NO322527B1 - Fremgangsmate for rensing av rekombinant Desmodus rotundus-spyttplasminogenaktivator (rDSPA α 1) fra et biologisk medium. - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for isolering og rensing av rekombinant Desmodus rotundus spyttplasminogenaktivator al (rDSPA a l)fra et biologisk medium.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Trombose dannes ved dannelsen av en blodklump i blodårer. Man skjelner mellom venøse tromboser omfattende lungeemboli og arterietromboser omfattende akutt hjerteinfarkt. Lungeemboli og hjerteinfarkt er livstruende hendelser som krever umiddelbar medisinsk intervensjon.

En populær form for terapi ved slike arterie- og venøse tromboser er anvendelse av plasminogenaktivatorer for å utføre enzymatiske trombolyser (Coilen et al., Ann. Rev. Med.,

(1988), 39:405-423). Disse stoffer, kalt trombocytter, forandrer plasminogen, det inaktive proenzym til fibrinolyse-systemet i blodet, til det aktive proteolytiske enzym, plasmin. Plasmin, i sin tur, oppløser det fibrøse stoffet fibrin, som er en vesentlig komponent i en blodpropp; dette fører til gjenåpning av de blokkerte kar og gjenopprettelse av blodstrøm. Ettersom plasmin imidlertid er en relativt uspesi-fikk protease kan den også ødelegge, ved hjelp av proteolyse, bestanddeler i blodet som er uunnværlige for intakt hemostase, f.eks. (fibrinogen) og således øke risikoen for blødning.

De første enzymatiske trombemedikamenter, strepto-kinase og urokinase, er forbindelser som etter at de injiseres inn i blodbanen forandrer plasminogen systemisk til plasmin og induserer systemisk proteolyse. Trombolyseterapier der disse forbindelser anvendes er forbundet med komplikasjoner relatert til blødning. Nyere trombolytterapier, basert på anvendelsen av plasminogenaktivatorer av vevstype, vanligvis kalt t-PA, er utviklet men de er også forbundet med mange ulemper, deriblant serøse blødningskomplikasjoner, en relativt hyppig hendelse ved reokklusjon, mangel på evne til å være jevnt effektiv, og mottakelighet for inaktivering av plasminogenaktivatorhemmere, slik som type 1-plasminogenaktivatorhemmer (PAI-1) (Loskutoff,

Seminars in Thrombosis and Hemostsis, vol. 14, nr. 1 (1988)).

I

I den senere tid har plasminogenaktivatorproteiner blitt renset fra vampyrflaggermus { Desmodus rotundus)-spytt og spyttkjertler (europeisk patentsøknad 0 383 417 (Baldus et al.); europeisk patentsøknad 0 352 119 (Duong et al.)). Disse plasminogenaktivatorer (kalt DSPA) er serinproteaser som katalyserer forandringen av plasminogen til plasmin, men de har høyere selektivitet mot fibrinbundet plasminogen og kan derfor assosieres med redusert alvorlighet og blødnings-frekvens når den anvendes ved trombocytterapi. Dessuten inaktiveres DSPA ikke lett ved hjelp av plasmainhibitorer, slik som PAI-1 og kan derfor assosieres med en lavere frekvens av reokklusjon.

To former av DSPA med høy molekylvekt (kalt al og a2) kan finnes i flaggermusspytt, begge består av flere domener, deriblant et proteasedomene, og begge har evnen til å bindes tett til plasminogen i nærvær av fibrin. De ulike former for DSPA er produsert i pattedyrcellekultur ved hjelp av rekombinant bioteknologi {Kråtzmer et al., Gene (1991), 105: 229-237, europeisk patentsøknad 0 352 119 (Duong et al.)) og rensing av rekombinant produsert DSPA (rDSPA) i liten skala er beskrevet (Witt et al., blood (1992), 79: 1213-1217). Journal of Biotechnology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL, Vol: 39, No. 1, pp 75-83, beskriver en metode for å rense rekombinant DSPA a 1 med affinitetskromatografi ved å bruke Erythrina latissima-trypsininhibitor immobilisert til Sepharose i kombinasjon med et vasketrinn med PBS/400 mM NaCl og eluering med 50 mM Na-acetat med pH 4. Isoleringen og rensingen av rDSPA i kommersiell skala og i en renhetsgrad som er egnet for farmasøytiske preparater har imidlertid ikke blitt beskrevet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolering og rensing av rekombinant DSPAal (rDSPA al) i en kommersiell skala. Den beskrevne oppfinnelse resulterer i rDSPA a 1 som er tilstrekkelig rent og stabilt til å kunne selges kommersielt og å være klinisk anvendbar.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for isolering og rensing av rDSPA ali kommersiell skala og fører til et produkt som er egnet for klinisk anvendelse.

Følgelig er et aspekt ved oppfinnelsen rettet mot fremgangsmåte for rensing av rDSPA a 1 fra et biologisk medium, hvorved fremgangsmåten omfatter følgende trinn: (a) tilføring av mediet til et kationbytteresin under anbringelsesbetingelser som fører til selektiv binding av rDSPA a 1 til kationbytteresinet; (b) eventuelt vasking av kationebytteresinet for å fjerne proteiner som ikke er rDSPA a 1 og forurensende stoffer som ikke er protein; (c) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra kationbytteresinet; (d) tilføring av rDSPA a 1-inneholdende eluert fra trinn (c) til et hydrofobt interaksjonsresin under anbringelsesbetingelser som fører til selektiv binding av rDSPA a 1 til det hydrofobe interaksjonsresin; (e) eventuell vasking av det hydrofobe interaksjonsresin for å fjerne proteiner som ikke er rDSPA a 1 og forurensende stoffer som ikke er protein; (f) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra det hydrofobe interaksjonsresin; (g) tilsetning av den rDSPA a 1-inneholdende eluert fra (f) til et affinitetskromatografiresin under tilførings-betingelser som resulterer i selektiv binding av rDSPA a 1 til affinitetskromatografiresinet; (h) eventuell vasking av affinitetskromatografiresinet for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og forurensende stoffer som ikke er protein; (i) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra affinitetskromatografiresinet for å produsere i det vesentlige rent rDSPA a 1 i en vandig oppløsning.

Nærmere bestemt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for rensing av rekombinant Desmodus rotundus-spyttplasminogenaktivator (rDSPA a 1) fra et biologisk medium,

kjennetegnet ved at den omfatter følgende:

(a) tilføring av mediet til et kationbytteresin ved pH mellom 4 og 7; (b) vasking av kationbytteresinet for å fjerne proteiner som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (c) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra kationbytteresinet; (d) tilføring av den rDSPA a 1-inneholdende eluent fra trinn (c) til et hydrofobt interaksjonsresin ved pH mellom 3 og 5 ; (e) vasking av det hydrofobe interaksjonsresin for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (f) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra det hydrofobe interaksjonsresin; (g) tilføring av den rDSPA a 1-inneholdende eluent fra trinn (f) til et affinitetskromatografiresin ved lav pH og lav ionestyrke; (h) vasking av affinitetskromatografiresinet for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (i) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra affinitetskromatografiresinet for å danne rent rDSPA a 1 i en vandig oppløsning.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som anvendt i beskrivelsen og i kravene, med mindre noe annet er spesifisert har følgende begreper angitte betydning: "Biologisk medium" refererer seg til en nøyaktig sammensetning av salter og næringsstoffer som er anvendt for å formere celler i kultur.

"Kondisjonert medium" refererer seg til et biologisk medium hvorved celler dyrkes, mediet kondisjoneres derfor ved veksten av cellene og inneholder produkter som utskilles i mediet under cellevekst. Disse kan være både avfallsprodukter produsert under vekst eller proteiner som sekreteres inn i

mediet fra cellene under vekst.

"Kationbytteresin" refererer seg til en naturlig eller kunstig forbindelse, vanligvis et fast stoff, som har evnen til å bytte bundete ioner med ioner fra det omkring-liggende flytende medium. Et kationbytteresin har negative funksjonelt fikserte ioner og bytter positive motioner.

Forankringsgruppene (utbyttingsaktive forbindelser) i kommersielt tilgjengelige kationbyttere er vanligvis -CgHjO".,-S03', -C00", -PO3-, eller -As03". Svakere kationbytteresiner er de hvorved bindingsstyrken til kationet ikke er høy, slik som de med funksjonelle karboksyl- eller karboksyalkylgrupper. Svakere kationbytteresiner er dessuten vanligvis fullt ut dissosiert ved sur pH. Et spesielt svakt kationbytteresin anvendt ifølge oppfinnelsen er omfattet av en matriks av silikapartikler som er kovalent bundet til polyetyleniminsilan, hvori aminogruppene i polyetyleniminet er derivatisert med karboksylgrupper. Et slikt resin er kommersielt tilgjengelig fra J.T. Baker under varemerket "Widepore CBX *?-kr ornat o-grafiresin.

"Hydrofob interaksjonsresin" refererer seg til et naturlig eller kunstig stoff, vanligvis et fast stoff som inneholder uladete grupper, slik som metyl, etyl, eller andre alkylgrupper. Disse grupper danner hydrofobe bindinger med grupper på proteinrester som har passert gjennom resinet og resulterer i separering av proteiner basert på interaksjons-styrken mellom proteinet og resingrupper. Et spesifikt hydrofobt ineraksjonsresin er omfattet av semi-rigide perler syntetisert ved hjelp av en kopolymerisasjon av etylenglykol og metakrylatpolymerer derivatisert med butylgrupper. Et slikt resin er kommersielt tilgjengelig fra Toso-Haas under varemerkenavnet "Toyo-Pearl" 650M C4.

"Affinitetskromatografiresin" refererer seg til et naturlig eller kunstig stoff, vanligvis et fast stoff som anvendes ved rensing av proteiner. Resinet separerer proteiner ut fra affiniteten som er til stede mellom grupper på proteinet og grupper på resinet. Ved foreliggende oppfinnelse er resinet anvendt som et affinitetskromatografiresin vanligvis anvendt som et størrelseseksklusjonsresin for å separere

proteiner på grunnlag av størrelsen til disse. Et spesifikt affinitetskromatografiresin er en kryssbundet, kopolymer til allyldekstran og N,N'-metylenbisakrylamid i form av perler som har evnen til å fraksjonere globulaere proteiner mellom 20.0000 og 8.000.000 kDa. Et slikt resin er kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia, under varemerkenavnet "Sephacryl" S-400.

"Alkyl" refererer seg til et monovalent radikal som er rettkjedet eller forgrenet som kun består av karbon og hydrogen, uten umettning og med fra en til atten karbonatomer, fortrinnsvis fra ett til seks karbonatomer, f.eks. metyl, etyl, n-propyl, isopropyl(1-metyletyl), n-butyl, t-butyl(l,l-dimetyletyl) , seJc-butyl (1-metylpropyl) , n-pentyl, n-heksyl og lignende.

"I det vesentlige ren" som anvendt i forbindelse med renhet av rDSPA a 1-produkt etter rensingsprosedyren beskrevet i denne søknad betyr at mer enn 80 % av det totale protein i det endelige rensingsprodukt er rDSPA a 1, fortrinnsvis mer enn 90 % av det totale protein isolert er rDSPA a 1 og mest foretrukket 98 % av det totale protein isolert er rDSPA a 1. Proteininnhold og renhet er basert på revers fase HPLC og SDS-faggelanalyse.

"Protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerensde stoffer som ikke er protein" refererer seg til alle stoffer som er forskjellige fra rDSPA a 1 funnet i det biologiske medium hvor fra rDSPA a 1 er renset.

"Farmasøytisk akseptabel eksipiens" refererer seg til en akseptabel bærer og ethvert farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff som kreves for å være forenlig med fysiologiske betingelser, som er ikke-toksiske og som ikke på en skadelig måte virker inn på den biologiske aktivitet til det farma-søytiske preparat som er suspendert eller inkludert i det. Egnede eksipienser ville være forbindelser, slik som mannitol, succinat, glysin eller serum albumin.

"Terapeutisk effektiv mengde" refererer seg til mengden av rDSPA a 1 som, når den administreres til et menneske med behov derav, er tilstrekkelig til å føre til behandling, som definert nedenfor, for sykdomstilstander kjennetegnet ved trombose. Mengden av en forbindelse som

består av en "terapeutisk effektiv mengde" vil variere avhengig av forbindelsen, sykdomstilstanden og dennes grad av alvorlighet, men kan påvises rutinemessig av en vanlig fagperson på området ved å benytte sine kunnskaper og denne beskrivelse.

"Behandling" som anvendt heri dekker behandlingen av en sykdomstilstand hos et menneske, hvilket sykdomstilstanden er kjennetegnet ved trombose, og omfatter:

(i) forebyggelse av at sykdomstilstanden oppstår hos et menneske, særlig når et slik menneske er predisponert for sykdomstilstanden, men har fortsatt ikke blitt diagnostisert til å ha den; (ii) hemming av sykdomstilstanden, dvs. stoppe utviklingen av denne; eller (iii) lindre sykdomstilstanden, dvs. forårsake at sykdomstilstanden går tilbake.

"Eventuell" menes at den etterfølgende beskrevne hendelse kan eller kan ikke skje, og at beskrivelsen omfatter tilfeller der nevnte hendelse eller tilfelle skjer og tilfeller der det ikke skjer.

Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for isolering og rensing av rDSPA ali kommersiell skala og på en form som er egnet for anvendelse i farmasøytiske preparater. rDSPA a 'l produseres ved fermentering av en pattedyrcellelinje med evnen til å sekrere rDSPA a 1-produktet inn i dyrkningsmediet. Det kondisjonerte medium, dvs. mediet erholdt fra bioreaktoren inneholdende pattedyrcellene, høstes og rDSPA a 1 separeres fra andre proteiner og forurensende stoffer ved hjelp av en serie av kromatografiske trinn, som starter med anvendelse av et kationbytteresin, etterfulgt av selektiv eluering av rDSPA a 1 fra resinet. rDSPA a 1-fraksjonen erholdt ved hjelp av selektiv eluering fra kationbytteresinet tilfører så til et hydrofobt interaksjonsresin der en selektiv eluering fra matriksen tilveiebringer en rensing på et annet nivå. Den eluerte rDSPA a 1-fraksjon tilføres så til et affinitetskromatografiresin der selektiv eluering tilveiebringer et ytterligere rensingsnivå. Det rensede rDSPA a 1 konsentreres så ved hjelp av vanlige teknikker, slik som ultrafiltrering, og så lyofiliseres.

Foreliggende oppfinnelse er utført spesifikt som beskrevet nedenfor.

A. Isolering og rensing.

1. Dyrkningsmedium og cellelinjer

Dyrkningsmediet omfatter et basalmedium som er egnet for pattedyrcellevekst, slik som DMEM eller Ham's F12. Et spesielt medium er William's E medium (William's G.M. and Gunn, J.M, Exp. Cell Res., (1974)89:139). For inokulering av vekstfasen vil basalmediet vanligvis være supplementert med en serumkilde, vanligvis bovint serum (BS) eller nyfødt kalveserum (CS), til stede i en konsentrasjon i området fra ca. 0,1 til 10 vekt %, vanligvis er det til stede i ca. 1 til 5 vekt %. Andre vekstfaktorer eller buffere, slik som HEPES, kan også tilsettes. Under perfusjonsvekstfasen er serum konsentrasjonen vanligvis opprettholdt ved samme konsentrasjon, vanligvis i området fra ca. 3 til 8 %, vanligvis ca. 5 %.

Cellelinjer som er egnet for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter pattedyrcellelinjer med evnen til ikke-forbundet vekst i suspensjonskultur og/eller forbundet vekst på mikrobærerperler. Spesielle cellelinjer som imøtegår disse behov omfatter kinesisk hamsterovarie (CHO)-cellelinjer, BHK-celler eller HEK293-cellelinjen (Kråtzschmer et al., Gene, (1991) 116:281-284; Petri, T., J. Bio Tech-nology, (1995) 39: 75-83).

En særlig foretrukket CHO-cellelinje er DXB11, som er beskrevet i Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, (1980) 77:4216-4220. Disse celler ble kotransfektert med ekspresjonsvektorene pSVPAll og pUDHFRl, som inneholder de kodende sekvenser for henholdsvis DSPA al og dihydrofolat-reduktase fra mus (Petri, T., ibid). Den transformerte CHO-cellelinje anvendt ved foreliggende oppfinnelse ble kalt CD16 og er deponert i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC) og er gitt ATCC # CRL 12023.

2. Ekspresjon av kultur og produksjonsfase

Etter inokulering med enten konfluente kulturer med omrøring eller deler av andre bioreaktorkulturer vil celle-kulturen ekspandere til produksjonstetthet, vanligvis i området fra ca. l-40xl0<6> celler/ml.

Etter at den ønskede celletetthet på mikrobærerperler er oppnådd initieres perfusjon av ferskt medium supplert med serum. Alternativt kan celler dyrkes i suspensjonskultur. Vanligvis vil konsentrasjonen til serumet i det ferske medium være i området fra ca. 2 til 10 vekt %, mer vanlig i området fra ca. 3 til 8 vekt % og mer normalt ca. 5 vekt %. Innledningsvis vil perfusjonsgraden være i området fra ca. 0,25 til 0,75 kulturvolumer/dag, vanligvis ca. 0,5 kulturvolumer/dag. Ettersom celleveksten økes perfusjonsgradient til endelig grad i området fra ca. 1,5 til 2,5 kulturvolumer/dag, vanligvis over en periode på ca. 2 til 10 dager. Under ekspansjonen tilsettes sterile, pre-ekvilibrerte mikrobærerperler til reaktoren for å opprettholde mikrobærerperlene i en celle-tetthetsgrad i området fra ca. 0,5 til 1,0 g mikrobærerperler til IO<9> celler. Vanligvis tilsettes mikrobærerperlene til reaktoren ved anvendelse av et sugeapparat til prøvelinjen.

Etter at celletettheten har nådd produksjonsnivået reduseres serumtilsetningen til den ferske kultur, vanligvis til en konsentrasjon i området fra ca. 0,1 til 2,0 vekt %, vanligvis 1 %.

Kulturen i produksjonsfase krever at man er oppmerksom på flere fermenteringsparametere: temperatur, pH og nivået av oppløst oksygen måles daglig. Ytterligere kultur-medium, serum og lut tilveiebringes til ettersom tilførings-tankene uttømmes. Prøver av det kondisjonerte medium, definert som medium som inneholder produkt, analyseres rutinemessig, minst hver annen dag for å sikre at produksjonen skjer uten forurensning.

Prosedyren for oppsamling av det kondisjonerte medium fra bioreaktorer minimaliserer innhøstingen av celler ved anvendelse av filtere med en porediameter på omtrent 100-150 <y>m. For suspensjonskulturer kan et vortex-strømningsfilter anvendes for å bevare celler i bioreaktoren. De høstede celler samles i sterile beholdere og lagres for opp til 38 dager før ytterligere prosessering. rDSPA a 1 funnet i bioreaktorinn-høstingen sekreres fra CHO-cellene i en prosessert form som har full biologisk aktivitet og som er klar for rensing.

3. Kationbytterkromatografi

Etter pH-justering til fra 4 til 6, fortrinnsvis ca. 5 tilsettes rDSPA ali det kondisjonerte medium til en kationbyttermatriks {vanligvis pakket i form av en kolonne) under betingelser utvalgt for å tilveiebringe i det vesentlige fullstendig binding av rDSPA a 1 til matriksen. Ettersom andre proteiner også vil bindes tilveiebringer det innledningsvis bindingssted et første separeringsnivå ettersom flere av de uønskede eller forurensende proteiner og andre forbindelser, slik som fenol rød, i det kondisjonerte medium ikke vil ha evnen til å binde til matriksen og således vil strømme gjennom matriksen. rDSPA a 1 renses ytterligere ved hjelp av selektiv eluering fra matriksen, der elueringen kan gjennomføres ved enten en trinnvis eluering eller lineær gradienteluering ved økning av ionestyrken i bufferen. I hvert tilfelle oppsamles rDSPA a 1 for ytterligere rensing som beskrevet nedenfor.

Egnede kationbyttermatrikser omfatter ulike resiner derivatisert med funksjonelle kationgrupper som har evnen til å bind rDSPA a 1. Syntetiske resiner er foretrukket, slik som det omfattet av silikagelpartikler, kryssbundet agarose eller kryssbundne polymetakrylatpolymerer, derivatisert med funksjonelle kationgrupper, slik som karboksyl, karboksymetyl, sulfonyl, fosforyl og lignende. Relativt svake resiner er særlig anvendbare, slik som de med funksjonelle karboksyl-eller karboksyalkylgrupper, slik som karboksymetyl eller karboksyetyl. Et særlig foretrukket resin er omfattet av en matriks av silikapartikler som er kovalent bundet til polyetyleniminsilan, med aminogrupper av polyetylenimin silan derivatisert med karboksylgrupper. Slikt resin er "Baker Widepore CBX" {45 mm perlestørrelse), som er kommersielt tilgjengelig fra J.T. Baker.

Bindings- og elueringsbetingelser vil variere avhengig av bindingsstyrke til kationresinet. For svake kationresiner, slik som "Baker Widepore CBX" kan binding utføres ved lav ionestyrke under lett sure betingelser, vanligvis pH 4-7, fortrinnsvis ca. pH 5. Etter vasking av matriksen kan rDSPA a 1 selektivt elueres ved eksponering av matriksen for en mobil fase med en forhøyet ionestyrke, ved anvendelse av enten lineær eller trinnvis eluering. For "Baker Widepore CBX"-resin vil rDSPA a 1 eluere ved en pH på ca. 7,5, med en saltkonsentrasjon mellom ca. 100 mM og 500 mM NaCl. Kolonnen kan så strippes og regenereres for senere anvendelse.

Med "Baker Widepore CBX"-matriksen vil fortrinnsvis resinet være ekvilibrert innledningsvis med en buffer inneholdende 100 mM natriumacetat, pH 5. Buffer tilsettes kolonnen i en strømningsgrad på 0,2 til 2,0 kolonnevolumer per minutt inntil pH i effluenten stabiliseres ved 5. Det kondisjonerte medium inneholdende rDSPA a 1 filtreres med et filter på 1,2 um og titreres så til en pH mellom 4 og 7, mest foretrukket 5, ved anvendelse av iseddik. Mediet tilføres så til kolonnen, vanligvis ved anvendelse av en tannhjulspumpe, med en strømningsgrad som ikke er større enn 2,0 kolonnevolumer per minutt. Et filter tilveiebringes for å fjerne partikler som kan tette kolonnematriksen. Kolonnematriksen reekvilibreres så med acetatekvilibreringsbuffer inntil pH stabiliserer seg ved 5, vanligvis krever dette ca. 2 til 7 kolonnevolumer. En vaskebuffer inneholdende 50 mM natriumfosfat, pH 7,5 tilføres så til kolonnen med ca. 0,1 til ca. 0,2 kolonnevolumer per minutt inntil pH i eluenten stabiliseres ved 7,5. rDSPA a 1 elueres så fra kolonnen ved anvendelse av en elueringsbuffer inneholdende 50 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid, pH 7,5. Elueringsbufferen tilsettes inntil det ikke finnes mer protein i utstrømningen fra kolonnen. En strippebuffer inneholdende 2,0 M natriumacetat, pH 8 tilføres så til kolonnen for å regenerere matriksen. Lagringsbufferen inneholder 10 % eddiksyre og 45 % etanol.

4. Hydrofob interaksjonskromatografi

rDSPA a 1-fraksjonen oppsamlet fra kationbytte-matriksen tilsettes så til en hydrofob interaksjonsmatriks (vanligvis i form av en kolonne) under betingelser som

tillater binding av rDSPA a 1 til matriksen, vanligvis med høy ionestyrke og lav pH. rDSPA a 1 elueres så selektivt ved økning av konsentrasjonen til et organisk løsningsmiddel i form av en mobil fase tilført til kolonnen, ved anvendelse av en lineær eller trinnvis gradient. rDSPA a 1-fraksjonen samles for ytterligere rensing. Dette trinnet reduserer DNA-konsentrasjonen 100 til 1000 ganger og inaktiverer potensielle forurensende virus.

Egnede hydrofobe interaksjonsmatrikser omfatter flere ulike uladete resiner med kovalent bundete hydrofobe grupper, slik som propyl, butyl, oktyl, fenyl og lignende. Resinene kan være kryssbundete organiske polymerer, slik som styrendivinyl-benzen, silika, agarose, polymetakrylat eller enhver av mange ulike andre egnede partikulære bærere. Et særlig foretrukket resin er omfattet av semirigide runde perler syntetisert ved hjelp av en kopolymerisering av etylenglykol og matakrylat-polymerer derivatisert med butylgrupper. Et slikt resin er "Toyo-Pearl" 650M (40-90 um perler) som er kommersielt tilgjengelig fra Toso-Haas.

Binding til den hydrofobe interaksjonskolonne utføres under betingelser med høy ionestyrke, vanligvis ved en sur pH fra 3-5, mer vanlig ca. 4. I det vesentlige alle proteiner i rDSPA a 1-fraksjonen som elueres fra kationbytteresinet bindes til den hydrofobe interaksjonskolonne. Ulike proteiner kan selektivt elueres på bakgrunn av ulik hydrofob interaksjons-styrke til de hydrofobe grupper i matriksen, dvs. for å øke hydrofobisiteten til proteinet. Eluering kan utføres med en trinnvis eller lineær gradient, vanligvis med en alkohol-eluent, slik som etanol eller isopropanol. En særlig foretrukket alkohol er etylalkohol.

Med "Toyo-Pearl" C4-matriksen kan fortrinnsvis ekvilibrering utføres med en ekvilibreringsbuffer inneholdende 50 mM natriumacetat, 500 mM natriumklorid pH 4. Etter at rDSPA a 1-fraksjonen fra ionebytterkolonnen er titrert til pH 4 tilføres denne til C4-matriksen og matriksen reekvilibreres så med ekvilibreringsbufferen beskrevet ovenfor. Kolonnen vaskes etter hverandre med to buffere, som følger. Ved første vask (vask 1) anvendes minst to kolonnevolumer av en buffer inneholdende 20 mM HC1. Vasking fortsettes inntil effluenten ikke inneholder mer protein, som vist ved fast UV-absorbans. Matriksen vaskes (vask 2) så med ikke mindre enn 10 kolonnevolumer av en buffer inneholdende 19 % etanol, 20 mM HC1 og vasking fortsettes med en buffer inneholdende 20,5 % etanol, 20 mM HC1 inntil ikke mer protein elueres. Eluering av rDSPA a 1-produktet utføres ved anvendelse av en buffer inneholdende 29 % etanol, 20 mM HC1, pH 2,5. Etter eluering av produktet strippes kolonnen med ikke mindre enn to kolonnevolumer av en buffer inneholdende 100 mM NaOH. Matriksen lagres i vaskebuffer 1.

5. Affinitetskromatografi

rDSPA a 1-fraksjonen som er oppsamlet fra det hydrofobe interaksjonsresin tilføres så til en affinitets-matriks (vanligvis i form av en kolonne) under betingelser som tillater binding av rDSPA a 1 til affinitetsmatriksen. Mens rDSPA a 1 forblir bundet til kolonnen elueres forurensende stoffer ved hjelp av vasking av kolonnen med 2 til 3 kolonnevolumer av 20 mM HC1. Dette trinn fremmer en bufferbytting for å bistå farmasøytisk formulering og oppløselighet og også lette inaktiveringen/fjerningen av potensielle forurensende virus. 2,5 kolonnevolumer av bufferen anvendes fortrinnsvis. rDSPA a 1 elueres så selektivt under en buffer inneholdende 200 mM glysin, fri basis med en pH mellom 4 og 5. rDSPA a 1-fraksjonen oppsamles for konsentrering.

Ved foreliggende oppfinnelse er resinene anvendt som affinitetsresiner resiner som normalt anvendes som størrelses-ekspresjonsresiner. Egnede affinitetsmatrikser omfatter resiner omfattende en kryssbundet polymer av allyldekstran og N,N<1->metylenbisakrylamid i form av perler med en diameter mellom 25 og 75 pm. Særlig foretrukket resin er "Sephacryl 400", som er kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia og har evnen til å fraksjonere globulære proteiner mellom 20.000 og 8.000.000 kDa.

Binding av rDSPA a 1 til affinitetsresinet oppnås under betingelser med lav ionestyrke og lav pH. I det vesentlige all rDSPA a 1 oppsamlet fra det hydrofobe interaksjonsresin bindes til kolonnen. rDSPA a 1 kan selektivt elueres ved å heve pH og/eller ionestyrken. Eluering kan utføres med en trinnvis eller lineær gradient, vanligvis med en eluent inneholdende 200 mM glysin, fri basis.

Med "Sephacryl S-400"-matriksen kan fortrinnsvis ekvilibreringen utføres med en buffer inneholdende 19 % etanol, 20 mM HC1, inntil pH i effluenten forblir uendret. Matriksen mettes med rDSPA a 1-fraksjonen fra den hydrofobe interaksjonskolonne og vaskes så med en buffer inneholdende 20 MmHCl til UV-signalet fra effluenten er stabilt. Eluering av bundet rDSPA a 1 utføres ved anvendelse av en buffer inneholdende 200 mM glysin. Etter eluering av produktet strippes kolonnen med ikke mindre enn to kolonnevolumer av en buffer inneholdende 100 mM NaOH. Etter vasking av matriksen med minst to kolonnevolumer av vaskebufferen (20 mM HC1), kan matriksen lagres i denne buffer.

6. Konsentrasjon

Det rensede protein kan så konsentreres, vanligvis ved hjelp av filtrering eller lignende og kan eventuelt lyofiliseres eller på annen måte inkorporeres i vanlige farmasøytiske preparater. Vanlige konsentrasjons- og lyofiliseringsmetoder er godt beskrevet i den vitenskapelige litteratur.

B. Formulering

1. Farmasøytiske preparater

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et reagens med signifikant terapeutisk verdi. rDSPA a 1, renset ved hjelp av de beskrevne fremgangsmåter, bør være anvendbar ved behandling av arterielle og venøse tromboser.

Rekombinant rDSPA a 1, renset som beskrevet heri, kan administreres til en pasient. Dette reagens kan kombineres for terapeutisk anvendelse med andre bestanddeler, f.eks. i vanlige farmasøytisk akseptable bærere, fortynnere, sammen med fysiologisk uskadelige stabilisatorer og eksipienser. Disse kombinasjoner kan sterilfiltreres og plasseres i doseformer ved hjelp av lyofilisering i doseampuller•eller lagring i

stabiliserte vandige preparater.

Mengdene av reagens som er nødvendig for effektiv terapi vil være avhengig av mange ulike faktorer, slik som administreringsmåte, fysiologisk tilstand til pasient, og andre administrerte medikamenter. Behandlingsdoser bør således titreres for å optimalisere sikkerhet og effektivitet. Vanligvis kan doser anvendt in vitro tilveiebringe anvendbar rett-ledning med hensyn til mengder som er anvendbare for in situ administrering av reagenser. Dyretesting av effektive doser for behandling vil tilveiebringe ytterligere forutsigelig indikasjon av human dose. Ulike betraktninger f.eks. beskrevet i Gilman et al. (red) (1990) Goodman and Gilman' s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, red., Pergamon Press; og Rem ington' s Pharmaceutical Sciences, 18. utgave (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.

Fremgangsmåte for administrering er diskutert deri og nedenfor, f.eks. for oral, intravenøs, intraperitoneal eller intramuskulær administrering, transdermal diffusjon og andre. Farmasøytisk akseptable bærere vil omfatte vann, salt, buffere, og andre forbindelser som beskrevet, f.eks. i Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey, basert på dosene som kreves for andre plasminogenaktivatorer kan det forventes at det er behov for en total dose på mellom 80 og 110 mg { Physi-cians' Desk Reference, 49. utgave (1995), Medical Economics Data Production Company, s 1083-1085) .

Terapeutiske formuleringer kan administreres i enhver vanlig doseformulering, mens det er mulig for den aktive bestanddel å bli administrert alene er det å foretrekke å presentere det i form av et farmasøytisk preparat. Preparater omfatter minst én aktiv bestanddel som definert ovenfor, sammen med en eller flere akseptable bærere derav. Hver bærer må være både farmasøytisk og fysiologisk akseptabel ved at den er kompatibel med de andre bestanddelene og ikke skadelig for pasienten. Formulering omfatter de som egnet for oral eller parenteral (deriblant subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal) administrering. Formuleringene kan for letthets skyld presenteres i enhetsdoseform og kan fremstilles ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er godt kjent innen teknikkens stand innen farmasi. Se f.eks. Gilman et. al., ibid, og Remington ibid.

For å oppsummere er de foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen som beskrevet i oppsummering av oppfinnelsen som følger: en fremgangsmåte for isolering og rensing av rDSPA a 1 fra et biologisk medium, nevnte fremgangsmåte omfatter følgende trinn: (a) tilføring av mediet med en pH på 5 til et kationbytteresin omfattende en matriks av silikapartikler som er kovalente bundet til polyetyleniminsilan, hvori aminogruppene er derivatisert med karboksylgrupper, som fører til selektiv binding av rDSPA a 1 til kationbytteresinet; (b) vasking av kationbytteresinet ved pH 5 med 100 mM NaOAc og 50mM Nap04 ved pH 7,5, for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og forurensende stoffer som ikke er protein; (C) eluering av bundet rDSPA a 1 fra kationbytteresinet med en buffer inneholdende 50 mM natriumfosfat og 500 mM natriumklorid ved pH7,5; (d) tilføring av den rDSPA a 1-inneholdende eluent fra trinn (c) ved pH 4 til et hydrofobt interaksjonsresin omfattende semirigide runde perler syntetisert ved hjelp av en kopolymerisering av etylenglykol og metakrylatpolymerer derivatisert med butylgrupper, som fører til selektiv binding av rDSPA a 1 til det hydrofobe interaksjonsresin; (e) vasking av det hydrofobe interaksjonsresin med 20 mM HC1 og så med 20 mM HC1 inneholdende 19 % EtOH for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og forurensende stoffer som ikke er protein; (f) eluering av bundet rDSPA ot 1 fra det hydrofobe interaksjonsresin med en buffer inneholdende 29 % etanol og 20 mM saltsyre ved pH 2,5; (g) tilføring av den rDSPA a 1-inneholdende eluent fra trinn (f) ved pH 2,5 til et affinitetskromatografiresin bestående av en kryssbundet polymer av allyldekstran og N,N'-metylenbisakrylamid som fraksjonerer globulære proteiner mellom 20.000 og 8.000.000 kDa, som fører til selektiv binding av rDSPA cc 1 til af f initetskromatograf iresinet; (h) vasking av affinitetskromatografiresinet med 20 mM HC1 for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og for-urensede stoffer som ikke er protein; (i) eluering av bundet rDSPA a 1 fra affinitetskromatografiresinet med en buffer inneholdende 200 mM glysin ved en pH mellom 4 og 5, for å produsere rDSPA a 1 som er i det vesentlige ren i en vandig oppløsning.

Eksempel 1

Cellekulturproduksjon av rDSPA a 1

En ampulle fra DSPA Working Cell Bank ble tinet og inokulert i en rullekolbe med 5 % kalveserum i vekstmediet (WEC 6.0 medium, Williams E modifisert).Over en to ukers periode ble cellene ekspandert i fire rullende kolber, cellene ble behandlet med trypsin slik at de løsnet fra de rullende kolber og inokulert i fire rotasjonskolber på 11 med 4 x IO<8 >celler i hver i 11 vekstmedium. Etter fire dager ble kulturene fra de fire rotasjonskolbene anvendt for å inokulere en bio-reaktor på 101. Ytterligere en 11 vekstmedium ble tilsatt bioreaktorkulturen på inokuleringsdagen. Den neste dag ble bioreaktoren fylt til 101 med vekstmedium. Dyrking både med og uten tilsetning av mikrobærerperler ble gjort ut fra denne fremgangsmåte. pH i mediet ble kontrollert til å være 7,0 - 7,4 og oksygenering ble opprettholdt til alle tider ved hjelp av et luftspredersystem. Temperaturen ble opprettholdt ved 34-39 °C.

Celletettheten på inokuleringsdagen i bioreaktoren var 8,1<10> per ml og etter to dager var celletettheten for-doblet, på dette tidspunkt var perfusjonsgraden satt til 0,5 kulturvolumer per dag (cv/dag). Perfusjonsgraden ble økt med hensyn til celletetthet, slik at 9 dager etter inokulering av bioreaktoren hadde tettheten nådd 6,2 x IO<6> celler/ml og perfusjonen økt til 2cv/dag.

Bioreaktoren ble så byttet til produksjonsmedium (1 % kalveserum i WEC 5.0-medium) og to dager senere ble oppsamling av masse startet og fortsatte så lenge som 10 uker. Under produksjonsfasen var gjennomsnittlig celletetthet 15 x IO<6 >celler per ml med omtrent 75 % overlevelse. Gjennomsnittlig rDSPA a 1-produksjon var 40 milligram rDSPA a 1 per liter og gjennomsnittlig spesifikk produksjonsgrad var 6 pikogram rDSPA a 1 per celle per dag.

Ekspansjon og fermenteringsvolumer ble oppnådd ved overføring av halvparten av innholdet i en reaktor til et nytt kar. Begge bioreaktorer ble plassert i produksjonsmedium tilført med 2 cv/dag, og oppsamlingen av produksjonshøsten startet umiddelbart.

Eksempel 2

Rensing av rDSPA a 1

1. Kationbytterkromatografi (kolonne A). Bioreaktorinnhøstingen lagres ved omgivelsestemperatur (15-25°C). Den filtreres så gjennom et filter på 0,45 um før tilføring til en kationbytterkolonne. Rensing av innhøstingen starter med et kolonnekromatografitrinn ved anvendelse av CBX-resinet fremstilt av J.T. Baker (kolonne A). Dette trinn letter en signifikant rensing av proteinet.

Kolonne A-buffere består av buffer Al: ekvilibreringsbuffer (50 mM NaoAc, pH 5,0), buffer A2: vaskebuffer (50 mM NaPCu, pH7,5), buffer A3: elueringsbuffer (50 mM NaPCU, 500 mM NaCl, pH 7,5), buffer A4: strippebuffer (2 M NaAc, pH 8,0), og buffer A5: lagringsbuffer (45% EtOH, 10 % HoAc).

De følgende kolonneoperasjonsparametre er egnet for en kolonne pakket med 6 kg resin og som har et kolonnevolum på 15 liter. Ikke mer enn 4,5 g rDSPA a. 1 kan tilføres kolonnen per runde. Det tilsettes ikke mer til kolonnen enn at det foreligger en strømningsgrad på ikke mer enn 2 liter per minutt og et kolonnetrykk som ikke er mer enn 137895,2 pascal. Kolonne og overvåkingsparametere sjekkes før hver runde. Tilført materiale og karomatografibuffere avgasses ved hjelp av luftspredning med helium før anvendelse.

Bioreaktorinnhøstingen filtreres med et filter på 1,2 mm for så å titreres til pH 56,00 (±=,10) ved anvendelse av iseddik. Før tilsetning ekvilibreres kolonnen med ikke mer enn 30 liter buffer Al inntil effluenten har pH 5,0 (±0,20). Etter at kolonnen er ekvilibrert tilsettes innhøstingen fra bioreaktoren til kolonnen. Kolonnen reekvilibreres med ikke mindre enn 80 liter buffer Al. Kolonnen er ordentlig reekvilibrert når effluenten har pH 5,0 (±0,20) og når en stabil UV-grunnlinje er nådd. Kolonnen vaskes med ikke mindre enn 145 liter buffer A2. Kolonnen er ordentlig vasket når effluenten har pH 7,5 (±0,20) og når en stabil UV-grunnlinje er nådd.

Produktet elueres fra kolonnen med ikke mindre enn 30 liter buffer A3 og oppsamles i et separat kar. Elueringen er antatt å være fullstendig når en stabil UV-grunnlinje er nådd. Etter eluering av produktet strippes kolonnen inntil en stabil UV-grunnlinje er oppnådd, ved anvendelse av ikke mindre enn 30 liter buffer A4. Kolonnen renses for ny anvendelse (det skal ikke anvendes på mer enn 50 sykluser). Kolonne A-produktet (eller eluat) lagres ved 2-8 °C. Gjennomsnittlig gjenvinning var 93 % og gjennomsnittlig (protein) renhet i eluatet var 81 %. 2. Hydrofob interaksjonskromatografi (kolonne B). Etter kromatografi ved hjelp av CBX-resinet ble det gjort kromatografi på rDSPA a 1-produktet ved anvendelse av et C4-hydrofobt interaksjonsresin (Toso-Haas) (kolonne B). Dette trinn letter signifikant fjerning av kontaminanter som ikke er protein og hjelper også på inaktiveringen/fjerningen av mulige viruskontaminanter. Kolonne B-bufferen består av buffer Bl: Ekvilibreringsbuffer (50 mM NaoAc, 5000 mM NaCl, pH 4,0), buffer B2: vaske og lagringsbuffer (20 mM HC1,), buffer B3: vaskebuffer (20 mM HC1, 19 % EtOH), buffer B4: vaskebuffer (20 mM HC1, 20,5 % EtOH), buffer B5: elueringsbuffer (20 mM HC1, 29,5 % EtOH), og buffer B6: strippebuffer (0,1N NaOH). De følgende kolonneoperasjonsparametre er tilstrekkelig for et kolonnevolum på 15 liter. Ikke mer enn 9 g rDSPA a 1 kan tilføres kolonnen per runde. Kolonnen tilsettes med en strømningsgrad som ikke er mer enn 2 liter per minutt og ikke mer enn et trykk på 103421,4 pascal. Kolonnen og overvåknings-spesifikasjonene sjekkes før hver runde.

Før tilsetning ekvilibreres kolonnen inntil effluenten har pH 4,00 (±0,20). Kolonnen A-eluatet titreres til pH 4,00 (±0,10) ved anvendelse av iseddik, avgasses og tilsettes. Kolonnen reekvilibreres med ikke mindre enn 30 liter buffer Bl inntil effluenten har pH 4,00 (±0,20) og til en stabil UV-grunnlinje er oppnådd. Kolonnen vasket med tre buffere. Den første vask utføres med ikke mindre enn 45 liter buffer B2. Kolonnen er ordentlig vasket når effluenten har pH 1,90(±0,20) og når en stabil UV-grunnlinje er oppnådd. Kolonnen vaskes en annen gang med ikke mindre enn 145 liter buffer B3 inntil en stabil UV-grunnlinje er oppnådd. Kolonnen vaskes en tredje gang med ikke mindre enn 30 liter av buffer 4 og er fullstendig vasket når en stabil UV-grunnlinje er nådd.

rDSPA a 1 elueres fra kolonnen med ikke mindre enn 30 liter buffer B5 og oppsamles i et separat kar. Eluering fortsettes inntil en stabil UV-grunnlinje er oppnådd. Kolonnen vaskes så for gjenbruk (anvendes ikke mer enn 50 sykluser). Kolonne B-produktet (eller eluatet) lagres ved 2-8 °C i ikke mer enn 15 dager før ytterligere prosessering. Gjennomsnittlig utvinning var 91 og gjennomsnittlig (protein) renhet til eluatet var 97 %.

3. Affinitetskromatografi (kolonne C). Det ble deretter gjort kromatografi på kolonne. B-produktet ved anvendelse av Sephacryl S-400 (Pharmacia)(kolonne C). Dette trinn fremmer en bufferutveksling for å lette dannelse og også for å hjelpe til ved inaktiveringen/fjerningen av viruskontaminanter. Kolonne C-bufferne består av buffer Cl: Ekvilibreringsbuffer (20 mM HC1, 19 % EtOH), buffer C2: vaskebuffer (20 mM HC1), buffer C3: eluerings- og lagringsbuffer (200 mM glysin, sterilfiltrert), og buffer C4: stripperbuffer (0,1N NaOH). Følgende kolonneoperasjonsparametre er egnet for et kolonnevolum på 10 liter. Ikke mer enn 20 g rDSPA a 1 kan tilføres kolonnen per runde. Kolonnen tilføres med en strømningsgrad som ikke er mer enn 0,5 liter per minutt og et trykk som ikke er mer enn 103421,4 pascal. Eluatene fra en eller flere kolonne B-runder samles, for så å fortynnes med en C2 buffer og to deler buffer 5-eluat. Den endelige etanolkonsentrasjon vil være omtrent 19

Før tilføring ekvilibreres kolonnen med ikke mindre enn 15 liter buffer Cl inntil effluenten har pH 1,8 (±0,20). Etter tilsetning vaskes kolonnen med ikke mindre enn 30 liter buffer C2. Kolonnen er ordentlig vasket når UV-signalet er stabilt. Produktet elueres fra kolonnen med ikke mindre enn 20 liter buffer C3 og oppsamles i et separat kar. Eluering fortsettes inntil en stabil UV-grunnlinje er nådd.

Etter eluering av produktet strippes kolonnen med ikke mindre enn 12 liter buffer C4 og lagres inntil gjenbruk som ikke overskrider 20 sykluser. Kolonne C-produktet (eller eluatet) fortynnes til en konsentrasjon på < 1 mg per milli-liter med buffer C3 og lagres ved 2-8 °C for ytterligere prosessering. Den gjennomsnittlige utvinning av rDSPA a 1 var 97 % og gjennomsnittlig (protein) renhet til eluatet var 98 %.

Konsentrasjonen og formuleringstrinnene etter fullføring av rensingstrinnene ovenfor ble utført på S-400-affinitetskolonneeluatet, som var lagret i ikke mer en 70 dager. Kolonne C-eluatet ble samlet og konsentrert ved hjelp av en spiralvevet ultrafiltreringsmembran som fjerner bestanddeler med lav molekylvekt (30.000 dalton cut-off). Produktet ble oppsamlet i en pyrogenfri container i en konsentrasjon som var høyere enn 8 mg/ml. Mannitol ble tilført til en endelig konsentrasjon på 4 %.

Den siste formuleringsbuffer (200 mM glysin, 4 % mannitol (w/v) ble tilført for å bringe konsentrasjonen i det formulerte masseprodukt til 7,5 mg/ml. Det masseformulerte produkt ble så sterilfiltrert, fordelt i ampuller og lyo-filisert.

Claims (23)

1. Fremgangsmåte for rensing av rekombinant Desmodus rotundus-spyttplasminogenaktivator (rDSPA a 1} fra et biologisk medium, karakterisert ved at den omfatter følgende: (a) tilføring av mediet til et kationbytteresin ved pH mellom 4 og 7; (b) vasking av kationbytteresinet for å fjerne proteiner som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (c) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra kationbytteresinet; (d) tilføring av den rDSPA a 1-inneholdende eluent fra trinn (c) til et hydrofobt interaksjonsresin ved pH mellom 3 og 5; (e) vasking av det hydrofobe interaksjonsresin for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (f) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra det hydrofobe interaksjonsresin; (g) tilføring av den rDSPA a 1-inneholdende eluent fra trinn (f) til et affinitetskromatografiresin ved lav pH og lav ionestyrke; (h) vasking av affinitetskromatografiresinet for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (i) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra affinitetskromatografiresinet for å danne rent rDSPA a 1 i en vandig oppløsning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det biologiske medium er et kondisjonert medium.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kationbytteresinet i trinn (a) består av silikagelpartikler, kryssbundet agarose eller kryssbundne polymetakrylatpolymerer, derivatisert med karboksyl- eller karboksyalkylgrupper.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at kationbytteresinet består av en matriks av silikapartikler kovalent bundet til polyetyleniminsilan, hvori aminogruppene til polyetylenimin-silanet er derivatisert med karboksylgrupper.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at tilføringsbetingelsene i trinn (a) omfatter tilføring av mediet ved pH mellom 4 og 7.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at elueringen av rDSPA a 1 i trinn (c) utføres ved anvendelse av en buffer inneholdende 50 mM NaPhos og mellom 100 mM og 500 mM NaCl eller en buffer med ekvivalent ionestyrke.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det hydrofobe interaksjonsresin i trinn (d) er et uladet resin, derivatisert med alkylkjeder med en lengde på 1-10 karboner eller med aryl-alkylgrupper.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det uladete resin består av silikagelpartikler, kryssbundet agarose eller en kryssbundne polymetakrylatpolymer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det uladete resin omfatter semirigide runde perler syntetisert ved kopolymerisering av etylenglykol og metakrylatpolymerer derivatisert med butylgrupper.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at tilføringsbetingelsene i trinn (d) omfatter tilføring av eluenten fra trinn (c) ved pH mellom 3 og 5.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at tilføringsbetingelsene i trinn (d) omfatter tilføring av eluenten fra trinn (c) i 50 mM NaPhos, 500 mM NaCl, justert til pH 4 med fosforsyre, eller i en buffer med ekvivalent ionestyrke.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at elueringen i trinn (f) utføres ved anvendelse av en buffer omfattende 20 mM HC1 og med en etanolkonsentrasjon høyere enn 25 %.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at etanolkonsentrasjonen er mellom 28,5 % og 30 %.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at etanolkonsentrasjonen er 29 %.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori affinitetskromatografiresinet fra trinn (g) består av en kryssbundet kopolymer av allyldekstran og N,N'-metylenbisakrylamid i form av perler med en diameter mellom 25 og 75 um.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at perlen har evnen til å fraksjonere globulære proteiner mellom 20.000 og 8.000.000 kDa.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at tilsetningsbetingelsene i trinn (g) omfatter tilsetning av eluenten fra trinn (f) ved en pH mellom 1 og 4.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 15, hvori elueringen i trinn (i) utføres ved anvendelse av en buffer inneholdende 200 mM glysin ved en pH mellom 3 og 6, eller en buffer med ekvivalent ionestyrke.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter konsentrering av den vandige oppløsning av rDSPA a 1.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at den omfatter lyofilisering av den konsentrerte rDSPA a 1-oppløsning.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter konsentrering av den vandige oppløsning av rDSPA a 1 og lyofilisering av den konsentrerte rDSPA a 1-oppløsning.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilføring av mediet ved pH mellom 4 og 7 til et kationbytteresin bestående av silikagelpartikler, kryssbundet agarose eller kryssbundete polymetakrylatpolymerer derivatisert med karboksyl- eller karboksyalkylgrupper; (b) vasking av kationbytteresinet for å fjerne proteiner som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (c) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra kationbytteresiner ved anvendelse av en buffer inneholdende 50 mM natriumfosfat og mellom 100 mM og 500 mM NaCl eller en buffer med ekvivalent ionestyrke; (d) tilsetning av den rDSPA a 1-inneholdende eluent fra (c) ved en pH mellom 3 og 5 til et hydrofobt interaksjonsresin bestående av silikagelpartikler, kryssbundet agarose eller kryssbundete polymetakrylatpolymerer; (e) vasking av det hydrofobe interaksjonsresin for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (f) selektiv eluering av bundet rDSPA a 1 fra det hydrofobe interaksjonsresin ved anvendelse av en buffer inneholdende 20 mM HC1 og med en etanolkonsentrasjon høyere enn 25 %; (g) tilføring av den rDSPA ot 1-inneholdende eluent fra trinn (f) ved pH mellom 1 og 4 til et affinitetskromatografiresin bestående av en kryssbundet polymer av allyldekstran og N,N'-metylenbisakrylamid i form av perler med en diameter mellom 25 og 75 um; (h) vasking av affinitetskromatografiresinet for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (i) selektiv eluering av bundet rDSPA ot 1 fra affinitetskromatografiresinet med en buffer inneholdende 200 mM glysin med pH mellom 3 og 6 eller en buffer med ekvivalent ionestyrke for å fremstille rent rDSPA a 1 i en vandig oppløsning.

23. Fremgangsmåte for isolering og rensing av rDSPA a 1 fra et biologisk medium, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilsetning av mediet ved pH 5 til et kationbytteresin bestående av en matriks av silikapartikler kovalent bundet til polyetyleniminsilan, hvori aminogruppene derivati-seres med karboksylgrupper; (b) vasking av kationbytteresinet ved pH 5 med 100 mM NaOAc og 50 mM NaP04 ved pH 7,5 for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (c) eluering av bundet rDSPA a 1 fra kationbytteresinet med en buffer inneholdende 50 nM natriumfosfat og 500 natriumklorid ved pH 7,5; (d) tilsetning av den rDSPA a 1-inneholdende eluent fra trinn (c) ved pH 4 til et hydrofobt interaksjonsresin bestående av semirigide runde perler syntetisert ved kopolymerisering av etylenglykol og metakrylatpolymerer derivatisert med butylgruppe; (e) vasking av det hydrofobe interaksjonsresin med 20 mM HC1 og så med 20 mM HC1 inneholdende 19 % EtOH for å fjerne protein som ikke er rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (f) eluering av bundet rDSPA a 1 fra det hydrofobe interaksjonsresin med en buffer inneholdende 29 % etanol og 20 mM saltsyre ved pH 2,5; (g) tilsetning av en rDSPA a 1-inneholdende eluent fra trinn (f) ved pH 2,5 til affinitetskromatografiresin bestående av en kryssbundet polymer av allyldekstran og N,N'-metylenbisakrylamid som fraksjonerer globulære proteiner mellom 20.000 og 8.000.000 kDa; (h) vasking av affinitetskromatografiresinet med 20 mM HC1 for å fjerne protein som ikke rDSPA a 1 og kontaminerende stoffer som ikke er protein; (i) eluering av bundet rDSPA ot 1 fra affinitetskromatografiresinet med en buffer inneholdende 200 mM glysin ved pH mellom 4 og 5 for å produsere ren rDSPA a 1 i en vandig oppløsning.