HU205171B - Process for producing biologically active plasminogen activator - Google Patents

Process for producing biologically active plasminogen activator Download PDF

Info

Publication number
HU205171B
HU205171B HU872536A HU253687A HU205171B HU 205171 B HU205171 B HU 205171B HU 872536 A HU872536 A HU 872536A HU 253687 A HU253687 A HU 253687A HU 205171 B HU205171 B HU 205171B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
medium
plasminogen activator
cells
cell
culture
Prior art date
Application number
HU872536A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT43875A (en
Inventor
William R Arathoon
Stuart E Builder
Anthony S Lubiniecki
Reis Robert D Van
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of HUT43875A publication Critical patent/HUT43875A/hu
Publication of HU205171B publication Critical patent/HU205171B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

A jelen találmány olyan eljárásokkal foglalkozik, , amelyneksegítségével biológiailag aktív szöveti típusú plazminogén aktivátort és származékait állítják elő, főleg rekombináns gazdasejtek szuszpenziós tenyészeteiből.
A humán szöveti típusú plazminogén aktivátor a plazminogént plazminná alakítja. Az így előállított plazmin’proteolitikusan hasítja'a fibrin állományt, amely a vérrögök alapanyagát alkotja. A humán szöveti típusú aktivátor ezáltal a vérrögök feloldódásában működik közre, következésképpen hasznos a különböző trombotikus rendellenességekkezelésében.
A „t-PA” rövidítést a humán szöveti típusú plazminogén aktivátorhoz az International Committee on Thrombosis and Hemostasis (Trombózissal Hemosztázissal Foglalkozó Nemzetközi Bizottság) XXVHI. Találkozóján tett javaslatra fogadták el Bergamoban (Olaszország), 1982. július 27-én. Mint itt használjuk a „humán szöveti” típusú „plazminogén aktivátor”, „humán t-PA”, „t-PA”, „humán szöveti plazminogén aktivátor” vágy ^szöveti plazminogén aktivátor” kifejezések humán külső (szöveti típusú) plazminogén aktivátort jelölnék, amelyeket pl. természetes forrásokból állítunk elő extrahálással és tisztítással [lásd Collen és munkatársai: 41766 számú európai szabadalmi közzétételi irat (közzétéve 1981. december 16-án az 1980. június 11-i elsőbenyújtás alapján); és Rijtsen és munkatársai: Jorual of Bioi. Chem. 256,7035 (1981); ezek az irodalmi helyek ebbe a bejelentésbe referenciaként vannak beépítve], vagy rekombináns sejttenyészet rendszerekből állítunk elő, amint ezt a molekula aminosavszekvenciájával és egyéb jellemzőivel együtt leírták pl. a93619 számú európai szabadalmi közzétételi iratban (közzétéve 1983. november 9-én, az 1982. május 54 első benyújtás alapján); ezt az irodalmi helyet is beépítjük referenciaként a jelen bejelentésbe. A fenti kifejezések magukban foglalják a biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátor ekvivalenseket is; ezekaglikozilezési rendszerben különböznek, amelyről úgy véljük, hogy az adott tenyésztési körülményektől függ, valamint annak.a gazdaszervezetnek a természetétől, amelyből a humán szöveti típusú plazminogén aktivátort kinyerjük; és egy vagy több aminosavban különböznek a teljes szekvenciában.
A bejelentő laboratóriumaiban a kutatók rekombináns DNS technológiával prokarióta és eukarióta gazdaszervezetekben olyan humán szöveti típusú plazminogén aktivátort állítottak elő, amelymentes azoktóla fehérjéktől, amelyekkel ez normális módon egyébként társult (lásd a 93619 számú európai közzétételi iratot). Számos ok van arra, hogy a humán szöveti típusú plazminogén aktivátort előnyösen rekombináns eukarióta gazdaszervezetekben, pl. emlős sejtekben állítsuk elő. Azreukarióta gazdaszervezetek általában hatékonyak abban a képességükben, hogy felismerjenek és glikozilezzenek olyan fajlagos aminosav gyököket a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor molekulában, amelyek rendszeresen glikozilezve vannak a természetes állapotban; kialakítsák a természetben előforduló kovalens keresztkötéseket a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor molekula különböző cisztein gyökei között; és sokkal szorosabban közelítsék a natív humán szöveti típusú plazminogén aktivátor általábanos konformációs szerkezetét. Ezekről a jellemvonásokról úgy véljük, hogy fontosak egy biológiailag aktív és biztonságos humán szöveti típusú plazminogén aktivátor termék előállításánál.
A humán szöveti típusú plazminogén aktivátor előállítása rekombináns gazdasejtekből azonban nem mentes kísérő problémáktól. így pl. úgy találták, hogy kitermelés-korlátozó nehézségek vetődnekfel, mivel a humán szöveti típusú plazminogén aktivátort termelő törzseket szokásos módon szérum, különböző vér- és más állati szövet eredetű frakciók, vagy ezek hidrolizátumai jelenlétében tenyésztjük. Ennek következtében az ilyen sejtek által kiválasztott humán szöveti típusú plazminogén aktivátor nagy mennyiségű szérum fehérjének és más szérumkomponenseknek van kitéve. Úgy találták, hogy ezeknek a komponenseknek némelyike állandóan bonyolítja egy ép humán szöveti típusú plazminogén aktivátor tisztítását gyógyászatilag elfogadható formára, mivel ezek nehezen szétválaszthatóan kötött aggregátum komplexeket képeznek a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor molekulával. Ezek az aggregátumok hatással vannak a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor molekula biológiai aktivitására is, így csökkentve általában a biológiailag aktív ép humán szöveti típusú plazminogén aktivátor normálisan elvárt hozamát. Szérumkomponensek hozzáadása növeli a szennyezések mennyiségét is, amelyeket el kell távolítani a tisztítás során. Ezen kívül ezek közül a komponensek közül sok proteolitikusan bontja a szöveti típusú plazminogén aktivátort. A kívánt humán szöveti típusú plazminogén aktivátor tisztítása ezekből a rendszerekből technikai nehézségeket vet fel, következésképpen drágább eljárásokat igényel.
Ezekkel a megfigyelésekkel összhangban szérummentes tápközeget javasoltak a kísérletekben, hogy elkerüljék a problémákat a tenyésztett sejtek által kiválasztott, endogén módon termelt plazminogén aktivátorok termelésében és tisztításában. Lásd pl. 1.) a 113319 számú európai szabadalmi közzétételi iratot (közzétéve 1984. július 11-én, az 1982. december 30-i első bejelentés alapján), amely endogén módon termelt humán szöveti típusú plazminogén aktivátort kiválasztó, szérumtól nem függő természetes humán sejtvonal előállítását ismerteti; 2.) a 4232124 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást; 3.) a 4328314 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást; 4.) a 4317882 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást; és 5.) Gasser és munkatársai közleményét [In Vitro Cellular and Developmental Biology 2 J], 588 (1985). Ezeknek a referenciáknak egyike sem foglalkozik nagysűrííségű sejtnövesztéssel, és főleg rekombináns gazdasejt szuszpenziós tenyészeteivel. Másrészt a 112940 számú európai közzétételi irat (közzétéve 1984. július 11-én, az 1982. december 30-i első bejelentés napján) emberi szöveti típusú plazminogén aktivátor előállításának folyamatára irányul, albuminnak, a szérum egyik fehérje-komponensének hozzáadását foglalva magában.
Javasoltak már olyan eljárásokat is, amelyekben a sejtszaporításl, majd t-Pa termelési és kinyerési fázist magábafoglaló eljárás során igyekeztek a termelési fázis kezdete előtt eltávolítani az említett káros anyagokat vagy legalábbis lényegesen csökkenteni azok koncentrációját részleges vagy teljes közegcsere útján. Más területeken, például interferon termelésével kapcsolatban leírták már a sej ttenyészetek frakcionálását a tápközeg szennyezéseinek vagy más nemkívánatos anyagainak részleges vagy teljes eltávolítására. Lásd pl. Van Reis és munkatársai közleményét [The Journal of Immunology 133, 758 (1984)], ahol csökkentik a plazma-fehérje szintet a leukocita sejttenyészetekből, ezáltal csökkentve a. nyers, endogén módon termelt humán gamma interferon szennyezéseit [lásd még: Van Reis és munkatársai: Methods in Enzymology, 119,77]. 1982 novemberében, Miamiban (Florida), a Third Annual International Congress fór Interferon Research (Az Interferon-kutatás Hl. évenkénti Nemzetközi Kongresszusa) keretében Van Reis és munkatársai beszámoltak a keresztáramú szűrés alkalmazásáról, hogy csökkentsék az ontológ plazmafehérje szintjét az endogén módon termelt humán gamma interferon humán sejttenyészetből való kinyerésében. A kinyert interferon mennyiségét azonban nem tudták növelni további eltávolítással a termelés során.
A jelen találmány célkitűzése az volt, hogy olyan eljárást dolgozzunk ki t-Pa emlős állati gazdasejtek felhasználásával történő előállítására, amely lehetővé teszi egyrészt a felnagyítást nagyüzemi méretekre, másrészt a tápközeg nemkívánatos alkotórészeinek az eljárás szempontjából optimális fázisban történő eltávolítását.
A t-Pa rekombináns emlős állati gazdasejtek felhasználásával történő termelését eddig általában hordozón rögzített gazdasejtkultúrával végezték. Az emlős állati sejtek ugyanis általában nagyméretű, törékeny és bonyolult szerkezetű sejtek, amelyeknek a finom és érzékeny burkoló plazma-hártyáját nem védi szilárd, ellenállóképes sejtfal, ezért az ilyen sejtekkel való dolgozás különleges óvatosságot igényel. Szuszpenzióban való tenyésztésük azért is nehéz, mert ezek a sejtek normális körülmények között egy specializált életmódhoz adaptálódtak egy szervezett állati szövet részeként, kölcsönös függésben sok más sejt specializált funkcióitól és egy olyan cirkulációs rendszertől, amely pontosan beállított, stabil környezetet biztosít valamennyi sejt számára. Szuszpenzióban az egyes sejtek a megszokott környezetükből kiszakítva egészen más életfeltételek közé kerülnek. Mindezekre a körülményekre való tekintettel az emlős állati szöveti sejteket biotechnikai eljárásokban rendszerint hordozóhoz kötött kultrákban alkalmazzák, különösen olyan esetekben, amikor a biotechnikai művelet során még a tápközeg cseréjére is szükség van, amikoris az ilyen csere könnyen megoldható a tápközeg egyszerű dekantálása és új, a káros anyagoktól mentes tápközeggel való helyettesítése útján. A rögzített tenyészetek hátránya azonban, hogy csak korlátozott méretű edényekben folytatható le a velük való dolgozás, ami gátat szab az eljárás nagyüzemi méretű felnagyítása elé.
A találmány alapját az az új felismerésünk képezi, hogy a t-Pa igen jó stabilitású és jó minőségű termék alakjában való termelését lehetővé tevő tápközegcsere megoldható a technológiailag előnyös és nagyüzemi méretre felnagyítható szuszpenziós gazdasejt-kultúrában, az érzékeny gazdasejtek messzemenő kímélése mellett, ha a sejtek szaporodását és fejlődését elősegítő adalékokat is tartalmazó tápközegben történő sejtszaporítás után a tápközeget folyamatos visszakeringtetéses keresztáramú szűrés és friss tápközeg folyamatos hozzávezetése útján cseréljük ki a t-Pa termelése és elkülönítése szempontjából káros anyagokat nem tartalmazó tápközegre, a kultúra homogén szuszpenzió-jellegének folyamatos fenntartása mellett. így jól irányítható technológiai folyamatban megy végbe a sejtszaporítás, majd a t-Pa termelése és kinyerése, és elkerülhető a tápközegcsere szokásos módokon, mint a sejtek kiszűrése vagy kicentrifugálása esetén fellépő sejtkárosodás..
A fentiekben előadottakat összefoglalva tehát a találmány új eljárás biológiailag aktív szöveti típusú plazminogén aktivátor előállítására, rekombináns gazdasejteknek biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátor rekombináns expresszió útján történő termelésére képes szuszpenziós kultúrájában, oly módon, hogy
a) rekombinánsan fertőzött gazdasejteket ismert módon szérum komponenseket is tartalmazó tápközegben szuszpenziós kultúrában tenyésztünk;
2) egy a sejteket visszatartó, de a sejtmentes szűrletet átengedő pórusméretű membránon át keresztáramú szűréssel a sejtkultúrát visszakeringtetve a közeg egy részét sejtmentes szűrlet alakjában eltávolítjuk;
3) miközben az elvezetett szűrletet a szérummentes közeggel folyamatosan pótoljuk;
4) a biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátor expresszióterméket a kicserélt közegű kultúrából kinyerjük.
A biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátort tehát a gazdasejtek olyan tenyészetében fenntartott sejtekben való kifejeződéssel állítjuk elő, amely tenyészet a káros komponensektől mentes. A biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátort ezután a sejtekből izoláljuk a további tisztítás előtt, amely a gyógyászati beadáshoz alkalmassá teszi ezt.
Nem várt módon a jelen találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a tisztított, ép humán szöveti típusú plazminogén aktivátor előállítását olyan hozammal, amelyet eddig nem tartottak elérhetőnek. Ezen túl a jelen találmány szerinti eljárások olyan biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátort szolgáltatnak, amely legalább 50% egyedi lánc formá3
HU 205171 Β val rendelkezik, szemben a jelen eljárások előtt kapott termékkel, amely lényegesen kevesebb egyedi lánc formával rendelkezik. Ez, úgy véljük, nemcsak váratlan, hanem jelentős is, mivel azt jelzi, hogy ezek az eljárások olyan terméket szolgáltatnak, amelyek lényegébenmentesek a proteolitikus bomlástól a különböző hasításihelyeknél. Ezen kívül az az anyag, amely zömmel egyedi lánc formájú, úgy tűnik, legalább azonos hatékonyságú, mint akettős láncú anyag, és kisebb fibrinogén lebontást mutat, amelynek jelentősége lehet akünikai alkalmazásban.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.
A Általános ismertetés
Az emlős gazdasejt tenyészetek esetében a káros tápkozegalkotórészek tipikus avér-és egyéb állati szövet-eredetű proteázok, glikozidázok, mint pl. a neuramidáz, proteáz inhibitorok, albumin, stb., amelyek kezdetben jelen vannak a növekedést serkentő tápközegben.
A „biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátor” kifejezés a fentebb leírt humán szöveti típusú plazminogén aktivátorra vonatkozik, amely képes a fibrin vérrögök in vivő feloldásának előidézésére.
A „gazdasejt-tenyészet” kifejezés t-PA-t termelő gazdasejtek tenyészetére vonatkozik, pl. azokra, amelyek szöveti típusú plazminogén aktivátort kódoló DNS-t működőképesen magában foglaló kifejező vektorral vannak fertőzve. A „rekombináns gazdasejt-tenyészet” olyan „gazdasejt-tenyészet”, amely szöveti típusú plazminogén aktivátort kódoló DNS-t működőképesen magában foglaló kifejező vektorral van fertőzve. A „szuszpenziós rekombináns gazdasejt-tenyészet” rendszerek előnyösek.
Az emlős gazdasejtek széles választékát lehet alkalmazni itt. A megfelelő gazdasejtek előnyösen azok, amelyek képesek fertőződni szöveti típusú plazminogén aktivátort kódoló DNS-t működőképesen magábanfoglaló kifejező vektorral, képesek kifejezni biológiailag aktív szöveti típusú plazminogén aktivátort, és alkalmasak növesztésre és fenntartásra szuszpenziós tenyészetben. Következésképpen bármilyen emlős gazdasejt, amely t-PA-t termel és/vagy rekombináns technikával irányítható arra, hogy rekombináns humán szöveti típusú plazminogén aktivátort termeljen, a jelen találmány oltalmi körén belül van. Az előnyös emlős gazdasejtek közt találjuk a rekombináns humán szöveti típusú plazminogén aktivátort kiválasztó kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket (lásd a fentebb idézett 93619 számú európai szabadalmi közzétételi iratot}(ATCCCCL61).
A jelen találmány szerinti eljárásban a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor termelésére képes sejteket először növesztő szuszpenzióban növesztjük „növekedést serkentő tápközeg-ben. Ez a növekedést serkentő tápközeg lehet bármilyen irodalomban ismert standard tápközeg vagy variációja, amely serkenti a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor előállítására használt adott sejtvonal tenyésztését [lásd pl. az,ATCC Media Handbook” (ATCC Tápközeg Kézikönyv) című kiadványt, szerkesztők: Cote és munkatársai; American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (1984)]. Egy növekedést serkentő tápközeg emlős sejtekhez előnyösen tartalmaz szérumkiegészítéseket, mint pl. borjúembrió szérum, vagy más olyan kiegészítő komponenseket, amelyeket általában alkalmaznak, hogy megkönnyítsék a sejtnövekedését és osztódását, ilyenek pl. állati hús- és tejhidrolizátumok, szövet- vagy szervkivonatok, elbontott vérrögök, vagy kivonataik, stb. A kiindulási növekedést serkentő tápközeg lehet olyan tápközeg is, amely lehetővé teszi a gazdasejtek növesztését és fenntartását és a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor kifejeződését. Ezen kívül egy glicinben és/vagy hipoxantinban és/vagy timidinhen hiányos és/vagy metotrexátot tartalmazó standard növesztő tápközeget lehet alkalmazni, hogy fenntartsuk a szelektív kényszert a humán szöveti típusú plazminogén aktivátort kifejezni képes kifejező vektort, valamint metotrexáthoz kis kötési aktivitással bíró dihidrofolát reduktázt tartalmazó rekombináns CHO sejtekhez. Más szelektálható és/vagy sokszorozható markereket is lehet alkalmazni. Más alkalmas tápközegek közt találjuk pl. a transzferrint, inzulint, és különböző fémeket.
A találmány egyik kiviteli módjában miután a gazdasejteket kinövesztettük megfelelő sejtsűrűségre, pl. 1.10°/ml—3.107/ml CHO sejtre, az ártalmas komponenseket a növekedést serkentő tápközegekben tápközeg-cserével eltávolítjuk, mégpedig „keresztáramú szűrés” révén. A keresztáramú szűrés a szűrés olyan módjára vonatkozik, ahol humán szöveti típusú plazminogén aktivátort termelő sejtek szuszpenziója lényegében párhuzamosan áramlik egy olyan szűrővel, amely áteresztő a szuszpenzíó sejtektől eltérő komponensei számára.
A keresztáramú szűrési eljárást a folyadék dinamikai paramétereinek sorozata jellemzi, beleértve a Re= Reynolds-számot, a yw= fal nyírási sebességet, a ΔΡnyomásesést és a TMP= membránon keresztüli nyomást. A Re, és ΔΡ függ a szűrőrendszer geometriájától, az áramlási körülményektől és a folyadék tulajdonságaitól. így pl. ha üreges rostos szűrőrendszert alkalmazunk, ezeket a paramétereket a következőképpen számíthatjuk ki:
Re=2pQ^snyrh
7w=4QA^rh4
AP=8QDrls/NTrrh 4 ahol p= a sejtszuszpenzió sűrűsége; Qs= a szuszpenzió recirkularizációs áramlási sebessége; η3= a szuszpenzió dinamikus viszkozitása; n= az üreges rostok száma; rh= üreges rost belső sugara; és L= üregest rost hossza. Hasonló egyenleteket lehet levezetni más folyadékutak geometriájához is. Az átlagos membránon keresztüli nyomást a következőképpen lehet kiszámítani:
TMP=Pin-Pf-AP/2=QfR'rlf/A ahol Pin=bemenő nyomás; Pf=szűrlet nyomása; Qf= szűrési sebesség; R= membrán ellenállás; A= memb4
HU 205 171 Β rán terület; és a szűrlet dinamikus viszkozitása. Egy előnyös kiviteli módban az áramlási út geometriáját és a működési paramétereket úgy választjuk meg, hogy a sejt lerakódását a szűrőmembránra minimálissá tegyük, ezáltal megnöveljük az elválasztási folyamat hatékonyságát és minimálisra csökkentsük a nyírás által indukált sejtkárosodást. A sejtlerakódást empirikusan a következőképpen lehet meghatározni:
DP=v^2UVrc 2v3/2 aholDP= lerakodási paraméter; v= kinematikus viszkozitás; U= szűrési sebesség; λ= a Cc sejtkoncentráció empirikus függvénye; rc= sejtsugár. Ennélfogva a keresztáramú szűrési folyamatot a sejtszuszpenzió (p, η5, ηΓ, λ, Cc és rc), a membrán és az áramlási geometria kiválasztása (n, r,v L, R és A), valamint a műveleti paraméterek kontrolijai (Qs és Qf) határozzák meg. Egy előnyös kiviteli formában az áramlási út geometriáját és a műveleti körülményeket úgy választjuk meg, hogy a Re 2100 és DP 0,35 legyen.
A káros komponensek koncentrációja csökken olyan keresztáramlású szűrési eljárás révén, amelyben a sejtszuszpenzió recirkulál a szűrőberendezésen át és az áramlás egy részét elvonjuk, mivel sejtmentes szűrlet. Konstans sejtszuszpenzió térfogatot tarthatunk fenn olyan tápközeg hozzáadásával, amely nem tartalmaz káros komponenseket. A káros komponensek végső maradék hányadosát a következőképpen lehet kiszámítani.
Cp-lC^e-Vyi/V ahol Cp= a káros alkotórészek koncentrációja a termelő szuszpenzióban; Co= a káros alkotórészek kiindulási koncentrációja a sejtnövesztő szuszpenzióban; Vx= a sejtszuszpenzió térfogata a tápközeg-csere során; e= a természetes logaritmus alapja; Vm= a csere tápközeg térfogata; és Vp= a termelő szuszpenzió végső térfogata. A káros alkotórészek koncentrációjának előre meghatározott szintre való csökkentéséhez szükséges csere-tápközeg térfogatát az alábbi képlettel számíthatjuk ki:
Vm=Vxln(C0Vx/CpVp) ahol ln= természetes logaritmus. Ebből az egyenletből nyilvánvaló, hogy ennek a találmánynak előnyös kiviteli módja magában foglalja a sejtszuszpenzió kezdeti koncentrációjának minimális Vx értékre való csökkentését a fentebb említett konstans térfogatú tápközeg-csere előtt. A káros alkotórészek koncentrációjának csökkentését így a következőképpen hajtjuk végre;
I. a sejtnövesztő szuszpenziót koncentrál juk eredeti Vo térfogatáról Vx-re; Π. állandó térfogatú tápközegcserét hajtunk végre; és Hl. további csökkentést végzünk, ha Vx V .
így pl. ha a Kezdeti sejttenyészet térfogata a tápközegcsere előtt 100 liter, a káros alkotórészek 10000szeres általános csökkentését érhetjük el, ha a sejtszuszpenziót 10 literre csökkentjük, 45 liter tápközeget használva tápközegcserét hajtunk végre, és 1000 liter termelési térfogatot alkalmazunk.
Így tehát lehetséges kvantitatívan meghatározni a kezdeti növekedést serkentő tápközeg hígítási tényezőjét a tápközeg-csere során úgy, hogy a káros alkotórészek mennyisége az így létrejövő gazdasejt-szuszpenzióban egy előre meghatározott koncentráció alatt legyen, ezáltal az ilyen komponensek kedvezőtlen hatásai minimálisak legyenek. Az ilyen hígítási tényezőket meglehet határozni a növesztő tápközegek minden egyes tételénél. így pl. különböző szérumkoncentrációkkal kiegészített emlős-sejtnövesztő tápközegek különböző hígítási faktorokat igényelnek, hogy a nem kívánatos komponensek mennyisége csökkenjen olyan funkcionálisan ekvivalens koncentrációkra, amely lehetővé teszi a gyógyászatilag elfogadható humán szöveti típusú plazminogén aktivátor előállítását. Következésképpen a hígítási faktort olyan módon lehet megválasztani, hogy a szérum mennyisége a végső emlőssejt kifejező tápközegben pl. az eredetileg alkalmazott tel jes mennyiségnek kevesebb, mint 1%-a legyen.
Az itt alkalmazott szűrőmembrán bármilyen olyan membrán lehet, amely a szakterületen ismert és megfelelő membránnal és elrendezéssel bír úgy, hogy képes legyen visszatartani a humán szöveti típusú plazminogén aktivátort termelő sejteket, és közben tegye lehetővé a különböző káros alkotórészeknek, hogy áthatoljanak rajta. így lehet alkalmazni bármilyen megfelelő membránt, amely lehetővé teszi a sejtek visszatartását a folyadék kiválasztott dinamikus körülményei között, miközben lehetővé teszi a káros komponensek áthatolását az eltávolítás érdekében. A pórusméret felső határaként mintegy 5 mikron, és alsó határaként mintegy 0,1 mikron lehet alkalmas.
A friss csere-tápközeg lényegében mentes a káros komponensektől. így pl. ez nem tartalmaz semmiféle káros komponenst jelentős mennyiségben, pl. proteázokat, neuramidinázokat, proteáz inhibitorokat stb. Az ilyen tápközegek, pl. változhatnak a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor előállításához használt sejt típusával, és olyan tápközegek közül lehet kiválasztani ezeket, amelyek pl. a szakterületen rendelkezésre állnak. Ez lehet azonos, mint a végső kifejező tápközeg (ez kényelem szempontjából előnyös), vagy valamivel kevésbé gazdag tápközeg, mint pl. pufferolt izotóniás fiziológiás sóoldat.
Az itt leírt, humán szöveti típusú plazminogén aktivátort termelő CHO sejtekhez pl. végső kifejező tápközeget lehet kialakítani CHO sejtek tenyésztéséhez alkalmas standard tápközegből, amely nincs kiegészítve borjúembrió-szérummal. A végső kifejező tápközegre példa egy olyan keverék, amely azonos arányban tartalmaz Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközeget (nagy glükóz-tartalmú) és Ham-féle F-12 tápközeget.
A humán szöveti típusú plazminogén aktivátort izoláljuk, majd ezt követően tisztítjuk a kifejező tápközegből, és gyógyászati szerként alkalmazzuk különböző érrendszeri állapotok vagy betegségek kezelésére.
B. Előnyös kiviteli mód
Egy előnyös kiviteli módban humán szöveti típusú plazminogén aktivátor termelésére képes CHO sejteket növesztünk, mint szuszpenziőt borjú-embrió szérummal kigészített CHO tápközegben, előre meghatá5
HU 205171 Β rozott sejtsűrűségre. A sejtszuszpenziót azután keresztáramlású szűréssel koncentráljuk. A szérumot ezután eltávolítjuk a koncentrált szuszpenzióból állandó térfogatú keresztáramlású szűréssel, miközben folyamatosan adjuk be a szérummentes tápközeget azonos sebességgel, ahogy a szérumot tartalmazó tápközeget eltávolítjuk. Ezt követően aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátor termeló'dik a szérummentes kifejező tápközegben szuszpendált CHO sejtekrévén. Azígy termelthumán szöveti típusú plazminogén aktivátort a CHO sejtek a kifejező tápközegbe választjákki, és ezt standard technikákkal lehet elkülöníteni.
Különböző kapacitású tenyésztőedényeket alkalmazunk CHO sejtek szuszpenziójának növesztéséhez. Az egyes tenyésztő edények bemenő nyílásán keresztül porózus, tangenciális áramlású szűrők rendszerével van összekötve, amely viszont a kimenő nyílásokon keresztül visszafel&össze van kötve a tenyésztő kamrával. Növesztés után a CHO sejteket és szérumot tartalmazó tápközeget átszivatjuk a porózus, tangenciális áramlású szűrők rendszerén először azért, hogy a szuszpenziót koncentráljuk, majd azért, hogy a szérum-komponenseket eltávolítsuk a szuszpenzióból a tápközeg-csere során. A CHO sejtszuszpenziót a szűrőkön és a tenyésztő edényen át recirkuláljuk, lehetővé téve,hogy arégi tápközeg és a szérum komponensek egy részét eltávolítsuk. A friss, steril kifejező tápközeg, amely szérumot nem tartalmaz, utánpótlását a sejtszuszpenzióhoz adjuk, hogy fenntartsuk a tenyésztő edény névleges térfogatát. Miután a szérumkoncentrációt ilyen módon az előre meghatározott koncentrációra csökkentettük folyamatos tápközegcserével, a sejteket sterilezett csöveken át másik edénybe visszük át, amely szérummentes kifejező tápközeget tartalmaz, amelybe a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor kiválasztódik. Ezután a humán szöveti típusú plazminogén aktivátort standard technikákkal eltávolítjuk.
C. Példák
Sejtnövesztés, tápközeg-csere és termelő fázisok pETPFR kifejező vektorral (lásd a fentebb idézett
93619 számú európai szabadalmi közzétételi iratot) fertőzött és ezáltal rekombináns t-PA-t kifejező kínai hörcsög petefészek sejteket (ATCC CCL61) a folyékony nitrogénben való tárolási formából felélesztünk, és olyan tápközegben növesztünk, amely Ham-féle F12 és Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközeg 1:1 arányú keverékét tartalmazza. Ez a keverék nem tartalmaz hipoxantint vagy timidint. Dializált vagy dialízissel szűrt borjúembriószérumot [7% (térfogat/térfogat)] és metotrexátot (500 mmól/l-ig) adunk a tápközeghez. A sejteket szuszpenziós tenyészetben növesztjük üvegedényekben, mintegy 37 °C hőmérsékleten inkuhálva. Asejteket tovább tenyésztjük és a populációt kiterjesztjük ebben a tápközegben minden 3-5 napon. Amikor elegendő sejt gyülemlett fel, ezeket 10 literes rozsdamentes acél fermentorba visszük át, mintegy három napon át tartó további növesztés céljából. Ehhez a növesztési fázishoz a tápközeg össze6 tételét megváltoztatjuk, hogy jobb sejtkitermelést adjon; ez tartalmaz mind hipoxantint, mind timidint, de nem tartalmaz metotrexátot. Ebbe a tápközegbe nem dializált borjúembrió szérumot építünk be [2% (térfogat/térfogat)], és a három napos növesztő fázis után a sejtpopuláció sűrűsége mintegy 0,25.106 sejt/ml-ről mintegy 1,0.106 sejt/ml-re növekszik.
A sejteket azután tápközeg-cserének vetjük alá, amint ezt korábban leírtuk, újra szuszpendálva szérummentes termelő tápközegben mintegy 90 órán át A tápközeg-cserét a következőképpen hajtjuk végre.
Egy üreges rost tangenciális áramlású szűrőt és hozzá csatlakozó bemenő és kimenő szilikongumi csöveket autoklávban sterilezőnk, majd a 10 literes termelő edényhez csatlakoztatjuk gőzzel sterílezhető kötésekkel. Az alkalmazott szűrő poliszulfon üreges rost szűrőegység (gyártó: A G. Technology, Inc., 1BZE100801AL számú szűrő), amely 280 üreges rostot tartalmaz 0,75 mm belső átmérővel, és névlegesen 0,1 pm-es pórusokat hosszuk mentén. Ez az egység -0,386 m2 (4,15 négyzetláb) szűrési területtel rendelkezik A sejteket recirkuláltatjuk az üreges rostokon át és vissza az edénybe, Watson-Marlow kétcsavaros szivattyú alkalmazásával. Mintegy 3,5 liter/percrecírkulációs sebességet alkalmazunk, és ugyanakkor a folyadék egy részét kivonjuk és tiszta szőriéiként elvezetjük 211 ml/perc sebességgel. Ezen a módon a sejteket visszatartjuk és a tenyészet térfogatát mintegy 5,2 literre csökkentjük. Ugyanekkor friss, steril, szérummentes tápközeget (azonos összetételű, mint amelyet fentebb használtunk, de szarvasmarha szérumot vagy ebből származó alkotórészeket nem tartalmaz) szivattyúzunk a tenyésztő edénybe mintegy 211 ml/perc sebességgel, így tartva fenn a térfogatot, ugyanakkor állandóan hígítva a régi tápközeget.
liter friss, szérummentes tápközeget szivattyúzunk át a rendszeren, hogy mintegy 190000-szeres (vagy kevesebb, mint 0,0001 térfogat%) számított csökkenést kapjunk a szérumkoncentrációban, amikor a sejtszuszpenzió egy alikvotját adjukfriss tápközeghez egy külön 10 literes rozsdamentes acél fermentorban. Asejteket ezután a termelő fázishozinkubáljuk 90 órán át 37 ’C hőmérsékleten. Mintákat veszünk ki a tenyészetből, centrifugálással tisztítjuk és -20 ’C hőmérsékleten tároljuk a későbbi elemzésig.
Egy másik példában, amely a fentivel párhuzamosan fut, minden körülmény, sejt és tápközeg hasonló az üreges rost szűrő kivételével. Ebben az esetben a szűrő 290 üreges rostot tartalmaz és -0,4 m2 (4,3 négyzetláb) területű, de egyébként hasonló a fentebb leírt szűrőhöz (gyártó: A G. Technology, Inc., 1810902AL számú szűrő).
Az elemzés módszerei
A mintákat kezeljük és elemezzük, hogy bemutassuk a szarvasmarha szérum káros hatásait az ezekben a példákban alkalmazott CHO sejtek által termelt tPA-ra. A szérummentes termelő fázisból származó, derített sejttenyészet folyadék mintáit lefagyasztjuk, β-merkapto-etanollal redukáljuk, és SDS elektroforézisnek vetjük alá Laemmli szakaszos rendszerét alkal1
HU 205 171 Β mazva [Laemmli: Natúré, 227,680 (1970)]. Az ezen a módon elkülönített fehérjéket ezüst festésnek vetjük alá [Morríssey: Anal. Biochem. 117,307 (1981)], vagy nitrocellulóz lapra visszük át [átvitel 4 órán át, 8 ’C hőmérsékletnél 0,5 amperrel 0,45 pm-es nitrocellu- 5 lózra, Towbin és munkatársai módszerét alkalmazva; PNAS 76,6350 (1979)]. A t-PA-t tartalmazó t-PAfehérjéket, fehérje-fragmentumokat és nagy molekulatömegű komplexeket közvetett, enzimmel kapcsolt immunassay technikával tesszük láthatóvá a nitrocel- 10 lulóz lapon. Akezdeti reakciót kötött t-PA fehér jékkel és nyúl anti-t-PA-antitesttel egy második antitesttel végzett kezeléssel követjük. Ez a második antitest torma-peroxidázzal összekapcsolt anti-nyúl IgG (kecskékben kialakított). Ez után a reakció után a H2O2- 15 ben és PBS-ben levő 44-Cl-naf tol kromofór hozzáadása szín kifejlődését eredményezi a kötött antitest területein, ezzel mutatva be a t-PA és társult fehérjéi elektroforetikus elrendezését. így ezeket a technikákat alkalmazva a t-PA állapotát a nyers tenyészfolyadékban további tisztítás nélkül meg lehet határozni.
Eredmények
Hogy bemutassuk a borjúembrió szérum káros hatásait a t-PA-ra, a termelő fázisból vett mintákat foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS), vagy 0,175% (térfogat/térfogat) borjúembrió, szérummal, vagy 1,75% (térfogat/térfogat) borjúembrió szérummal inkubáljuk 22 órával vagy 46 órával a fentebb leírtak szerinti elemzés előtt. Ennek eredményeit az 1. ábra ezüsttel festett géljein és a 2. ábra megfelelő immun-foltjain mutatjuk be.
Az 1. ábra a fentebb leírt módon kapott t-PA minták ezüsttel festett gélje,
A 2. ábra az 1. ábrában bemutatottal azonos gél immunfolt térképe.
Avonal száma Minta
Molekulatömeg-standardok [92,5 kilodalton (K),; 66,2K; 45 K; 31K;
21,5 K; 14,4 K]
Autentikus t-PA referencia standardok t-PA-t tartalmazó sejttenyészet folyadék (laboratóriumi referencia)
Sejttenyészet folyadék termelő fázisú mintából . Termelő fázisú minta. 22 órás inkubálás 37 ’C hőmérsékleten foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS)
Termelő fázisú minta. 46 órás inkubálás 37 ’C hőmérsékleten PBS-ben
Vak csík
Termelő fázisú minta. 22 órás inkubálás 37 ’C hőmérsékleten 0,175% (térfogat/térfogat) borjúembrió-szérumos közegben (PBS).
Termelő fázisú minta. 46 órás inkubálás 37 ’C hőmérsékleten 0,175% (térfogat/térfogat) FBS-ben.
0,175% (térfogat/térfogat) FBS egyedül. Inkubálás 22 órán át 37 ’Chőmérsékleten
0,175% (térfogat/térfogat) FBS egyedül. Inkubálás 46 órán át 37 ’C hőmérsékleten
Termelő fázisú minta. Inkubálás 46 órán át 1,75% (térfogat/térfogat) FBSben.
Termelő fázisú minta. Inkubálás 46 órán át 1,75% (térfogat/térfogat) FBSben.
1,75% (térfogat/térfogat) FBS egyedül. Inkubálás 22 órán át 37 ’C hőmér- . sékleten
1,75% (térfogat/térfogat) FBS egyedül, Inkubálás 46 órán át 37 ’C hőmérsékleten << Az 1. es 2. ábrákban a 2. és 3. vonalak a t-PA referencia standardok (egyedi láncú t-PA, amely a nagyobb molekulatömegű csíkot mutatja, és kettős láncú t-PA, amely a kisebb molekulatömegű csíkot mutatja).
A jelen levő borjúembrió szérum (FBS) megfigyelt káros hatásai az alábbiak: a) az ép t-PA eltűnését idézi elő a különböző proteolitikusan hasított formák és 55 fragmentumaik ezzel együtt járó felgyülemlésével (lásd a 2. ábra 8. és 9. vonalait); és b) nagyobb molekulatömegű komplex anyag képződése 90-200 K dalton mérettartomáynban (lásd a 2. ábra 12. és 13. vonalait).
Az eredmények azt mutatják, hogy amikor a fen- 60 tebb léírt módon (lásd: Sejtnövesztés, tápközeg-csere és termelő fázisok) kapott szérummentes sejttenyészet folyadékot PBS jelenlétében inkubáljuk 22 vagy 46 órán át, ez lényegében változatlan marad (lásd az I. és 2. ábra 5. és 6. vonalait). Ugyanakkor a t-PA-nak mind proteolitikus lebomlása, mind nagy molekulatömegű komplex-képzése lejátszódik, ha engedjük, hogy borjúembríó-szérum maradjon a termelő fázisú sejttenyészet tápközegben. Ennek megfelelően a szérum eltávolítása az itt leírt tápközeg-csere eljárással lényegében eltávolítja annak káros hatásait is.
A találmány szerinti eljárásnak a t-Pa eddig ismert
HU 205171 Β előállítási módjaival szembeni lényeges jellemzője, hogy a transzformált gazdasejteket a tápközegben szuszpendálva alkalmazzuk és a sejteket az egész eljárás (sejtszaporítás szérumtartalmú tápközegben, tápközegcsere és t-Pa termelés a káros alkotórészektől 5 messzemenőenmentesített tápközegben) során homogén szuszpenzióban tartjuk. Anagy méretekben történő termelést lehetővé tevő szuszpenziós sejtkultúra esetében a szuszpenzió homogén jellegének fenntartása mellett a káros alkotórészek messzemenő eltávo- 10 lítása, vagy legalábbis ezek koncentrációjának lényeges csökkentése kétféle módon valósítható meg: 1. a szükséges mértékben szaporított sejteket és emellett a t-Pa termelése szempontjából káros szérumot is tartalmazó tápközeget friss, káros alkötórészektől mén- 15 tes tápközeggel eredeti térfogatának többszörösére hígítjuk, vagy 2. a találmány szerinti módon, a káros anyagokat tartalmazó tápközegnek friss, káros anyagoktól mentes tápközeggel szembeni folyamatos viszszakeringtetéses keresztáramú szűrés útján történő 20 messzemenő kicserélése útján. Ez utóbbi eljárás a káros alkotórészek gyakorlatilag ugyanolyan mértékű eltávolítását teszi lehetővé, mint a csupán rögzített gazdasejtkultűra esetében lehetséges tápközeg-dekantáIás és friss tápközeggel való helyettesítés, és — amint 25 az alábbi összehasonlító kísérlet tanúsítja — igen lényeges előnyöket biztosít a termelt t-Pa minősége szempontjából.
Összehasonlító példa 30
Humán szöveti plazminogén aktivátor (t-Pa) expressziójára ismert módon transzformált rekombináns kínai hörcsög petefészek (CHO) gazdasejteket (ATCC CCL 61) egy 9 literes üveg fermentorban, 2 tf/tf.% marhaembrió szérumot (FBS) és 2 tf/tf.% marhaszé- 35 rum albumint (BSA) tartalmazó tápközeg (Ham-féle F12 és Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközeg 1:1 tf.-arányú keveréke) 5 literjében 37 °C hőmérsékleten szuszpendálva szaporítunk 2.106 sejt/ml sejtsűrűség eléréséig. Az így kapott 5 liter szuszpenziós ino- 40 kulum-kultúrátkét egyenlő térfogatú részre osztjuk.
A) Egy rozsdamentes acélból készült 10 literes fermentorba 7,5 liter fentivel egyező összetételű, de FBS és BSA szérumot nem tartalmazó tápközeghez hozzáadjuk a fenti módon előállított inokulum-kultúra 45 2,5literjét; azígy kapott, kb. 5.105 sejt/ml sejtsűrűségű fermentlé az inokulum sejtszuszpenzióban eredetileg jelenvolt káros alkotórészeket négyszeres hígításban tartalmazza.
B) Egy párhuzamos kísérletben a fenti módon ka- 50 pott inokulum-kultúramásikfelét a termelő reaktorba való átoltás előtt tápközegcserének vetjük alá friss, szérumokat nem tartalmazó, egyébként azonos összetételű tápkőzeggel szembeni keresztáramú szűrés útján ezt a műveletet az előző példákban leírt módon 55 végezzük, 3,5 liter/perc áramlási sebességű visszakeringtetéssel, miközben a közeg egy részét folyamatosan, 300 ml/perc áramlási sebességgel pótoljuk. A műveletet három napon át folytatjuk és így a közegben jelenvolt káros anyagok mennyiségét az eredeti kon- 60 centráció kb, 1/13000 részére csökkentettük.
Az így lefolytatott közegcsere után a szuszpenziós sejtkultúrát egy az A) kísérletben alkalmazottal azonos típusú 10 literes rozsdamentes acél fermentorba vezetjük, és további friss, szérummentes tápközeggel 5.105 sejt/ml sejtsűrűségre hígítjuk.
Mindkét (A és B) fermentorban a szuszpenziós kultúrát 37 °C hőmérsékleten, azonos körülmények között inkubáljuk, majd mindkét fermentorból a fermentációs levet steril körülmények között, 28 °C hőmérsékleten történő szűréssel elkülönítjük. A további feldolgozást és az eredmények értékelését az előző példákban leírt módon végezzük.
A közegcsere nélkül, csupán a káros anyagok koncentrációjának a szuszpenziós sejtkultúra négyszeres térfogatra való hígítása útján történő csökkentésével lefolytatott A) kísérletben kapott fermentációs lében a t-Pa koncentrációja 52 ±5 mg/liter, a találmány szerinti módon, folytonos keresztáramú szűréssel szérumtalanított B) szuszpenziós kultúrában a t-Pa koncentrációja 51 ± 1 mg/HtervoIt.
A termelt t-Pa hasonló összmennyisége mellett igen lényeges volt a termék minőségi különbsége:
Az A) kísérletben kapott t-Pa terméknek az 55%-a már a termék elkülönítésekor lebomlott, kétszálas alakban volt és csupán 45% volt bomlatlan, egyszálas t-Pa, míg a B) kísérletben az elkülönített t-Pa termékben csak 23% volt lebomlott, kétszálas alakban, 77%-a pedig bomlatlan, egyszálas t-Pa volt.
A termék stabilitásának vizsgálatára a kapott fermentációs terméket további 2 napig inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten. 2 nap után az A) kísérletben kapott t-Pa már teljesen lebomlott, kétszálas alakban volt, míg a találmány szerinti eljárásnak megfelelő B) kísérletben kapott termékben még mindig 74% volt a bomlatlan, egyszálas t-Pa mennyiségi arány.
A fenti eredmények vüágosan mutatják, hogy a B) kísérletben kapott t-Pa mind minőség, mind stabilitás szempontjából messze felülmúlja az A) eljárás szerint kapott terméket.
Az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti módon folyamatos keresztáramú szűréssel szérumtalanított szuszpenziós sejtkultúra által termelt tPa abszolút mennyisége nem mutat lényeges eltérést a csupán többszörös térfogatra való felhígítás útján csökkentett szérum-koncentrációjú szuszpenziós sejtkultúra által termelt mennyiségtől, de igen lényeges különbség van a kétféle termék minősége között.

Claims (4)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás biológiailag aktív szöveti típusú plazminogén aktivátor előállítására emlős gazdasejteknek biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátor rekombináns expresszió útján történő termelésére képes szuszpenziós kultúrájában, azzal jellemezve, hogy
    a) rekombinánsanfertőzöttgazdasejteketismertmődon szérum komponenseket is tartalmazó tápközegben szuszpenziós kultúrában tenyésztünk;
    HU 205 171 Β
  2. 2) egy a sejteket visszatartó, de a sejtmentes szűrletet átengedő pórusméretű membránon át keresztáramú szűréssel a sejtkultúrát visszakeringtetve a közeg egy részét sejtmentes szűrlet alakjában eltávolítjuk;
  3. 3) miközben az elvezetett szűrletet a szérummentes közeggel folyamatosan pótoljuk;
  4. 4) a biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivátor expresszióterméket a kicserélt közegű kultúrából kinyerjük.
    2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közeg egy részét porózus, üreges rostfalon ke5 resztül távolítjuk el.
    3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős állati sejtekként rekombináns módon fertőzött CHO sejtekét tenyésztünk.
HU872536A 1986-06-06 1987-06-03 Process for producing biologically active plasminogen activator HU205171B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87164286A 1986-06-06 1986-06-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT43875A HUT43875A (en) 1987-12-28
HU205171B true HU205171B (en) 1992-03-30

Family

ID=25357832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU872536A HU205171B (en) 1986-06-06 1987-06-03 Process for producing biologically active plasminogen activator

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5053334A (hu)
EP (1) EP0248675B1 (hu)
JP (1) JPS6332484A (hu)
KR (1) KR930002888B1 (hu)
AT (1) ATE75775T1 (hu)
AU (1) AU601984B2 (hu)
DD (1) DD257087A5 (hu)
DE (2) DE3718939C2 (hu)
DK (1) DK175366B1 (hu)
ES (1) ES2032444T3 (hu)
FI (1) FI91886C (hu)
FR (1) FR2599625B1 (hu)
GB (1) GB2191493B (hu)
GR (1) GR3005245T3 (hu)
HU (1) HU205171B (hu)
IE (1) IE60485B1 (hu)
IL (1) IL82746A (hu)
NO (1) NO170595C (hu)
NZ (1) NZ220547A (hu)
PT (1) PT84991B (hu)
ZA (1) ZA874054B (hu)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT84991B (pt) * 1986-06-06 1990-03-08 Genentech Inc Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo
JP2576200B2 (ja) * 1988-03-09 1997-01-29 味の素株式会社 生理活性タンパク質の製造法
EP0338716A3 (en) * 1988-04-21 1990-04-11 Berlex Laboratories, Inc. Method and system for the production of non-degraded proteins from mammalian cells
DE3829244A1 (de) * 1988-08-29 1990-03-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von einkettigem t-pa
EP0391080A3 (de) * 1989-03-07 1990-11-07 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Herstellung von zweikettigem t-PA
GB2249099B (en) * 1990-09-26 1995-05-03 Squibb & Sons Inc Squalene synthetase
US5677184A (en) * 1994-04-19 1997-10-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. CHO cells that express human LH-RH receptor
US6077940A (en) * 1997-12-24 2000-06-20 Genentech, Inc. Free solution ligand interaction molecular separation method
AU2003218572B2 (en) * 2002-04-08 2009-08-20 Octane Biotech, Inc. Automated tissue engineering system
PL2343362T3 (pl) * 2006-07-14 2016-11-30 Udoskonalony sposób hodowania komórek
EP3327132A3 (en) * 2007-08-09 2018-07-18 Wyeth LLC Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors
CA2787656A1 (en) * 2010-01-22 2011-07-28 Lonza Walkersville, Inc. High yield method and apparatus for volume reduction and washing of therapeutic cells using tangential flow filtration
US10934519B2 (en) * 2011-07-29 2021-03-02 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Systems, methods and control laws for cell harvesting
CN104583386A (zh) * 2012-08-20 2015-04-29 泰尔茂比司特公司 浓缩穿过细胞生长腔室循环的流体的组分
AU2018324180A1 (en) 2017-09-01 2020-03-19 Lonza Cologne Gmbh End-to-end cell therapy automation
SG11202106384YA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Octane Biotech Inc Carousel for modular biologic production units
JP2022514761A (ja) 2018-12-21 2022-02-15 ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド ウイルスベクターの自動産生方法
WO2020132743A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Octane Biotech Inc. Cell culture and tissue engineering systems with controlled environmental zones
CN113498432A (zh) 2019-02-08 2021-10-12 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 用于自动化生物反应器的细胞浓缩方法和装置
AU2022303345A1 (en) 2021-07-02 2024-01-18 Combangio, Inc. Processes for making and using a cellular fibronectin composition

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3904480A (en) * 1972-10-24 1975-09-09 Lilly Co Eli Enhanced production of plasminogen activator
JPS5329985A (en) * 1976-08-27 1978-03-20 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd High concentration culturing of yeast
JPS5571496A (en) * 1978-11-24 1980-05-29 Asahi Chem Ind Co Ltd Preparation of living substance
US4409331A (en) * 1979-03-28 1983-10-11 Damon Corporation Preparation of substances with encapsulated cells
US4232124A (en) * 1979-04-23 1980-11-04 Mann George F Method of producing plasminogen activator
DE3015699C2 (de) * 1979-04-26 1982-07-15 Asahi Kasei Kogyo K.K., Osaka Herstellung eines Plasminogen-Aktivators
JPS5642584A (en) * 1979-09-18 1981-04-20 Asahi Chem Ind Co Ltd Cell cultivation method
US4420398A (en) * 1981-08-13 1983-12-13 American National Red Cross Filteration method for cell produced antiviral substances
IL68561A (en) * 1982-05-05 1991-01-31 Genentech Inc Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof
JPS5951220A (ja) * 1982-08-02 1984-03-24 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤
US4537860A (en) * 1982-12-08 1985-08-27 Monsanto Company Static cell culture maintenance system
NZ206699A (en) * 1982-12-30 1989-08-29 Bio Response Inc Process for the production of serum independent cell lines
IE56716B1 (en) * 1983-01-19 1991-11-20 Genentech Inc Method for producing human tpa and expression vectors therefor
JPS59121172U (ja) * 1983-02-04 1984-08-15 ミネソタ・マイニング・アンド・マニユフアクチユアリング・コンパニ− ケーブル電線被覆の剥離部分のカバー装置
US4546083A (en) * 1983-04-22 1985-10-08 Stolle Research & Development Corporation Method and device for cell culture growth
PH22337A (en) * 1983-11-21 1988-08-12 Ciba Geigy Ag Synthesis of fibrinolytic agents by yeast
US4740461A (en) * 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4888115A (en) * 1983-12-29 1989-12-19 Cuno, Incorporated Cross-flow filtration
US4757005A (en) * 1984-04-19 1988-07-12 Miles Inc. Method and cell line for obtaining plasminogen activators
DE3676604D1 (de) * 1985-03-22 1991-02-07 Chiron Corp Expression von epa in saeugetierzellen.
AU593264B2 (en) * 1985-07-10 1990-02-08 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Chromosomal DNA sequence, expression vector for human tissue plasminogen activating factor, cultured cells transfected with same and method of producing said activating factor
WO1987001389A1 (en) * 1985-09-06 1987-03-12 Codon Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
JPH07110232B2 (ja) * 1985-10-14 1995-11-29 株式会社日立製作所 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置
PT84991B (pt) * 1986-06-06 1990-03-08 Genentech Inc Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo

Also Published As

Publication number Publication date
FI872526A (fi) 1987-12-07
IE871504L (en) 1987-12-06
IL82746A0 (en) 1987-12-20
NO872395L (no) 1987-12-07
IL82746A (en) 1994-10-07
GB2191493B (en) 1991-02-27
GB8713267D0 (en) 1987-07-08
DE3718939A1 (de) 1987-12-17
FI91886C (fi) 1994-08-25
KR880000590A (ko) 1988-03-28
GR3005245T3 (hu) 1993-05-24
ES2032444T3 (es) 1993-02-16
ATE75775T1 (de) 1992-05-15
NZ220547A (en) 1990-01-29
PT84991A (en) 1987-07-01
DK288187D0 (da) 1987-06-04
EP0248675A1 (en) 1987-12-09
IE60485B1 (en) 1994-07-27
ZA874054B (en) 1989-02-22
PT84991B (pt) 1990-03-08
DE3778758D1 (de) 1992-06-11
JPS6332484A (ja) 1988-02-12
KR930002888B1 (ko) 1993-04-12
NO170595B (no) 1992-07-27
HUT43875A (en) 1987-12-28
NO872395D0 (no) 1987-06-05
FR2599625B1 (fr) 1992-03-13
AU7387287A (en) 1987-12-10
NO170595C (no) 1992-11-04
FI872526A0 (fi) 1987-06-05
DK288187A (da) 1987-12-07
DD257087A5 (de) 1988-06-01
JPH0574346B2 (hu) 1993-10-18
FR2599625A1 (fr) 1987-12-11
US5053334A (en) 1991-10-01
FI91886B (fi) 1994-05-13
AU601984B2 (en) 1990-09-27
DE3718939C2 (de) 1998-09-17
EP0248675B1 (en) 1992-05-06
DK175366B1 (da) 2004-09-13
GB2191493A (en) 1987-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU205171B (en) Process for producing biologically active plasminogen activator
CA2192683C (en) Filtration
KR0184235B1 (ko) 거핵구 형성 인자
US5378612A (en) Culture medium for production of recombinant protein
JPS59139324A (ja) 血清非依存性セルラインの確立方法
EP0355811B1 (en) Thrombus control agent
CN1295580A (zh) 制造鼠和人内源性血管生成抑制因子的方法
EP1309604B1 (en) Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides
Baker et al. Effect of the amino acids and dialyzable constituents of embryonic tissue juice on the growth of fibroblasts
CN1145637A (zh) 具有弹性蛋白酶抑制活性的α-1-抗胰凝乳蛋白酶
US4965344A (en) Process for obtaining active proteins from a biologically inactive form
EP1068301B1 (de) Bakterielle transglutaminasen
RU2221041C1 (ru) ШТАММ Bacillus licheniformis БСТ-1-ПРОДУЦЕНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНАЗЫ
EP0115284A2 (en) Tissue culture medium
US20030119091A1 (en) Cell-free protein synthesis method and extract solution therefor
AU682274C (en) Filtration
JP4190753B2 (ja) 血管新生阻害活性をもつプラスミノゲン断片およびその生成を導く化合物の探索方法
Na et al. Degradation of collagens, immunoglobulins, and other serum proteins by protease of salmonella schottmulleri and its toxicity to cultured cells
JPH01157384A (ja) 非会合の組織プラスミノーゲン活性化因子を培養細胞から高収率で得る方法
JPH05252951A (ja) プロコラゲナーゼの製造方法