JP2009543565A - 細胞を培養する改善された方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
供給速度=SFR×(総細胞培養物容積)×(生存細胞密度) (1)
に従った供給速度で添加され、供給速度は一日当たりリットル数で表現されて、SFRは比供給速度、すなわち単位時間あたり生存細胞毎に添加される培地の容積として表現される細胞培養液が細胞培養物に供給される速度であり、生存細胞密度は単位容積あたりの生存細胞数である。生存細胞数は、例えばトリパンブルー排除法を通じて、当業者によって判定されることができる。比供給速度は、好ましくは0.01〜0.3nL/細胞/日の間、より好ましくは0.01〜0.2nL/細胞/日の間で選択される。
[実施例1:バッチ工程、流加工程、および本発明に従った工程間の比較]
この実施例では、本発明に従った方法の性能をバッチおよび流加工程と比較した。
ザルトリウスB5容器内で、4Lの作業容積でバッチ工程を実行した。6mMのL−グルタミン(glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地に細胞を3×10e5細胞/mLで接種し、続いて17日間培養した。
ザルトリウスB5容器内で、4Lの作業容積で流加工程を実行した。6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地に細胞を3×10e5細胞/mLで接種した。培養中にグルコースおよびグルタミンを添加して、上の濃度をそれぞれ15mMおよび1mMに保った。5日目からアミノ酸およびペプチドを添加して、消費されたアミノ酸を補給した。
2Lアプリコン容器内で、本発明の工程を実施した。Refine TechnologyからのATF−2システムを用いて、ATFフローモードで操作される、ゼネラル・エレクトリック(GE)から得られた分画分子量(MWCO)100kDaの中空繊維膜を使用して、細胞およびIgG生成物を保持した。6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地中で、3×10e5細胞/mLで培養を開始した。0.05〜0.2nL/細胞/日の間の比流速(SFR)を使用して、懸濁細胞培養物を通して、6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地を灌流した。得られた最大生成物濃度は1.4g/Lであった。
この実施例では、本発明に従った方法を再度バッチおよび流加工程と比較し、工程C2ではCO2圧力を制御して50kDa分離システムを使用した。
ザルトリウスB5容器内で、4Lの作業容積でバッチ工程を実行した。6mMのL−グルタミン(glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地に細胞を3.105細胞.mL−1で接種し、続いて17日間培養した。
ザルトリウスB5容器内で、4Lの作業容積で流加工程を実行した。6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地に細胞を3.105細胞.mL−1で接種した。培養中にグルコースおよびグルタミンを添加して、上の濃度をそれぞれ15mMおよび1mMに保った。5日目からアミノ酸およびペプチドを添加して、消費されたアミノ酸を補給した。
2Lアプリコン容器内で、本発明の工程を実施した。Refine TechnologyからのATF−2システムを用いて、ATFフローモード内で操作される、GEからの分画分子量(MWCO)50kDaの中空繊維膜を使用して、細胞およびIgG生成物を保持した。6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地中で、3×10e5細胞/mLで培養を開始した。0.05〜0.2nL.細胞−1.日−1の間のSPRを使用して、懸濁細胞培養物を通して、6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地を灌流した。CO2圧力を15%未満に制御した。
図3および図4から分かるように、本発明に従った工程は、等しいかそれ以下の時間で(バッチ時間の100%;流加時間の81%)、顕著な生存細胞密度の増大および生成物濃度の増大をもたらした(2415%×バッチ収率;690%×流加収率)。
この実施例では、細胞培養物除去を伴う本発明に従った方法の性能を再度バッチおよび流加工程と比較する。工程C3では細胞培養物が除去された。
ザルトリウスB5容器内で、4Lの作業容積でバッチ工程を実行した。6mMのL−グルタミン(glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地に細胞を3.105細胞.mL−1で接種し、続いて17日間培養した。
ザルトリウスB5容器内で、4Lの作業容積で流加工程を実行した。6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地に細胞を3.105細胞.mL−1で接種した。培養中にグルコースおよびグルタミンを添加して、上の濃度をそれぞれ15mMおよび1mMに保った。5日目からアミノ酸およびペプチドを添加して、消費されたアミノ酸を補給した。
2Lアプリコン容器内で、本発明の工程を実施した。Refine TechnologyからのATF−2システムを用いて、ATFフローモード内で操作される、GEからの分画分子量(MWCO)100kDaの中空繊維膜を使用して、細胞およびIgG生成物を保持した。6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地中で、3×10e5細胞/mLで培養を開始した。0.05〜0.2nL.細胞−1.日−1の間のSPRを使用して、懸濁細胞培養物を通して、6mMのL−グルタミン(Glutamin)を添加したSAFCからのVPRO培地を灌流した。10.106細胞.mL−1を超えたら1日あたり作業容積の10%、生存細胞密度が30.106細胞.mL−1を超えたらそれ以降は1日あたり作業容積の30%の細胞培養を除去する。
図5から分かるように、本発明の工程によってより高い生存細胞密度が迅速に達成される。さらに細胞密度が非常に高くても保持装置の目詰まりが起こらなかったため、工程C3は40日間近い期間にわたり作動を維持されたので、図5はまた、本発明の工程によって細胞生存度がより長く維持できることも示す。
この実施例では、IgG産生CHO細胞系に、本発明に従った方法を実施して温度低下を含めて細胞生育を低下させた。
2Lアプリコン容器内で、本発明の工程を実施した。細胞および生成物保持装置は、Refine TechnologyからのATF−2システムを用いて、ATFフローモードで操作されるゼネラル・エレクトリックからの50kD分画分子量(MWCO)中空繊維膜である。ハイクローンからのMTCM−49培地中で、5.106細胞.mL−1で培養を開始した。0.1〜0.4nL.細胞−1.日−1の間のSPRを使用して、懸濁細胞培養物を通して培地を灌流した。CO2圧力は15%未満に制御された。
データは、本発明の工程が、タンパク質産生CHO細胞系を使用した場合にも機能することを示す。達成された細胞密度および生成物濃度は、バッチ培養と比較して増大する。データはまた、本発明に従った方法で(例えば温度低下によって)細胞生育を抑止できる一方、培養システム中の生成物蓄積が継続することも示す。
本発明に従った方法はまた、骨髄腫細胞系にも適用できる。この目的でザルトリウスバイオスタットBコントローラーを使用して、温度を36.5℃に、pHを7.2〜6.8の間に、およびDOを40%空気飽和率に調節して、100rpmで発酵を実施する。5Lザルトリウス容器内のハイクローンからのSFM4Mab培地に、骨髄腫細胞を3×10e5細胞/mlで接種して細胞培養を開始する。細胞および生成物保持装置は、Refine TechnologyからのATF−4システムを用いて、ATFフローモード内で操作されるゼネラル・エレクトリックからの30kD分画分子量(MWCO)中空繊維膜である。0.1〜0.4nL.細胞−1.日−1の間のSPRを使用し、懸濁細胞培養物を通して、ハイクローンからのSFM4Mab培地を灌流させる。CO2圧力は15%未満に制御される。
本発明に従った方法はまた、懸濁状態の形質転換MDCK細胞系に適用できる。この目的でザルトリウスバイオスタットBコントローラーを使用して、温度を36.5℃に、pHを7.2〜6.8の間に、およびDOを40%空気飽和率に調節して、100rpmで発酵を実施する。5Lザルトリウス容器内のインビトロジェンからのVP−SFM培地に、形質転換MDCK細胞を3×10e5細胞/mlで接種して細胞培養を開始する。細胞および生成物保持装置は、Refine TechnologyからのATF−4システムを用いて、ATFフローモード内で操作されるゼネラル・エレクトリックからの30kD分画分子量(MWCO)中空繊維膜である。0.1〜0.4nL.細胞−1.日−1の間のSPRを使用し、懸濁細胞培養物を通して、インビトロジェンからのVP−SFM培地を灌流させる。CO2圧力は15%未満に制御される。
Claims (14)
- 細胞が生物学的物質を産生し、少なくとも1つの細胞培養液成分が細胞培養物に供給され、
細胞、生物学的物質、および細胞培養液を含んでなる細胞培養物が分離システム上で循環され、
分離システムが生物学的物質よりも低い分子量を有する物質から生物学的物質を分離し、
生物学的物質が反応器内に保持されまたはその中に送り戻される、
反応器内で細胞培養液中の懸濁状態の細胞を培養する方法。 - より低い分子量の物質の一部が細胞培養物から連続的に除去される、請求項1に記載の方法。
- 細胞が哺乳類細胞、好ましくはE1−不死化HER細胞、より好ましくはPER.C6細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 生物学的物質が組み換えタンパク質、好ましくは抗体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 分離システムが、フィルター、好ましくは薄膜フィルター、より好ましくは中空繊維フィルターである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物がクロスフロー、好ましくは交互のタンジェンシャルフローで、フィルター上で循環される、請求項5に記載の方法。
- 細胞培養物が反応器から少なくとも1回除去され、液体、好ましくは細胞培養液が反応器に添加されて細胞培養物の除去を代償する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養条件が、細胞生育速度および/または細胞比生産性が制限されないように選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養条件が、細胞培養液成分の少なくとも1つの濃度が一定のままであるように選択される、請求項8に記載の方法。
- 枯渇栄養素を反応器に供給することで、少なくともこれらの栄養素が部分的にまたは好ましくは完全に補給される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 場合により生物学的物質が細胞からおよび/または細胞培養物から収集される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも50×106細胞/mLの生存細胞密度および少なくとも5g/Lの生物学的物質濃度を有する哺乳類細胞を含んでなる細胞培養物。
- 生物学的物質の濃度が少なくとも10g/L、好ましくは少なくとも11g/Lである、請求項12に記載の細胞培養物。
- 哺乳類細胞がE1−不死化HER細胞、好ましくはPER.C6細胞である、請求項12または13に記載の細胞培養物。
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