CULTIVO DE CÉLULA Y MÉTDO DE UTILIZACIÓN DEL MISMO CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con un método para cultivar una célula y el uso del método. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para cultivar una célula y un método para permitir que una célula produzca una proteína que utiliza el método anterior. ANTECEDENTES DEL RAMO El cultivar una célula de animal para obtener una proteína natural producida por la célula de animal, o al cultivar una célula de animal que incorpora un gene que codifica una proteína deseada para producir la proteína deseada, etc., nutrientes esenciales, tales como bases, azúcares, aminoácidos, y vitaminas se añaden a un medio de cultivo. Además un extracto derivado de mamífero, concretamente suero tal como suero bovino fetal, usualmente se añade en una escala de 5 a 20% para proliferación de la célula de animal. Sin embargo, dicho suero derivado de mamífero tiene un número de desventajas. Cuenta de 75 a 95% del costo del medio de cultivo, y debido a las diferencias entre lotes existentes en calidad, la proliferación estable no se logra. Además, el suero derivado de mamífero no se
puede esterilizar en un autoclave o lo semejante, y de esta manera se puede contaminar con viruses o micoplasmas. Aún cuando la mayoría de estos virus o micoplasmas son no patógenos, pueden convertirse en factores desconocidos adicionales desde el punto de vista de fabricación estable. Además, el suero contiene más de 500 tipos de proteínas, complicando de esta manera el aislamiento y purificación de la proteína deseada, el producto de célula, del medio cultivado. Para resolver estos problemas con fabricación estable, se realizan métodos que utilizan una proteína purificada derivada de suero tal como fetuina, insulina o transferina, en lugar del suero. Los métodos que utilizan componentes de medio de cultivo extraídos de mamífero, también se tratan desde el punto de vista de costo de producción. Recientemente, sin embargo, se ha expresado interés sobre la relación entre componentes derivados de mamíferos y enfermedades tales como la enfermedad de vaca loca, encefalopatyía espongiforme bovina (BSE), encefalopatía esponjiforme transmisible (TSF), y enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJK) . El desarrollo de un medio de cultivo para cultivar células de animal libres de estos componentes derivados de mamífero se ha demandado desde el punto de
vista de seguridad. Al cultivar una célula de animal, la falla en añadir los componentes derivados de mamífero arriba descritos al medio de cultivo ocasiona una caída marcada en el régimen de supervivencia de células, y una disminución en cuenta de célula viable en el caldo de cultivo, en una etapa temprana de cultivo. Estos eventos hacen imposible el cultivo de término prolongado o el cultivo de escala grande. A fin de resolver el problema arriba descrito, un método en el que se añade un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado al medio de cultivo se ha reportado (Documentos de Patente 1 y 2) . Con este método, la producción elevada de proteína se ha hecho posible sin suero bovino fetal que se creía generalmente era esencial. Sin embargo, se ha deseado mejora adicional debido a los niveles todavía superiores de producción de proteína son preferibles desde el punto de vista de costo de producción. Documento de Patente 1: Publicación Internacional WO 99/63058 Documento de Patente 2: Publicación de Patente No Examinada Japonesa No. 2003-334068 EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN
PROBLEMA PARA SOLUCIÓN POR LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es permitir una producción elevada de célula de proteína realizando cultivo por lote alimentado utilizando un medio que contiene un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado. MEDIOS PARA RESOLVER EL PROBLEMA Como resultado de investigaciones extensas e intensas a la solución del problema arriba descrito, los presentes inventores han encontrado que es posible permitir que una célula produzca una proteína de interés de un rendimiento todavía superior realizando cultivo por lote alimentado usando un medio que contiene un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado añadido al mismo. De esta manera, se logró la presente invención. Los asuntos materia de la presente invención son como se describen abajo. (1) Un método para cultivar una célula que comprende iniciar cultivando en un medio inicial y alimentar cuando menos una vez un medio de alimentación al medio inicial durante el cultivo, en donde cuando menos uno del medio inicial o el medio de alimentación contiene un producto de degradación
enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado añadido al mismo. (2) Un método para cultivar una célula que comprende iniciar cultivando en un medio que contiene un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado añadido al mismo y alimentar cuando menos una vez un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado al medio durante el cultivo . (3) El método de (2), en donde la célula se cultiva mediante cultivo de alimentación de lote. (4) El método de cualquiera de (1) a (3), en donde la célula es una célula hacia la que se ha transferido un gene que codifica una proteína de interés. (5) El método de (4), en donde la proteína de interés es un anticuerpo. (6) El método de cualquier de (1) a (5), en donde la célula es una célula de animal. (7) El método de (6), en donde la célula es una célula de mamífero. (8) El método de (7), en donde la célula de mamífero es una célula CHO. (9) Un método para producir una proteína cultivando una
célula, que comprende iniciar el cultivo en un medio inicial y alimentar cuando menos una vez un medio de alimentación al medio inicial durante el cultivo, en donde cuando menos uno del medio inicial o el medio de alimentación contiene un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado añadido al mismo. (10) Un método para producir una proteína cultivando una célula, que comprende iniciar cultivando en un medio que contiene un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado añadido al mismo y alimentar cuando menos una vez un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado al medio durante el cultivo. (11) El método de (10), en donde la célula se cultiva mediante cultivo por lote alimentado. (12) El método de cualquiera de (9) a (11), en donde la célula es una célula hacia la que se ha transferido un gene que codifica una proteína de interés. (13) El método de (12), en donde la proteína de interés es un anticuerpo. (14) El método de cualquiera de (9) a (13), en donde la célula es una célula de animal. (15) El método de (14), en donde la célula es una célula de
mamífero . (16) El método de (15), en donde la célula de mamífero es una célula CHO. EFECTO DE LA INVENCIÓN La presente invención, es posible permitir que una célula produzca una proteína de interés a un rendimiento todavía mayor añadiendo un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado no solamente al medio en el inicio del cultivo, sino también al medio durante el cultivo. La presente invención abarca los contenidos descritos en la especificación y/o los dibujos de la Solicitud de Patente japonesa No. 1005-000747 basada en la cual la presente solicitud de patente reclama la prioridad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que muestra las concentraciones (g/L) de un anticuerpo producido en medio de cultivo por células CHO que se cultivaron en un medio libre de componente derivado de mamífero suplementado con 5 g/L de hidrolizado de bonito (medio inicial) y un medio libre de componente derivado de mamífero suplementado con 30 g/L de hidrolizado de bonito (medio de alimentación) . La Figura 2 es una gráfica que muestra las
concentraciones (g/L) de un anticuerpo producido en el medio de cultivo por células CHO que se cultivaron en un medio libre de componente derivado de mamífero suplementado con 15 g/L de hidrolizado de bonito (medio inicial) y un medio libre de componente derivado de mamífero suplementado con 75 g/L de hidrolizado de bonito (medio de alimentación) . La Figura 3 es una gráfica que muestra las concentraciones (g/L) de una proteína producida en medio de cultivo mediante células CHO que se cultivaron en un medio libre de componente derivado de mamífero suplementado con 5 g/L de hidrolizado de bonito (medio inicial) y un medio libre de componente derivado de mamífero suplementado con 30 g/L de hidrolizado de bonito (medio de alimentación) . MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN A continuación, se describirá la presente invención con mayor detalle. En la presente invención, cultivar una célula se inicia en un medio inicial, al que se alimenta un medio de alimentación cuando menos una vez durante el cultivo. Cuando menos uno del medio inicial o medio de alimentación contiene un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado añadido al mismo. Además, en una modalidad preferida de la presente
invención, cultivar una célula se inicia en un medio que contiene un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado, y cuando menos una vez un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado se alimenta al medio durante el cultivo. De conformidad con la presente invención, es posible cultivar una célula satisfactoriamente un medio generalmente utilizado como un medio de cultivo de célula de animal, convencional sin añadir componentes derivados de mamífero . Generalmente, los métodos de cultivo de célula se clasifican en cultivo por lote, cultivo continuo, y cultivo por lote alimentado. En la presente invención, cualquiera de estos métodos se puede utilizar. De preferencia, el cultivo por lote alimentado o cultivo continuo se utiliza. Más preferentemente se usa el cultivo por lote alimentado. El cultivo por lote es un método de cultivo en el que una pequeña cantidad de cultivo de semilla se añade a un medio y la célula se desarrolla en el mismo sin alimentación de medio fresco ni remoción de caldo de cultivo durante el cultivo . El cultivo continuo es un método de cultivo en el
que un medio se alimenta continuamente y remueve continuamente durante el cultivo. El cultivo por perfusión se incluye también en el cultivo continuo. Puesto que el cultivo por lote alimentado es intermedio entre el cultivo por lote y el cultivo continuo, también se llama cultivo de semi-lote. Durante el cultivo, el medio de alimenta continua o intermitentemente, pero la remoción continua de caldo de cultivo como se ve en el cultivo continuo no se realiza. El medio que se alimenta en el cultivo por lote alimentado (a continuación llamada "medio de alimentación") puede no ser el mismo medio que ya se usó en el cultivo relevante (denominado a continuación "medio inicial") . Un medio diferente se puede alimentar o un componente específico solo se puede alimentar. En la presente invención, el término "medio inicial" significa un medio que se utiliza usualmente en la primera etapa de cultivo de célula. Sin embargo, cuando el medio de alimentación se alimenta en porciones una pluralidad de veces, el medio antes de alimentar cada porción del medio de alimentación se puede considerar como un medio inicial. En el método de la presente invención, cuando se emplea el cultivo por lote alimentado, un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de
carne de pescado puede estar contenido en cualquier del medio de alimentación o el medio inicial. De preferencia, un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado está contenido en ambos, el medio de alimentación y el medio inicial. Adicionalmente, se prefiere que la concentración del producto de degradación enzimática de carne de pescado o extracto de carne de pescado en el medio de alimentación sea superior que la concentración correspondiente en el medio inicial. La concentración de producto de degradación enzimátíca de carne de pescado o extracto de carne de pescado en el medio inicial puede ser usualmente 1-30 g/L, de preferencia 3-20 g/L, más preferentemente 5-15 g/L. La concentración del producto de degradación enzimática de carne de pescado o extracto de carne de pescado en el medio de alimentación puede ser usualmente 5-150 g/L, de preferencia 10-120 g/L, más preferentemente 20-90 g/L, todavía más preferentemente 30-75 g/L. La relación en volumen entre el medio inicial y el medio de alimentación no está particularmente limitada. Usualmente, cuando el volumen del medio inicial se toma como 1, la relación del medio de alimentación es 0.01-10, de preferencia 0.1-1, más preferentemente 0.2-03. El medio de alimentación se puede alimentar continuamente o de vez en cuando. Cuando
se alimenta de vez en cuando, el número de veces de alimentación no está particularmente limitado. El medio de alimentación se puede alimentar una vez o una pluralidad de veces . Con respecto al producto de degradación enzimática de carne de pescado o extracto de carne de pescado usado en la presente invención, los ejemplos de carne de pescado incluyen la carne de pescado o pescados de carne roja, tales como bonito, fragata, macarela, atún, macarela, saurio pacífico, sardina, macarela de caballo y salmón; y la carne de pescado de pescados de carne blanca, tales como bacalao, bajo de mar japonés, lenguado de ojo derecho, lenguado de ojo izquierdo, y brema de mar. Los ejemplos preferidos son bonito, macarela de fragata, bacalao, macarela, salmón, y sardina. El extracto de carne de pescado usado en la presente invención se puede obtener cortando la carne de pescado en piezas apropiadas, o desmenuzar la carne de pescado en una forma pastosa, y extraer los componentes solubles de las piezas o la pata con agua caliente (por ejemplo, agua calienta a de 90 a 95°C) durante varias decenes de minutos a varias decenas de horas. Los ejemplos específicos incluyen material hecho de bonito hervido para
producción de bonito seco, y drenar la cocción durante la producción de alimentos enlatados. El producto de degradación de enzima de carne de pescado se puede obtener, por ejemplo, añadiendo una cantidad apropiada de agua a carne de pescado cocida como está, o carne de pescado desmenuzada hasta una pasta, o el extracto de carne de pescado anterior, si es necesario, calentando para desnaturalización de proteína, luego tratar el material con una proteasa, y centrifugar o filtrar el material tratado como se desee, para eliminar aceites e insolubles. El extracto de carne de pescado resultante o el producto de degradación enzimática de carne de pescado se ajusta deseablemente a pH 7 a 7.4 antes del uso. La proteasa usada en la presente invención es, por ejemplo, una proteinaza y/o una peptidasa. Como se utiliza en la presente, el término "proteinaza" se refiere a una enzima que hidroliza una proteína como un substrato, mientras que el término "peptidasa" se refiere a una hidrolasa de enlace de péptido para un péptido como un substrato. Es decir, la actividad de la proteasa contra el substrato de proteína se puede distinguir como actividad de proteínas, mientras que la actividad de la proteasa con el substrato de péptido se puede distinguir como actividad de peptidasa. Cuando se cataliza la
división de una cadena de enlace de péptido, en su sitio intermedio, mediante la actividad de proteasa contra el substrato de proteína, el término "proteinaza" se usa. Por lo tanto, endopeptidasa se usa en la presente como una de proteinazas. Ejemplos específicos de enzimas para usarse en la presente invención incluyen enzima de origen de planta, tales como papaína, quimopapaína, bromelaína, y ficina, y enzimas de microorganismos, tales como oldes, bacterias y levadura. Incluyen endopeptidasa, exopeptidasa, aminopeptidasa, carboxipeptidasa y dipeptidasa. Estas enzimas se pueden usar solas o en combinación. Cuando se combinan, se pueden añadirá al mismo tiempo, o progresivamente. El producto de degradación enzimática de carne de pescado de la presente invención es de preferencia un producto de degradación enzimática de carne de pescado obtenido mediante tratamiento con la proteinaza, seguido por tratamiento con la peptidasa. Las condiciones para tratamiento con enzimas difieren dependiendo del tipo de enzima usada. Usualmente, el tratamiento de enzima se realiza de pH 2 a 12, de preferencia pH 4 a 8, a 30 a 90°C, de preferencia 40 a 65°C, durante 30 minutos a 72 horas, de preferencia 3 a 24 horas. La enzima se
usa a alrededor de 0.001 a 10% p/p, de preferencia 0.1 a 1% p/p, más preferentemente 0.2-0.6% p/p, con relación a la proteína como el substrato. La enzima en el producto de degradación enzimática de carne de pescado resultado se inactiva mediante calentamiento o lo semejante, y realizando centrifugación o filtración como se desee, para eliminar aceites e insolubles, mediante lo cual se puede preparar el producto de degradación enzimática. La carne de pescado comprende tripas de pescado y la propia carne. La relación entre tipas y la propia carne no está particularmente limitada y se puede usar cualquier relación. Por ejemplo, la relación descrita en la Publicación de Patente No Examinada japonesa No. 2003-334068 se puede usar. Con respecto a otros componentes del medio de cultivo usado en la presente invención, diversos componentes utilizados usualmente en medios de cultivo de célula (de preferencia célula animal) se puede usar apropiadamente. Incluyen aminoácidos vitaminas, factores de lípido, fuentes de energía, reguladores osmóticos, fuentes de hierro y reguladores de pH. Además de estos componentes, elementos de metal vestigiales, agentes tensioactivos, cofactores de crecimiento, nucleósidos y lo semejante se pueden añadir.
Los ejemplos específicos de dichos componentes incluyen aminoácidos, tales como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-cisteína, L-cistina, L-glutamina, L-ácido glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofán, L-tirosina, y L-valina, de preferencia L-alanidna, L-arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-cistina, L-glutamina, L-ácido glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serien, L-treonina, L-triptofán, L-tirosina, y L-valina; vitaminas, tales como í-inositol, biotína, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, ácido nicotínico, ácido p-aminobenzoico, pantotenato de calcio, clorhidrato de piridoxal, clorhidrato de piridoxína, riboflavina, clorhidrato de tiamina, vitamina B. Sub.12, y ácido ascórbico, de preferencia, tiotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, pantotenato de calcio clorhidrato de piridoxal, riboflavina, clorhidrato de tiamina, vitamina B. sub.12, y ácido ascórbico; factores de lípico, tales como cloruro de colina, tartrato de colina, ácido linoleico, ácido oleico y colesterol, de preferencia cloruro de colina; fuentes de energía, tales como glucosa, galactosa, mañosa y fructosa, de
preferencia, glucosa; reguladores osmóticos, tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio y nitrato de potasio, de preferencia, cloruro de sodio; fuentes de hierro, tales como EDTA de hierro, citrato férrico, cloruro ferroso, cloruro férrico, sulfato ferroso, sulfato férrico y nitrato férrico, de preferencia cloruro férrico, EDTA de hierro y citrato férrico; y reguladores de pH, tales como bicarbonato de sodio, cloruro de calcio, fosfato de sodio monobásico, HEPES, y MOPS, de preferencia bicarbonato der sodio. El medio de cultivo que contiene cualquiera de estos componentes se puede proporcionar como ejemplos. Además de los componentes anteriores, se pueden añadir elementos de metal vestigial, tales como sulfato de cobre, sulfato de manganeso, sulfato de zinc, sulfato de magnesio, cloruro de níquel, cloruro de estaño, cloruro de magnesio y subsilicato de sodio, de preferencia, sulfato de cobre, sulfato de zinc y sulfato de magnesio; agentes tensioactivos, tales como Tween 80, y Pluronic F68. cofactores de crecimiento, tales como insulina recombinante, IGFR recombinante, EGF reco binante, FGF recombinante, PDGF recombinante, TGF-a recombinante, clorhidrato de etanolamina, selenita de sodio, ácido retinoico, y dihidrocloruro de putrescina, de preferencia, selenita de sodio, clorhidrato de
etanolam a, IGF recombmante, y dihidrocloruro de putrescma; y nucleosidos, tales como deoxiadenos a, deoxicitid a, deoxiguanos a, adenosma, histid a, guanos a, y updma. En las modalidades preferidas de la presente invención arriba descrita, antibióticos tales como estreptomicina, potasio de pemcilma-G, y gentamic a, e indicadores de pH, tales como Rojo Fenol, pueden estar contenidos . El medio usado en la presente invención se puede preparar añadiendo un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado a un medio de cultivo de célula animal comercial, tal como D-MEM (Dlbecco's Modified Eagle Med?om(, D-MDM/F-12 Mezcla 1:1 (Dulbecco' s Modified Eagle Médium: Nutrient Mixture F12), RPM11640, CHO-S-SFMII ( Invitrogen) , CHO-SF (Sigma-Aldrich) , EXCELL 301 (JRH Biosciences) , CD-CHO (Invitrogen) , IS CHO-V (Irvine Scientific) o PC-ACF-CHO (Sigma-Aldrich) . En la presente invención, el medio al que se añade un producto de degradación enziraatica de carne de pescado o un extracto de pesado no está particularmente limitado, y cualquier medio se puede usar. De preferencia, un medio libre de suero que no contienen ningún suero derivado de mamífero se puede utilizar. En particular, un medio libre de
componente derivado de mamífero que no contiene ningún componente de mamífero aislado de mamíferos se prefiere. Cuando el medio al que se añade un producto de degradación enzimático de carne de pescado o un extracto de carne de pescado a un medio libre de suero o un medio libre de componente derivado de animal, usualmente, la célula que se va a cultivar se adapta con anticipación a que la célula pueda crecer en dicho medio. El método de acondicionamiento de células es bien conocido por aquellos expertos en el ramo. Las cantidades de los otros componentes en el medio de cultivo son 0.05 a 1,500 mg/L para aminoácidos, 0.001 a 10 mg/L para vitaminas, 0 a 200 mg/L para factores de lípido, 1 a 20 g/L de fuentes de energía, 1 a 10,000 mg/L para tampones de pH, 0.00001 a 200 mg/L para elementos de metal vestigiales, 0 a 5,000 mg/L para agentes tensioactivos, 0.05 a 10,000 ug/L para cofactores de crecimiento, y 0.001 a 50 mg/L para nucleósidos. Estas cantidades se pueden determinar apropiadamente dependiendo del tipo de la célula que se va a cultivar, y el tipo de la proteína de interés. El pH del medio de cultivo difiere dependiente de la célula que se va a cultivar, pero es generalmente pH 6.8 a 7.6 y apropiadamente pH 7.0 a 7.4 en muchos casos.
El medio de cultivo de la invención se puede usar, sin ninguna restricción, para cultivar diversas células (v.gr., células bacterianas, células fúngales, fcélulas de insecto, células de planta, células de animal, etc.). Por ejemplo, una célula COS o célula CHO que tiene un gene que codifica una proteína de interés incorporada por procedimientos de ingeniería genética, o una célula de fusión de producción de anticuerpo representada por un hibridoma, tal como ratón-humano, ratón-ratón, o ratón-rata se puede cultivar mediante el método de la presente invención. El método de cultivo de la presente invención también se puede utilizar cuando una célula de animal se cultiva para obtener una proteína natural producida por la célula de animal. El método de cultivo también se puede usar para cultivar células BHK y células HeLa así como las células arriba mencionadas. Una célula animal particularmente preferible en la presente es una célula CHO hacia la que se ha transferido un gene que codifica una proteína de interés. La proteína de interés no está particularmente limitada y puede ser cualquier proteína tal como un anticuerpo (anticuerpo natural, anticuerpos de tamaño molecular bajo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, etc.), o una proteína fisiológicamente activa (factor de estimulación de colonia de
granulocito (G-CSF) , factor de estimulación de colonia de granulocito-madrofago 8GM-CSF) , eritropoietina, interferón, interleucina tal como IL-1 o IL-6, tPa, urocinasa, albúmna de suero, factor de coagulación de sangre, etc.). entre todas, un anticuerpo es especialmente preferido. Los ejemplos de anticuerpos producidos mediante el método de producción de la presente incluyen no solamente anticuerpos monoclonales derivados de animales tales como humano, ratón, rata, hámster, conejo, mono o lo semejante, sino también anticuerpos recombinantes artificialmente modificados tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos o lo semejante. La clase de inmunoglobulina de estos anticuerpos no está particularmente limitada, y puede ser cualquier clase tales como IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, etc.), IgA, IgD, IgE, IgM o lo semejante. Cuando el anticuerpo se va a utilizar como un farmacéutico, la clase es de preferencia IgG o IgM. Además, el anticuerpo de la presente invención abarca no solamente anticuerpos completos sino también fragmentos de anticuerpo (tales como Fv, Fab, F(ab)2) y anticuerpos de tamaño molecular bajo, v.gr., Fv de una sola cadena (scFV, sc(FV)2, etc., de monovalencia o divalencia o valencia superior preparados enlazando regiones variables de anticuerpos con un
enlace tal como enlazador de péptido. Las condiciones de cultivo difieren dependiendo del tipo de la célula usada, y las condiciones preferibles se pueden determinar como se desee. Por ejemplo, cuando la célula es una célula CHO, se puede cultivar usualmente en una atmósfera con una concentración de C02 en una fase de gas de 0 a 40%, de preferencia 2 a 10%, a 30 a 391C, de preferencia alrededor de 37°C, durante 1 a 14 días. El cultivo se puede realizar utilizando diversos dispositivos de cultivo para cultivo de célula de animal, por ejemplo, un dispositivo de cultivo de tanque de tipo fermentador, un dispositivo de cultivo de tipo de levantamiento de aire, un dispositivo de cultivo de tipo de matraz de cultivo, un dispositivo de cultivo de matraz de tipo hilador, un dispositivo de cultivo de tipo microportador, un dispositivo de cultivo de tipo de lecho fluidizado, un dispositivo de cultivo de tipo de fibra hueca, un dispositivo de cultivo de tipo de botilla de rodillo, y un dispositivo de cultivo de tipo de lecho empacado. La producción elevada de proteína se hace posible cultivando una célula (de preferencia, célula de animal) de conformidad con el método de la presente invención. Para producir una proteína en una célula de animal,
el mero cultivo puede ser suficiente, o se puede requerir un procedimiento especial. Los procedimientos, condiciones, etc., se pueden determinar, como se requiera, dependiendo de la célula de animal que se va a cultivar. En el caso de una célula CHO transformada con un vector que contiene un gene que codifica un anticuerpo quimérico de ratón-humano mediante una operación de ingeniería genética, por ejemplo, el cultivo se realiza ba o las condiciones antes mencionadas, mediante lo cual la proteína de interés se puede obtener en el medio de cultivo en alrededor de 1 a 14 días, de preferencia en alrededor de 7 a 10 días. Luego, el medio de cultivo se somete a aislamiento y purificación por métodos convencionales (ver, por ejemplo, Introduction to Antibody Eng eepng, Chijín Sho Kan publishing company, pág. 102-104; Affimty Chromatography Principies & Methods, Amersham Pharmacia Biotech, pág. 56-60) , mediante lo cual se puede obtener la proteína de interés. De conformidad con la presente invención, es posible producir un anticuerpo recombinante (anticuerpo natural, fragmento de anticuerpo, anticuerpo de tamaño molecular bajo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo específico, etc.), una proteína recombinante
(factor de estimulación de colonia de granulocito (G-CSF),
factor de estimulación de colonia de granulocito-macrofago (GM-CSF) , eritropoietina, interferón, interleucina, tal como IL-1 o IL-6, t-PA, urocinasa, albúmina de suero, factor de coagulación de sangre, etc.), o lo semejante en un rendimiento elevado. EJEMPLOS A continuación, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos y Ejemplo de Referencia. Estos ejemplos se pretenden para ilustrar la presente invención y no para limitar el alcance de la presente invención. EJEMPLO 1 : Cultivo por Lote Alimentado Usando Hidrolizado de Bonito. Las composiciones de los medios y el método de preparación de los mismos son como se describe abajo. Medio Inicial: El hidrolizado de bonito preparado en el Ejemplo de Referencia 1 se añadió a un medio libre de componente derivado de mamífero a 5 g/L. Después de la disolución, el medio resultante se esterilizó con filtro. Medio de Alimentación: Las concentraciones de los componentes en el medio libre de componente derivado de mamífero usado como el medio inicial se hicieron alrededor del doble con relación al medio inicial. El hidrolizado de bonito (30 g/L)
se añadió al medio resultante y se disolvió, seguido por esterilización con filtro. Célula: Cepa de célula CHO productora de anticuerpo humano (L612) de anti-gangliosido GM3 recombinante descrita en la Publicación Internacional WO 2005/005636. La clase de este anticuerpo es IgM. El medio inicial se añadió a un dispositivo de cultivo tipo tarro. La cepa de célula CHO arriba descrita se añadió al mismo a 2 x 105 células mL. Luego se inició el cultivo a 37°C bajo 10% de C02. En el cultivo de lote alimentado, el medio de alimentación se alimentó a un régimen de flujo constante de el día 3 de cultivo, y las células se cultivaron hasta el día 14. El muestreo se realizó al principio del cultivo y en los días 3, 7, 10 y 14. El sobrenadante de cultivo de cada muestra se sometió a cromatografía de exclusión de tamaño para determinar la concentración de anticuerpo producido. Como se muestra en la Figura 1, la concentración de anticuerpo fue alrededor de 0.6 g/L después de 10 días de cultivo cuando el medio de alimentación no se alimentó. Por otra parte, cuando la solución que contiene el hidrolizado de bonito se alimentó, se pudieron alcanzar concentraciones elevadas de anticuerpo (1.2 g/L o más después de 10 días de cultivo y excediendo 1.7
g/L después de 14 días de cultivo) . EJEMPLO 2: Cultivo de Lote Alimentado Usando un Hidrolizado de Bonito. Las composiciones de los medios y el método de preparación de las mismas son como se describe abajo. Medio Inicial: EL hidrolizado de bonito preparado en el Ejemplo de Referencia 1 se añadió a un medio libre de componente derivado de mamífero a 15 g/L. Después de la disolución, el medio resultante se esterilizó con filtro. Medio Libre: Las concentraciones de los componentes del medio libre de componente derivado de mamífero usadas en medio inicial se hicieron alrededor de 4 veces con relación al medio inicial. El hidrolizado de bonito (75 g/L) se añadió al medio resultante y se disolvió, seguido por esterilización con filtro. Célula: Cepa de célula CHO que produce anticuerpo MP-1 humanizado (anticuerpo receptor de IL-6 anti-humano) se preparó usando el promotor Ia de alargamiento humano descrito en el Ejemplo 10 de la Publicación Internacional WO 92/19759 basado en el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 de la Publicación de Patente No Examinada japones No. H8-99902. La clase de este anticuerpo es IgGl. El medio inicial se añadió a un dispositivo de
cultivo tipo tarro. La cepa de célula CHO arriba descrita se añadió al mismo a 1 x 106 células/mL, cuando el medio de alimentación se iba a alimentar y a 0.5 x 106 células/mL cuando el medio de alimentación no se alimentó. Luego, el cultivo se inició a 37°C bajo 10% de C02. En cultivo por lote alimentado, el medio de alimentación se alimentó a un régimen de flujo constante desde el día 2 de cultivo, y las células se cultivaron hasta el día 10. Se realizó muestreo al principio del cultivo y en los días 3, 5, 7 y 10. El sobrenadante de cultivo de cada muestra se sometió a cromatografía de afinidad utilizando una columna de proteína A para determinar la concentración del anticuerpo producido. Como se muestra en la Figura 2, la concentración de anticuerpo fue alrededor de 0.5 g/L después de 7 días de cultivo cuando el medio de alimentación no se alimentó. Por otra parte, cuando la solución que contiene el hidrolizado de bonito se alimentó, se pudieron lograr concentraciones elevadas de anticuerpo (1.1 g/L o más después de 7 días de cultivo y excediendo 1.4 g/L después de 10 dias de cultivo). EJEMPLO 3: Cultivo por Lote Alimentado Usando un Hidrolizado de Bonito. Las composiciones de los medios y el método de preparación de las mismas son como se describe abajo.
Medio Inicial: El hídrolizado de bonito preparado en el Ejemplo de Referencia 1 se añadió a un medio libre de componente derivado de mamífero a 5 g/L. Después de la disolución, el medio resultante se esterilizó con filtro. Como un control, el mismo medio sin el hidrolizado de bonito se usó. Medio de Alimentación: Las concentraciones de los componentes en el medio libre de componente derivado de mamífero usado como el medio inicial se hicieron dos veces con relación al medio inicial. El hidrolizado de bonito (30 g/L) se añadió al medio resultante y se disolvió, seguido por esterilización con filtro. Como un control, el mismo medio sin el hidrolizado de bonito se usó. Célula: Célula CHO recombinante, que produce (FV)2 (sc(Fv)2)2 de cadena sencilla de enlace con MPL preparada mediante el método descrito en la Publicación Internacional WO 2005/056604. Resultados de Cultivo: El medio inicial se añadió a un dispositivo de cultivo tipo tarro. La cepa de célula CHO arriba descrita se añadió al mismo a 3 x 105 células/mL. Luego, el cultivo se inició a 37°C bajo 10% de C02. El medio de alimentación se alimentó a un régimen de flujo constante desde el día 3 de
cultivo, y las células se cultivaron hasta el dia 14. El muestreo se realizó de vez en cuando durante el cultivo. Para el sobrenadante de cultivo de cada muestra, la concentración de proteína se determinó mediante el método BIACORE utilizando una parte se secuencia de aminoácido MPL a la que se liga sc(Fv)2. Como se muestra en la Figura 3, la concentración de proteína después de 14 días de cultivo fue alrededor de 450 mg/L cuando el medio de cultivo sin el hidrolizado de bonito se alimentó. Por otra parte, cuando la solución con el hidrolizado de bonito se hidrolizó se pudo lograr una concentración de proteína elevada (que ecede 760 mg/L después de 14 días de cultivo) . EJEMPLO DE REFERENCIA 1: Preparación de un Producto de Degradación Enzimática de Bonito Un bonito comercialmente disponible se usó como carne de pescado. A 840 kg de bonito desmenuzado, se añadieron 1,200 kg de agua. La mezcla se incubó durante 1 hora junto con 3.2 kg de papaína derivada de planta a pH 6.0 y a 65°C para degradación enzimática. Luego, la degradación enzímática se llevó a cabo adicionalmente con 3.2 kg de exopeptidasa derivada de molde durante 15 horas bajo las condiciones anteriores, después de lo cual el sistema se calentó a 95°C para inactivar las enzimas. Luego, el sistema
se centrífugo y filtró para remover los insolubles y aceites.
El residuo se concentró para obtener alrededor de 150 kg de un producto de degradación enzimática de carne de pescado
(bonito) . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. APLICABILIDAD INDUSTRIAL. De conformidad con la presente invención, es posible cultivar una célula establemente sin usar proteínas costosas, tales como suero de bovino fetal, que varían grandemente en calidad. Adicionalmente, cultivando una célula de conformidad con el método de la presente invención, los riesgos de contaminación con priones anormales o virus que se han convertido en serios problemas recientemente se pueden eliminar, y se pueden producir biofarmacéuticos seguros y suministran en cantidades grandes.