JPS58146278A - ウロキナ−ゼの大量製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトに出来する細胞を利用して、ウロキナー
ゼを大量にかつ高収率で製造する方法に関するものであ
る。

ウロキナーゼはプラスミノーゲンを活性化する酸素であ
り、諸血栓症の治療剤として有効であるばかりでなく、
近年、制癌剤との併用効果が認められ、その需要は急速
に拡大している。

匠来、ウロキナーゼの工業的製造法として、人尿より単
離精製する方法がよく知られている。しかしながら、人
尿を原料とする従来の方法は、原料の品質が不安定であ
ｐ、衛生上問題も太きく、かつ健康人の尿を大量に入手
することが困難である等の欠点を有している。

一方、ヒトに由来する細胞がウロキナーゼを生産するこ
とが知られている（　Ｍａｒｉａ　Ｂ、　Ｂｅｒ萌ｋａ
ｎｄ　Ｈａｕ　Ｃ，Ｋｗａａｎ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　
Ｉｎｖｅｓｔ、４８　（１９６９）１７４０）。したが
って、ヒトに由来してウロキナーゼを生産する細胞を大
量に培養することによって、ウロキナーゼを工業的に生
産することができる。この方法は、一定した品質の原料
を大量に、衛生上の汚染の危険なく供給することが可能
であり、その工業化技術の確立が期待されている。

従来、ヒトに由来してウロキナーゼを生産する細胞のよ
うな［固定依存性細胞（ａｎｃｈａｒａｇｅｄｅｐｅｎ
ｄｅｎｔ　ｃｅＪ１月を培養するための方法として、シ
ャーレやローラーボトルを培養器として用いる方法がと
られてきた。しかしながら、これらの方法でウロキナー
ゼの工業的生産に必要なだけの大量の細胞を培養するた
めには、故多くのシャーレやローラーボトルを必要とし
、そのそれぞれについて物理化学的な環境を調整し、細
胞植付、培地交換等の操作を正確に、かつ無菌的に行な
わなければならんい等の欠点を有する。

一方、正に荷電したビーズ担体表面に１固定依存性細胞
」を培養する方法（Ａ、Ｌ、　ｖａｎ　Ｗｅｚｚｅｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　２１６　（１９（Ｓ７）　６４　）が知
られている。

この方法は、培養容量に対する培養表面の比を犬さくと
ることができるため、単一の培養槽内で大量の細胞を培
養するのに適している。−１：た培養槽内の物理化学的
環境を均一に調整することができ、必安な操作数を少な
くできるため、「固定依存性細胞」の太液培養の工業化
のために適した方法である。

しかしながら、シャーレやローラーボトルで良好に培養
できた細胞を、そのままの条件で正に荷電し、たビーズ
担体を用いて培養しようとする時、その′ｗｉ養がしば
しば不安定で、時には細１ｊｄが死滅し−Ｃし址うこと
が知られている。この」：うな欠点を有するため、ヒト
に由来してウロキナーゼと生産する細胞を、正に荷電し
罠ビーズ担体表面で大量に、かつ安定に培養することに
よって、ウロキナーゼを大量、高収率かつ安定に生産す
る技術はいまだに確立されていない。

本発明者らは、ヒトに由来してウロキナーゼを生産する
細胞を、正に荷電したビーズ担体表面で増殖させ、ウロ
キナーゼを生産させる技術を開発するため鋭意研究を重
ねた結果、本発明をなすに到った。本発明によれば、上
記の欠点を克服してウロキナーゼを大量、高収率かつ安
定して生産することができる。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明における正に荷電したビーズ担体表面での細胞培
養は、「増殖培養」と「ウロキナーゼ生産培養」の２段
階に分けられる。すなわち、「増殖培養」とは、増殖培
地中で正に荷電したビーズ担体表面に細胞を付着させ、
同表面上で細胞を分裂、増殖させる培養をいう。この「
増殖培養」で細胞を十分に増殖させた後、培地を増殖培
地からウロキナーゼ生産培地におきかえることによシ「
ウロキナーゼ生産培養」となる。この「ウロキナーゼ生
産培養」では、細胞はほとんど増殖しないが、ウロキナ
ーゼ生産培地にウロキナーゼを分　５− 泌しつづける。

本発明に用いられるヒトに由来してウロキナーゼを生産
する細胞には、ヒトの腎臓、心臓、肺、肝臓、包皮、全
胎児に由来する細胞などがある。

なかでもヒトの胎児腎臓に由来する細肪は、ウロキナー
ゼの生産性が高いのでより好ましい。

本発明に用いられる正に荷電したビーズ担体は、ビーズ
本体と正の荷電を４える極性基から成る。

ビーズ本体の材質としては、細胞に直接毒性を与えない
ことが必要であり、このようなものとして、たとえば、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン
、ポリメタリル酸、ポリスルポン、ポリエーテルスルホ
ン、ガラスなどがある。　　。

なかでも架橋デキストランは安全に使用でき、極性基の
導入が簡単に行々えることからよシ好ましい。

ビーズ本体は、直径５０〜１０００μｍ、よシ好ましく
は１００〜３００μｍの球状ないしそれに近い形状のも
のが好ましい。すなわち、直径が小さすぎると曲率が大
きくなるので細胞が付着しに　６− くいし、直径が太きすぎると培養容量あたりの表面積が
小さくなるからである。その比重は、攪拌によって容易
に懸濁できるように１をわずかに超えるものが好ましい
５、正の極性基としては、３級または４級のアミンが好
ましく、このようなものとして、たとえば、ジエチルア
ミノエチル基、ジメチルアミノエチル基、ジエチルアミ
ンメチル基、ジー（ヒドロキシエチル）アミノエチル基
、トリエチル−２−ヒドロキシーアミノグロビル基など
がある。このような正に荷電した細胞培養用のビーズ担
体は市販されている。たとえばファルマシア・ファイン
・ケミカル社のサイトデツクス１（登録商標名）とフロ
ー・ラボラトリ−社のスーパー・ビーズ（登録商標名）
は、ジエチルアミノエチル基を有する架橋デキストラン
ビーズであり、バイト・ラド社のバイオ・キアリア−（
登録商標名）は、ジエチルアミノエチル基を有するポリ
アクリルアミドゲルであり、いずれも本発明に使用する
ことができる。

本発明に用いられる培養槽としては、細胞に対する毒性
がなく、正に荷電したビーズ担体を懸濁させる機構をも
ち、温度、溶存酸素濃度、ｐＨを制御できる機構をもつ
ものが必要である。このような培養槽の材質として、た
とえば、ガラス、ステンレスなどが好ましい。正に荷電
したビーズ担体を懸濁させる機構としては、回転攪拌子
を用いるものが最も普通であるが、培養槽自体を回転さ
せて懸濁させることもできる。

培養に供する細胞は、あらかじめ増殖用培地に懸濁させ
ておかなければならない。そのためには、シャーレ・ロ
ーラーボトル、正に荷電したビーズ担体等を用いて増殖
させておいた細胞をトリプシン等の消化酵素で処理する
。その後、遠心分離で同消化酵素を除き、増殖用培地を
加えて細胞を同培地に懸濁させる。ヒトに由来してウロ
キナーゼを生産するような「固定依存性細胞」は、懸濁
状態では増殖することができず、また不安定であるため
、できるだけ早く正に荷電したビーズ担体表面に付着さ
せなければならガい。

このようにして準備した増殖用培地中の懸濁細胞と正に
荷電したビーズ担体とを、培養槽内に加えることにより
「増殖培養」を開始する。正に荷電したビーズ担体は、
培養容量１　ｍｌ当り乾燥重量で１〜１０〜、より好捷
しくけ２〜５〜加えることが好ましい。また懸濁細胞は
培養容量１　＋ｎｌ当り１０４〜３　Ｘ　１０５個、よ
り好ましくは５　Ｘ　１０４〜１．５　Ｘ　１０４個加
えるのがよい。この条件は、正に荷電したビーズ担体１
個当り数個〜数十個の細胞を付着させるために選ばれる
。

「増殖培養」は攪拌により、懸濁細胞を正に荷電したビ
ーズ担体表面に付着させ、同表面上で細胞を分裂、増殖
させることにより行なわれる。攪拌は正に荷電したビー
ズ担体が懸濁でき、かつ同ビーズ表面に付着した細胞に
損傷を与えないような強さで行ガう。培養温度は２０〜
４０℃、より好１しくに３５〜３８℃で行なう。培養ｐ
Ｈは５〜９、よシ好ましくは６．５〜８に調整する。こ
のようにして「増殖培養」は通常４〜１０日間行なう。

その間、増殖用培地を１〜３回新しいものと交換するか
、新しい培地を連続的に加えることに＝　９　＝ より、細胞の増殖をより促進することができる。

本発明に用いられる増殖用培地は、基本培地、血清、添
加物からなる。基本培地は炭素源、窒素源および無機塩
頻々どからなる。本発明に用いられる基本培地は、通常
の動物細胞の培養に用いられるものでよく、そのような
ものとして、たとえば、ミニマム・エツセンシャル培ｉ
ｌ　　１９９培ｔ４、ハムのＦ−１０培地、ハムのＦ−
１２培地、ＲＰＭ１１６４０培地などがある。これらの
基本培地の組成は、たとえば「組織培養」　（中井準之
助他編集。

朝食書店、１９６７年）に記載されている。

本発明者らは、増殖用培地の基本培地の成分のうちＬ−
グルタミンを別に添加し、最終濃ｆｌｏ、７〜１，５７
／ｌとすることにより、ウロキナーゼの生産量が大幅に
増加することを本発明において見出した。たとえば、ミ
ニマム・エッセンシャル培地は通常Ｌ−グルタミンを０
，２　ｑ　２　ｙ／を含むが、別にＬ−グルタミンを加
え最終濃度１．ＯＹ／ｌとすることによシ、ウロキナー
ゼ生産量は約５０％増加する。ところが、従来のシャー
レを用いた培養−１０− 法では、Ｌ−グルタミンを増加させてもウロキナーゼ生
産量は増加しない。この事実は、本発明に用いられる正
に荷電したビーズ担体を用いる培養法の技術の確立のた
めには、シャーレ法で確立した技術を必ずしもそのまま
適用できないことを示している。

本発明に用いられる増殖用培地には血清が必要である。

血清の種類としては、たとえば、牛胎児、牛新生児、馬
などの血清を用いることができるが、牛胎児の血清が最
も好ましい。血清の濃度は３〜２０　Ｖ／Ｖ％、より好
ましくは５〜１０　Ｖ／Ｖ条加えることにより、細胞は
良好に増殖する。

一方、先に本発明者らは、基本培地にエビダーマルグロ
ースファクタートトランスフエリンを添加することによ
り、必要な血清量を大幅に低減できることを見出してい
る（％願昭５６−８４２７３）。

本発明においても、両物質を増殖用培地に添加すること
により、血清量をｉ　ｏ　ｖ／ｖ％から０．４　Ｖ／Ｖ
チに下けてもウロキナーゼ生産量はほとんど低下シナイ
。エビダーマルグロースファクターの好ましい添加濃度
は０．３〜３７．５μグ／　ｍｌ、より好ましくは０．
５〜３．０μｒ／ｄ、）ランスフェリンの好ましい添加
濃度は０．４〜５０μｙ／ＩＩ＋７！、より好ましくけ
０．８〜２．０μ７／−である。必要な血清量を大幅に
低減できることは、本発明を用いてのウロキナーゼ製造
の工業化をより有利にする。

本発明者らは、「増殖培養」において溶存酸素を制御す
ることが非常に重要であることを本発明において見出し
た。すなわち、「増殖培養」において増殖用培地の溶存
酸素濃度を空気飽和溶存酸素濃度の１５〜６０チに保つ
ことにより、ウロキナーゼ生産量を大幅に増加させるこ
とができる。溶存酸素濃度が空気飽和溶存酸素濃度の１
５〜６０チから外れると、ウロキナーゼ生産量は大きく
減少する。

「増殖培養」で十分に細胞を増殖させた後、培地を増殖
用培地からウロキナーゼ生産培地におきかえることによ
り、「ウロキナーゼ生産培地」を開始する。「ウロキナ
ーゼ生産培養」における攪拌、培養温度、培養ｐＨなど
は、「増殖培養」と同じである。

本発明において用いられるウロキナーゼ生産培地は、基
本培地と添加物からなり、血清は全く使用し々い。基本
培地としては、増殖用培地で用いられたものが使用でき
る。

ウロキナーゼ生産培地の添加物として、たとえば、グリ
シン（特開昭５ｌ−１２８４９０）、フマール酸、リン
ゴ酸、コハク酸、グリコール酸（特開昭５５−７１４９
６）などが報告されている。これらの添加は、本発明に
おいても有効である。特にグリシンとフマール酸を単独
でもあるいは組合わせて添加しても、ウロキナーゼ生産
量を大きく増加させる。この他、ラクトアルブミン加水
分解物も有効な添加物である。

本発明者らは、「ウロキナーゼ生産培養」においても溶
存酸素を制御することは非常に重要であることを本発明
において見出した。すなわち、「ウロキナーゼ生産培養
」においてウロキナーゼ生産培地の溶存酸素濃度を空気
飽和溶存酸素濃度の１０〜８０チに保つことにより、ウ
ロキナーゼ−１３− 生産量を大幅に増加させることができる。「ウロキナー
ゼ生産培養」において溶存酸素濃度がこの範囲から外れ
ると、ウロキナーゼ生産量は大きく減少する。

［ウロキナーゼ生産培養］の期間は通常３０〜６０日で
あるが、１００日を超えることも可能である。ウロキナ
ーゼの生産速度は、生産の後半では次第に遅くなるので
、工業的生産の場合は、最も効率の良い日数が選ばれる
。ウロキナーゼ生産培地は通常２〜１０回に１回新しい
培地と交換するか、あるいは連続的に新しい培地を加え
ることが望ましい。同培地の交換頻度を少なくすること
により、同培地中のウロキナーゼ濃度は増加するが、培
養全期間にわたる総ウロキナーゼ生産量が減少するので
、工業的生産の場合は、最も効率のよい培地交換頻度が
選ばれる。

ウロキナーゼ生産培地に分泌されたウロキナーゼの濃度
の測定は通常用いられるウロキナーゼカ価測定法、たと
えばフィブリン平板法（医薬品研健、第５巻、２９５頁
、１９７４年）などがある。

−１４− このフィブリン平板法とは、フィブリノーゲン溶液にト
ロンビン溶液を混和して凝固させたフィブリン平板上に
被験液を添着させて、室温で約２０時間おいた後、フィ
ブリン溶解窓の大きさを測定し、標準品と比較すること
によって、その力価を算出するものである。ウロキナー
ゼの力価ｔまＩＵ（国際単位）で表示することが一般的
である。

「ウロキナーゼ生産培養」に用いられ、回収されたウロ
キナーゼを含むウロキナーゼ生産培地を梢Ｎすることに
よって、純粋なウロキナーゼを得ることができる。精製
法としては通常用いられる方法、たとえば、吸着法、塩
析法、透析法、クロマトグラフィー法、ゲル渥過法、電
気泳動法などを単独で、あるいは組合わせて行なわれる
。

本発明によって、正に荷電したビーズ担体を用いる培養
法でウロキナーゼを大量、高収率かつ安定して生産がで
きるようになった。本発明の方法１ は、従来法の欠陥である原料尿の濃度が低いこと、健康
な者の品質の安定した尿を大量に集めることが難しいこ
と、尿取扱い上に衛生上の問題があること等の難点が除
かれ、品質の安定した濃度の高い原料液を大量に安定供
給することができ、工業的なウロキナーゼの製造方法と
して好適である。

次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ 本実施例ではシャーレを用いた方法と、正に荷電したビ
ーズ担体を用いる方法の比較を示す。

細胞としてヒト胎児の腎臓に由来する細胞（マイクロバ
イオロジカル・アソシエイッ社）を用い、正に荷電した
ビーズ担体としてファルマシア・ファイン・ケミカル社
のサイトデックス１（登録商標名）を用いた。培養槽は
１０００−のガラス製培養槽に培養容量５００１ｎｔで
行なった。同培養槽は回転攪拌子をそなえ、温度、ｐＨ
１溶存酸素濃度を制御することができる機構を有する。

増殖用培地に懸濁した細胞を５　Ｘ　１０？個、正に荷
電したビーズ担体を乾燥重量で１，２５９培養槽に加え
、増殖用培地を加えることで培養容量を５００−とした
。培養は「増殖培養」と「ウロキナーゼ培養」を通じて
、攪拌回転数６Ｏｒｐｍ、温度３７℃、ｐＨ７、溶存酸
素濃度を空気飽和溶存酸素濃度の４０チに制御して行な
った。増殖用培地は基本培地とシテミニマム・エツセン
シャル培地を用い、Ｌ−グルタミンを１，０９／／＝、
ウシ胎児血清を１０Ｖ／Ｖ％になるように添加した。「
増殖培養」は６日間行ない、途中４口重に増殖用培地を
交換した。

「増殖培養−：終了後、培地を、１９９培地と１２／ｌ
のフマール酸、５９／ｌのラクトアルブミン加水分解物
からなるウロキナーゼ生産培地におきかえて、「ウロキ
ナーゼ生産培養」を開始した。［ウロキナーゼ生産培養
ＪＦｉ５０日間行なった。同期間中に５日に１回、計１
０回、ウロキナーゼ生産培地を新しいものと交換するこ
とにより、ウロキナーゼを含む同培地を５を回収した。

この中に含まれるウロキナーゼは平均３２０■Ｕ／ｌｎ
１．、総量１．６×１０’ＩＵであった。

一方、同時に上記細胞を直径１００ｍ１＋のプラスチッ
クシャーレに、１枚当Ｊ　５　Ｘ　１０５個の細胞を植
え付け、培地量を１枚当り１０ｔＲｔで上と全く同一　
１７− じ培養を行ない、ウロキナーゼを生産させた。その結果
、ウロキナーゼを含むウロキナーゼ生産培地をシャーレ
１枚当り１０〇−回収した。この中に含まれるウロキナ
ーゼは、平均２６５ＩＵ／−１総量はシャーレ１枚当り
２．６５Ｘ１０４ＩＵであった。

この結果から、５００−の培養槽が生産するのと同量の
ウロキナーゼを生産するためには、約６０枚のシャーレ
が必要であることが示される。１基の培養槽に必要な操
作数と、１枚のシャーレに必要な操作数はほとんど等し
いので、同量のウロキナーゼを生産するためにシャーレ
法では約６０倍の操作回数を要することになる。培養槽
１基当りの培養容量を増すことにより、この差はますま
す広がる。本実施例によって、ウロキナーゼの工業的製
造方法として、本発明で用いられる正に荷電したビーズ
担体を用いる方法が好適であることが示される。

実施例２ 本実施例では、増殖用培地中のし一グルタミンー　１８
− の濃度とウロキナーゼ生産量との関係を調べた。

すなわち、０．２　ｑ　２　ｙ／ｌのし一グルタミンを
含むミニマム・エツセンシャル培地に、牛胎児血清ヲ１
ｏ　ｖ／ｖ％加えた増殖用培地を用いる場合を対照とし
た。対照にさらに種々の量のＬ−グルタミンを添加した
実験を行った。その他の実験条件に１、実施例１と同じ
である。結果を第１表に、正に荷電したビーズ担体を用
いる方法、シャー法のそれぞれにつき、ウロキナーゼ生
産量を対照に対する比率で示した。ビーズ担体を用いる
方法では、Ｌ−グルタミン濃度を０．７〜１−５　ｇ／
ｌとすることにより、ウロキナーゼ生産量は大幅に増加
し、特に１、ｏｆ／ｌでは対照に対して約７０％増加す
ることが本実施例で示された。一方、シャーレを用いた
培養法では、Ｌ−グルタミンを増加させてもウロキナー
ゼ生産量は増加しない。

第　１　表　増り１α用培地中のＬ−グルタミン量とウ
ロキナーゼ生産量の関係 実施例３ 本実施例では、増殖用培地の溶存酸素濃度とウロキナー
ゼ生産量との関係を調べた。増殖用培地の溶存酸素濃度
を変化させた以外の実験条件は、実施例１と同様に行な
った。

結果を第２表に示した。ウロキナーゼ生産量は、増殖用
培地の溶存酸素濃度が空気飽和溶存酸素濃度の４０％で
ある場合に対する比率で表わした。

同溶存酸素濃度が１５〜６０％でウロキナーゼ生産量は
大きく、それ以外でウロキナーゼ生産量は大きく減少し
ている。

第　２　表　増殖用培地の溶存酸素濃度（空気飽和溶存
酸素に対するバーセン日とウロキナーゼの相対生産量の
際実施例４ 本実施例では、ウロキナーゼ生産培地の溶存酸素濃度と
ウロキナーゼ生産量との関係を調べた。

ウロキナーゼ生産培地の溶存酸素濃度を変化させた以外
の実験条件は、実施例１と同様に行なった。

結果を第６表に示した。ウロキナーゼ生産量は、ウロキ
ナーゼ生産培地の溶存酸素濃度が空気飽和溶存酸素濃度
の４０％である場合に対する比率で表わした。同溶存酸
素濃度が１０〜８０％でウロ−２１＝ キナーゼ生産量は大きく、それ以外でウロキナーゼ生産
量は太きく減少している。

第　３　表　ウロキナーゼ生産培地の溶存酸素濃度（空
気飽和溶存酸素に対するパーセント）とウロキナーゼの
相対生産量の関係 実施例５ 本実施例では、エビダーマルグロースファクターとトラ
ンスフェリンの増殖用培地への添加効果を調べた。すな
わち、実施例１の増殖用培地の成分中１０　Ｖ／Ｖ％の
牛胎児血清にかわって、エビダーマルグロースファクタ
ー１μｒ／ｒｎ１％　　）ランスフェリ７１μｆ　／ｍ
ｌ　、牛胎児血清０，４　Ｖ／Ｖ％を同培地に添加した
。その他の実験条件は、実施例１と同様に行った。

その結果、ウロキナーゼ生産量は実施例１の場合の９２
％（５０口間の［ウロキナーゼ生埋培養−２２＝ で総量１．４７　Ｘ　１０’　ＩＵ）であった。エビダ
ーマルグロースファクターと）・ランスフェリンを増殖
用培地に加えることにより、血清を１０　ｖ、”ｖ％か
ら２５分の１の０，４　Ｖ／Ｖ％に減じても、ウロキナ
ーゼ生産量はほとんど低下しない。このように必要な血
清量を大幅に低減できることは、本発明を用いてのウロ
キナーゼ製造の工業化をより有利にする。

−２６− ４１７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトに由来してウロキナーゼを生産する細胞を正に
   荷電したビーズ担体表面で増殖させ、ウロキナーゼ生産
   させることを特徴とするウロキナーゼの大量製造方法。 ２、正に荷電したビーズ担体表面で増殖させる際の増殖
   用培地がＬ−グルタミン全０．フ〜１．５グ／を添加配
   合されたものである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、正に荷電したビーズ担体表面で増殖させる際の増殖
   用培地の溶存酸素濃度を空気飽和溶存酸素濃度の１５〜
   ６０チに保持する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、正に荷電したビーズ担体表面でウロキナーゼ生産さ
   せる際のウロキナーゼ生産培地の溶存酸素濃度を空気飽
   和溶存酸素濃度の１０〜８０％に保持する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ５、ヒトに由来してウロキナーゼを生産する細胞がヒト
   胎児の腎臓に由来する細胞である特許請求の範囲第１項
   ないし第４項記載の方法。 ６、正に荷電したビーズ担体表面で増殖させる際の増殖
   用培地がエビダーマルグロースファクターとトランスフ
   ェリンを添加配合されたものである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。