CN116121183A - M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体提供M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用。该M4完全培养基包括基础培养基和UltroserTM Gserum substitute，该基础培养基可以为DMEM/F 12或α‑MEM。M4完全培养基可以实现宫血间充质干细胞的良好增殖，保持细胞活性和增殖能力，为宫血间充质干细胞的后续研究和利用提供基础，降低产品的成本。此外，M4完全培养基成分明确，避免病毒感染的风险，整个细胞培养过程可控。

Description

M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用。
背景技术
子宫内膜间基质细胞(宫血间充质干细胞)是子宫内膜具有高度再生能力的原因，随着女性月经期子宫内膜的脱落混入月经血中。Men-MSCs(Menstrual Blood-DerivedMesenchymal Stem Cells)的起始原料来源于健康女性供者非创伤性方式(月事杯收集)提供的月经血。密度梯度离心从月经血中提取的宫内膜间月经期脱落的成体干细胞，经体外无菌培养扩增合适的细胞代次，扩增培养过程鉴定具有间充质干细胞贴壁增殖、多向分化潜能，间充质干细胞表达的表型蛋白等间充质干细胞生物活性的特征。
现有宫血间充质干细胞的培养方法一般是使用10％胎牛血清进行正常培养，在血清中进行培养的细胞，随着细胞的传代，细胞的增殖能力会下降，同时细胞的三系分化能力也随着下降，另外，血清中的成分不明确，而且是从动物来源的，未知病毒的污染也未可知，血清中的杂质成分在工艺中也无法得到可靠的控制，保存方法也无法稳定，因此其使用中存在的问题较多，在临床使用中这些问题也无法避免，所以开发新的宫血间充质干细胞培养基就显得尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明第一目的在于提供M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用。
本发明的第二目的在提供一种宫血间充质干细胞的培养方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用，该M4完全培养基包括基础培养基和UltroserTM G serum substitute，该基础培养基可以为DMEM/F 12或α-MEM。
本发明还提供一种宫血间充质干细胞的培养方法，该方法利用M4完全培养基作为细胞培养基培养分离得到的宫血间充质干细胞，该M4完全培养基包括基础培养基和UltroserTM G serum substitute，该基础培养基可以为DMEM/F12或α-MEM。
本发明的发明人出乎意料地发现，通过本发明的方法制备的宫血间充质干细胞能显著降低促炎因子IL-1β和IL-6水平。
因此，本发明提供了一种降低促炎因子IL-1β和IL-6水平的方法，其包括向受试者施用通过本发明的方法制备的宫血间充质干细胞。
本发明还提供了通过本发明的方法制备的宫血间充质干细胞在制备用于降低促炎因子IL-1β和IL-6水平的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的技术效果至少为：
经研究发现，在多种血清替代物中，UltroserTM G serum substitute可以替代血清，以DMEM/F12或α-MEM为基础培养基，UltroserTM G serum substitute为培养基添加物，构成的M4完全培养基可以实现宫血间充质干细胞的良好增殖，保持细胞活性和增殖能力，为宫血间充质干细胞的后续研究和利用提供基础，降低产品的成本。此外，M4完全培养基成分明确，避免病毒感染的风险，整个细胞培养过程可控。
本发明提供的宫血间充质干细胞的培养方法简单易操作，仅仅在原有的细胞培养流程中将原培养基替换为M4完全培养基，并不需要额外的特殊操作即可获得大量的宫血间充质干细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中P0代细胞形态学观察结果；
图2为本发明实施例1中P5代细胞形态学观察结果；
图3为本发明实施例1中P10代细胞形态学观察结果。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，″或″的使用意味着″和/或″。此外，术语″包括″及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用，其中，M4完全培养基包括基础培养基和UltroserTM G serum substitute，基础培养基为DMEM/F 12或α-MEM。
UltroserTM G serum substitute为Pall品牌的一种非异种、动物无血清、替代胎牛血清的培养基补充物，含有丰富的生长因子和细胞因子。
在一些实施方式中，UltroserTM G serum substitute在M4培养基中的体积占比为0.5％-4％，优选为2％。该血清替代物以2％的添加量即可替代10％FBS实现宫血间充质干细胞的培养，且取得更优的培养效果。
在优选的实施方式中，基础培养基为DMEM/F12培养基，该培养基可以取得更好的培养效果，细胞活性好，干细胞特性维持稳定，同时扩增效率高。
在优选的实施方式中，为了抑制微生物的生长和杀菌，M4完全培养基还包括抗生素，例如盐酸万古霉素抗生素。
本发明还提供一种宫血间充质干细胞的培养方法，该方法将分离得到的宫血间充质干细胞重悬于M4完全培养基中进行培养，该M4完全培养基包括基础培养基和UltroserTMG serum substitute，该基础培养基为DMEM/F12或α-MEM。
任选地，本发明中所述的基础培养基中进一步添加0.1-0.3％3-氨基丙磺酸钠，以降低炎性因子的表达。
本发明提供的M4完全培养基保存在2-8℃，有效期为14天。
本发明中具体的宫血间充质干细胞的培养方法可以如下：
宫血间充质干细胞的分离：
将宫血样本擦拭消毒转移至生物安全柜中，混匀，经输血器滤网过滤去除黏液及块状物质，收集细胞滤液混匀，取适量计WBC数，将滤液混匀离心弃上清，细胞沉淀用含盐酸万古霉素抗生素的磷酸盐缓冲液(PBS)pH(含抗PBS)重悬，离心清洗2遍，离心参数设定为300g、6min。根据WBC计数结果，加入含抗PBS重悬混匀细胞，调整WBC浓度为(0.20-1.00)×107cells/ml，按体积比2∶1进行密度梯度离心纯化，离心参数设定为700g、30min，吸弃上层溶液，吸取白膜层细胞(单个核细胞)，加入含抗PBS混匀，800g、6min离心。弃上清，加入含抗PBS重悬混匀细胞沉淀，300g、6min离心清洗，清洗完成后，用含抗PBS重悬细胞沉淀混匀合并至1管，300g、6min、离心。用含盐酸万古霉素抗生素的M4完全培养基重悬细胞沉淀获得原代细胞，接种数瓶T75瓶，密度是60.0×106cells/瓶。
宫血间充质干细胞的培养
将上述细胞在37℃，5％CO2的培养箱中培养，对细胞每隔2-3天进行观察换液，当融合度达到70-90％时，用1.2mg/ml重组胰蛋白酶溶液进行消化，按1×106cells/瓶进行传代培养，传到P1时进行细胞冻存，冻存液为90％M4完全培养基和10％二甲基亚砜。保存于液氮罐中，传代至P5细胞用于细胞制剂的制备。
经实验证实，上述培养方法培养宫血间充质干细胞可以最大限度的维持干细胞增殖能力，细胞分化能力，同时细胞的安全性高。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1不同基础培养基、血清或血清替代物组合对宫血干细胞的影响
1.宫血间充质干细胞分离培养
将宫血样本过滤并计数后取滤液离心(2800rpm)，上清备用(2×5ml，病原体质控送检)。血细胞沉淀用PBS(Phosphate Buffer Saline，磷酸缓冲盐溶液)重悬，使用Ficoll密度梯度离心法(Ficoll∶血细胞悬液＝1∶2)分离获取单个核细胞，用PBS洗涤两次并计数，将每份单个核细胞分成八等份，分别使用八种不同组合的体系重悬(分组如下表1)，根据细胞数种瓶。细胞常规培养至大于3×106cells的细胞数量时，进行冻存，培养过程中在相应代次进行其他对应的检测。
血清替代物分别从Gibco/Invitrogen，Helios Bioscience，Pall三个厂家购买，其中，血清替代物-Helios的货号为HPCFDCRL50(UltraGROTM-Advanced)，血清替代物-Pall的货号为15950-017(UltroserTMG serum substitute)，血清替代物-Gibco的货号为1848845。
表1不同培养基的组分
Figure BDA0003985235340000081
2.细胞形态学观察
不同培养体系的宫血间充质干细胞各代次细胞至少观察一次，原代可酌情增加观察次数，观察时需对细胞形态，密度进行记录，并拍照记录，每个代次传代前必须拍照作为原始记录。细胞形态学观察结果P0代如图1所示(DG和MG的P0贴壁细胞量太少，无法扩增，废弃)，P5代如图2所示，P10代如图3所示。可见镜下观察，DF、DP、MF、MP细胞透明度大，折光性强，轮廓清晰，大小均一，前期稍微偏圆，后期呈典型的纺锤形和长梭型；而通过观察，发现DH、MH细胞早期贴壁较少，细胞成片生长，中间有空隙，折光性弱，轮廓不清，细胞逐渐不规则，失去原有特点，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，纤维化严重，细胞表面出现丝状物质；DG、MG：基本无细胞贴壁，PBMC接种20天后无细胞贴壁，无细胞生长。
3.表面标记物、生长曲线/倍增时间检测
各组在P5、P10分别收集大于3×106细胞进行表面标记物检测，包括CD11b(CD：Cluster of Differentiation，白细胞分化抗原)，CD19，CD34，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA-DR(human leukocyte antigen DR，人类白细胞DR抗原)。
结果如下表2所示：
表2不同培养基培养的宫血间充质干细胞表面标记物检测
Figure BDA0003985235340000101
ISCT标准：具有关键表面标志分子，包括：CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD146，并且不具有如下的造血细胞表面标志分子：CD34、CD45、CD14、CD11b，CD79α，CD19和HLA-DR。
DH和MH阴性表面标记CD45均大于2％，不符合ISCT公布的标准，而DP和MP均符合要求。其中一个样本的MP，P5时阳性标记CD105符合要求，而在P10时，低于标准，根据形态学上的分析结果，推测是由于细胞老化引起的。
各组分别收集约1×106个P5、P10细胞用于检测倍增时间。结果如下表3所示。
表3不同培养基培养的宫血间充质干细胞的倍增时间
Figure BDA0003985235340000111
通过倍增时间可以发现，倍增时间最小的是DP或MP，优于血清加基础培养基的传统培养体系，倍增时间均值排序如下：
P5细胞倍增时间：DP＜MF＜MP＜MH＜DF＜DH；
P10细胞倍增时间：MP＜DP＜DF＜DH＜MH＜MF。
实施例2不同基础培养基与血清替代物组合筛选的人宫血间充质干细胞对体外炎症刺激模型的影响
1.实验过程
宫血间充质干细胞与RAW264.7共培养对炎症抑制作用的研究。取对数生长期RAW264.7小鼠巨噬细胞调节至2.5×105cells/ml，2ml/孔接种细胞至6孔板中。待细胞贴壁后，将实验分为3组：Control组(RAW264.7无LPS处理)、LPS模型组(RAW264.7加有效浓度LPS处理最佳时间点)及LPS+MenSCs共培养组(RAW264.7加有效浓度LPS处理，其中LPS造模终浓度0.8μg/ml，作用3h后与MenSCs共培养24h。取出接种有RAW264.7细胞的6孔板，加入0.8μg/ml LPS，继续培养3h后，将接种有MenSCs的Transwell 6孔板小室放入相应接种有RAW264.7细胞的6孔板孔内，继续培养24h后，采用Real-time qPCR法，检测各组IL-1β和IL-6的相对表达。根据mRNA的表达结果初步筛选出对炎症刺激具有抑制作用的MenSCs。
2.实验结果如下表4所示
表4不同培养基培养的宫血间充质干细胞对体外炎症刺激模型的影响
Figure BDA0003985235340000121
成功建立RAW264.7细胞炎症模型后，使用本实验中宫血来源的MenSCs与造模后的RAW264.7细胞共培养，Real-time qPCR结果(表4)提示组合DP、MF、MP培养的MenSCs对应共培养组中促炎因子IL-1β和IL-6表达均分别有一定的一致性，即较DF、DH和MH 3个组合对应共培养组IL-1β、IL-6mRNA均下调较明显。
进一步地，DP、MF、MP组在其基础培养基中添加0.1-0.3％3-氨基丙磺酸钠所培养制备的宫血间充质干细胞均能进一步降低IL-1β、IL-6mRNA表达水平。相对没有添加3-氨基丙磺酸钠的对照组而言，降低10-25％。
实施例3不同基础培养基与血清替代物组合筛选的人宫血间充质干细胞对体内动物模型的影响
1、实验过程
16～18g的C57小鼠64只，随机分成8组，每组8只，雌性，组别为对照组：模型1，模型2；给药组为6个组(方案中6个MenSCs培养体系)。动物适应3～4天开始实验。用PBS配制不同剂量的博来霉素(Bleomycin，BLM)(小鼠的造模体积50μl/只，具体根据体重计算)。动物用3％异弗烷呼吸麻醉。给药组和模型组用加长的200μl无菌枪头气道滴注BLM(小鼠的造模体积50μl，缓慢滴注，对照组给药PBS。造模后，立即旋转动物，使BLM均匀分布，保持动物直立2～3min。动物苏醒恢复正常活动后(约造模后2～4h)，对照组和模型组尾静脉给与生理盐水，给药各组给与相同浓度的6个间充质干细胞。给药后，动物放回笼架常规饲养。造模后28天，所有组别处死，取肺脏，Masson(胶原染色淡蓝色)染色观察胶原的沉淀情况。
2、实验结果如表5所示
表5
Figure BDA0003985235340000141
成功建立小鼠肺纤维化模型后，宫血干细胞尾静脉给药后，胶原的沉淀情况提示DP对肺纤维化的治疗效果最好，MP的效果其次。DP的组合用于宫血干细胞的培养，即98％DMEM/F-12(Gibco)+2％UltroserTM G serum substitute(Pall)，称为M4完全培养基。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.M4完全培养基在宫血间充质干细胞培养中的应用，其中，M4完全培养基包括基础培养基和UltroserTM G serum substitute，所述基础培养基为DMEM/F12或α-MEM。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，UltroserTM G serum substitute在M4培养基中的体积占比为0.5％-4％。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，UltroserTM G serum substitute在M4培养基中的体积占比为2％。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，基础培养基中进一步含有0.1-0.3％3-氨基丙磺酸钠，任选地，所述基础培养基为DMEM/F12。
5.根据权利要求1_4任一项所述的应用，其特征在于，所述M4完全培养基还包括抗生素，优选为盐酸万古霉素抗生素。
6.一种宫血间充质干细胞的培养方法，其特征在于，将分离得到的宫血间充质干细胞重悬于M4完全培养基中进行培养，所述M4完全培养基包括基础培养基和UltroserTM Gserum substitute，所述基础培养基为DMEM/F12或α-MEM。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，当宫血间充质干细胞的融合度达到70％-90％时，用酶消化，按0.5×106～1.5×106cells/瓶进行传代培养。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，宫血间充质干细胞的P1细胞用于冻存。
9.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，宫血间充质干细胞的P5细胞用于细胞制剂的制备。
10.根据权利要求6-9任一项所述的培养方法培养的宫血间充质干细胞在制备用于降低促炎因子IL-1β和IL-6水平的药物中的用途。
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