenttien konsentraatio tuot- tamissuspensiossa, CQ = haitallisten komponenttien alku- 15 perainen konsentraatio solujen kasvususpensiossa, νχ = solususpension tilavuus elatusaineen vaihdon aikana, e = luonnollisen logaritmin kanta, V = vaihtoelatusaineen m tilavuus ja = tuottamissuspension lopullinen tilavuus. Vaihtoelatusaineen tilavuus, joka vaaditaan haitallisten 20 komponenttien konsentraation. pienentamiseksi ennalta maa-ratylle tasolle, voidaan laske seuravasti: \ - WAvp' ; jossa ln = luonnollinen logaritmi. Tasta yhtSldstM kSy 25 ilmi, etta taman keksinnSn erityisen hyvånå pidettyyn suoritusmuotoon kuuluisi solususpension alkukonsentroimi-nen mahdollisimman pieneen arvoon νχ ennen ylla mainittua elatusaineen vaihtoa, jolloin tilavuus pysyy V2dciona. Haitallisten komponenttien konsentraation pienentåminen 30 suoritetaan siten I) konsentroimalla solujen kasvususpen-sio sen alkuperåisestS tilavuudesta V tilavuuteen V ; O Λ II) suorittamalla elatusaineen vaihto tilavuuden pysyessa vakiona ja III) pienentamalla lisaa, jos νχ < V^.
Siten esimerkiksi jos alkuperaisen soluviljelmSn 35 tilavuus on ennen elatusaineen vaihtoa 100 litraa, voidaan
II
„ 91886 saada aikaan kaiken kaikkiaan 10 000-kertainen haital-listen komponenttien konsentraation pieneneminen konsent-roimalla solususpensio 10 litraksi, suorittamalla elatus-aineen vaihto kåyttSen 45 litraa elatusainetta ja kSyttS-5 mSllS tuottamistilavuutta 1000 litraa.
On siten mahdollista mSSråtå kvantitatiivisesti alkuperaisen kasvua tukevan elatusaineen elatusaineen vaihdon aikana laimenemisen kerroin siten, etta haitallis-ten komponenttien maSrS on saadussa isantSsolususpensiossa 10 alle ennalta måSråtyn konsentraation, jolloin saadaan tal-laisten komponenttien haitalliset vaikutukset mahdollisim-man vahaisiksi. Tallaisia laimennuskertomia voidaan mSa-rittaa jokaiselle viljely-erSlle. Esimerkiksi imettavSis-ten solujen viljelyaineet, joihin on lisåtty erilaisia 15 konsentraatioita seerumia, voivat vaatia erilaisia laimen-nuskertoimia ei-toivottujen komponenttien mSårSn pienen-tamiseksi funktionaalisesti vastaaviksi konsentraatioiksi, joissa on mahdollista tuottaa farmaseuttisesti hyvSksytta-vSS ihmisen kudostyvppia olevaa plasminogeeniaktivaattor, 20 ria. NiinpS laimennuskerroin voidaan valita sellaiseksi, etta seerumin maårS on lopullisessa imettSvaisen solujen ilmentamiselatusaineessa esimerkiksi pienempi kuin noin 1 prosentti alkujaan kåytetysta kokonaismååråstå.
. Tassa kaytettSvat suodatuskalvot voivat olla mita 25 tahansa alalia tunnettuja, jotka ovat kalvoltaan ja kon-figuraatioltaan sopivia, niin etta ne kykenevat pitamåån ihmisen kudostyyppiå olevaa plasminogeeniaktivaattoria tuottavat solut, mutta antavat erilaisten haitallisten komponenttien kulkea låpi. Siten voidaan kåyttåa mitå 30 tahansa sopivaa kalvoa, joka mahdollistaa solujen pi-tåttåmisen valituissa nesteen dynaamisissa olosuhteis-sa, mutta antaa haitallisten komponenttien kulkea lå-vitse poistettavaksi. Huokoskoon ylårajaksi sopisi noin 5 mikronia ja alarajaksi noin 0,1 mikronia.
12 91 886
Tuore vaihtoelatusaine on suurin piirtein vailla haitallisia komponentteja. Se ei esimerkiksi sisålla mer-kittåviå mååriå vahingollisia komponentteja, kuten esim. proteaaseja, neuramididaaseja, proteaasien inhibiittorei-5 ta jne. Tallainen elatusaine vaihtelee luonnollisesti sen solutyypin mukaanf jota kåytetåån tuottamaan ihmisen kudostyyppiå olevaa plasminogeenin aktivaattoria, ja se voidaan valita esimerkiksi alalla kåytettåvisså olevista.
Se voi olla sama kuin lopullinen ilmentåmiselatusaine 10 (mukavuussyistå) tai jokin niukempi elatusaine, kuten esimerkiksi puskuroitu, isotooninen suolaliuoselatus-aine.
Esimerkiksi tåsså kuvatuille ihmisen kudostyyppiå olevaa plasminogeenin aktivaattoria tuottaville CHO-soluil-15 le voidaan lopullinen, ilmentåmiselatusaine valmistaa normaalista CHO-solujen viljelyyn kåytettåvåstå elatus-aineesta, johon ei ole lisåtty sikiokautisen vasikan seerumia. Esimerkki lopullisesta ilmentåmiselatusaineesta on seos, jossa on yhtå suuret osat Dulbecco-muunnettua 20 Eaglesin elatusainetta (runsaasti glukoosia) ja Hamin F-12-elatusainetta.
Toisissa suoritusmuodoissa voidaan haitalliset komponentit jattåå pois, tai suurin piirtein kokonaan . jåttåå pois, elatusaineesta ennen viljelyå tai ne voidaan 25 poistaa esimerkiksi sentrifugointi- tai laskeutusmenet-telyjen avulla.
Ihmisen kudostyyppiå oleva plasminogeeniaktivaat-tori eristetåån ja sen jålkeen puhdistetaan ilmentåmiselatusaineesta ja sitå kåytetåån farmaseuttisena vaikut-30 taja-aineena erilaisten verisuonitilojen tai -sairauksien hoitoon.
B. Erityisen hyvåna pidetty suoritusmuoto
Erityisen hyvånå pidetysså suoritusmuodossa CHO-soluja, jotka kykenevåt tuottamaan ihmisen kudostyyppiå 35 olevaa plasminogeeniaktivaattoria, kasvatetaan suspen- ,3 91886 siona CHO-elatusaineessa, johon on lisåtty sikidkautisen vasikan seerumia, ennalta mååråttyyn solujen tiheyteen asti. Solususpensio konsentroidaan sitten poikittaisvir-taussuodatuksen avulla. Tåmån jålkeen poistetaan seerumi 5 konsentroidusta suspensiosta vakiotilavuudessa tapahtu-van poikittaisvirtaussuodatuksen avulla, lisåten jatku-vasti seerumitonta elatusainetta samalla nopeudella kuin seerumia sisåltåvåå elatusainetta poistetaan. Sen jålkeen annetaan seerumittomaan ilmentåmiselatusaineeseen suspen-10 doitujen CHO-solujen tuottaa aktiivista ihmisen kudos-tyyppiS olevaa plasminogeenin aktivaattoria. CHO-solut erittåvåt tålloin tuottamansa ihmisen kudostyyppiå olevan plasminogeenin aktivaattorin ilmentåmiselatusaineeseen ja se voidaan erottaa siitå yleisillå menetelmilla.
15 CHO-solususpensioiden kasvattamisessa kaytetSSn tilavuudeltaan erilaisia viljelyastioita. Kukin viljely-astia on yhdistetty tuloaukkojen kautta huokoisten tan-gentiaalisen virtauksen suodattimien jårjestelmaa, joka on puolestaan yhdistetty ulostuloaukkojen kautta takai-20 sin viljeykammioon. Kasvatuksen jalkeen pumpataan CHO- solususpensiot ja seerumia sisaltavåt elatusaine huokoisten tangentiaalisen virtauksen suodattimien jårjestelmån kautta, ensiksi suspension konsentroimiseksi ja sen jalkeen seerumin komponenttien poistamiseksi suspensiosta 25 elatusaineen vaihdon aikana. CHO-solususpensiota kierrS-tetåån suodattimien ja viljelyastian kautta antaen osan vanhasta elatusaineesta ja seerumin komponenteista pois-tua. Solususpensioon lisStSån taydellykseski tuoretta steriiliå ilmentåmiselatusainetta, joka ei sisallS see-30 rumia, jotta viljelyastiassa saataisiin pidettyå nimellis-tilavuus. Sen jalkeen kun seerumin konsentraatioksi jat-kuvan elatusaineen vaihdon avulla, solut siirretSan steriloitujen putkien kautta toiseen, seerumitonta ilmentåmiselatusainetta sisåltavåån astiaan, jonka elatus-35 aineeseen ihmisen kudostyyppiå oleva plasminogeeni- 14 91886 aktivaattori erittyy. Sen jålkeen ihmisen kudostyyppiå oleva plasminogeeniaktivaattori voidaan poistaa ylei-sillå menetelmilla.
C. Esimerkkeja 5 Solujen kasvatus-, elatusaineen vaihto- ja tuottamis-vaiheet
Kiinalaisen hamsterin munasarjan (CHO-) soluja (ATCC nro CCL61), jotka oli transfektoitu ilmentåmisvek-torilla pETPFR (katso EP 93619 supra) ja ilmensivåt sen 10 vuoksi rekombinantti-t-PA:ta, elvytettiin nesteytetyn typen påållå såilyttåmisen jålkeen ja kasvatettiin ela-tusaineessa, jonka muodosti 1:1-seos Hamin F12- ja Dulbecco-muunnettua Eagle'in elatusainetta. Tåmå seos ei sisåltånyt hypoksantiinia eikå tymidiinia. Elatusaineeseen 15 lisåttiin dialysoitua tai diasuodatettua sikidkautisen naudan seerumia (7 %, tilavuus/tilavuus) ja metotreksaat-tia (500 nMrksi). Soluja kasvatettiin suspensioviljel-mSssa lasiastioissa inuboiden noin 37 °C:ssa. Soluja siir-rostettiin uusiksi viljelmiksi ja populaatiota laajen-20 nettiin tåhan elatusaineeseen joka 3. - 5. paiva. Kun oli kertynyt riittavasti soluja, ne siirrettiin ruostumatonta terastå olevaan 10 l:n kåymisastiaan kasvatettaviksi vie-la noin kolmen paivan ajan. TatS kasvatusvaihetta vårten . elatusaineen koostumusta muutettiin, jotta saataisiin 25 parempia solusaantoja, ja se sisålsi sekå hypoksantiinia ettå tymidiiniå, mutta ei metotreksaattia. Tåhan elatusaineeseen oli lisåtty dialysoimatonta sikidkautisen naudan seerumia (2 %, tilavuus/tilavuus), ja kolme påivåå kestå-vån kasvuvaiheen aikana solupopulaation tiheys kasvoi noin 30 suuruudesta 0,25 x 10® solua/ml noin suuruudeksi 1,0 x 10® solua/ml.
Soluille suoritettiin sitten elatusaineen vaihto kuten aikaisemmin on kuvattu, suspendoiden ne seerumitto-maan tuottamiselatusaineeseen noin 90 tunnin ajaksi. Ela-35 tusaineen vaihto suoritettiin seuraavasti:
II
15 91 886
Onttokuitu-tangentiaalisen virt-auksen suodatin ja siihen liitetyt sisaSntulo- ja poisto-silikonikumiput- ket steriloitiin autoklaavissa ja yhdistettiin sitten 10 l:n tuottamisastiaan hfiyrysteriloitavien liittymien 5 kautta. KSytetty suodatin oli polysulfonionttokuituyksik- ko (valmistaja: A. G. Technology, Inc., suodatin # 1BZE100801AL), joka sisalsi 280 onttoa kuitua, joiden sisahalkaisija oli 0,75 mm ja joissa oli pitkin pituut- ta nimellisesti 0,1 um olevia huokosia. TSmSn yksikSn 2 10 suodatuspinta-ala oli 3 855,5 cm . Soluja kierrStettiin onttojen kuitujen ISvitse ja takaisin astiaan kåyttSen Watson Marlow -kaksilohkoista pumppua. KSytettiin kier-rStysnopeutta suurin piirtein 3,5 litraa minuutissa ja samanaikaisesti osa nesteestM laskettiin pois ja heitet-15 tiin menemaSn kirkkaana suodoksena noin nopeudella 211 ml minuutissa. TSllS tavalla sSilytettiin solut ja pienen-nettiin viljelman tilavuus suurin piirtein 5,2 litraksi. Tana aikana pumpattiin viljelyastiaan tuoretta steriilia seerumitonta elatusainetta (koostumukseltaan samaa kuin 20 aikaisemmin kHytetty, mutta ilman nauhdan seerumia tai siita peraisin olevia komponentteja) noin nopeudella 211 ml minuutissa sailyttaen siten tilavuus ennallaan laimennettaessa jatkuvasti vanhaa elatusainetta.
. Systeemin ISvitse pumpattiin 55 litraa tuoretta ; 25 seerumitonta elatusainetta, jotta saataisiin laskettu seerumin konsentraation pieneneminen noin 190 00 kertai-sesti (tai alle 0,0001 tilavuusprosenttiseksi), kun osa solususpensiosta lisattiin tuoreeseen seerumittomaan elastusaineeseen uuteen ruostumatonta terSsta olevaan • : 30 10 l:n kaymisastiaan. Soluja inkuboitiin sitten tuot- tamisvaihetta vårten noin 90 tunnin ajaksi 37 °C:ssa. Viljelmasta otettiin naytteitS, selkeytettiin sentri-fugoimalla ja sSilytettiin -20 °C:ssa mydhempSS ana-lysointia vårten.
16 91 886
Toisessa esimerkisså, joka suoritettiin rinnak- kaisena, olivat kaikki kåytetyt olosuhteet, solut ja ela- tusaineet samoja, paitsi onttokuitusuodatin. Tassa tapauk- sessa suodatin sisålsi 290 onttoa kuitua ja sen suodatus- 2 5 pinta-ala oli 3 994,8 cm , mutta se oli muuten samanlai-nen kuin yllå kuvattu {valmistaja: A. G. Technology, Inc., suodatin # 1810902 AL).
Analyys imenetelmiå Nåytteitå kåsiteltiin ja analysoitiin, jotta osoi-10 tettaisiin naudan seerumin haitalliset vaikutukset naissa esimerkeisså kSytettyjen CHO-solujen tuottamaan t-PA:han. Seerumittomasta tuottamisvaiheesta peråisin olevia sel-keytetyn soluviljelmånesteen nåytteitå sulatettiin, pelkis-tettiin β-merkaptoetanolilla ja niille suoritettiin S.D.S-15 elektroforeesi kayttMen Laemmlin epåjatkuvaa systeemia (Laemmli, Nature, 227, 680, (1970)). TSllå tavalla ero-tetuille proteiineille suoritettiin hopeavarjays (Morrissey, Anal. Biochem. 117, 307, (1981)) tai ne siirrettiin nitro-selluloosakalvoille (siirto 4 tunnin aikana 8 °C:ssa ja 20 kayttMen 0,5 ampeeria 0,45 μπι:η nitroselluloosalle kSyt-taen seuraavaa menetelmaa: Towbin et al., PNAS 76, 6350, (1979)). t-PA-proteiinit, -proteiinin palaset ja suuren molekyylipainon omaavat kompleksit, jotka sisålsivåt . t-PA:ta, tehtiin silmin nShtåviksi nitroselluloosakalvol- 25 la epasuoran entsyymin kytketyn immunoanalyysimenetelmån avulla, joka voidaan kuvata seuraavasti: Alkuperaista sitoutuneiden t-PA-protelinien ja kaniinin anti-t-PA-vasta-aineen valistå reaktiota seurasi kasittely toisella vasta-aineella. TSma oli piparjuuriperoksidaasiin kytketty : 30 anti-kaniinin IgG (tuotetta vuohissa). Taman reaktion jal- keen seurasi kromoforin 4-Cl-naftoli I^f^jssa ja PBS:n lisåamista varin kehittyminen alueilla, jossa oli sitoutu-nutta vasta-ainetta, minkS avulla saatiin kuva t-PA:n ja siihen liittyneiden proteiinien kulkeutumisesta elektrofo-35 reesissa. Siten voitiin naitS menetelmia kMyttaen måarittåå t-PA:n tila raaoissa viljelynesteissa ilman lisapuhdistusta.
K
17 91 886
Tulokset
Jotta osoitettaisiin sikiokautisen naudan seerumin haitalliset vaikutukset t-PA:han, inkuboitiin tuottamis-vaiheesta perSisin olevia nåytteitå fosfaati11a puskuroi-5 dun suolaliuoksen (PBS) kanssa tai 0,175 tilavuus/tila-vuus-prosentin tai 1,75 tilavuus/tilavuus-prosentin kanssa sikibkautisen nauhdan seerumia 22 tunnin tai 46 tunnin ajan ennen kuin ne analysoitiin kuten ylla on kuvattu. Saadut tulokset ovat nåhtåvisså kuvion 1 hopealla vSrja-10 tyss5 geelissS ja vastaavassa iinmunoblotissa kuviossa 2.
Kuviossa 1 on hopealla varjåtty t-PA-nåytteiden geeli, joka on saatu ylia kuvatulla tavalla.
Kuviossa 2 on immunoblotti kuviossa 1 esitetysta identtisesta geelista.
15 Kuvissa on
Kaista nro Nayte 1 Molekyylipainostandardeja (92,5 kilodaltonia (K), 66,2 K, 45 K, 31 K, 21,5 K, 14,4 K) 2 Autenttisia t-PA-vertailustandardeja 20 3 t-PA:ta sisSltavå solujen viljelyneste (laboratoriovertailunayte) 4 solujen viljelyneste tuottamisvaihenaytteesta 5 tuottamisvaihenayte; inkuboitu 22 tuntia • 37 °C:ssa fosfaatilla puskuroidun suolaliuok- 25 sen (PBS) kanssa 6 tuottamisvaihenayte; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa PBS:n kanssa 7 nollakaista 8 tuottamisvaihenayte; inkuboitu 22 tuntia 30 37 °C:ssa 0,175 prosentin (tilavuus/tilavuus) kanssa sikibkautisen naudan seerumia 9 tuottamisvaihenayte; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa 0,175 prosentin (tilavuus/tilavuus) kanssa FBS:aa 18 91 886 10 0,175 prosenttinen (tilavuus/tilavuus) FBS yksin; inkuboitu 22 tuntia 37 °C:ssa 11 0,175 prosenttinen (tilavuus/tilavuus) FBS yksin; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa 5 12 tuottamisvaihenayte; inkuboitu 22 tuntia 37 °C:ssa 1,75 prosentin (tilavuus/tilavuus) kanssa FBS:aa 13 tuottamisvaihenSyte; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa 1,75 prosentin (tilavuus/tilavuus) 10 kanssa FBS:aa
14 1,75-prosenttinen (tilavuus/tilavuus) FBS
yksin; inkuboitu 22 tuntia 37 °C:ssa 15 1,75-prosenttinen (tilavuus/tilavuus) FBS yksin; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa 15 Kuvioissa 1 ja 2 ovat kaistat 2 ja 3 t-PA-vertailu- standardeja (yksiketjuista t-PA:ta, joka nakyy suuremman molekyylipainon vyShykkeena, ja kaksiketjuista t-PA:ta, joka nakyy pienemman molekyylipainon vyohykkeina).
Haitalliset vaikutukset, jotka on todettu sikid-20 kautisen naudan seerumin (FBS) lansaololla, ovat a) etta se aiheuttaa ehyen t-PA:n haviamista ja samanaikaisesti erilaisten proteolyyttisesti hajoittuneiden muotojen ja niiden palasten kertymista (katso kuvion 2 kaistat . 8 & 9) ja b) etta muodostuu suuremman molekyylipainon * 25 omaavaa kompleksoitunutta materiaalia alueelta 90 - 200 kilodaltonia (katso kuvion 2 kaistoja 12 & 13).
Tuloksista nakyy, etta kun seerumitonta solujen viljelynestetta, joka oli saatu kuten on kuvattu kappa-leessa "Solujen kasvatus-, elatusaineen vaihto- ja tuot-; 30 tamisvaiheet", inkuboitiin PBS:n lasna ollessa 22 tai 46 tunnin ajan, se pysyi suurin piirtein muuttumattomana (katso kuvioiden 1 ja 2 kaistoja 5 ja 6). Siten aiheu-tuu seka t-PA:n proteolyyttista hajoittumista etta suuren molekyylipainon omaavien t-PA:n kompleksien muodostumista, 35 jos sikiokautisen naudan seerumin annetaan jaada tuotta- 91886 1 9 misvaiheen solujenviljelyaineeseen. Nåin olien seerumin polstaminen tSssM kuvatun elatusaineenvaihtomenetelman avulla poistaa suurin piirtein sen haitalliset vaikutukset.
Vaikka edellS olevassa kasitellaån exityisiS parhai-5 na pidettyja suoritusmuotoja, on selvaM, ettei tamS kek-sint$ rajoitu niihin. Alan normaalin ammattitaidon omaa-vat huomaavat, etta esitettyihin suoritusmuotoihin voidaan tehdå erilaisia muunnelmia ja etta sellaisten muunnelmien on tarkoitettu sisSltyvan tSmSn keksinnon piiriin.
Claims (8)
1. Menetelma biologisesti aktiivisen kudosplasmi-nogeeniaktivaattorin tuottamiseksi rekombinantti-is&nnan 5 solususpensioviljelmassa, joka yhdistelma-DNA:ta ilmenta- målia pystyy tuottamaan biologisesti aktiivista ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoria, tunnettu siita, etta a) viljeliaan yhdistelma-DNA:11a transfektoidut 10 kiinalaisen hamsterin munasarjan (CH0-) isantasolut sus- pensioviljelmassa kayttaen kasvua edistavaa elatusainet-ta, joka sallii isantasolujen kasvun ja yliapidon; b) poistetaan mainitun viljelmån elatusaineesta sellaiset alustan komponentit, jotka haittaavat ihmisen 15 kudosplasminogeeniaktivaattorin talteenottoa ja biologis ts aktiivisuutta sailyttaen isanta-solujen ilmentamisky-vyn, poikittaisvirtaussuodatusmenetelmaiia kayttaen suo-datinlaitetta, jossa on sellainen sopiva kalvo, etta so-luviljelmasuspensio kierratetaan suodatinlaitteen lapi ja 20 osa elatusaineesta poistetaan soluttomana suodoksena sa-malla kun soluviljelmasuspension homogeeninen luonne sai-lytetaan; c) suodos korvataan elatusaineella, josta kompo- . nentit, jotka haittaavat ihmisen kudosplasminogeeniakti- * 25 vaattorin talteenottoa ja aktiivisuutta, puuttuvat; ja d) kerataan biologisesti aktiivinen ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattori vaihdetussa elatusaineessa ole-vasta viljelmasta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, :30 tunnettu siita, etta poikittaisvirtaussuodatus suoritetaan laakean suodatuskalvon lapi.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta poikittaisvirtaussuodatus suoritetaan huokoisen onton kuidun seinaman lapi. 91886
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta poikittaisvirtaussuodatus suorltetaan kalvoklerukan lapi.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 5 tunnettu siita, etta kasvua ja solujen lisaanty-mista tukevat elatusaineen komponentit ovat peraisin ve-resta tai kudoksesta tai niiden johdannaisista.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta isantasolut sisaitavat il- 10 mentamisvektorin, joka pystyy ilmentamaan ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattorin ja monistettavan markkerin ja lisaksi solut viljeliaan elatusaineessa, joka on valittu yliapitamaan selektiivisen paineen ennen vaihetta d) so-luille, jotka sisaitavat monistettavaa markkeria monena 15 kopiona.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta monistettava markkeri on di-hydrofolaattireduktaasi, jolla on alhainen sitoutumisaf-finiteetti metotreksaattiin ja etta selektiivisen paineen 20 yliapitamiseksi valittu elatusaine sisaitaå metotreksaat- tia.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta poikittaisvirtausmenetelmai- . le ovat ominaisia solujen kerrostumisparametri, DP, ja 25 joukko nesteen dynaamisia parametreja mukaanlukien Re eli Reynoldin luku, ja etta solususpensio, laite ja laitteen suoritusolosuhteet on valittu siten, etta Re on pienempi kuin 2100 ja DP on pienempi kuin 0,35. 91886
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87164286A | 1986-06-06 | 1986-06-06 | |
| US87164286 | 1986-06-06 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI872526A0 FI872526A0 (fi) | 1987-06-05 |
| FI872526A FI872526A (fi) | 1987-12-07 |
| FI91886B FI91886B (fi) | 1994-05-13 |
| FI91886C true FI91886C (fi) | 1994-08-25 |
Family
ID=25357832
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI872526A FI91886C (fi) | 1986-06-06 | 1987-06-05 | Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5053334A (fi) |
| EP (1) | EP0248675B1 (fi) |
| JP (1) | JPS6332484A (fi) |
| KR (1) | KR930002888B1 (fi) |
| AT (1) | ATE75775T1 (fi) |
| AU (1) | AU601984B2 (fi) |
| DD (1) | DD257087A5 (fi) |
| DE (2) | DE3718939C2 (fi) |
| DK (1) | DK175366B1 (fi) |
| ES (1) | ES2032444T3 (fi) |
| FI (1) | FI91886C (fi) |
| FR (1) | FR2599625B1 (fi) |
| GB (1) | GB2191493B (fi) |
| GR (1) | GR3005245T3 (fi) |
| HU (1) | HU205171B (fi) |
| IE (1) | IE60485B1 (fi) |
| IL (1) | IL82746A (fi) |
| NO (1) | NO170595C (fi) |
| NZ (1) | NZ220547A (fi) |
| PT (1) | PT84991B (fi) |
| ZA (1) | ZA874054B (fi) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT84991B (pt) * | 1986-06-06 | 1990-03-08 | Genentech Inc | Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo |
| JP2576200B2 (ja) * | 1988-03-09 | 1997-01-29 | 味の素株式会社 | 生理活性タンパク質の製造法 |
| EP0338716A3 (en) * | 1988-04-21 | 1990-04-11 | Berlex Laboratories, Inc. | Method and system for the production of non-degraded proteins from mammalian cells |
| DE3829244A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von einkettigem t-pa |
| EP0391080A3 (de) * | 1989-03-07 | 1990-11-07 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung von zweikettigem t-PA |
| GB2249099B (en) * | 1990-09-26 | 1995-05-03 | Squibb & Sons Inc | Squalene synthetase |
| US5677184A (en) * | 1994-04-19 | 1997-10-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | CHO cells that express human LH-RH receptor |
| US6077940A (en) * | 1997-12-24 | 2000-06-20 | Genentech, Inc. | Free solution ligand interaction molecular separation method |
| AU2003218572B2 (en) * | 2002-04-08 | 2009-08-20 | Octane Biotech, Inc. | Automated tissue engineering system |
| PL2343362T3 (pl) * | 2006-07-14 | 2016-11-30 | Udoskonalony sposób hodowania komórek | |
| EP3327132A3 (en) * | 2007-08-09 | 2018-07-18 | Wyeth LLC | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
| CA2787656A1 (en) * | 2010-01-22 | 2011-07-28 | Lonza Walkersville, Inc. | High yield method and apparatus for volume reduction and washing of therapeutic cells using tangential flow filtration |
| US10934519B2 (en) * | 2011-07-29 | 2021-03-02 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Systems, methods and control laws for cell harvesting |
| CN104583386A (zh) * | 2012-08-20 | 2015-04-29 | 泰尔茂比司特公司 | 浓缩穿过细胞生长腔室循环的流体的组分 |
| AU2018324180A1 (en) | 2017-09-01 | 2020-03-19 | Lonza Cologne Gmbh | End-to-end cell therapy automation |
| SG11202106384YA (en) | 2018-12-21 | 2021-07-29 | Octane Biotech Inc | Carousel for modular biologic production units |
| JP2022514761A (ja) | 2018-12-21 | 2022-02-15 | ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド | ウイルスベクターの自動産生方法 |
| WO2020132743A1 (en) | 2018-12-28 | 2020-07-02 | Octane Biotech Inc. | Cell culture and tissue engineering systems with controlled environmental zones |
| CN113498432A (zh) | 2019-02-08 | 2021-10-12 | 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 | 用于自动化生物反应器的细胞浓缩方法和装置 |
| AU2022303345A1 (en) | 2021-07-02 | 2024-01-18 | Combangio, Inc. | Processes for making and using a cellular fibronectin composition |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3904480A (en) * | 1972-10-24 | 1975-09-09 | Lilly Co Eli | Enhanced production of plasminogen activator |
| JPS5329985A (en) * | 1976-08-27 | 1978-03-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | High concentration culturing of yeast |
| JPS5571496A (en) * | 1978-11-24 | 1980-05-29 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Preparation of living substance |
| US4409331A (en) * | 1979-03-28 | 1983-10-11 | Damon Corporation | Preparation of substances with encapsulated cells |
| US4232124A (en) * | 1979-04-23 | 1980-11-04 | Mann George F | Method of producing plasminogen activator |
| DE3015699C2 (de) * | 1979-04-26 | 1982-07-15 | Asahi Kasei Kogyo K.K., Osaka | Herstellung eines Plasminogen-Aktivators |
| JPS5642584A (en) * | 1979-09-18 | 1981-04-20 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Cell cultivation method |
| US4420398A (en) * | 1981-08-13 | 1983-12-13 | American National Red Cross | Filteration method for cell produced antiviral substances |
| IL68561A (en) * | 1982-05-05 | 1991-01-31 | Genentech Inc | Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof |
| JPS5951220A (ja) * | 1982-08-02 | 1984-03-24 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤 |
| US4537860A (en) * | 1982-12-08 | 1985-08-27 | Monsanto Company | Static cell culture maintenance system |
| NZ206699A (en) * | 1982-12-30 | 1989-08-29 | Bio Response Inc | Process for the production of serum independent cell lines |
| IE56716B1 (en) * | 1983-01-19 | 1991-11-20 | Genentech Inc | Method for producing human tpa and expression vectors therefor |
| JPS59121172U (ja) * | 1983-02-04 | 1984-08-15 | ミネソタ・マイニング・アンド・マニユフアクチユアリング・コンパニ− | ケーブル電線被覆の剥離部分のカバー装置 |
| US4546083A (en) * | 1983-04-22 | 1985-10-08 | Stolle Research & Development Corporation | Method and device for cell culture growth |
| PH22337A (en) * | 1983-11-21 | 1988-08-12 | Ciba Geigy Ag | Synthesis of fibrinolytic agents by yeast |
| US4740461A (en) * | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
| US4888115A (en) * | 1983-12-29 | 1989-12-19 | Cuno, Incorporated | Cross-flow filtration |
| US4757005A (en) * | 1984-04-19 | 1988-07-12 | Miles Inc. | Method and cell line for obtaining plasminogen activators |
| DE3676604D1 (de) * | 1985-03-22 | 1991-02-07 | Chiron Corp | Expression von epa in saeugetierzellen. |
| AU593264B2 (en) * | 1985-07-10 | 1990-02-08 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Chromosomal DNA sequence, expression vector for human tissue plasminogen activating factor, cultured cells transfected with same and method of producing said activating factor |
| WO1987001389A1 (en) * | 1985-09-06 | 1987-03-12 | Codon | Methods for the recovery of tissue plasminogen activator |
| JPH07110232B2 (ja) * | 1985-10-14 | 1995-11-29 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置 |
| PT84991B (pt) * | 1986-06-06 | 1990-03-08 | Genentech Inc | Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo |
-
1987
- 1987-06-02 PT PT84991A patent/PT84991B/pt unknown
- 1987-06-02 IL IL8274687A patent/IL82746A/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-03 NZ NZ220547A patent/NZ220547A/en unknown
- 1987-06-03 HU HU872536A patent/HU205171B/hu unknown
- 1987-06-04 KR KR1019870005638A patent/KR930002888B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-06-04 DK DK198702881A patent/DK175366B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 FI FI872526A patent/FI91886C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 FR FR878707905A patent/FR2599625B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 AU AU73872/87A patent/AU601984B2/en not_active Expired
- 1987-06-05 JP JP62142121A patent/JPS6332484A/ja active Granted
- 1987-06-05 IE IE150487A patent/IE60485B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 ES ES198787304995T patent/ES2032444T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 NO NO872395A patent/NO170595C/no unknown
- 1987-06-05 GB GB8713267A patent/GB2191493B/en not_active Revoked
- 1987-06-05 DE DE3718939A patent/DE3718939C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 DE DE8787304995T patent/DE3778758D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 ZA ZA874054A patent/ZA874054B/xx unknown
- 1987-06-05 AT AT87304995T patent/ATE75775T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 DD DD30357587A patent/DD257087A5/de unknown
- 1987-06-05 EP EP87304995A patent/EP0248675B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-05-09 US US07/522,073 patent/US5053334A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-07-21 GR GR920401579T patent/GR3005245T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI91886C (fi) | Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi | |
| RU2222547C2 (ru) | Получение рекомбинантного фактора viii в среде, не содержащей белка | |
| US20050019914A1 (en) | Perfusion process for producing erythropoietin | |
| JP6282467B2 (ja) | タンパク質を生産するための方法 | |
| Ryll et al. | Production of recombinant human interleukin-2 with BHK cells in a hollow fibre and a stirred tank reactor with protein-free medium | |
| JP2003506077A (ja) | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 | |
| EP0254076B1 (en) | Improved recombinant protein production | |
| US5576194A (en) | Recombinant protein production | |
| WO1998006822A1 (en) | Culture medium and use of the same | |
| AU2460702A (en) | A method for the production of pharmaceutically active recombinant proteins | |
| EP1660641B1 (en) | Follicular fluid for prolonged growth and survival of cells for cell therapies | |
| JPH0947284A (ja) | 動物細胞の培養方法 | |
| JP2879906B2 (ja) | プロコラゲナーゼの製造方法 | |
| CN116121183A (zh) | M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用 | |
| JPS61126031A (ja) | コロニ−形成刺激因子の製造法 | |
| WO1994018310A1 (en) | Growth enhancing media supplement for the culture of mammalian cells | |
| JPH05207875A (ja) | 無血清培地 | |
| JPH0532025B2 (fi) | ||
| JPH09252767A (ja) | 無血清培地、動物細胞の培養方法および蛋白質の製造方法 | |
| MXPA98003051A (en) | Preparation of recombinant factor viii in a protei free medium | |
| JPS58146278A (ja) | ウロキナ−ゼの大量製造方法 | |
| JPH05252951A (ja) | プロコラゲナーゼの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| HC | Name/ company changed in application |
Owner name: COURTAULDS COATINGS (HOLDINGS) LIMITED |
|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: GENENTECH, INC. |
|
| MA | Patent expired |