TW201604277A - 改良之細胞培養方法（三） - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種於一反應器於一細胞培養基之懸浮液中培養細胞，較佳為E1-永生化HER細胞，更佳為PER.C6細胞之方法，其中該等細胞產生一生物物質，較佳為抗體，其中至少一種細胞培養基成分係進給至該細胞培養物中；以及其中包含該等細胞、該生物物質、及細胞培養基之該細胞培養物循環通過一分離系統；以及其中該分離系統將該生物物質與具有比該生物物質更低分子量之物質分離；以及其中該生物物質係保留於反應器內或反向進給回該反應器內。較佳部分較低分子量物質係由該細胞培養物中連續移除。

Description

改良之細胞培養方法(三) 發明領域
本發明係關於一種於一反應器內於一細胞培養基之懸浮液中培養細胞之方法。
發明背景
此種方法例如由WO04/099396為已知。此處說明如何將一批次式進給方法中之生長條件最佳化，來改良細胞培養物之細胞密度及期望之生物材料之產量。
此外，WO05/095578揭示一種經由連續灌注培養包含細胞培養基細胞之一細胞培養物來培養細胞之方法，其中細胞培養基添加至細胞培養物，細胞培養物循環通過一過濾模組，該過濾模組包含中空纖維，結果導致液體流出流具有比該細胞培養物更低的細胞密度，以及於該過濾模組內部之液流為交替正切流，其中該等細胞可製造一生物物質。於WO05/095578之實例中顯示製造0.9克/升/日產物，相當於流出流中之產物濃度約為0.3克/升。
含有該生物物質之液體體積愈大，則該生物物質純化變成愈煩瑣。所得生物物質之濃度不如 WO04/099396及WO05/095578所揭示之方法之生物物質之濃度高。因此此種生物物質之下游處理變煩瑣，原因在於生物物質於進一步純化步驟之前必須經濃縮，或須純化大量較低度濃縮之生物物質。此外，於較低生物密度培養細胞，結果導致較低體積生產力，因此需要較大型及/或較多個培養容器，如此對一給定製造層面而言需要更高的資本設備投資。
因此，本發明之目的係提供一種其中產物係以較高濃度由細胞培養獲得之方法。
本發明之又一目的係允許長時間培養細胞及製造生物材料之方法。
發明概要
此等目的可經由一種於一反應器於一細胞培養基之懸浮液培養細胞之方法，其中該等細胞製造一生物物質，其中至少一種細胞培養基成分係進給至該細胞培養物；以及其中包含該生物物質及細胞培養基之細胞培養物循環通過一分離系統；以及其中該分離系統將該生物物質與具有分子量比該生物物質更低之該等物質分離；以及其中該生物物質係保留於反應器或反向進給回該反應器內。
舉例言之，本發明係關於一種於一反應器於一細胞培養基培養細胞之方法，其中該等細胞製造一生物物質；其中養分及/或細胞培養基進給至該反應器；以及其中包含該等細胞及細胞培養基之細胞培養物循環通過具有 孔徑或具有分子量截留為5kD至500kD之一過濾器。
發現經由使用將該生物物質與具有比該生物 物質更低分子量之物質分離之一分離系統，生物物質以較高濃度積聚於該細胞培養物中。
如此本發明與先前技術說明之細胞培養之差 異在於，本發明方法允許期望之生物材料連同細胞質塊之積聚。
於本發明之一較佳實施例中，部分較低分子 量物質係由該細胞培養中連續移除。
本發明方法之一額外優點為，比較例如批次 法或批次式進給法實例可達成較高活細胞濃度。此外，比較例如批次法或批次式進給法，製造時間亦即細胞製造生物物質的時間可延長。此外，比較批次法或批次式進給法，可使用較小型反應器。使用較小型反應器之優點在於可減少設備及工廠相關的投資成本。
此外，可於較短時間獲得較高濃度之生物物 質。
發現可於反應器內部獲得較高濃度之生物物質，而細胞存活率不會銳減，如此不會限制其製造時間。熟諳技藝人士預期出現產物抑制，亦即藉生物物質本身抑制生物物質的製造，或藉細胞所製造的其它巨分子(例如宿主細胞蛋白質、酶、或細胞殘骸)而抑制生物物質的製造。此外，發現期望之生物材料的積聚不會有損分離系統的功能。
本發明方法比較根據WO05/095578及 WO04/099396之方法，就細胞密度、細胞培養物中之產物濃度及延長培養週期等方面而言提供顯著優點。結果，本方法獲得期望生物材料之改良製造。
可用於製造生物物質之細胞原則上全部皆為 熟諳技藝人士已知之細胞，該等細胞具有製造生物產物的能力。該等細胞可為真核細胞例如絲狀真菌，例如黑麴菌(Aspergillus niger)、稻麴菌(Aspergillus oryzae)、雷思木霉(Trichoderma reesei)、產黃青霉(Penicillium chrysogenum)；酵母類例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、Phaffia rhodozyma；得自比奇菌(Pichia)屬之酵母例如巴士多比奇菌(Pichia pastoris)；或為原核細胞例如大腸桿菌(Escherichia coli)、芽抱桿菌屬(Bacillus sp.)例如第一芽孢桿菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、溶解澱粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)、鏈絲菌屬(Streptomyces sp.)、麩胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas sp.)。真核細胞之實例例如也說明於Chu,L.,Robinson,D.K.,(2001)Curr.Opinion Biotechn.,vol.12,p.180-187。較佳用於本發明方法之細胞為動物細胞，特別為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞之實例包括CHO(中國倉鼠卵巢)細胞、融合瘤、BHK(嬰倉鼠腎)細胞、骨髓瘤細胞、人類細胞例如HEK-293細胞、人類淋巴母細胞、E1-永生化HER細胞、小鼠細胞例如NS0 細胞。更佳使用E1-永生化HER細胞，最佳為PER.C6細胞。
一次人胚胎網膜(HER)細胞可分離自胎兒 (Byrd P,Brown KW,Gallimore PH.1982。藉經轉殖之腺病毒12 DNA之人胚胎網狀母細胞之惡性轉形，自然298：69-71；Byrd PJ,Grand RJA,Gallimore PH.1988。藉腺病毒E1區及E1A+ras之組合進行一次人胚胎網膜細胞之差異轉形，致癌基因2：477-484)。一次細胞於培養數個繼代培養之後將死亡。用於本發明之目的之E1-永生化HER細胞係經由表現其中編碼腺病毒E1A蛋白質及E1B蛋白質之DNA，獲得永生化細胞而從一次HER細胞衍生而得。此種永生化細胞可培養超過100繼代培養。獲得E1-永生化HER細胞之方法例如係說明於美國專利5,994,128；Byrd P,Brown KW,Gallimore PH.1982。藉經轉殖之腺病毒12 DNA之人胚胎網狀母細胞之惡性轉形，自然298：69-71；Byrd PJ,Grand RJA,Gallimore PH.1988。藉腺病毒E1區及E1A+ras之組合進行一次人胚胎網膜細胞之差異轉形，致癌基因2：477-484；及Gallimore,P.H.,Grand,R.J.A.及Byrd P.J.(1986)，以猴病毒40、腺病毒及ras致癌基因之人胚胎網狀母細胞之轉形，抗癌研究，6，499-508頁。例如永生化HER細胞包括PER.C1、PER.C3、PER.C4、PER.C5、PER.C6、PER.C8及PER.C9細胞係經由於人磷酸甘油酸酯激酶(「PGK」)啟動基因的控制之下，使用含有腺病毒血清型5(Ad5)E1A-編碼序列及E1B-編碼序列(Ad5核苷酸459-3510)之一質體轉感染所產生(參考美國專利 5,994,128)。
於一較佳實施例中，於本發明方法中之細胞 為E1-永生化HER細胞，更佳為PER.C6細胞(參考美國專利5,994,128)。PER.C6細胞例如為以ECACC No.96022940寄存之細胞(例如參考美國專利5,994,128、EP 0833934 B1)。
於本發明方法中，細胞可以任一種形式於懸 浮液培養，例如細胞可呈永生化細胞、單一細胞、或細胞簇或其組合。較佳細胞係呈單一細胞及/或呈不超過100細胞更佳不超過20細胞之細胞簇培養。細胞可為例如致動於微載體上，微載體例如可購自GE健康照護公司(GE Healthcare)(賽妥戴斯(Cytodex))。
此處定義之反應器為一種包含細胞培養之系 統，而該細胞培養又包含細胞及細胞培養基。較佳提供無菌屏障諸如空氣濾清器來防止其它細胞的污染期望的細胞；較佳係經由提供正確的培養條件，諸如混合、溫度、pH、氧濃度等來為細胞維持有利的環境。
反應器例如可具有更為持久的本質，例如反 應器可為不鏽鋼製成或玻璃製成或反應器可具有拋棄式本質，例如反應器可為塑膠瓶或塑膠袋。適合用於本發明之反應器之實例包括但非限於攪拌槽反應器、空氣升高反應器、及拋棄式袋，可藉搖動、振動或攪動來混合。較佳使用拋棄式(生物)反應器，原因在於該等反應器為有利，反應器所需投資成本相對較低，反應器有較大操作彈性、較短週轉時間，且反應器容易組配來適合本發明方法。拋棄式 (生物)反應器於市面上可購自海可隆(Hyclone)、沙妥立思(Sartorius)、艾普立康(Applikon)、或偉夫(Wave)。
於本發明之主幹內部定義之「分離系統」一 詞為可基於分子量來分離之系統。於本發明方法中使用之分離系統為可由具有比該生物物質更低分子量之物質分離該生物物質之系統。換言之，分子量截留係選定為分子量截留(MWCO)係比生物物質之分子量更小，更佳更小至少因數2，最佳更小至少因數3。典型地，當然係依據於本發明方法所製造之生物物質之分子量決定，分離系統之MWCO較佳至少為5kDa，更佳至少為10kDa，最佳至少為30kDa，且較佳至多為500kDa，更佳至多為300kDa，最佳至多為100kDa。例如對於具有分子量150kDa之IgG而言，以至多50kDa之MWCO之分離系統為佳。
分離系統之實例包括但非限於過濾器、離心 機及水性二相萃取系統。
「過濾器」一詞用於此處係表示包括可基於 尺寸或基於分子量分離粒子之全部裝置。原則上，於本發明方法中，可選用任一種過濾器，只要孔徑或MWCO係選擇讓生物物質與具有比該生物物質更低分子量之物質分離即可，典型具有孔徑或MWCO為5kDa至500kDa。適合用於本發明之過濾器實例包括膜過濾器、陶瓷過濾器及金屬過濾器。可使用任一種形狀之過濾器；過濾器例如為螺旋捲繞或為管狀，或過濾器可以片狀形式使用。較佳於本發明方法中，所使用之過濾器為膜過濾器，較佳為中空纖維過 濾器。「中空纖維」一詞表示管狀膜。管子內徑至少為0.1毫米，更佳至少為0.5毫米，最佳至少為0.75毫米且較佳管子內徑至多為10毫米，更佳至多為6毫米及最佳至多為1毫米。包含中空纖維之過濾器模組於市面上例如可得自奇異公司(General Electric)(GE，前名阿默山公司(Amersham))。
藉由包含生物物質、細胞及細胞培養基之細 胞培養物於一分離系統上循環，生物物質及細胞保留於反應器內，因此液體流出流具有比細胞培養物更低濃度之生物物質及更低細胞密度。通常於本發明方法中，液體流出流不含或殆不含任何生物物質之細胞。通常，液體流出流主要只含具有分子量低於生物物質之分子量之成分。因此大致上全部細胞及大致上全部生物物質通常係保留於反應器內。
較佳過濾器之孔徑或MWCO經選擇讓過濾 器之孔徑或MWCO比較產物之直徑或產物之分子量更小，更佳小至少因數2，最佳小至少因數3，來確保產物之高保留性。典型地，當然係依據產物之尺寸及分子量而定，換言之，依據本發明方法所製造之生物物質之尺寸或分子量而定，過濾器之孔徑或MWCO較佳至少為5kDa，更佳至少為10kDa，及最佳至少為30kDa，及/或過濾器/過濾膜之孔徑或MWCO較佳至多為500kDa，更佳至多為300kDa，及最佳至多為100kDa。
分子量截留(MWCO)一詞表示高於該MWCO 分子量之至少90%粒子係由分離系統所保留。
細胞培養物於一分離系統循環，例如過濾器 裝置循環，讓細胞培養物通過分離系統，例如過濾器，結果導致液體流出流及內容物可維持於反應器內或反向進給回反應器之流。其內容物維持於反應器內或反向進給回反應器內之液流大致上只含有具有分子量至少等於或高於該生物物質之分子量之成分，因此該液流將包含比液體流出流更大量之生物物質。
原則上，並無特殊限制，於本發明方法期間 何時細胞培養開始循環通過分離系統。細胞培養物的循環例如可始於該方法的起點，或可始於細胞之活細胞數目達到某個程度時。
細胞培養物循環於過濾器上可為就過濾器表 面之實質垂直流，也稱作為死端流；或循環可為實質上平行於過濾器表面之流，也稱作為正切流，例如單向正切流(TFF)或交叉流。交叉流之較佳實例為交替正切流(ATF)，原因在於使用ATF，發現即使於極高細胞密度也不會(快速)出現過濾器阻塞。一般瞭解於深部過濾時，最終小孔隙過濾器需要藉過程前置過濾器來保護避免阻塞。本實務係基於一般瞭解有較小孔隙或有較小MWCO之過濾器較容易阻塞，因而限制生產時間。若使用ATF，則無需使用前置過濾器。
液流可藉由移動培養物導引，藉由移動過濾 器或藉由二者導引。過濾器例如可藉旋轉移動(旋轉過濾器)或藉振動移動(振動過濾器)。另外，若液流之經由移動細胞 培養物導引，過濾器為靜態，細胞培養物例如可藉幫浦或藉加壓移動。
「交替正切流」一詞表示於過濾器表面之相同方向(亦即正切過濾器表面)只有一道液流，該液流來回移動，以及有實質垂直於該過濾器表面方向之另一道液流。交替正切流可根據熟諳技藝人士已知之方法(例如述於US 6,544,424)來達成。
於細胞培養過程中，至少一種細胞培養基成分，例如一種或多種養分及/或細胞培養基可進給至細胞。於根據本發明之方法中，較佳藉由養分進料之進給反應器來補充部分或較佳補充全部至少一種被耗盡的養分。例如完全細胞培養基可進給至反應器，完全細胞培養基較佳係呈分開進料，因此無需分開準備。細胞培養基例如可以較為濃縮形式進給至細胞；其優點為體積較小因此較容易處理。此外，一種或多種養分可進給至反應器。例如碳水化合物例如葡萄糖或果糖；胺基酸諸如麩胺或胜肽類也較佳進給至反應器。
於本發明之較佳實施例中，細胞培養條件經選擇，讓細胞生長速率及/或細胞之比生產力未受限制，更佳細胞培養基之至少一種成分之濃度維持大致上恆定。限制細胞培養條件之實例為養分限制及抑制性代謝產物(諸如氨氣、二氧化碳及乳酸鹽)的形成。舉例言之，細胞培養條件諸如進料可選擇讓細胞生長速率不受限制，例如經由供給足量養分來補償養分的耗盡；及/或避免製造出抑制性 代謝產物諸如乳酸鹽或氨。舉例言之，可選擇通氣條件，讓二氧化碳的形成不會限制細胞生長速率。於非限制性條件下生長的細胞由優良製造規範(GMP)觀點看來高度較佳，原因在於1)可獲得恆定細胞培養環境，於多種情況下，可獲得穩定良好之產品品質；以及2)可獲得高細胞存活率，於某些情況下，可獲得大於98%之細胞存活率。高細胞存活率可降低細胞相關污染物諸如宿主細胞蛋白質的釋放，而有助於產物的純化。此外，細胞於不受限制之細胞生長速率及/或不受限制之比生產力生長，具有商業優勢，如此生長細胞可於甚至更短時間內製造更大量生物物質，原因在於於該方法將可更早期達到更高細胞密度。
細胞之「比生產力」為每單位時間每個細胞 所製造之給定生物物質數量，通常係以皮克．細胞-1日-1表示。
至少一種細胞培養基成分例如養分及/或細 胞培養基添加至細胞培養之添加速率(流入速率或灌注速率)影響細胞的存活率及細胞密度。於本發明方法中，細胞培養基成分諸如養分及/或細胞培養基可以例如連續流、半連續流例如階梯式流或交錯流進給。較佳，細胞培養基成分例如養分及/或細胞培養基係以連續流添加。
細胞培養基成分諸如完全細胞培養基及/或 養分原則上可於方法過程中之任何時間進給至反應器。較佳，進料係始於酶基質諸如麩胺基葡萄糖達到過低濃度，因而導致細胞生長停止之前；或進料係始於抑制性代謝產 物諸如乳酸鹽或氨達到高濃度結果細胞生長停止之前。由此點開始，細胞培養基成分諸如養分及/或完全細胞培養基較佳係以符合酶基質的需求之速率進給至反應器。
於本發明之一個實施例中，細胞培養基係以根據式(1)之進給速率添加：進給速率=SFR x(總細胞培養物體積)×(存活細胞密度) (1)
其中進給速率係以每日之升數表示，其中SFR為比進給速率，亦即細胞培養基進給至細胞培養物之速率，以每單位時間每個存活細胞之培養基添加量表示；以及其中存活細胞密度為每單位體積之存活細胞數目。存活細胞數目可由熟諳技藝人士例如透過崔朋藍(trypan blue)排除方法測定。比進給速率較佳係選用0.01至0.3奈升/細胞/日，更佳為0.01至0.2奈升/細胞/日。
較佳當調整進給速率時考慮額外參數，例如考慮進給至培養物之葡萄糖數量及/或氧攝取速率。舉例言之，用於PER.C6細胞，培養基及/或養分之進給速率較佳係選用葡萄糖濃度維持於3至20毫莫耳/升，更佳維持於5至15毫莫耳/升。較佳葡萄糖濃度至少為3毫莫耳/升，更佳至少5毫莫耳/升且較佳至多20毫莫耳/升更佳至多15毫莫耳/升。
於本發明之特定實施例中，細胞培養物(包括細胞、生物物質及細胞培養基)至少由反應器移開一次；添加液體例如細胞培養基或養分進料至反應器來補償細胞培養物的移除。細胞培養物的移除可能導致較長方法時間，於高細胞密度組合高細胞存活率，導致較高生產力。細胞 培養物可連續移除或階段式移除。
於本發明之較佳實施例中，一旦達到期望之 細胞密度，例如細胞密度至少為10×105存活細胞/毫升，較佳至少20×106存活細胞/毫升，更佳至少30×106存活細胞/毫升例如至多200×105存活細胞/毫升之細胞密度時，細胞培養物(包括細胞、生物物質及細胞培養基)由反應器移出；以及例如細胞培養基或養分進料等液體添加至反應器來補償所移除之細胞培養物。較佳細胞培養物之移除速率允許細胞密度維持於期望之細胞密度之範圍。本發明之此一實施例比較習知批次法或批次式進給法高度優異，原因在於組合本發明方法之優點於可夠長時間維持高存活率，因此可實現甚至更高之總體積生產力。「體積生產力」一詞表示每單位時間每單位反應器體積所生產之生物物質數量，通常係以克．升-1．日-1表示。比較習知灌注方法，本發明之實施例也高度較佳，原因在於其組合本發明方法之優點與細胞培養物移除流含有高濃度生物物質。於細胞培養物移除流中之高濃度生物物質可由其中收穫生物物質因而於商業上獲得高度感興趣。於其中細胞培養被移除之習知灌注方法中，細胞培養移除流不含足量生物物質來讓收穫生物物質有商業價值，細胞培養的移除流通常被視為廢棄物。因此，於本發明之實施例中，理論上全部製造的生物物質皆可以直捷、經濟可行且簡單之方式收穫。
於本發明之特佳實施例中，細胞培養條件係 選用細胞生長速率及/或細胞之比生產力未受限制，且更佳 細胞培養條件係選擇也讓細胞培養基之至少一種成分諸如葡萄糖或麩胺成分之濃度維持恆定，以及一旦達到期望之細胞密度時細胞培養物至少由反應器移除一次，且液體例如細胞培養基添加至反應器來補償該細胞培養物的移除。
較佳流出流速率係選用實質等於至少一種細 胞培養基成分例如養分及/或細胞培養基之添加速率減任選的細胞培養物移除速率。
製造生物物質的細胞例如為可表現該生物物 質之編碼基因之細胞。可表現該生物物質之編碼基因之細胞例如可經由使用一質體轉感染該等細胞而製備，該質體含有該生物物質之編碼基因及適當選擇標記之編碼基因，例如新黴素(neomycine)抗藥性編碼基因(Neo編記基因)。然後穩定轉感染細胞可藉選擇壓力來選出。例如以Neo標記基因為例，經由將轉感染的細胞於G418(珍那瑞辛(genericin))存在下培養，即刻篩選具有高度該生物物質表現程度之細胞之選擇壓力下選出。製備表現一種蛋白質之E1-永生化HER細胞純株之方法及培養此種細胞來製造該種蛋白質之方法為熟諳技藝人士眾所周知，例如可參考US 6,855,544。
可由細胞所製造之生物物質，例如可經由表 現一(重組)編碼基因所製造之生物物質因而為(重組)蛋白質，特別為受體、酶、融合蛋白質、血液蛋白質例如得自血液凝固串級之蛋白質、多功能蛋白質例如紅血球生成素、病毒蛋白質或細菌蛋白質例如用於疫苗；免疫球蛋白例如抗體如IgG或IgM等；較佳為細胞製造之蛋白質更佳為 細胞製造之抗體。較佳，細胞製造之生物物質諸如蛋白質或疫苗可用於藥學製劑作為活性成分。於本發明之內文中，「產物」一詞與「生物物質」一詞互換使用。
於本發明之架構內，藥學製劑一詞表示任一 種可用作為藥物特別用於人體作為藥物之製劑。此種藥物例如可用於診斷或用於預防目的，例如疫苗及/或用於治療目的例如病人缺乏之酶或蛋白質或殺死非期望的細胞之抗體。藥學製劑可進一步含有藥學上可接受之載劑或賦形劑，其實例為熟諳技藝人士眾所周知。
PER.C6細胞系可用於製造生物物質，諸如 E1-排空腺病毒(例如參考美國專利6,994,128；Nichols等人，2002，腺病毒載體之繁殖；PER.C6細胞之使用於：Curiel D.Douglas JT編輯，基因治療用之腺病毒載體，聖地牙哥：艾索維亞(Elsevier)，129-167頁、其它病毒(例如參考WO 01/38362)、或重組蛋白質例如參考美國專利6,855,544；Yallop等人，2005，PER.C6細胞用於製造生物藥學蛋白質，新穎生藥：設計、發展及優化，第4輯，779-807，Jörg Knäblein(編者))。
可用於藥學製劑(括出商品名)作為活性成分 之蛋白質實例包括鐵尼太普拉斯(Tenecteplase)(TN Kase)、(重組)抗嗜血因子(瑞法妥(ReFacto))、類淋巴母細胞干擾素α-n1(偉費隆(Wellferon))、(重組)凝血因子(諾佛席分(NovoSeven))、伊坦尼賽普(Etanercept)(英布爾(Enbrel))、萃司土馬(Trastuzumab)(赫賽普丁(Herceptin))、 英富西馬(Infliximab)(瑞米凱(Remicade))、帕里席祖馬(Palivizumab)(賽納吉(Synagis))、巴席里西馬(Basiliximab)(西慕列(Simulect))、達可立祖馬(Daclizumab)(西那帕(Zenapaz))、瑞土西馬(Rituximab)(瑞土山(Rituxan))、(重組)第IX凝血因子(貝涅費(Benefix))及干擾素β-1a(阿佛涅(Avonex))。
可用作為藥學製劑之活性成分之疫苗實例包 括經分離之蛋白質抗原，其實例包括但非限於活、口服、四價輪狀病毒疫苗(瑞塔席爾(RotaShield))、狂犬病疫苗(藍阿佛(RanAvert))、流行性感冒疫苗及鈍化A型肝炎疫苗(法可塔(VAQTA))。
培養基之pH、溫度、溶氧濃度及滲透度原則 上並無特殊限制，且係依據所選用的細胞類型決定。較佳，pH、溫度、溶氧濃度及滲透度經選擇因而對細胞的生長及細胞生產力為最佳。熟諳技藝人士瞭解如何找到培養之最佳pH、溫度、溶氧濃度及滲透度(例如參考WO 2004/099396)。較佳用於本發明方法，當使用E1-永生化HER細胞時，pH係選用6.6至7.6及/或溫度係選用30℃至39℃及/或滲透度係選用260至400毫滲透度/千克(mOsm/kg)。為了維持最佳方法條件，期望自動化控制方法條件。為了獲得最佳方法條件，例如細胞生長停止來獲得較高生產力，於培養期間可施加培養條件的變定。例如可藉溫度變動(例如由37℃至32℃)、pH變動或滲透壓變動來建立。
本發明方法原則上可於任一型適合用於細胞 培養之細胞培養基進行。細胞培養基及細胞培養條件之選用指南為眾所周知，例如提供於Freshney,R.I.動物細胞培養(基本技術手冊)第4版2000年Wiley-Liss之第8章及第9章；以及提供於Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G.細胞與組織培養：實驗室程序1993年，約翰威利父子公司。
舉例言之，細胞培養基例如包含碳水化合物 源、鹽類及/或胺基酸及/或維生素及/或脂質及/或清潔劑及/或緩衝劑及/或生長因子及/或激素及/或細胞激素及/或微量元素來作為細胞培養基成分。碳水化合物來源實例包括葡萄糖、果糖、半乳糖及丙酮酸鹽。鹽類之實例包括鎂鹽例如MgCl2．6H2O、MgSO4及MgSO4．7H2O；鐵鹽例如FeSO4．7H2O；鉀鹽例如KH2PO4、KCl；鈉鹽例如NaH2PO4、Na2HPO4；及鈣鹽例如CaCl2．2H2O。胺基酸之實例包括全部已知之蛋白質產生性胺基酸諸如組胺酸、麩胺、蘇胺酸、絲胺酸、蛋胺酸。維生素之實例包括抗壞血酸、生物素、膽鹼．Cl、肌糖醇、D-泛酸、核糖黃素、脂質之實例包括脂肪酸例如亞麻酸及油酸；清潔劑之實例包括吞恩(Tween)80及普隆尼克(Pluronic)F68。緩衝劑之實例包括HEPES及Na2CO3。生長因子/激素/細胞激素之實例包括IGF(胰島素狀生長因子)、氫皮質酮(hydrocortisone)及(重組)胰島素。 微量元素之實例為熟諳技藝人士所已知且包括鋅、鎂及硒。細胞培養基例如也包含其它細胞培養基成分例如大豆蛋白腖或乙醇胺。
用於根據本發明之生物物質之製造，特別若 該生物物質欲用作為藥學製劑之活性成分，以不含血清之培養基優於含有血清來源之培養基。其理由在於血清來源之培養基可能污染有病毒，存在有普利子感染(prionic infections)的風險，可能造成下游生藥產品製造上的重大障礙(換言之，由細胞培養中進一步純化該生物物質的重大障礙)。因此本發明方法較佳係於不含來自於動物來源包括人類來源之血清之細胞培養基進行。因得自哺乳動物來源之化合物也具有感染風險，故較佳細胞培養基為不含哺乳動物來源(亦即細胞培養基不含得自哺乳動物來源之血清或成分)。更佳，細胞培養基為不含動物來源(亦即細胞培養基不含來自動物來源包括人類來源之血清或成分)。可用於培養PER.C6細胞之不含血清之培養基之實例包括市售培養基例如EX Cell VPRO培養基(SAFC)、HyQ® CDM4Retino(海可隆)、IS ProVec CD(艾文科學公司(Irvine scientific))、293-SFM II(因維左金公司(invitrogen))。
於較佳實施例中，於本發明方法製造之生物 物質係由液流中收穫，該液流之內容物係維持於反應器或較佳反向進給回反應器；或收穫自由反應器中移除之細胞培養物；或收穫自二者。於本發明方法所製造之生物物質可使用與生物物質相關之方法而進一步有所謂之下游處理之細胞培養物中收穫，該等使用之方法為熟諳技藝人士眾所周知。下游處理通常包含以各種組合及各種順序之數個純化步驟。於下游處理之純化步驟之實例為分離步驟(例如藉親和層析術及/或離子交換層析術及/或藉水性二相系統 萃取及/或例如藉硫酸銨沉澱)、濃縮生物物質之步驟(例如藉超濾或滲濾濃縮)、交換緩衝液之步驟及/或去除病毒或鈍化病毒之步驟(例如經由病毒過濾、pH變換或溶劑清潔劑處理)。
於一個態樣中，本發明係關於一種細胞培 養，包含哺乳動物細胞較佳為E1-永生化HER細胞，更佳為PER.C6細胞，具有活細胞密度至少為50×106細胞/毫升，較佳至少為60×106細胞/毫升，特別至少為90×106細胞/毫升，及具有生物物質濃度至少為5克/升，更佳至少為10克/升，特別至少為11克/升。原則上，生物物質濃度係如生物物質之溶解度所允許儘可能為高濃度。活細胞濃度典型為不超過200×106細胞/毫升，且較佳係於80-150×106細胞/毫升之範圍。
活細胞密度例如可使用崔朋藍排除法例如使 用市面上得自以伊諾法提公司(innovates)(西戴司(Cedex)細胞計數器)之細胞計數器。
細胞培養表示包含細胞培養基、細胞及生物 物質之液體，該液體係細胞於反應器內於細胞培養基培養程序之結果，其中該細胞製造該生物物質。
現在將藉下列實例說明本發明，但非限制性。
第1圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及 C1(本發明方法)之活細胞密度Y(106毫升-1)相對於處理時間X(日)之作圖。
第2圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及 C1(本發明方法)之反應器Z中之IgG濃度(比較方法A之IgG濃度之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
第3圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及 C2(本發明方法)之活細胞密度Y(106毫升-1)相對於處理時間X(日)之作圖。
第4圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及 C2(本發明方法)之反應器Z中之IgG濃度(比較方法A之IgG濃度之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
第5圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及 C3(本發明方法)之活細胞密度Y(106毫升-1)相對於處理時間X(日)之作圖。
第6圖顯示方法A、及C3之反應器Z中之IgG 濃度(比較方法A3之IgG濃度之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
第7圖顯示方法A、B及C3之累進產率Q(比較 每個反應器體積，於方法A之產率之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
第8圖顯示C4(本發明方法)之細胞數目Y(106 毫升-1)相對於處理時間X(日)之作圖。
第9圖顯示方法C4(本發明方法)之一實施例 於反應器Z之IgG濃度(比較所達到之最大IgG濃度之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
較佳實施例之詳細說明 實例 實例1：批次法、批次式進給法及根據本發明方法間之比較
於本實例中，根據本發明之方法之效能與批次法及批次式進給法作比較。
第1圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及C1(本發明方法)之活細胞密度Y(106毫升-1)相對於處理時間X(日)之作圖。
第2圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及C1(本發明方法)之反應器Z中之IgG濃度(比較方法A之IgG濃度之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
全部發酵皆係使用沙妥立思(Sartorius)生物史塔(Biostat)B控制器將溫度控制於36.5℃，pH於7.2至6.8及DO於50%空氣飽和度及於200rpm進行。全部實驗係使用相同之可製造IgG之PER.C6細胞系(參考WO 2004/099396)。
批次法A
批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細胞以3×105細胞/毫升接種於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)及隨後培養17日。
批次式進給法B
批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細胞以3×105細胞/毫升接種於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)。於培養期間，添加葡萄糖及麩胺，來分別維持濃度高於15mM及1mM。由第5日開始添加胺基酸及胜肽來補 充所耗用之胺基酸。
本發明方法C1
本發明方法係於2升艾普立康容器內進行。得自奇異公司(GE)之100kDa分子量截留(MWCO)中空纖維膜以ATF流動模式操作，使用ATF-2系統(精製技術公司(Refine Technology))用來保留細胞及IgG產物。培養始於3×105細胞/毫升於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)。補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)係使用比流速(SFR)為0.05及0.2奈升/細胞/日灌注通過懸浮液細胞培養物。所得最高產物濃度為1.4克/升。
本發明方法比較所述培養模式可於較短時間內獲得較高活細胞密度及較高產物濃度，由如下第1圖及第2圖可知。
實例2：批次法、批次式進給法及根據本發明方法間之比較
於本實例中，根據本發明方法再度與批次法及批次式進給法比較；於方法C2中，二氧化碳壓力經控制，及使用50kDa分離系統。
第3圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及C2(本發明方法)之活細胞密度Y(106毫升-1)相對於處理時間X(日)之作圖。
第4圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及C2(本發明方法)之反應器Z中之IgG濃度(比較方法A之IgG濃度之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
全部發酵皆係使用沙妥立思生物史塔B控制器將溫度控制於36.5℃，pH於7.2至6.8及DO於50%空氣飽和度及於 200rpm進行。全部實驗係使用相同之可製造IgG之PER.C6細胞系(參考WO2004/099396)。
批次法A
批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細胞以3×105細胞/毫升接種於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)及隨後培養17日。
批次式進給法B
批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細胞以3×105細胞/毫升接種於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)。於培養期間，添加葡萄糖及麩胺，來分別維持濃度高於15mM及1mM。由第5日開始添加胺基酸及胜肽來補充所耗用之胺基酸。
本發明方法C2
本發明方法係於2升艾普立康容器內進行。50kDa分子量截留(MWCO)中空纖維膜(GE)於ATE流動模式使用ATE-2系統(精製技術公司)操作，用來保留細胞及IgG產物。培養始於3×105細胞/毫升於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)。補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)係使用比流速(SFR)為0.05及0.2奈升/細胞/日灌注通過懸浮液細胞培養物。二氧化碳濃度控制低於15%。
結果
如由第3圖及第4圖可知，根據本發明方法於相等時間或較少時間(100%批次時間；81%批次式進給時間)獲得顯著提高之活細胞密度及較高產物濃度(2415%×批次產率； 690%×批次式進給產率)。
本發明方法之總生產率增高(以克．升-1．日-1表示)為批次生產力(以克．升-1．日-1表示)之23.9倍，及為批次式進給生產力(以克．升-1．日-1表示)的8.5倍。於本發明方法C2中，製造11.1克產物/升。17日期間未出現保留裝置的阻塞，即使使用極高細胞密度也未發生。
實例3：批次法、批次式進給法及根據本發明方法間之比較
於本實例中，根據本發明方法伴以細胞培養物移除效能再度與批次法及批次式進給法作比較；於方法C3中，細胞培養物已經被移除。
第5圖顯示方法A(批次)、B(批次式進給)及C3(本發明方法)之活細胞密度Y(106毫升-1)相對於處理時間X(日)之作圖。
第6圖顯示方法A、及C3之反應器Z中之IgG濃度(比較方法A3之IgG濃度之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
第7圖顯示方法A、B及C3之累進產率Q(比較每個反應器體積，於方法A之產率之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
全部發酵皆係使用沙妥立思生物史塔B控制器將溫度控制於36.5℃，pH於7.2至6.8及DO於50%空氣飽和度及於200rpm進行。全部實驗係使用相同之可製造IgG之PER.C6細胞系(參考WO2004/099396)。
批次法A
批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細胞 以3×105細胞/毫升接種於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)及隨後培養17日。
批次式進給法B
批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細胞以3×105細胞/毫升接種於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)。於培養期間，添加葡萄糖及麩胺，來分別維持濃度高於15mM及1mM。由第5日開始添加胺基酸及胜肽來補充所耗用之胺基酸。
本發明方法C3
本發明方法係於2升艾普立康容器內進行。100kDa分子量截留(MWCO)中空纖維膜(GE)於ATF流動模式使用ATF-2系統(精製技術公司)操作，用來保留細胞及IgG產物。培養始於3×105細胞/毫升於補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)。補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)係使用比流速(SFR)為0.05及0.2奈升/細胞/日灌注通過懸浮液細胞培養物。每日於高於細胞密度10×106細胞/毫升-1時以10%工作量移除細胞培養物，而當活細胞密度超過30×106細胞/毫升-1及以上時以每日之30%工作量移除。
結果
如由第5圖可知，使用本發明方法可快速達成較高活細胞密度。第5圖也顯示使用本發明方法，細胞存活率可較長時間維持，方法C3可維持操作超過接近40日時間，即使高細胞密度，保留裝置仍然未發生阻塞。
第6圖顯示本發明方法之產物濃度遠比批次法之產物 濃度更高。含有產物之產物流比較批次法A之終濃度可以約200%至250%之倍數收穫自方法C3。
第7圖顯示大部分產物係藉本發明方法形成，本發明方法可比較批次法A或批次式進給法B維持更長時間。於第17日，方法C3之累進產率為批次法(A3)累進產率之8.1倍，而為批次式進給法(B)之累進產率之2.1倍。此外，於第17日，批次法結束。於第21日，方法C3之累進產率為批次式進給法之累進產率之3.0倍。於第21日批次式進給法結束。於第39日後，方法C3之總累進產率為批次法A之累進產率之25倍而為批次式進給法B之累進產率之6倍。
由本實驗獲得結論，於根據本發明方法中期望之生物材料之總產率可具有於細胞密度超過某個高濃度時排放細胞培養物來進一步改良。
實例4：CHO細胞之培養及製造
於本實例中，根據本發明之方法係使用可製造IgG之CHO細胞系進行，包括溫度下降來降低細胞生長。
第8圖顯示C4(本發明方法)之細胞數目Y(106毫升-1)相對於處理時間X(日)之作圖。
第9圖顯示方法C4(本發明方法)之一實施例於反應器Z之IgG濃度(比較所達到之最大IgG濃度之百分比)相對於處理時間X(日)之作圖。
發酵係使用沙妥立思生物史塔B控制器控制溫度於36.5℃，pH於7.1至6.9及DO於40%空氣飽和度及於100rpm進行。於第5日溫度降至32℃。
本發明方法C4
本發明方法係於2升艾普立康容器內進行。細胞及產物保留裝置為於ATF流動模式附有ATF-2系統(精製技術公司)之50kDa分子量截留(MWCO)中空纖維膜(奇異公司)。培養係始於5×106細胞/毫升-1於MTCM-49培養基(海可隆公司)。培養基使用SPR為0.1至0.4奈升．細胞-1．日-1灌注通過懸浮液細胞培養物。二氧化碳壓力控制低於15%。
結果
資料顯示當使用可製造蛋白質之CHO細胞系時，本發明方法也有效。所達成之細胞密度及產物濃度比批次培養高。資料也顯示於根據本發明之方法中，可停止細胞培養(例如藉溫度下降)，而產物積聚於培養系統仍然持續。
實例5：使用骨髓瘤細胞系進行本發明方法
根據本發明方法也可應用於骨髓瘤細胞系。為了達成此項目的，使用沙妥立思生物史塔B控制器將溫度控制於36.5℃，pH控制於7.2至6.8及DO控制於40%空氣飽和度及於100rpm進行發酵。細胞培養始於以3×105細胞/毫升接種骨髓瘤細胞於5升沙妥立思容器內之SFM4Mab培養基(海可隆公司)。細胞及產物保留裝置為附有ATF-4系統(精製技術公司)於ATF流動模式操作之30kDa分子量截留(MWCO)中空纖維膜(奇異公司)。SFM4Mab培養基(海可隆公司)係使用SPR為0.1至0.4奈升．細胞-1．日-1灌注通過懸浮液細胞培養物。二氧化碳壓力控制低於15%。
實例6：使用MDCK細胞系進行本發明方法
根據本發明方法也可應用於轉形MDCK細胞系。為了達成此項目的，使用沙妥立思生物史塔B控制器將溫度控制於36.5℃，pH控制於7.2至6.8及DO控制於40%空氣飽和度及於100rpm進行發酵。細胞培養始於以3×105細胞/毫升接種轉形MDCK細胞於5升沙妥立思容器內之VP-SFM培養基(因維左金公司)。細胞及產物保留裝置為附有ATF-4系統(精製技術公司)於ATF流動模式操作之30kDa分子量截留(MWCO)中空纖維膜(奇異公司)。VP-SFM培養基(因維左金公司)係使用SPR為0.1至0.4奈升．細胞-1．日-1灌注通過懸浮液細胞培養物。二氧化碳壓力控制低於15%。

Claims (19)

  1. 一種在一反應器中於一細胞培養基之懸浮液內培養細胞之方法，其包含：使一細胞培養物循環通過一分離系統，其中該細胞培養物包含真核細胞、該等細胞所製造之生物物質、及細胞培養基，其中至少一種細胞培養基成分係進給至該細胞培養物；其中該細胞培養物係以實質上平行於該分離系統表面之流循環通過該分離系統而導致有一液體流出流及一細胞培養物內容物被保留於或進給回該反應器內之流；其中該分離系統包含一具有孔徑特徵在於分子量截留(molecular weight cut-off)比該生物物質之分子量更小的過濾器以將該生物物質與具有比該生物物質更低分子量之物質分離；以及其中該液體流出流主要只含具有分子量低於該生物物質之分子量之成分，而該細胞培養物內容物被保留於或進給回該反應器內之流大致上只含有具有分子量等於或高於該生物物質之分子量之成分。
  2. 如請求項1之方法，其中該分子量截留比所欲生物物質之分子量更小達有至少一因數2。
  3. 如請求項1之方法，其中該分子量截留比所欲生物物質之分子量更小達有至少一因數3。
  4. 如請求項1之方法，其中部分較低分子量物質係由該細胞培養物中連續移除。
  5. 如請求項1之方法，其中該等真核細胞為哺乳動物細胞。
  6. 如請求項5之方法，其中該等哺乳動物細胞係選自於由下列所組成之群組：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、融合瘤、嬰倉鼠腎(BHK)細胞、骨髓瘤細胞、人類細胞、及小鼠細胞。
  7. 如請求項5之方法，其中該等真核細胞為E1-永生化HER細胞。
  8. 如請求項5之方法，其中該等真核細胞為PER.C6細胞。
  9. 如請求項1之方法，其中該生物物質為重組蛋白質。
  10. 如請求項1之方法，其中該生物物質為抗體。
  11. 如請求項1之方法，其中該分離系統為膜過濾器。
  12. 如請求項1之方法，其中該分離系統為中空纖維過濾器。
  13. 如請求項1之方法，其中該細胞培養物係以交替正切流循環於該過濾器。
  14. 如請求項1之方法，其中該細胞培養基成分係進給至該反應器中之細胞培養物。
  15. 一種在一反應器中於一細胞培養基之懸浮液內培養細胞之方法，其包含：使一細胞培養物循環通過一分離系統，其中該細胞培養物包含真核細胞、該等細胞所製造之生物物質、及細胞培養基，其中至少一種細胞培養基成分係進給至該細胞培養物； 其中該細胞培養物係以實質上平行於該分離系統表面之流循環通過該分離系統而導致有一液體流出流及一細胞培養物內容物被保留於或進給回該反應器內之流；其中該分離系統包含一具有孔徑特徵在於分子量截留(molecular weight cut-off)比該生物物質之分子量更小的過濾器以將該生物物質與具有比該生物物質更低分子量之物質分離；及其中該液體流出流主要只含具有分子量低於該生物物質之分子量之成分，而該細胞培養物內容物被保留於或進給回該反應器內之流大致上只含有具有分子量等於或高於該生物物質之分子量之成分；以及其中該細胞培養物由該反應器移除至少一次。
  16. 如請求項15之方法，其中液體被添加至該反應器來補償該細胞培養物的移除。
  17. 如請求項16之方法，其中該液體為細胞培養基。
  18. 如請求項1之方法，其中該生物物質係收穫自該細胞培養物。
  19. 如請求項15之方法，其中該生物物質係收穫自由該反應器移除至少一次之細胞培養物。
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