JPS6332484A - 生物学的に活性なプラスミノ−ゲン活性化因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子およびその誘導体を、特に組換え＠蜀宿主
細胞培養物から製造するための方法に関する。

先行技術 ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子はプラスミノー
ゲンをプラスミンに変換する。こうして生成したプラス
ミンは、血餅の骨格を構成しているフィブリンマトリッ
クスをタンパク質加水分解的に切断する。ヒト組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子はこのようにして血餅の溶解
に関与し、従って種々の血栓疾徹の治療に有用である。

ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の略号ｒｔ−Ｐ
ＡＪは、血栓症および止血に関する国際委員会ＸＸ〜Ｎ
（ｔｈｅ　ＸＸＶＩＩＩ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈ
ｅ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅ
ｅ　ｏｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍ。

５ｔａｔｉｓ；Ｂｅｒｇａｍｏ、Ｉ　ｔａｌｙ、２７　
Ｊｕｌｙ　１９ｇ２）に提案された後、採用されたもの
である。本明細書中で用いる場合、「ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子」、「ヒトｔ−Ｐ　Ａｊ、ｒｔ−
ＰＡｊ、ｒヒト組織プラスミノーゲン活性化因子」また
は「組織プラスミノーゲン活性化因子」なる語句は、ヒ
トの外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子を意
味し、これは、たとえば天然原料の抽出および精製ロコ
ーレン等（Ｃｏｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）；欧州特許出
願Ｎ０９４１７６６（１９８０年６月１１日の最初の出
願に居いて１９８１年１２月１６日公開）、およびリジ
ケン等（Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５６．７０３５（１
９８’ｌ））を参照コ、ならびに組換え細胞培養システ
ム［たとえば欧州特許出願公開Ｎｏ、９３６１９（１９
８２年５月５日の最初の出願に基いて１９８３年１１月
９日公開）に、アミノ酸配列および分子のその他の性質
とともに記載されているコによって調製される。またこ
の語句には、全体の配列中、ｌまたはそれ以上のアミノ
酸、およびグリコジル化パターン（これは、使用する特
定の培養条件およびヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子を与える宿主の性質に依存すると考えられている）
が異なっている生物学的に活性なヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子等個物も含まれる。

本出願人等は、通常はヒト組織型プラスミノーゲン活性
化因子と結合しているタンパク質を実質的に含まないヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子を、組換えＤＮＡ
法によって原核および真核宿主中に産生させた（上記Ｅ
ＰＡ９３６１９を参照）。いくつかの理由から、ヒト組
織型プラスミノーゲン活性化因子を組換え真核宿主（ｒ
ことえば、呵乳動物細胞など）中で製造するのが好まし
い。

一般に真核宿主は、天然においては通常グリコジル化さ
れるヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子分子中の特
定のアミノ酸残基を認識してグリコジル化し、ヒト組織
型プラスミノーゲン活性化因子分子の種々のシスティン
残基間に天然の共有結合架橋を生成させ、そして天然の
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の全体の立体構
造により密接に近似させる能力に優れている。これらの
特徴は、生物学的に活性であり、かつ安全なヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子産物を製造するのに重要で
あると考えられている。

しかし、組換え宿主細胞からのヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子の製造には付随する問題がないわけでは
ない。すなわち、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を産生ずる細胞は慣習上、血清、血液あるいは他の動
物組織由来の種々のフラクション、またはそれらの加水
分解物の存在下で培養されるため、収量が限定されると
いう難題が生じることがわかった。結果として、このよ
うな細胞が分泌するヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子は、大量の血清タンパク質およびその他の血清成分
にさらされる。これらの成分のあるものは、ヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子分子との間に分離すること
が困難な結合し集合した複合体を形成するので、常に、
無傷のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を薬学的
に許容しうる形態へ精製するのを困難にすることがわか
った。

また、これらの集合体はヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子分子の生物学的な活性を阻害し、従って生物学
的に活性な無傷のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子の通常予想される収量を全体に減少させる。また、血
清成分を加えると、精製して除去しなければならない不
純物の蛍が増加する。さらに、これらの成分の多くは組
織型プラスミノーゲン活性化因子をタンパク質加水分解
的に分解する。所望のヒト組織型プラスミノーゲン活性
化因子をこれらの系から精製しようとすると技術的な難
題が生じ、従ってさらに高価につく方法が必要となる。

これらの観察と合致して、培養細胞が分泌する内生プラ
スミノーゲン活性化因子を製造および精製する際の問題
を避けるために血清を含まない培地が提案された。たと
えば、ｌ）欧州特許出願公開Ｎｏ、１１３３１９（１９
８２年１２月３０日の最初の出願に基いて１９８４年７
月１１日公開：・これには、内生ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を分泌する血清−非依存性の天然ヒト
細胞セルラインの調製が開示されている）、２）米国特
許Ｎｏ、４２３２１２４．３）米国特許Ｎｏ、４３２８
３１４．４）米国特許Ｎｏ、４３１７８８２、および５
）ガツサー等ＪＧａｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉ　ｎ
　Ｖ　ｉｔｒ。

Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａ
ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　２１　。

５８８（１９８５）ｌを参照。これらの文献はいずれも
高密度細胞増殖、および特に組換え＠濁宿主細胞培養物
に関係していない。一方、欧州特許出願公開Ｎｏ、Ｉ　
１２９４０（１９８２年１２月３０日の最初の出願に基
いて１９８４年７月１１日公開）は、血清のタンパク質
成分であるアルブミンを追加することを包含する、ヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法に関する
。

また細胞培養物を分別して、たとえば血清成分を除去す
るための種々の方法が知られている。たとえばファン・
レイズ等［Ｖａｎ　Ｒｅ１ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｆ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上３
３，７５８（１９８４）コは、白血球細胞培養物から血
漿タンパク質レベルを減少させ、それによって粗製の内
生ヒトγインターフェロンの不純物を減少させた［ファ
ン・レイズ等（Ｖａｎ　Ｒｅ１ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１９９　
、７７　）をも参照］。１９８２年１１月、フロリダ州
マイアミでのインターフェロン研究の第３回国際会議（
Ｔｈｉｒｄ　Ａｎｎｕａｌ　　ｒ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｉａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｆｏｒ　Ｔ　ｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒａｈ）において、ファン・レイズ
等は、ヒト細胞培養物から内生ヒトγインターフェロン
を回収する際に、交差フロー濾過（ｃｒｏｓｓ−ｒｌｏ
ｗ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてオートロガスな（
自己の）血漿タンパク質のレベルを減少させることにつ
いて報告した。しかし、製造中にさらに除去しても回収
インターフェロン量を増加させることができなかった。

発明の概要 本発明の目的は、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を産生ずる宿主細胞の培養物から、生物学的に活性な
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を製造（大スケ
ールで）し、回収するための方法を提供することである
。さらに詳しくは、本発明の目的は、実質的にタンパク
質加水分解、脱グリコツル化、各種プロテアーゼ阻害剤
による阻害、および面清成分との集合および汚染のない
生物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を製造するための方法を提供することである。

ｔ−ＰＡを産生ずる宿主細胞、たとえばヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子をコードしているＤＮ−Ａを機
能的（オベラブリー）に含有している組換えベクターで
トランスフェクションした宿主細胞を、好ましくは、細
胞増殖（よ促進するがしかし発現したヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子産物の回収および活性に有害であ
る、■またはそれ以上の成分を含有している増殖用培地
において増殖させる。実質的にこのような成分のすへて
を、培養前に除去するか、または培地交換、好ましくは
交差フロー濾過によって培養中に増殖用培地から除去す
る。除去後、この宿主細胞培養物は、それ以上の細胞複
製を必要とするかまたは必要とすることなく発現能力を
保持している。

これ以後、生物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子が、有害成分を実質的に含まない宿主細胞
培養物中に保持された細胞内で発現によって産生されど
。次いで、この生物学的に活性なヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を細胞から単離し、医薬投与に適する
ようにさらに精製する°。

予想外にも、本発明方法は、これまで達成できると考え
られていなかった収率で、純粋かつ無傷のヒト組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子を製造することを可能にする
。さらに、本発明方法は、少なくとも５０％が１本鎖形
である組成の生匍学的に活性なヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子を与える（これに対し、本方法以前に得
られていた産物の組成では１本鎖形が実質的にこれより
少ない）。このことは、種々の切断部位でのタンパク質
加水分解が実質的に起こっていない産物が本方法によっ
て得られるということを示しているので、予想外である
と同時に重要であると考えられる。さらに、１本鎖形に
富んだ物質は、少なくとも２本鎖物質と同じ効力を有す
るようであり、比較的少ないフィブリノーゲン分解を示
し、これらの結果は臨床応用に重要となろう。

詳細な説明 哺乳動物宿主細胞培養物の場合、代表的な有害培地成分
は、増殖用培地に始めに存在している血液またはその他
の動物組織由来のプロテアーゼ類、ノイラミニダーゼ（
ｎｅｕｒａｍｉｄｉｄａｓｅ）等のグリコシターセ類、
プロテアーゼ阻害剤類、アルブミンなどである。

「生物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子」なる語句は、生体内でのフィブリン血餅の溶解に
関与し得る上記ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
を意味する。

「宿主細胞培養物」なる語句は、ｔ−Ｐ、Ａ産生宿主細
胞、たとえば組織型プラスミノーゲン活性化因子をコー
ドしているＤＮＡを機能的に含有している発現ベクター
でトランスフェクションした宿主細胞の培養物を意味す
る。「組換え宿主細胞培養物」とは、組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードしているＤＮＡを機能的に含
有している発現ベクターでトランスフェクションした「
宿主細胞培養物」のことである。「組換え懸濁宿主細胞
培養物」システムが好ましい。

多種多様の宿主細胞を本発明に用いることがてきる。適
当な宿主細胞としては、ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子をコードしているＤＮＡを機能的に含有してい
る組換えベクターでトランスフェクションすることがで
き、発現によって生物学的に活性なヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子を産生ずることができ、モして懸濁
培養物中での増殖および維持が可能であるものか好まし
い。従って、ｔ−ＰＡを産生し、モして／または組換え
操作を行って組換えヒト組織型プラスミノ−ゲン活性化
因子を産生させ得るすべての宿主細胞が本発明の範囲内
に含まれる。好ましい宿主細胞は捕乳動物細ねであり、
これには組換えヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
を分泌するチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ　６１　：上記ＥＰＡ９３６
１９を参照）が含まれる。

本発明方法においては、ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子を産生じ得る宿主細胞を、始め１に「増殖用培
地」において増殖懸濁液として増殖させる。この増殖用
培地は、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の産生
用に用いる特定セルラインを培養するための、当分群で
知られている通常の培地またはその誘導体のどれであっ
てもよい。

たとえば、ＡＴＣＣ培地ハンドブックを参照［ＡＴＣＣ
Ｍｅｄｉａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｅｄ：Ｃｏｔｅ　ｅｔ
　ａｌ、、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

ＭＤ（１９８４）］。哨乳動物細胞のための増殖用培地
は、たとえば血清追加物（ウシ胎児血清など）、または
細胞の増殖および分裂を促進するために通常用いられる
その他の追加成分（動物の肉あるいは乳の加水分解物、
組織あるいは器官の抽出物、血餅分解物あるいはその抽
出物など）を含有していることが好ましい。この最初の
増殖用培地は、宿主細胞の増殖および維持、ならびにヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子の発現が可能であ
る培地であってもよい。さらに、グリシンおよび／ある
いはヒポキサンチンおよび／あるいはチミジンを欠き、
モして／またはメトトレキセートを含有している標準増
殖培地を用いて、メトトレキセートに対する結合親和力
が低いジヒドロ葉酸還元酵素、ならびにヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子を発現し得る発現ベクターを含
有している組換えＣＨＯ細胞のための選択圧を維持して
もよい。その他の選択可能な、および／または増幅可能
なマーカーを用いてもよい。その他の適当な培地成分に
は、たとえばトランスフェリン、インスリンおよび各種
金属が含まれる。

ある態様においては、宿主細胞を適当な細胞密度（たと
えば、ＣＨＯ細胞では約Ｉ　Ｘ　１０　ｓ／ｍ（１〜３
　ｘ　ｌ　Ｏ’／ｍ（１）まで増殖させた後、増殖用培
地中の有害成分を培地交換、好ましくは「交差フロー濾
過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）Ｊ
によって除去する。

交差フロー濾過とは、ヒト組織型プラスミノーゲン活性
化因子を産生ずる細胞の懸濁液が、細胞以外の！！濁液
成分を透過し得るフィルターに実質的に平行して流れる
濾過様式を意味する。

この交差フロー濾過は、Ｒｅ＝レイノルズ数、γ８＝壁
剪断速度、ΔＰ＝圧力降下、およびＴＭＰ＝膜内外圧力
差、を含む一群の流体力学パラメーターで特徴づけられ
る。Ｒｅ、γイおよびΔＰは濾過システムの幾何配置、
流動条件および流動体の性質に依存するであろう。たと
えば、中空繊維濾過システムを用いる場合、これらのパ
ラメーターは以下のようにして計算することができる：
Ｒｅ＝２ρＱｓ　／ｙ７ｓ　ｎπｒｈ γｗ　＝４ＱＢ　／ｎ７ｒｒｈ’ ΔＰ＝８Ｑ、Ｌηｓ　／ｒ＋πｒｈ’ ［式中の各文字はそれぞれ、ρ＝細胞懸濁液密度、Ｑａ
＝懸濁液循環速度、η８＝？３濁液の粘度係数、ｎ＝中
空繊維の数、ｒｈ＝中空繊維の内部半径、Ｌ＝中空繊維
の長さ、を表す］。

同様の式をその他の流路幾何配置について得ることがで
きる。平均の膜内外圧力差は以下のようにして計算する
ことができる： ’ｒＭＰ＝ＰＩｒｌ−Ｐｆ−ΔＰ／２＝ＱｆＲηｆ／Ａ
［式中の各文字はそれぞれ、Ｐｉｎ−流入側圧力、Ｐｆ
−濾液側圧力、Ｑｆ−濾過速度、Ｒ−膜抵抗、Ａ＝膜面
積、η壬−濾液の粘度係数、を表す］。

好ましい態様では、流路の幾何配置および稼動パラメー
ターは、濾過膜への細胞の沈積か最小になるように選ば
れ、こうして分離工程の効率を高め、剪断によ°って引
き起こされる細胞の損傷を最小にする。細胞の沈積は経
験上以下のようにして求められる。

ＤＰ＝ｕ”２Ｕλ／ｒ−ｏ２γ３／２ ［式中の各文字はそれぞれ、ＤＰ−沈積バラメーター、
ν＝動粘度、Ｕ＝濾過速度、λ−細胞濃度の経験関数、
ｃｏおよびｒ。−細胞半径、を表す３゜従って、交差フ
ロー濾過工程は、細胞懸ん液（ρ、ηｓ１ηｉｓ　ν、
Ｃｃおよびｒｅ）、膜の選択および流れの幾何（ｎ　ｓ
　ｒ　ｈｌＬ　、ＲおよびＡ）によって、ならびに稼動
パラメーターの制御（Ｑ８およびＱｆ）によって決まる
。好ましい態様では、流路幾何配置および稼動条件は、
Ｒｅ＜２１００およびＤＰ＜０．３５となるように選ば
れる。

有害成分の濃度は、交差フロー濾過工程（細胞ｔ！濁液
が濾過装置を循環している）によって減少し、流れの一
部は細胞を含まない濾液として取り出される。有害成分
を含有しない培地を加えることによって、一定の細胞懸
濁液体積を維持することができる。有害成分の最終的な
残存割合は、以下のようにして計算することができる：
［式中の各文字はそれぞれ、ｃｐ＝製造懸濁液中の有害
成分の濃度、ｃ０＝細胞増殖懸濁液中の有害成分の初期
濃度、ｖＸ＝培地交換時の細胞懸濁液の体積、ｅ＝自然
対数の底、ｖｌＴｌ＝交換培地の体積、ｖｐ＝製造懸濁
液の最終体積、を表すコ。

有害成分の濃度を予め決めたレベルまで低下させるのに
必要な交換培地の量は以下のようにして計算することが
できる： Ｖ、、−Ｖｘｌｎ（ＣｏＶｘ／ＣｐＶｐ）［式中、１ｎ
は自然対数を表す］。

この式から、本発明の好ましい態様が、上記の一定体積
の培地交換に先立って、始めに細胞懸濁液を最小のＶｘ
値まで濃縮することを包含するものであることが明らか
である。すなわち、有害成分濃度の希釈は、Ｉ）細胞増
殖懸謁液を最初の体積Ｖ０からＶｘまで濃縮し、１ｉ）
一定体積培地交換を行い、そして１ｉｉ）Ｖ２＜Ｖｐな
らさらに希釈を行うことによって達成される。

従って、たとえば培地交換前の最初の細胞培養物の体積
が１００Ｑであるときは、細胞懸濁液を１０１２まで濃
縮し、４５ｉ２の培地を用いて培地交換を行い、そして
１０００１２の製造体積を用いることによって、有害成
分濃度を全体でＩ　Ｏ，０００倍に希釈することができ
る。

このようにして、培地交換中の最初の増殖用培地の希釈
因子を定量的に求めて、得られた宿主細胞＠濁液中の有
害成分量を予め決めた濃度以下にし、こうして有害成分
の逆効果を最小にすることができる。このような希釈因
子を増殖培地の各バッチについて決めることもできる。

たとえば、哺乳動物増殖培地に追加した血清の濃度が異
なれば、所望ではない成分の量を、薬学的に許容しうる
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造が可能で
ある機能的に等しい濃度まで低下させるための希釈因子
は異なるであろう。従って、最終的な補乳動物発現培地
中の血清量が、たとえば最初に用いた合計量の約１％以
下になるように希釈因子を選択してもよい。

本発明で用いる濾過メンブラン（膜）は、本発明のヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子産生細胞を保持する
一方で各種有害成分を透過させうる適当な膜性能および
形状を有する、当分野で既知の膜から選択することがで
きる。すなわち、選択した流体力学条件下で細胞を保持
することができるが、その一方で有害成分を透過させて
除去することができる適当な膜のどれかを用いることが
できる。孔の大きさの上限は約５ミクロン、下限は約０
，１ミクロンが適当であろう。

新鮮な交換培地は有害成分を実質的に含んでいない。た
とえば、有意量の有害成分（プロテアーゼ類、ノイラミ
ニダーゼ類、プロテアーゼ阻害剤類など）を全く含んで
いない。もちろんこのような培地は、ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子を産生させるために用いる細胞の
種類によって異なり、たとえば当分野で用いられている
ものから選択することができる。これは最終的な発現培
地と同じ°であってもよいしく簡便化のため）、富み方
が幾分少ない培地、たとえば緩衝化した等張食塩水培地
などであってもよい。

本明細書に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子産生ＣＨＯ細胞に対しては、たとえばウシ胎児血清を
追加していないＣＨＯ細胞細胞径用の標準培地から最終
の発現培地を調製してもよい。

この最終の発現培地の例としては、ダルベツコの改良イ
ーグル（Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ　−ｍｏｄｉｆ　ｉｅｄ　
Ｅ　ａｇｌｅｓ）培地（高グルコース）とハム（Ｈａｍ
）のＦ’−１２培地の等置部混合物が挙げられる。

他の態様では、培養前に有害成分を培地から除去あるい
は実質的に除去してもよいし、また、たとえば遠心ある
いは沈澱法によって除去してもよい。

このヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を発現培地
から単離し、次いで精製し、種々の血管症状または疾患
の治療用薬剤として用いる。

好ましい態様においては、ヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子を産生ずることができるＣＨＯ細胞を、ウシ
胎児血清を追加したＣＨＯ培地中の懸濁物として、予め
決めた細胞密度まで増殖させる。次いでこの細胞懸濁液
を交差フロー濾過によって濃縮する。これ以後、血清は
一定量の交差フロー濾過（血清含有培地が除去される速
度と常に同じ速度で直情不含培地を加える）によって濃
縮懸濁液から除去される。次いで、この血清不含発現培
地中の懸濁ＣＨＯ細胞が活性なヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子を産生ずる。ＣＨＯ細胞は、こうして産
生じたヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を発現培
地中に分泌し、これを常法によって分離することができ
る。

種々の容量の培養容器を用いてＣＨＯ細胞懸濁物を増殖
させる。各培養容器を、多数並んでいる多孔性の接線方
向のフローフィルターに接続しくその入口を経て）、次
にこれを培養器に接続する（培養器に戻る出口を経て）
。増殖させた後、ＣＨＯ細胞と血清含有培地の懸濁液を
この多数並んでいる多孔性の接線方向のフローフィルタ
ーにポンプで送り込み、始め＠濁液を濃縮し、次いで培
地交換中に懸濁液から血清成分を除去する。このＣＨＯ
細胞懸濁液を、フィルターと培養容器間で循環させ、一
部の古い培地および血清成分を除去する。

血清を含まない新鮮な滅菌発現培地をこの細胞懸濁液に
供給し、培養容器中の名目体積を維持する。

このように、継続的な培地交換によって予め決めた濃度
まで血清濃度を低下させた後、血清不含の発現培地が入
っている別の容器に滅菌管を用いて細胞を移し、この培
地中にヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を分泌さ
せる。次いで常法によりヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子を取り出すことができる。

実施例 Ａ、細胞増殖、培地交換および製造段階発現ベクターｐ
ＥＴＰＦＲ（上記ＥＰＯ９３６１９を参照）でトランス
フェクションし、従って組換えｔ−ＦＡを発現するチャ
イニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣＮ
ｏ、ＣＣＬ６１）を、液体窒素貯蔵品から再生し、ハム
のＦＩ２培地およびダルベツコの改良イーグル培地の１
：１混合物からなる培地で増殖させた。この混合物はヒ
ボキサンチンまたはチミジンを含有していなかった。こ
の培地に、透析または透過濾過したウシ胎児血清（７％
ｖ／ｖ）およびメトトレキセイト（５００ｎＭまで）を
加えｔこ。この細胞を、約３７℃でインキュベートした
ガラス容器中、懸濁培養で増殖させた。３〜５日毎にこ
の培地で細胞を継代培養し、その数を増加させた。十分
量の細胞が蓄積したら、これをＩＯＮのステンレス発酵
槽に移し、さらに約３日間増殖させた。この増殖期には
、より良好な細胞収量が得られるように培地組成を変え
、ヒボキサンチンおよびチミジンの両者を含有さけたが
メトトレキセイトは含有させなかった。

この培地に、透析していないウシ胎児血清を導入しく２
％ｖ／ｖ）、３日間の増殖期の間に細胞密度を約０．２
５Ｘ１０’細胞／ＲＩ２から約１．０ＸＩＯ６細胞／村
まで増加させた。

次いで、血清を含まない製造培地中に懸濁させる前に、
上記のようにして９０時間、細胞を培地交換にかけた。

この培地交換は以下のようにして行った。

中空繊維の接線方向のフローフィルターならびにこれに
接続している入口および出口のシリコンゴム管をオート
クレーブで滅菌し、水蒸気滅菌しうる接続部を介して１
０（の製造容器に接続した。

フィルターとしては、内径が０．７５ｘｘであり、その
長さ方向に名目上０．１μｍの孔を有する２８０の中空
繊維を含有しているポリスルホン中空繊惟ユニット［Ａ
、Ｇ、テクノロジー社（Ａ、Ｇ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、　Ｉ　ｎｃ、）製：フィルター　＃ＩＢＺＥ１００８
０１ＡＬ］を用いた。このユニットは４．１５ｆｔ”の
濾過面積を存していた。ワトソン・マロ０２葉ポンプ（
Ｗａｔｓｏｎ　Ｍａｒｌｏｗ　ｔｗｏ　１ｏｂｅｄ　ｐ
ｕｍｐ）を用いて、この中空繊維と容器の間で細胞を循
環させた。

循環速度は約３　、５　ｆ２／分であり、これと同時に
液体の一部を、透明な濾液として約２１１ｘ（／分の速
度で流出させ、これを廃棄した。このようにして、細胞
を維持し、培養物体積を約５２１２まで減少させた。こ
の時点で、新鮮かつ滅菌した血清不含培地（上記で用い
たものと同じ配合であるが、ウシ血清またはそれから誘
導される成分を含んでいない）を、約２１１２Ｃ／分の
速度で培養容器にポンプで送り込み、こうして古い培地
を継続的に希釈除去しながら体積を維持した。

この系に新鮮な血清不含培地５５Ｑをポンプで送り込み
、その細胞懸濁液の一部を別の１０１２ステンレス発酵
漕中の新鮮な血清不含培地に加えたときに血清濃度が計
算値で約１９０，０００倍まで希釈されているようにし
た（または、体積で０゜０００１％以下になるように）
。次いでこの細胞を、製造段階用に３７℃で約９０時間
インキュベートした。この培養物から試料を採取し、遠
心して透明にし、後に行う分析用に一２０℃で保存した
。

これと同様にして行った第２の実施例では、中空繊維フ
ィルター以外については、用いた条件、細胞および培地
はすべて同様であった。ここでのフィルターは２９０の
中空繊維を含有し、４３ｒｔ２の濾過面積を有している
が、それ以外は上記のものと同様であった（Ａ、Ｇ、テ
クノロジー社製：フィルター　＃１８１０９０２ＡＬ）
。

Ｂ９分析方法 試料を処理し、分析して、これらの実施例で用いたＣＨ
Ｏ細胞が産生ずるｔ−ＰＡに対してウシ血清が及ぼす有
害効果を証明した。血清不含の製造段階からの透明化し
た細胞培養液試料を解凍し、β−メルカプトエタノール
で希釈し、レムリの不連続系［Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔ
ｕｒｅ、　２２７　、６８０　（１９７０）コを用いて
Ｓ、Ｄ、Ｓ、電気泳動にかけた。このようにして分離し
たタンパク質を銀染色にかけるか［モリッセイ（Ｍｏｒ
ｒｉｓｓｅｙ、　Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｇｍ、　
、　１上７，３０７（１９８１））］、またはニトロセ
ルロースシートに移行させた［トウビン等（Ｔｏｗｂｉ
ｎ　ｅｔａｌ、、ＰＮＡＳ、７６．６３５０（１９７９
））の方法を用い、８℃、０．５アンペアで４時間、０
．４５μ次ニトロセルロースに移行させる］。ｔ−ＰＡ
タンパク質、タンパク質フラグメントおよびｔ−ＰＡを
含有する高分子量複合体を、下記の間接酵素結合の免疫
検定法によって、このニトロセルロースシート上で見え
るようにした。すなわち、始めに結合ｔ−ＰＡタンパク
質とウサギ抗ｔ−ＰＡ抗体を反応させ、ついで第２の抗
体で処理した。この第２の抗体は西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合の抗ウサギＩｇＧ（ヤギを用いて得られた）
であった。この反応の後、過酸化水素およびＰＢＳ中の
発色団４−ＣＱ−ナフトールを加えると、結合した抗体
のところで発色し、これによってｔ−ＰＡおよび関連タ
ンパク質の電気泳動パターンが明らかになった。すなわ
ちこれらの方法を用いて、粗製の培養液中のｔ−ＰＡの
状態をさらに精製することなく測定することができる。

Ｃ１結果 ラン胎児血清がｔ−ＰＡに及ぼす有害効果を証明するた
め、製造段階からの試料を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
）と、または０．１７５％ｖ／ｖあるいは１．７５％ｖ
／ｖウシ胎児血清とともに２２時間または４６時間（上
記のようにして分析する前に）インキュベートした。こ
の結果を、銀染色ゲル（第１図）および対応する免疫プ
ロット（第２図）で示す。

第１図は、上記のようにして得たｔ−ＰＡ試料の銀染色
ゲルを示す。

第２図は、第１図のゲルと同じゲルの免疫プロットであ
る。

図中のレーン番号はそれぞれ以下に示す試料に対応して
いる。

レーン番号　　　　　試　　料 ■　　　分子量の標準［９２，５キロダルトン（Ｋ）、
６６．２に、　４５に、　３１に１２１．５に、１４．
４Ｋ］２　　　真正ｔ−ＰＡ対照標準 ３　　　　ｔ−ＦＡ金含有細胞培養液（実験室対照） ４　　　製造段階の試料からの細胞培養液５　　　製造
段階試料ニリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）とともに３７℃
で２２時間インキュベートした ６　　　製造段階試料、ＰＢＳとともに３７℃で４６時
間インキュベートした ７　　　空レーン ８　　　製造段階試料；０．１７５％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎
児試料（ＰＢＳ）とともに３７℃で２２時間インキュベ
ートした ９　　　製造段階試料；０．１７５ｇ（ｖ／ｖ）Ｆ　Ｂ
　Ｓとともに３７℃で４６時間インキュベートした １　０　　　０．１７５％（ｖ／ｖ）Ｆ　Ｂ　Ｓ単独；
３７℃で２２時間インキュベートした １　１Ｏ，ｔ７５％（ｖ／ｖ）Ｆ　Ｂ　Ｓ単独；３７℃
で４６時間インキュベートした Ｉ２　　　製造段階試料；１．７：ｄ（ｖ／ｖ）　Ｐ　
Ｂ　Ｓとともに３７℃で２２時間インキュベートした １３　　　製造段階試料、１．７５％（ｖ／ｖ）　Ｆ　
Ｂ　Ｓとともに３７℃で４６時間インキュベートした １４　　　１．７５％（ｖ／ｖ）　Ｐ　Ｂ　Ｓ単独；３
７℃で２２時間インキュベートした １　５　　　１．７５℃％（ｖ／ｖ）Ｆ　Ｂ　Ｓ単独；
３７℃で４６時間インキュベートした 第１図および第２図のレーン２および３は、Ｌ−ＰＡの
対照標準である（１本鎖ｔ−ＰＡはより高分子量のバン
ドとして、２本鎖ｔ−ＰＡはより低分子量のバンドとし
て示される）。

ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が存在していることによって観
察される有害効果は、ａ）タンパク質加水分解によって
切断された種々の形態およびそれらのフラグメントを付
随的に蓄積しながら無傷のｔ−ＰＡの消失を引き起こす
こと（第２図のレーン８および９を参照）、およびｂ）
９０〜２００キロダルトンの範囲のより高分子量の複合
物質を生成すること（第２図のレーン１２および１３を
参照）である。

また、上記のような「細胞増殖、培地交換および製造段
階」を経て得られた血清不含細胞培養液がＰＢＳの存在
下で２２または４６時間インキュベートされたときには
、実質的に変化しないままであるということが結果から
れかる（第１図および第２図のレーン５および６を参照
）。すなわち、ウシ胎児血清が製造段階の細胞培養物培
地に残っていると、ｔ−ＰＡの高分子量複合物の生成お
よびタンパク質加水分解の両方が起こる。従って、本明
細書中に記載した培地交換工程によって血清を除去する
と、その有害効果が実質的に取り除かれる。

上記に特定の好ましい態様について記載したが、本発明
はこれらに限定されるものではない。当分野で通常の知
識を有する者は、ここに開示した態様に種々の修飾を加
えることもあるであろうが、このような修飾は本発明の
範囲内に含まれるべきものである。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、本発明方法またはその他の対照
方法によって得たｔ−ＰＡについて電気泳動を行い、そ
してそれぞれ銀染色および免疫プロットしたゲルの模写
図である。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）宿主細胞の発現能力を保持しながら、培養物培地
   からヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の回収およ
   び活性に有害な培地成分のすべてを実質的に除去するこ
   とを特徴とする、生物学的に活性なヒト組織型プラスミ
   ノーゲン活性化因子を宿主細胞培養物中で製造するため
   の方法。
2. （２）該成分を培養前に除去する第１項記載の方法。
3. （３）該成分を培地交換によって培養中に培地から除去
   する第１項記載の方法。
4. （４）該成分を交差フロー濾過によって培養中に培地か
   ら除去する第３項記載の方法。
5. （５）該交差フロー濾過が平らな濾過メンブランを介し
   て行なわれる第４項記載の方法。
6. （６）該交差フロー濾過が多孔性中空繊維の壁を介して
   行なわれる第４項記載の方法。
7. （７）該交差フロー濾過が螺旋型のメンブランを介して
   行なわれる第４項記載の方法。
8. （８）該宿主細胞培養物が組換え宿主細胞培養物である
   第１項〜第７項のいずれかに記載の方法。
9. （９）該組換え宿主細胞培養物が組換え懸濁宿主細胞培
   養物である第８項記載の方法。
10. （１０）ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の回収
    および活性に有害である１またはそれ以上の成分を含有
    している増殖および細胞複製用培地において該宿主細胞
    培養物を増殖させ、交差フロー濾過によって該宿主細胞
    培養物から該１またはそれ以上の成分のすべてを実質的
    に除去し、そしてヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
    子の回収および活性に有害である成分を実質的に含まず
    、かつそれ以上の細胞複製を支持することを必要とする
    ことなく該宿主細胞培養物によるヒト組織型プラスミノ
    ーゲン活性化因子の発現を可能にする追加培地を宿主細
    胞培養物に供給することを特徴とする第１項記載の方法
    。
11. （１１）該増殖および細胞複製用培地の成分が血液、組
    織またはそれらの誘導体から得られるものである第１項
    記載の方法。
12. （１２）該宿主細胞培養物がヒト組織型プラスミノーゲ
    ン活性化因子を産生し得る哺乳動物細胞からなる第１項
    記載の方法。
13. （１３）該宿主細胞培養物が組換え発現によってヒト組
    織型プラスミノーゲン活性化因子を産生し得る哺乳動物
    細胞からなる第１項記載の方法。
14. （１４）該哺乳動物細胞が組換えによってトランスフェ
    クションされたＣＨＯ細胞からなる第１３項記載の方法
    。
15. （１５）ａ）ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を
    産生し得る細胞、および ｂ）ｉ）ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の回収
    および活性に有害である成分を実質的に含まず、かつ ｉｉ）細胞複製をさらに支持することを必要とすること
    なく、宿主細胞培養物においてヒト組織型プラスミノー
    ゲン活性化因子の発現を可能にする培地 からなる宿主細胞培養物。
16. （１６）組換えによってトランスフェクションされた宿
    主細胞からなる第１２項記載の細胞培養物。
17. （１７）組換えによってトランスフェクションされた哺
    乳動物細胞からなる第１２項記載の細胞培養物。
18. （１８）該哺乳動物細胞が組換えによってトランスフェ
    クションされたＣＨＯ細胞からなる第１７項記載の細胞
    培養物。