SK284179B6 - Spôsob čistenia rekombinantného aktivátora plazminogénu alfa1 zo slín Desmondus rotundus (rDSPalfa1) z biologického média a spôsob izolácie a čistenia rDSPA alfa1 z biologického média - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka spôsobu čistenia rekombinantného aktivátora plazminogénu al zo slín Desmondus rotundus (rDSPA al) z biologického média a ďalej spôsobu izolácie a čistenia rDSPA al z biologického média.

Doterajší stav techniky

Trombózy vznikajú vytvorením krvnej zrazeniny v krvných cievach. Je možné rozlišovať medzi žilovými trombózami, ktoré zahrnujú pľúcnu embóliu, a tepnovými trombózami, ktoré zahrnujú akútny infarkt myokardu. Pľúcna embólia a srdcový infarkt sú ľudský život ohrozujúce príhody, ktoré vyžadujú urýchlenú lekársku pomoc.

Všeobecne rozšírený spôsob terapie takýchto tepnových a žilových trombóz je použitie aktivátorov plazminogénu s cieľom vykonať enzymatickú trombolýzu (Collen a kol., Ann. Rev. Med., (1988), 39, 405 - 423). Tieto látky, nazývané trombolytiká, premieňajú plazminogén, neaktívny proenzým fibrinolytického systému v krvi, na plazmín, čo je aktívny proteolytický enzým. Plazmín potom rozpúšťa vláknitú látku fibrín, ktorá je základnou zložkou krvnej zrazeniny; to vedie k opätovnému otvoreniu upchatých ciev a k obnoveniu toku krvi v týchto cievach. Ale, ak je plazmín relatívne nešpecifická proteáza, môže tiež proteolýzou proteínov v krvi zničiť zložky, nevyhnutné na intaktnú hemostázu (ako napríklad fibrinogén) a taktiež sa zvyšuje riziko krvácania.

Prvé enzymatické trombolytiká, streptokináza a urokináza, sú zlúčeniny, ktoré sotva sú vstreknuté do obehu, sústavne premieňajú plazminogén na plazmín a indukujú systémovú proteolýzu. Trombolytické spôsoby liečenia, ktoré používajú tieto zlúčeniny, sú teda sprevádzané komplikáciami, ktoré sa vzťahujú na krvácanie. V poslednej boli síce vyvinuté novšie spôsoby trombolytickej terapie, ktoré sú založené na použití aktivátorov plazminogénu tkanivového typu, obvykle nazývaných t-PA (tissue Plasminogen Activators), ale sú obmedzené množstvom nevýhod, zahrnujúcich vážne komplikácie spojené s krvácaním, relatívne častým výskytom reoklúzie, neschopnosťou byť rovnomerne účinné a náchylnosťou na inaktiváciu inhibítormi plazminogénových aktivátorov, ako sú napríklad inhibítor plazminogénového aktivátora typu 1 (PAI-1) (pozri publikácia Loskutoff, Seminars in Trombosis and Hemostasis, Vol. 14, No. 1 (1988)).

Neskoršie boli purifikované plazminogén aktivujúce proteíny zo slín a zo slinných žliaz netopiera vampíra (Desmondus rotundus) (publikovaná európska patentová prihláška 0 383 417 (Baldus a kol.); publikovaná európska patentová prihláška 0 352 119 (Duong a kol.)).

Tieto aktivátory plazminogénu (nazývané DSPA) sú serinové proteázy, ktoré katalyzujú premenu plazminogénu na plazmín, ktoré však prejavujú väčšiu selektivitu na plazminogén viazaný na fibrín a z tohto dôvodu, ak sú používané na trombolytickú terapiu, môžu byť spájané so znižujúcou sa závažnosťou a frekvenciou krvácania. Okrem toho nie je DSPA ľahko inaktivovaný plazmovými inhibítormi, ako napríklad PAI-1 a z tohto dôvodu môžu byť spájané s menšou frekvenciou reoklúzií.

V netopierích slinách môžu byť nájdené dve formy DSPA s vysokou molekulovou hmotnosťou (označované al a a2), obidve z nich pozostávajú z niekoľkých domén, zahrnujúcich proteázovú doménu, pričom obidve z nich sú schopné pevnej väzby na plazminogén za prítomnosti fibrínu. Rôzne formy DSPA boli získané z kultúr buniek cicav cov rekombinantnou biotechnológiou (pozri publikácia Krätzschmer a kol., Gene (1991), 105: 229 - 237', publikovaná európska patentová prihláška 0 352 119 (Duong a kol.)) pričom bolo rovnako opísané čistenie rekombinantne vyrobeného DSPA (rDSPA) v malej miere (pozri publikácia Witt a kol., Blood (1992), 79: 1213 - 1217). Izolácia a čistenie rDSPA v komerčnom meradle a do stupňa čistoty vhodnej na použitie vo farmaceutických prípravkoch, neboli dosiaľ objavené.

Podstata vynálezu

Predmetný vynález sa týka spôsobu izolácie a čistenia rekombinantného DSPA al (rDSPA al) v komerčnom meradle. Vynález, tak, ako je opísaný, vedie k dostatočne čistému a stabilnému rDSPA al, aby mohol byť komerčne predajný a klinicky použiteľný.

Podstata spôsobu čistenia rekombinantného aktivátora plazminogénu al zo slín Desmondus rotundus (rDSPA al) z biologického média podľa predmetného vynálezu spočíva v tom, že pozostáva z nasledujúcich krokov:

a) aplikácia tohto média na katiónovú ionexovú živicu za podmienok, vedúcich k selektívnej väzbe rDSPA al na katiónovú ionexovú živicu,

b) premývanie tejto katiónovej ionexovej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty,

c) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z katiónovej ionexovej živice,

d) aplikovanie eluentu, ktorý obsahuje rDSPA al a ktorý bol získaný v kroku (c), na hydrofóbnu interaktívnu živicu za podmienok, ktoré vedú k selektívnej väzbe rDSPA al na túto hydrofóbnu interaktívnu živicu,

e) prípadne premývanie hydrofóbnej interaktívnej živice s cieľom odstrániť proteínov, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty,

f) selektívne eluovanie viazaného rDSPA α 1 z hydrofóbnej interaktívnej živice;

g) aplikovanie eluentu, ktorý obsahuje rDSPA al a ktorý bol získaný v kroku (f), na afinitnú chromatografickú živicu vedúcu k selektívnej väzbe rDSPA al na túto afinitnú chromatografickú živicu,

h) prípadne premývanie afinitnej chromatografickej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty,

i) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z afinitnej chromatografickej živice za získania v podstate čistého rDSPA al vo vodnom roztoku.

Pri výhodnom uskutočnení sa pri tomto postupe podľa vynálezu použije ako biologické médium kondiciované médium.

Katiónová ionexová živica z kroku (a) je výhodne zvolená zo súboru, zahrnujúceho častice silikagélu, zosieťovanú agarózu alebo zosieťované polymetakrylátové polyméry, modifikované karboxylovými alebo karboxyalkylovými skupinami.

Konkrétne je možné uviesť, že výhodne je katiónová ionexová živica tvorená matricou z častíc silikagélu, kovaIcntnc viazaných k polyetylénimínsilánu, pričom amínové skupiny polyetylénimínsilánu sú modifikované karboxylovými skupinami.

Vo výhodnom uskutočnení tohto postupu podľa vynálezu podmienky aplikácie v kroku (a) zahrnujú aplikovanie média pri pH v rozmedzí od 4 do 7.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia sa eluovanie rDSPA al v kroku (c) uskutočňuje s použitím pufra obsahujúceho 50 mM Na₃PO₄ a od 100 mM do 500 mM NaCl alebo s použitím pufra ekvivalentnej iónovej sily.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia hydrofóbna interaktívna živica z kroku (d) je živica bez náboja, modifikovaná alkylovými skupinami obsahujúcimi 1 až 10 atómov uhlíka alebo aryl-alkylovými skupinami, pričom táto živica je bez náboja a je zvolená zo súboru, zahrnujúceho častice silikagélu, zosieťovanú agarózu alebo zosieťovaný polymetakrylátový polymér.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia je živica bez náboja je tvorená semirigidnými sférickými granulami syntetizovanými kopolymerizáciou etylénglykolu a polymérov metakrylátového typu, modifikované butylovými skupinami.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia zahrnujú aplikačné podmienky v kroku (d) aplikáciu látky, eluovanej v kroku (c), pri pH v rozmedzí od 3 do 5. Konkrétne je možné uviesť, že výhodné aplikačné podmienky v kroku (d) zahrnujú aplikáciu látky, eluovanej v kroku (c), v 50 mM Na₃PO₄, 500 mM NaCl a pri hodnote pH upravenej na hodnotu 4 kyselinou fosforečnou alebo s použitím pufra ekvivalentnej iónovej sily.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia sa eluovanie v kroku (f) uskutočňuje s použitím pufra, ktorý obsahuje 20 mM HCI a ktorý má koncentráciu etanolu vyššiu ako 25 %, podľa ešte výhodnejšieho uskutočnenia v rozmedzí od 28,5 % do 30 %, najvýhodnejšie 29 %.

Afínitná chromatografická živica v kroku (g) je vo výhodnom uskutočnení vynálezu predstavovaná zosieťovaným kopolymérom alyldextránu a N,N’-metylénbisakrylamidu vo forme granúl s priemerom, ktorý je v rozmedzí od 25 do 75 pm, pričom tieto granuly sú schopné frakcionovať globuláme proteíny s veľkosťou od 20 000 do 8 000 000 kDa.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia aplikačné podmienky v kroku (g) zahrnujú aplikáciu eluentu v kroku (f) pri pH s hodnotou medzi 1 a 4.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia sa eluovanie v kroku (i) uskutočňuje s použitím pufra, obsahujúceho 200 mM glycínu a pri hodnote pH v rozmedzí od 3 do 6 alebo s použitím pufra ekvivalentnej iónovej sily.

Postup podľa predmetného vynálezu ďalej zahrnuje výhodne koncentrovanie vodného roztoku rDSPA al, pričom je rovnako výhodné, ak tento postup ďalej zahrnuje lyofilizáciu koncentrovaného roztoku rDSPA α 1.

Výhodne tento postup podľa vynálezu zahrnuje koncentrovanie vodného roztoku rDSPA al a lyofilizáciu koncentrovaného roztoku rDSPA al.

Podľa vynálezu je teda výhodný postup, ktorý konkrétne zahrnuje nasledujúce kroky:

a) aplikovanie média, ktoré má pH v rozmedzí od 4 do 7, na katiónovú ionexovú živicu, zvolenú zo súboru, zahrnujúceho častice silikagélu, zosieťovanú agarózu alebo zosieťované polymetakrylátové polyméry, modifikované karboxylovými alebo karboxyalkylovými skupinami, čo vedie k selektívnej väzbe rDSPA al na katiónovú ionexovú živicu,

b) prípadne premývanie tejto katiónovej ionexovej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínových nečistôt,

c) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z katiónovej ionexovej živice pufrom, ktorý obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a od 100 mM do 500 mM chloridu sodného alebo pufrom ekvivalentnej iónovej sily;

d) privedenie eluentu z kroku (c), ktorý obsahuje rDSPA α 1, pri pH v rozmedzí od 3 do 5 na hydrofóbnu interaktívnu živicu, zvolenú zo súboru, zahrnujúceho častice silika gélu, zosieťovanú agarózu alebo zosieťované polymetakrylátové polyméry, vedúce k selektívnej väzbe rDSPA al na túto hydrofóbnu interaktívnu živicu;

e) premývanie tejto hydrofóbnej interaktívnej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty;

f) efektívne eluovanie viazaného rDSPA al z hydrofóbnej interaktívnej živice pufrom, ktorý obsahuje 20 mM HCI a ktorý má koncentráciu etanolu väčšiu ako 25 %.

g) aplikovanie eluentu, ktorý obsahuje rDSPA al, z kroku f) pri hodnote pH v rozmedzí od 1 do 4 na afinitnú chromatografíckú živicu, predstavovanú zosieťovaným polymérom alyldextránu a Ν,Ν’-metylénbisakrylamidu v tvare granúl s priemerom v rozmedzí od 25 do 75 pm, vedúce k selektívnej väzbe rDSPA al na túto afinitnú chromatografickú živicu,

h) prípadné premývanie tejto afinitnej chromatografickej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty;

i) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z afinitnej chromatografickej živice s použitím pufra, ktorý obsahuje 200 mM glycínu, pri hodnote pH v rozmedzí od 3 do 6 alebo pufra ekvivalentnej iónovej sily, za vzniku čistého rDSPA al vo vodnom roztoku.

Do rozsahu predmetného vynálezu rovnako patrí spôsob izolácie a čistenia rDSPA al z biologického média, ktorého podstata spočíva v tom, že pozostáva z nasledujúcich krokov:

a) aplikovanie tohto média, ktoré má pH 5, na katiónovú ionexovú živicu, ktorá pozostáva z matrice častíc oxidu kremičitého kovalentne viazaných na polyetylénimínsilán, v ktorom boli amino skupiny modifikované karboxylovými skupinami, čo vedie k selektívnej väzbe rSDPA al na túto katiónovú ionexovú živicu;

b) premývanie tejto katiónovej ionexovej živice pri hodnote pH 5 použitím lOOmM acetátu sodného a 50 mM Na₃PO₄ pri pH 7,5, s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al aneproteínové nečistoty;

c) eluovanie viazaného rDSPA al z katiónovej ionexovej živice pufrom, ktorý obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného pri pH 7,5;

d) aplikovanie eluentu z kroku (c), ktorý obsahuje rDSPA al, pri hodnote pH 4 na hydrofóbnu interaktívnu živicu pozostávajúcu zo semirigidných sférických granúl syntetizovaných kopolymerizáciou etylénglykolu a polymérov typu metakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami, čo vedie k selektívnej väzbe rDSPA al na hydrofóbnu interaktívnu živicu;

e) premývanie tejto hydrofóbnej interaktívnej živice s použitím 20 mM HCI a potom s použitím 20 mM HCI, ktorá obsahuje 19 % etanolu s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty;

f) eluovanie viazaného rDSPA al z hydrofóbnej interaktívnej živice pufrom, ktorý obsahuje 29 % etanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkovej pri pH 2,5;

g) aplikovanie eluentu, ktorý obsahuje rDSPA al, z kroku (f) pri hodnote pH 2,5 na afinitnú chromatografickú živicu pozostávajúcu zo zosieťovaného kopolyméru alyldextránu a Ν,Ν’-metylénbisakrylamidu, ktorá fŕakcionuje globuláme proteíny s hmotnosťou medzi 20 000 a 8 000 000 kDa, čo spôsobí selektívnu väzbu rDSPA al na túto afinitnú chromatografickú živicu;

h) premývanie tejto afinitnej chromatografickej živice s použitím 20mM HCI s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínových nečistôt;

i) eluovanie viazaného rDSPA al z afmitnej chromatografickej živice s použitím pufra, ktorý obsahuje 200 mM glycínu, pri pH medzi 4 a 5, za vzniku čistého rDSPA al vo vodnom roztoku.

Postup izolácie a čistenia rDSPA al z biologického média podľa predmetného vynálezu je možné uskutočňovať v komerčnom meradle a získať tak produkt, ktorý je vhodný na klinické použitie.

Rekombinantný aktivátor plazminogénu al zo slín Desmondus rotundus (rDSPA al) je možné použiť na prípravu farmaceutického prostriedku obsahujúceho tento rDSPA al a farmaceutický prijateľný excipient.

Takto získaný rDSPA al, izolovaný a čistený spôsobom podľa vynálezu je možné použiť na liečenie človeka s tepnovými alebo žilovými trombózami.

V opise predloženého vynálezu a priložených nárokoch, pokiaľ nie je uvedené inak, majú nasledujúce výrazy uvedený význam:

Výraz „biologické médium“ sa vzťahuje na presne určené zloženie solí a živín používaných na rozmnožovanie buniek v kultúre.

Výraz „kondiciované“ sa vzťahuje na biologické médium, v ktorom bunky vyrástli. Médium bolo z tohto dôvodu ovplyvnené (kondiciované) rastom buniek a obsahuje produkty vylúčené do média počas bunkového rastu. Tieto produkty môžu byť buď odpadne produkty vytvorené počas rastu alebo proteíny, ktoré boli produkované a vylučované do média bunkami počas rastu.

Výraz „katiónová ionexová živica“ sa vzťahuje na prírodnú alebo umelú látku, obvykle pevnú látku, ktorá je schopná vymieňať viazané ióny za ióny z okolitého tekutého média.

Katiónová ionexová živica má záporné funkčné viazané ióny a vymieňa zodpovedajúce kladné ióny.

Aktívne zložky ionexov v komerčne dostupných katiónových meničoch sú obvykle -C_eH₅O\ -SO₃‘, -COO', -POj‘ alebo -AsO₃. Slabšie katiónová ionexové živice sú tie, v ktorých väzobná sila katiónov nie je vysoká, ako napríklad tie, ktoré obsahujú karboxylové alebo karboxyalkylové funkčné skupiny. Ďalej nie sú slabšie katiónové ionexové živice obvykle úplne disociované pri kyslom pH. Konkrétne slabá katiónová ionexová živica, používaná v spôsobe podľa predloženého vynálezu, pozostáva z matrice častíc oxidu kremičitého, kovalentne viazaných na polyetylénimín silánu, v ktorom amino skupiny polyetylénimínu boli modifikované karboxylovými skupinami. Takáto živica je komerčne dostupná od spoločnosti J. T. Baker pod chráneným obchodným označením chromatografická živica Widepore CBX®.

Výraz „hydrofóbna interaktívna živica“ sa vzťahuje na prírodnú alebo umelú látku, obvykle pevnú látku, ktorá obsahuje elektricky nenabité skupiny, ako napríklad metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo ďalšie alkylové skupiny. Tieto skupiny vytvárajú hydrofóbne väzby so skupinami na proteínových zložkách, ktoré prechádzajú živicou a vedú k oddeleniu proteínov, založenému na sile interakcie medzi proteínmi a živicovými skupinami. Konkrétna hydrofóbna interaktívna živica je zložená zo semirigidných sférických granúl, ktoré sú syntetizované kopolymerizáciou etylénglykolu a polymérov typu metakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami. Takáto živica je komerčne dostupná od spoločnosti Toso-Haas, pod chráneným obchodným označením Toxo-Pearl® 650M C4.

Výraz „afinitná chromatografická živica“ sa vzťahuje na prírodnú alebo umelú látku, obvykle pevnú látku, ktorá je používaná na čistenie proteínov. Živica oddeľujúca proteíny je založená na afinite, ktorá nastáva medzi skupinami proteínov a skupinami živice. V predloženom vynáleze je živica, používaná ako afinitná chromatografická živica, obvykle používaná ako veľkostne vylučovacia kvôli oddeleniu proteínov na základe ich veľkosti. Konkrétna afinitná chromatografická živica je zosieťovaný kopolymér alyl dextránu a Ν,Ν’-metylén bisakrylamidu vo forme granúl, ktoré sú schopné frakcionácie globulámych proteínov medzi 20 000 a 8 000 000 kDa. Takáto živica je komerčne dostupná od spoločnosti Pharmacia, pod chránených obchodným označením Sephacryl® S-400.

Výraz „alkyl“ sa vzťahuje na monovalentný radikál s lineárnym alebo rozvetveným reťazcom, ktorý pozostáva výhradne z uhlíka a vodíka, neobsahuje nenasýtené väzby a obsahuje jeden až osemnásť atómov uhlíka, výhodne jeden až šesť atómov uhlíka, ako napríklad radikál metyl, radikál etyl, radikál n-propyl, radikál izopropyl, (1-metyletyl), radikál n-butyl, radikál t-butyl (1,1-dimetyletyl), radikál sekbutyl(l-metylpropyl), radikál n-pentyl, radikál n-hexyl a podobne.

Výraz „v podstate čistý“ tak, ako je používaný v súvislosti s čistotou produktu rDSPA al po vykonaní schémy čistenia, podrobne opísanej v opise predloženého vynálezu, znamená, že viac ako 80 % celkového množstva proteínu v konečnom vyčistenom produkte, je rDSPA al, výhodne viac ako 90 % celkového izolovaného proteínu je rDSPA al a najvýhodnejšie 98 % celkového izolovaného proteínu je rDSPA al. Obsah a čistota proteínu sú určované reverznou fázovou HPLC (vysokoúčinná kvapalinová chromatografia) a gélovou analýzou SDS-PAGE (polyakrylová gélová elektroforéza s použitím dodecylsulfátu sodného).

Výraz „proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty“ sa vzťahuje na všetky materiály, iné ako rDSPA α 1, nájdené v biologickom médiu, z ktorého bol rDSPA al čistený.

Výraz „farmaceutický prijateľný excipient“ sa vzťahuje na prijateľný nosič a ktorúkoľvek farmaceutický prijateľnú pomocnú látku, pri ktorých bolo požadované, aby boli zlučiteľné s fyziologickými podmienkami, ktoré sú netoxické a nepôsobia nepriaznivo na biologickú účinnosť farmaceutickej kompozície v ňom suspendovanej alebo obsiahnutej. Vhodné excipienty by mohli byť zlúčeniny ako napríklad manit, sukcinát (jantaran), glycín alebo sérový albumín.

Výraz „terapeuticky účinné množstvo“ sa vzťahuje na také množstvo rDSPA al, ktoré ak je podávané človeku, ktorý ho potrebuje, je dostatočné na uskutočnenie liečby chorobných stavov charakterizovaných trombózou, v zmysle uvedenom ďalej. Množstvo zlúčeniny, ktoré tvorí „terapeuticky účinné množstvo“ sa mení v závislosti od zlúčeniny, chorobného stavu a jeho závažnosti, ale môže byť určené bežným spôsobom odborníkmi, ktorí majú znalosti v danom odbore a sú oboznámení s predmetným vynálezom.

Výrazy „liečenie“ alebo „liečba“, ako sú používané v tomto vynáleze, pokrývajú liečbu chorobného stavu človeka, pričom chorobný stav je charakterizovaný trombózou a uvedené výrazy zahrnujú :

i) zabránenie vzniku chorobného stavu u človeka, obzvlášť pokiaľ ide o človeka s predispozíciou vzhľadom na tento chorobný stav, u ktorého ale ešte diagnóza nepreukázala, že ju má;

ii) inhibíciu chorobného stavu, t. j. zastavenie jeho vývinu; alebo iii) uľahčenie chorobného stavu, t. j. spôsobenie ústupu chorobného stavu.

Výrazy „prípadný“ alebo „prípadne“ znamenajú, že následne opísaný výskyt okolností môže alebo nemusí nastať pričom opis predloženého vynálezu zahrnuje ako prípady, kde uvedená udalosť alebo okolnosť nastane, tak i prípady, v ktorých uvedená udalosť alebo okolnosť nenastane.

Predložený vynález sa týka spôsobu izolácie a čistenia rDSPA al v komerčnom meradle a vo forme, vhodnej na použitie vo farmaceutických prípravkoch. Tento rDSPA al je produkovaný fermentáciou bunkovej línie cicavcov, schopnej sekrécie produkovaného rDSPA al do kultivačného média. Kondiciované médium, inými slovami také médium, ktoré sa získa z bioreaktora, obsahujúceho bunky cicavca, sa zhromaždi a rDSPA al je oddelený od iných proteínov a nečistôt v rade za sebou uskutočnených chromatografických krokov, začínajúcich použitím katiónovej ionexovej živice, po ktorom nasleduje selektívne eluovanie rDSPA al zo živice. Frakcia rDSPA al, získaná selektívnym eluovaním z katiónovej ionexovej živice je potom aplikovaná na hydrofóbnu interaktívnu živicu, kde selektívne eluovanie z matrice predstavuje druhý stupeň čistenia. Vymytá frakcia rDSPA al je potom aplikovaná na afinitnú chromatografickú živicu, kde selektívne eluovanie poskytuje ďalší stupeň čistenia. Čistený rDSPA al jc ďalej koncentrovaný obvyklými technikami, ako napríklad ultratitráciou a potom lyofílizáciou.

Postup podľa predmetného vynálezu sa konkrétne uskutočňuje nasledujúcim spôsobom.

A. Izolácia a čistenie

1. Kultivačné médium a bunkové línie

Kultivačné médium zahrnuje základné médium vhodné na rast cicavčích buniek, ako napríklad DMEM alebo Hamovo médium F12. Médiom je najmä Williamsovo E médium (pozri publikácia Williams, G.M. and Gunn, J.M., Exp. Celí Res., (1974) 89:139). Vo fáze rastu naočkovaných buniek bude základné médium obvykle doplnené zdrojom séra, obvykle hovädzím sérom (BS) alebo sérom novonarodeného teľaťa (CS), prítomného v koncentrácii v rozmedzí od približne 0,1 % do približne 10 % hmotn., obvykle prítomného v koncentrácii v rozmedzí od približne 1 % do približne 5 % hmotn. Môžu byť pridané ďalšie rastové faktory alebo pufre, ako napríklad HEPES. Počas perfúznej rastovej fázy je koncentrácia séra obvykle udržovaná na rovnakej úrovni, ktorá je typicky v rozmedzí od približne 3 % do približne 8 %, obvykle okolo 5 %.

Bunkové línie vhodné na použitie podľa predloženého vynálezu zahrnujú bunkové línie cicavcov schopné neadherentného rastu v suspenznej kultúre a/alebo adherentného rastu na mikronosičových granulách. Konkrétne bunkové línie, ktorá vyhovujú týmto požiadavkám, zahrnujú bunkové línie vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), BHK bunky, alebo bunkovej línie HEK293 (pozri publikácia: Krätzschmer a kol., Gene, (1991) 116: 281 - 284; Petri, T., J. BioTechnology, (1995) 39: 75 - 83).

Zvlášť výhodná CHO bunková línia je DXB11, ktorá je opísaná v publikácii Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77: 4216 - 4220. Tieto bunky boli kotransfektované vektormi expresie pSVPAIl a pUDHFRl, ktoré zahrnujú sekvencie kódujúce DSPA al respektíve myšiu dihydrofolátovú reduktázu (pozri publikácia: Petri, T., ibid). Transformovaná CHO bunková línia, používaná v predloženom vynáleze, je označovaná CD 16 a bola deponovaná v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC) pod označením ATCC # CRL 12023.

2. Rast kultúry a produkčná fáza

Po naočkovaní buď zlúčenými kultúrami získanými centrifugáciou alebo časťou iných kultúr z bioreaktora sa bunková kultúra rozrastie na produkčnú hustotu, typicky v rozmedzí okolo 1 - 40x10⁶ buniek/ml.

Po dosiahnutí požadovanej hustoty buniek na mikronosičových granulách je začatá perfúzia čerstvého média doplneného sérom. Alternatívne môžu bunky rásť v suspenznej kultúre. Obvykle je koncentrácia séra v čerstvom médiu v rozmedzí od približne 2 % do približne 10 % hmotn., typickejšia bude koncentrácia séra v rozmedzí od približne 3 % do približne 8 % hmotn. a obvykle bude koncentrácia séra v rozmedzí okolo 5 % hmotn. Rýchlosť perfúzie bude na začiatku v rozmedzí od približne 0,25- do približne 0,75-násobku objemu kultúry/deň, obvykle v rozmedzí okolo 0,5-násobku objemu kultúry/deň. So zvyšujúcim sa rastom buniek je zvyšovaná rýchlosť perfúzie až ku konečnej rýchlosti v rozmedzí od približne 1,5- do približne 2,5-násobku objemu kultúry/deň, obvykle v priebehu približne 2 až približne 10 dní. Počas expanzie sú sterilné, vopred ekvalibrované granuly mikronosiča pridávané do reaktora, aby sa udržal pomer množstva granúl mikronosiča k bunkovej hustote v rozmedzí od približne 0,5 do približne 1,0 gramov mikronosičových granúl na 10⁹ buniek. Granuly mikronosiča sú výhodne pridávané do reaktora použitím nasávacieho zariadenia vzorkovacou trubicou.

Keď hustota buniek dosiahne produkčnú úroveň, bude pridávanie séra do čerstvého kultivačného média obmedzené, typicky na koncentráciu v rozmedzí od približne 0,1 do približne 2,0 % hmotn., normálne 1 % hmotn.

Kultúra v produkčnej fáze vyžaduje pozornosť, týkajúcu sa mnohých parametrov fermentácie: teplota, pH a stupeň rozpusteného kyslíka sú monitorované denne. Ďalšie kultivačné médium, sérum a alkalické látky je treba dodávať, sotva sa vyčerpajú zásobné nádrže. Vzorky kondiciovaného média, definovaného ako médium, ktoré obsahuje produkt, sú analyzované bežným spôsobom aspoň každé dva dni, aby sa zaistilo, že produkcia pokračuje bez kontaminácie.

Spôsob odberu kondiciovaného média z bioreaktorov minimalizuje odoberanie buniek použitím oddeľovacích textílií s pórmi s priemerom približne 100 - 150 mikrometrov. Suspenzné kultúry používajú vírusový filter na udržanie bunky v bioreaktore. Odoberané médium sa zbiera do sterilných zásobníkov a uchováva sa počas až 38 dni pred ďalším spracovaním. rDSPA al, ktorý sa nachádza v médiu z bioreaktora, bol vylučovaný z CHO buniek v spracovanej forme, ktorá je plne biologicky aktívna a ktorá je pripravená na čistenie.

3. Chromatografia katiónovou výmenou

Po nastavení pH na hodnotu v rozmedzí od približne 4 do približne 6, výhodne okolo 5, je rDSPA al, ktorý sa nachádza v kondiciovanom médiu, aplikovaný na katiónovú ionexovú matricu (obvykle vo forme kolóny) za podmienok zvolených tak, aby bola zaistená v zásade úplná väzba rDSPA al na matricu. I keď iné proteíny budú tiež viazané, úvodná väzobná etapa poskytuje prvý stupeň separácie, lebo množstvo nežiaducich alebo kontaminujúcich proteínov a iných zlúčenín, ako napríklad fenolová červeň, v kondiciovanom médiu nebude schopných väzby na matricu a teda pretečie matricou. rDSPA al je ďalej čistený selektívnym eluovaním z matrice, keď eluovanie môže byť vykonané buď eluovaním po krokoch alebo metódou eluovania lineárnym gradientom pri ktorej sa zvyšuje iónová sila pufra. V obidvoch prípadoch je rDSPA al odobratý s cieľom ďalšieho čistenia, ako bude opísané neskôr.

Vhodné katiónové ionexové matrice zahrnujú množstvo rôznych živíc, modifikovaných katiónovými funkčnými skupinami, ktoré sú schopné viazať rDSPA al. Výhodné sú umelé živice, ako napríklad tie, ktoré pozostávajú z častíc silikagélu, zosieťovanej agarózy alebo zosieťovaných polymetakrylátových polymérov, modifikovaných katiónovými funkčnými skupinami, ako napríklad karboxylová skupina, karboxymetylová skupina, sulfonylová skupina, fosforylová skupina a podobne. Zvlášť použiteľné sú relatívne slabé živice, ako napríklad také, ktoré majú karboxylovú alebo karboxyalkylovú funkčnú skupinu, ako je napríklad karboxymetylová skupina alebo karboxyetylová skupina. Zvlášť výhodná živica pozostáva z matrice z častíc oxidu kremičitého, kovalentne viazaných na polyetylénimín silán, s amino skupinami polyetylénimín silánu modifikovanými karboxylovými skupinami. Takáto živica je Baker Vadepore CBX® (veľkosť granúl 45mm), ktorá je komerčne dodávaná spoločnosťou J. T. Baker.

Väzbové podmienky a podmienky eluovania sa menia v závislosti od sily väzby katiónovej živice. Pre slabé katiónové živice, ako napríklad Baker Vadepore CBX, môže byť väzba vytvorená pri nízkej iónovej sile za mierne kyslých podmienok, typicky pH od 4 do 7, výhodne okolo pH 5. Po premývaní matrice môže byť rDSPA al selektívne vymytý vystavením matrice mobilnej fáze, majúcej zvýšenú iónovú silu, používajúcu buď lineárne eluovanie alebo eluovanie po krokoch. V prípade živice Baker Videpore CBX bude rDSPA al vymytý pri pH okolo 7,5, s koncentráciou soli medzi približne lOOmM a približne 500mM NaCl. Kolónu je možné podrobiť stopovaniu a regenerovať na ďalšie použitie.

S matricou Baker Widepore CBX, bude živica najprv výhodne ekvilibrovaná pufrom v množstve 1 OOmM octanu sodného s hodnotou pH 5. Pufer je aplikovaný na kolónu s rýchlosťou prietoku rovnajúcu sa 0,2-násobku objemu až 2,0-násobku objemu kolóny za minútu až do času, ako sa pH vystupujúcej tekutiny ustáli na 5. Kondiciované médium, obsahujúce rDSPA al, je filtrované 1,2 um filtrom a potom túrované až na pH medzi 4 a 7, najvýhodnejšie 5, použitím ľadovej kyseliny octovej. Médium je potom privádzané do kolóny, typicky použitím zubového čerpadla, pri rýchlosti toku nepresahujúcej dvojnásobok objemu kolóny za minútu. S cieľom odstrániť častice, ktoré by mohli upchať matricu kolóny, je použitý filter.

Matrica kolóny je potom znovu ekvilibrovaná ekvilibračným octanovým pufrom až do času, kým sa pH stabilizuje na 5, čo typicky vyžaduje množstvo pufra od približne dvojnásobku do približne sedemnásobku objemu kolóny. Potom je na kolónu aplikovaný premývací pufer, obsahujúci 50mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, rýchlosťou od približne 0,1-násobku do približne 0,2-násobku objemu kolóny za minútu až do času, ako sa pH eluovanej látky stabilizuje na 7,5. rDSPA al je potom vymyté z kolóny použitím vymývacieho pufra obsahujúceho 50mM fosforečnanu sodného, 500mM chloridu sodného, pH 7,5. Vymývací pufer sa ponechá prechádzať kolónou až do času, keď už nedochádza k vymývaniu proteínu z kolóny. Stripovací pufer, obsahujúci 2,0 M octanu sodného, pH 8, je potom aplikovaný na kolónu, aby bola regenerovaná matrica. Zásobovací pufer obsahuje 10 % kyseliny octovej a 45 % etanolu.

4. Hydrofóbna interaktívna chromatografia

Frakcia rDSPA al, zachytená z matrice katiónového ionexa je potom aplikovaná na hydrofóbnej interaktívnej matrici (obvykle vo forme kolóny) za podmienok, ktoré umožnia väzbu rDSPA al na matrici, typicky za vysokej iónovej sily a nízkeho pH. rDSPA al je potom selektívne vymytý zvýšením koncentrácie organického rozpúšťadla mobilnej fázy aplikovanej na kolónu, použitím lineárneho alebo krokového gradientu. Frakcia rDSPA al je odoberaná z kolóny na ďalšie čistenie. Tento krok zníži 100- až

1000-krát DNA kontamináciu a inaktivuje potenciálne vírusové nečistoty.

Vhodné hydrofóbne interaktívne matrice zahrnujú veľké množstvo elektricky nenabitých živíc, ktoré obsahujú kovalentne pripojené hydrofóbne skupiny, ako napríklad propylová skupina, butylová skupina, oktylová skupina, fenylová skupina a podobne. Živice môžu byť zosieťovaná organické polyméry ako napríklad styrén-divinylbenzén, οχιά kremičitý, agaróza, polymetakrylát, alebo ktorýkoľvek z veľkého množstva iných vhodných časticových nosičov. Zvlášť výhodná živica pozostáva zo semirigidných sférických granúl, ktoré sú syntetizované kopolymerizáciou etylénglykolu a polymérov typu metakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami. Takáto živica je Toyo-Pearl® 650M (granule 40 - 90 pm), ktorá je komerčne dostupná od spoločnosti Toso-Haas.

Väzba na hydrofóbnu interaktívnu kolónu je vykonáva za podmienok vysokej iónovej sily, obvykle pri kyslom pH od 3 do 5, obvykle okolo pH 4. V podstate všetok proteín obsiahnutý vo frakcii rDSPA al, ktorá bola vymytá z katiónovej ionexovej živice, je viazaný na hydrofóbnu interaktívnu kolónu. Rôzne proteíny môžu byť selektívne vymyté v závislosti od rôznych schopností hydrofóbnych interakcií s hydrofóbnymi skupinami na matrici, t. j., v poradí stúpajúcej hydrofobicity proteínu. Eluovanie kolóny môže byť vykonané krokovým alebo lineárnym gradientom, obvykle alkoholovým vymývacím rozpúšťadlom ako napríklad etanol alebo izopropanol. Zvlášť výhodný alkohol je etylalkohol.

Ekvilibrácia matrice Toyo-Pearl C4 môže byť výhodne uskutočnená ekvilibračným pufrom, ktorý obsahuje 50mM octanu sodného, 500mM chloridu sodného, pH 4. Potom, keď je frakcia rDSPA al z kolóny ionexa titrovaná na pH

4, je aplikovaná na C4 matrici, matrica je potom znovu ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom, ktorý bol opísaný skôr. Kolóna je následne premývaná postupne použitím dvoch pufrov, ako vyplýva z nasledujúceho výkladu. Prvé premývanie (premývanie 1) používa pufer, ktorého objem predstavuje aspoň dvojnásobok objemu kolóny a ktorý obsahuje 20mM HCI. Premývanie je opakované až do času, pokiaľ vystupujúca tekutina neobsahuje ďalší proteín, ako je známe zo stálej UV absorpcie. Matrica je potom premývaná (premývanie 1) použitím pufra, ktorého objem predstavuje najmenej desaťnásobok objemu kolóny a ktorý obsahuje 19 % etanolu, 20mM HCI a v premývaní sa pokračuje pufrom obsahujúcim 20,5 % etanolu, 20 mM HCI až do času, pokiaľ už nie je vymytý žiaden ďalší proteín. Eluovanie produktu rDSPA al je vykonané použitím pufra, ktorý obsahuje 29 % etanolu, 20mM HCI, pH 2,5. Po vymytí produktu je kolóna stripovaná pufrom, ktorého objem predstavuje najmenej dvojnásobok objemu kolóny a ktorý obsahuje lOOmM NaOH. Matrica je uchovávaná v pufri z premývania 1.

5. Afínitná chromatografia

Frakcia rDSPA al odobratá z hydrofóbnej interaktívnej živice je ďalej aplikovaná na afinitnej matrici (obvykle vo forme kolóny) za podmienok, ktoré umožnia väzbu rDSPA al na afinitnej matrici. Zatiaľ čo rDSPA al zostáva viazaný na kolónu, nečistoty sú vymyté premývaním kolóny 20mM HCI, ktorého objem predstavuje dvojnásobok až trojnásobok objemu kolóny. Tento krok uľahčuje výmenu pufra, čím napomáha vytváraniu farmaceutického prostriedku a zlepšuje rozpustnosť a tiež pomáha pri inaktivácii/odstránení potenciálnej vírusovej kontaminácie. Výhodne je používaný pufer, ktorého objem predstavuje 2,5-ná6 sobok objemu kolóny. rDSPA al je potom selektívne vymytý použitím pufra, ktorý obsahuje 200mM glycínu, voľnú bázu s pH medzi 4 a 5. Frakcia rDSPA al je odoberaná na koncentrovanie.

V predmetnom vynáleze sú ako afinitné živice používané tie živice, ktoré sú normálne používané ako molekulové veľkostne vylučovacie živice. Vhodné afinitné matrice zahrnujú živice pozostávajúce zo zosieťovaného polyméru alyl dextranu a Ν,Ν’-metylén bisakrylamidu vo forme granúl s priemerom medzi 25 a 75 pm. Zvlášť výhodná živica je Sephacryl 400®, ktorá je komerčne dostupná od spoločnosti Pharmacia a je schopná frakcionácie globulámych proteínov medzi 20 000 a 8 000 000 kDa.

Väzbu rDSPA al na afinitnú živicu je možné dosiahnuť za podmienok slabej iónovej sily a nízkeho pH. V podstate všetok rDSPA al odobratý z hydrofóbnej interaktívnej živice je viazaný na kolónu. rDSPA al môže byť selektívne vymytý zvýšením pH a/alebo iónovej sily. Eluovanie môže byť uskutočnené krokovým alebo lineárnym gradientom, obvykle s použitím eluentu, ktorý obsahuje 200mM glycínu, vo forme voľnej bázy.

Pri použití matrice Sephacryl S-400 môže byť výhodne ekvilibrácia uskutočnená pufrom, ktorý obsahuje 19 % etanolu, 20mM HC1, až do času, keď už pH vystupujúcej tekutiny zostáva nezmenené. Na matrici sa privedie frakcia rDSPA al z hydrofóbnej interaktívnej kolóny a potom sa uskutoční vymývanie pufrom, ktorý obsahuje 20mM HC1 až do doby, keď je UV signál z vystupujúcej tekutiny stály. Eluovanie viazaného rDSPA al sa uskutočňuje použitím pufra, ktorý obsahuje 200 mM glycínu. Po vymytí produktu je kolóna stripovaná pufrom, ktorého objem predstavuje viac ako dvojnásobok objemu kolóny, ktorý obsahuje lOOmM NaOH. Po premytí matrice pufrom, ktorého objem predstavuje aspoň dvojnásobok objemu kolóny (200 mM HC1), môže byť v tomto pufri matrica uchovávaná.

6. Koncentrácia

Vyčistený proteín podľa predloženého vynálezu môže byť potom koncentrovaný, typicky filtráciou alebo podobným spôsobom a môže byť prípadne lyofilizovaný alebo iným spôsobom začlenený do obvyklého farmaceutického prípravku. Použiteľné spôsoby koncentrácie a lyofilizácie sú dobre opísané v odbornej literatúre.

B. Príprava farmaceutických foriem

1. Farmaceutické prostriedky

Rekombinantnú DSPA al je možné použiť na prípravu prostriedku s významnou terapeutickou hodnotou. Tento rDSPA al, čistený postupom podľa predmetného vynálezu, je možné použiť pri liečbe tepnových a žilových trombóz.

Rekombinantný DSPA al, čistený postupom podľa predmetného vynálezu, môže byť podávaný pacientovi. Toto činidlo môže byť kombinované na účely terapeutického použitia s inými látkami, napríklad s obvyklými farmaceutický prijateľnými nosičmi alebo rozpúšťadlami a súčasne s fyziologicky neškodnými stabilizátormi a excipientmi. Tieto kombinácie môžu byť sterilné filtrované a spracované do dávkovacích foriem, napríklad lyofilizácia v dávkovacích nádobkách alebo uchovávanie v stabilizovaných vodných prípravkoch.

Množstvo činidla, ktoré je nevyhnutné na účinnú terapiu bude záležať na mnohých rôznych faktoroch, zahrnujúcich spôsob podávania, fyziologický stav pacienta a iné podávané lieky. Liečebné dávky by teda mali byť titrované, aby bola čo najviac zvýšená bezpečnosť a účinnosť. Dávky použité in vitro môžu obvykle predstavovať užitočnú in formáciu o použiteľných množstvách na podávanie týchto činidiel in situ. Pokusy na zvieratách, týkajúce sa účinnej dávky na liečenie zvierat môžu poskytnúť predbežné indikácie o dávkovaní človeku. Rôzne teoretické úvahy na túto tému sú opísané napríklad v publikácii Gilman a kol. (editori) (1990) Goodman and Gilman's: Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamen Press; a Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.

V uvedených publikácii a v ďalšom opise je pojednávané o rôznych spôsoboch podávania, napríklad o perorálnom podávaní, intravenóznom podávaní, intraperitoneálnom podávaní alebo o intramuskulámom podávaní, o transdermálnej difúzii a iných spôsoboch. Farmaceutický prijateľné nosiče budú obsahovať vodu, fyziologický roztok, pufŕy a iné zložky, opísané napríklad v The Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Vzhľadom na to, že dávkovanie iných aktivátorov plazminogénu sa pohybuje medzi 80 a 110 mg, celková dávka v tomto rozmedzí by mala byť dostačujúca (pozri publikácia: Physicians’Desk Reference, 49th ed. (1995), Medical Economics Data Produkce Company, str. 1083 - 1085).

Terapeutický prípravok môže byť podávaný v ktorejkoľvek obvyklej dávkovacej forme. I keď je možné podávať aktívnu zložku samostatne, je výhodnejšie, aby bola podávaná vo forme farmaceutického prostriedku. Tieto prostriedky obsahujú aspoň jednu aktívnu zložku, ako je definované, spolu s jedným alebo viacerými prijateľnými nosičmi aktívnej zložky. Každý nosič musí byť tak farmaceutický, ako fyziologicky prijateľný v tom zmysle, že je kompatibilný s inými zložkami a že neohrozuje pacienta. Tento prostriedok obsahuje také zložky, ktoré sú vhodné na perorálne podávanie alebo parenterálne podávanie (zahrnujúce subkutánne podávanie, intramuskuláme podávanie, intravenózne podávanie a intradermálne podávanie). Tieto prostriedky sú obvykle podávané v jednotkovej dávkovacej forme, pričom môžu byť pripravované ktorýmkoľvek zo spôsobov známych v odbore farmácie. Pozri napríklad Gilman a kol., ibid, and Remington ibid.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Postup podľa predmetného vynálezu bude v ďalšom bližšie vysvetlený pomocou konkrétnych príkladov uskutočnenia, ktoré sú však len ilustratívne a žiadnym spôsobom neobmedzujú rozsah predmetného vynálezu.

Príklad 1

Produkcia rDSPA al z bunkovej kultúry

Nádobka DSPA Working Celí Bank bola rozmrazená a naočkovaná do valcovitej nádoby s 5 % teľacieho séra v rastovom médiu (WEC 5.0 médium, pozmenené Williams E). Počas dvojtýždňovej doby sa bunky rozrástli a boli prenesené do štyroch valcových nádob, bunky z valcových nádob boli spracované trypsínom a naočkované do štyroch jednolitrových odstreďovacich baniek po 4 x 10⁸ buniek, každá s jedným litrom rastového média. Po štyroch dňoch boli kultúry zo štyroch centrifugácií použité na naočkovanie do desaťlitrového bioreaktora. Dodatočný jeden liter rastového média bol pridaný do kultúry bioreaktora v deň naočkovania. Ďalší deň bol bioreaktor naplnený desiatimi litrami rastového média. Kultivácia tak s pridávaním, ako i bez pridávania mikronosičových granúl sa riadila týmto protokolom. pH prostredie bolo regulované na 7,0 - 7,4 a okysličenie bolo udržiavané po celý čas rozptyľovacím systémom. Teplota bola udržiavaná na 34 - 39 “C.

Hustota buniek v deň naočkovania do bioreaktora bola 8,1 x 10⁵ buniek na ml a po dvoch dňoch sa hustota buniek zväčšila na dvojnásobok, v čase, v ktorej rýchlosť perfúzie bola nastavená na 0,5-násobok objemu kultúry za deň. Rýchlosť perfúzie bola zvyšovaná v závislosti od hustoty buniek tak, aby po deviatich dňoch uplynutých od naočkovania bioreaktora hustota dosiahla 6,2 x 10⁶ bunky/ml a perfúzia sa zvýšila na 2-násobok objemu kultúry za deň.

Bioreaktor bol potom prevedený na produkčné médium (1 % teľacie sérum vo WEC 5.0 médiu ) a o dva dni neskôr začalo odoberanie produkcie a pokračovalo počas desiatich týždňov. Počas fáze produkcie bol priemer hustoty buniek 15 x 10⁶ buniek na ml s približne 75 % životnosťou. Priemer produkcie rDSPA al bol 40 miligramov rDSPA al na liter a priemer špecifickej produkčnej rýchlosti bol 6 pikogramov rDSPA al na bunku na deň.

Expanzia fermentačných objemov bola dosiahnutá presunom polovice obsahu reaktora do novej nádoby. Obidva bioreaktory boli umiestnené do produkčného média, perfúzované dvoma násobkami objemu kultúry za deň a ihneď začalo odoberanie produkcie.

Príklad 2

Čistenie rDSPA al

1. Chromatografia katiónovou výmenou (Kolóna A)

Odber z bioreaktora je uchovávaný pri teplote okolia (15 - 25 °C). Je potom filtrovaný cez 0,45 mikrónový filter pred privedením na katiónovú ionexovú kolónu. Čistenie odobratého materiálu začína krokom kolónovej chromatografie použitím živice CBX, vyrobenej spoločnosťou J. T. Baker (Kolóna A). Tento krok umožňuje významnú časť čistenia proteínu.

Pufre kolóny A pozostávajú z Pufra Al : ekvilibraný pufer (50mM octan sodný, pH 5,0), z Pufra A2: premývací pufer (50mM Na₃PO₄, pH 7,5), z Pufra A3: vymývací pufer (50mM Na₃PO₄, 500 mM NaCl, pH 7,5), z Pufra A4: stripovací pufer (2M octan sodný, pH 8,0) a z Pufru A5: zásobovací pufer (45 % etanol, 10 % kyseliny octovej).

Nasledujúce operačné parametre kolóny sú vhodné pre kolónu naplnenú 6 kg živice a s objemom kolóny 15 litrov. Najviac 4,5 gramov rDSPA al môže byť privedené na kolónu v jednom spracovaní. Kolóna je plnená pri veľkosti toku menšom ako 2 litre za minútu a pri tlaku kolóny nepresahujúcom 20 psi. Hodnoty kolóny a monitoru sú kontrolované pred každým spracovaním. Plniaci materiál a chromatografické pufre sú pred použitím zbavené plynov a preplachovaním héliom.

Odber z bioreaktora je filtrovaný 1,2 mm filtrom, potom titrovaný na pH 5,00 (±0,10) použitím ľadovej kyseliny octovej. Pred plnením je kolóna ekvilibrovaná najmenej 30 litrami Pufra Al až do času, ako má vychádzajúca tekutina pH 5.00 (±0,20). Sotva je kolóna ekvilibrovaná, je na kolóne privádzaný odber. Kolóna je znovu ekvilibrovaná najmenej osemdesiatimi litrami Pufra Al. Kolóna je znovu správne ekvilibrovaná, keď má vychádzajúca tekutina 5,00 (±0,20) a keď je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra. Kolóna je eluovaná najmenej 145 litrami Pufra A2. Kolóna je správne vymytá, keď má vychádzajúca tekutina pH 7,50 (±0,20) a keď je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra.

Produkt je vymytý z kolóny použitím najmenej 30 litrov Pufra A3 a odobratý do oddelenej nádoby. Eluovanie je považované za dosiahnuté, keď je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra. Po vymytí produktu je kolóna stripovaná až do času, ako je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra, použitím najmenej 30 litrov Pufra A4. Kolóna je potom čistená, aby mohla byť znovu použitá (bez toho, že by bola prekročená hranica 50 cyklov používania). Produkt kolóny A (alebo eluát) je uchovávaný pri teplote 2 až °C. Priemerný výťažok bol 93 % a priemerná (proteínová) čistota vymytého materiálu bola 81 %.

2. Hydrofóbna interaktívna chromatografia (KolónaB)

Na vykonanie chromatografie na živici CBX je produkt rDSPA al chromatografovaný s použitím C4 hydrofóbnej interaktívnej živica (Toso-Haas) (Kolóna B). Tento krok uľahčuje významne odstránenie neproteínových nečistôt a tiež pomáha pri inaktivácii/odstránení možných vírusových nečistôt. Pufre kolóny B pozostávajú z Pufra Bl: ekvilibračný pufer (50mM octan sodný, 500mM NaCl, pH 4,0), z Pufra B2: premývací a zásobovací pufer (20mM HC1), z Pufra B3: premývací pufer (20mM HC1, 19 % etanol), z Pufra B4: premývací pufer (20mM HC1, 20,5 % etanol), z Pufra B5: vymývací pufer 20mM HC1, 29,5 % etanol), a z Pufra B6: stripovací pufer (0,lN NaOH). Nasledujúce operačné parametre kolóny sú vhodné na 15 litrový objem kolóny. V jednom spracovaní môže byť privedených na kolónu najviac 9 gramov DSPA al. Kolóna je plnená pri veľkosti toku najviac 2 litre za minútu a pri tlaku kolóny najviac 15 psi. Hodnoty kolóny a monitoru sú kontrolované pred každým spracovaním.

Pred plnením je kolóna ekvilibrovaná až do času, ako má vychádzajúca tekutina pH 4,00 (± 0,20). Látka vymytá z kolóny A je titrovaná na pH 4,00 (± 0,10) použitím ľadovej kyseliny octovej, zbavená plynu a privádzaná do kolóny. Táto kolóna je znovu ekvilibrovaná najmenej 30 litrami Pufra B1 až do času, ako má vychádzajúca tekutina pH 4,00 (± 0,20) a prv, ako je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra. Kolóna je premývaná tromi puframi. Prvé premývanie je najmenej 45 litrami Pufra B2. Kolóna je správne premytá, keď má vychádzajúca tekutina pH 1,90 (±0,20) a keď je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra. Kolóna je premývaná druhýkrát najmenej 145 litrami Pufra B3 až do času, ako je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra. Kolóna je premývaná po tretíkrát najmenej 30 litrami Pufra B4 a premývanie je úplné, keď je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra.

rDSPA al je vymytý z kolóny použitím najmenej 30 litrov Pufra B5 a zhromažďovaný do oddelenej nádoby. V eluovaní sa pokračuje až do času, pokiaľ je dosiahnutá stabilná základná línia UV spektra. Kolóna je potom čistená, aby mohla byť znovu použiteľná (bez toho, že by bola prekročená hranica 50 cyklusov používania). Produkt kolóny B (alebo eluát) je uchovávaný pri teplote 2 - 8 °C počas najviac 15 dní pred ďalším spracovaním. Priemerný výťažok bol 91 % a priemerná (proteínová) čistota vymytého materiálu bola 97 %.

3. Afinitná chromatografia (Kolóna C)

Produkt kolóny B podstupuje ďalej chromatografiu použitím Sephacryl S-400 (Pharmacia) (Kolóna C). Tento krok uľahčuje výmenu pufra, čím napomáha vytváraniu prípravku a teda pomáha pri inaktivácii/odstránení vírusových nečistôt. Pufre kolóny C pozostávajú z Pufra Cl: ekvilibraný pufer (20mM Hcl, 9 % etanol) z Pufra C2: premývací pufer (20mM glycínu, sterilné filtrovaného) a z Pufra C4: stripovací pufer (0,lN NaOH). Nasledujúce operačné parametre kolóny sú vhodné na desaťlitrový objem kolóny. V jednom spracovaní môže byť na kolónu privedených najviac 20 gramov rDSPA al. Kolóna je plnená pri rýchlosti najviac 0,5 litra za minútu a pri tlaku kolóny najviac 15 psi. Eluáty z jedného alebo viac spracovaní Kolóny B sú zlúčené a potom sú zriedené jedným dielom eluátu

SK 284179 Β6

Pufra C2 a dvoma dielmi eluátu Pufra 5. Konečná koncentrácia etanolu bude približne 19 %.

Pred plnením je kolóna ekvlibrovaná najmenej 15 litrami Pufra C1 až do času, ako má vychádzajúca tekutina pH 1,80 (± 0.20). Po naplnení sa kolóna premýva najmenej 30 litrami Pufra C2. Kolóna je náležíte premývaná, pokiaľ UV signál nie je stabilný. Produkt je vymytý z kolóny použitím najmenej 20 litrov Pufra C3 a zhromažďovaný do oddelenej nádoby. V eluovaní sa pokračuje až do času, pokiaľ nie je dosiahnutá stála základná línia UV spektra.

Po eluovaní produktu je kolóna stripovaná najmenej 12 litrami Pufra C4 a uchovávaná až do opätovného použitia, ktoré však nemá prekročiť 20 cyklov. Produkt kolóny C (alebo eluát) je zriedený na koncentráciu menšiu ako 1 mg na mililiter Pufra C3 a uchovávaný pri teplote 2 - 8 °C s cieľom ďalšieho spracovania. Priemerný výťažok bol 97 % a priemerná (proteínová) čistota vymytého materiálu bola 98 %.

Kroky koncentrácie a prípravy farmaceutických kompozícii nasledovali po dokončení krokov čistenia (opísaných skôr) a boli vykonávané s vymytým produktom afinitnej kolóny S-400, ktorý bol uchovávaný najdlhšie 70 dni. Eluáty kolóny C boli zlúčené a koncentrované špirálovo vinutou ultrafiltračnou membránou, ktorá odstraňuje látky nízkej molekulovej hmotnosti (priepustnosť do 30 000 daltonov). Produkt sa zozbieral do kontajnera, ktorý neobsahuje pyrogénne látky, v koncentrácii vyššej ako 8 mg/ml. Ku koncovej 4 % koncentrácii bol pridaný manit.

Nakoniec bol pridaný formulačný pufer (200mM glycinu, 4 % manitu (hmotnosť/objem)), aby upravil koncentráciu hromadne pripraveného produktu na 7,5 mg/ml. Hromadne pripravený produkt je potom sterilné filtrovaný, rozdelený do nádob a lyofilizovaný.

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob čistenia rekombinantného aktivátora plazminogénu al zo slín Desmondus rotundus ( rDSPA al) z biologického média, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z nasledujúcich krokov:

   a) aplikácia tohto média na katiónovú ionexovú živicu za podmienok, vedúcich k selektívnej väzbe rDSPA al na katiónovú ionexovú živicu,

   b) premývanie tejto katiónovej ionexovej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA α 1 a neproteinové nečistoty,

   c) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z katiónovej ionexovej živice,

   d) aplikovanie eluentu, ktorý obsahuje rDSPA al a ktorý bol získaný v kroku (c), na hydrofóbnu interaktívnu živicu za podmienok, ktoré vedúcich k selektívnej väzbe rDSPA al na túto hydrofóbnu interaktívnu živicu,

   e) prípadne premývanie hydrofóbnej interaktívnej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA α 1 a neproteínové nečistoty,

   f) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z hydrofóbnej interaktívnej živice;

   g) aplikovanie eluentu, ktorý obsahuje rDSPA al a ktorý bol získaný v kroku (f), na afmitnú chromatografickú živicu vedúcu k selektívnej väzbe rDSPA al na túto afmitnú chromatografickú živicu,

   h) prípadne premývanie afinitnej chromatografickej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty,

   i) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z afinitnej chromatografickej živice za získania v podstate čistého rDSPA al vo vodnom roztoku.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že biologické médium je kondiciované médium.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že katiónová ionexová živica z kroku (a) je zvolená zo súboru, zahrnujúceho častice silikagélu, zosieťovanú agarózu alebo zosieťované polymetakrylátové polyméry, modifikované karboxylovými alebo karboxyalkylovými skupinami.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že katiónová ionexová živica je tvorená matricou z častíc silikagélu, kovalentné viazaných k polyetylénimínsilánu, pričom amínové skupiny polyetylénimínsilánu sú modifikované karboxylovými skupinami.
5. 5. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že podmienky aplikácie v kroku (a) zahrnujú aplikovanie média pri pH v rozmedzí od 4 do 7.
6. 6. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že eluovanie rDSPA al v kroku (c) sa uskutočňuje s použitím pufra obsahujúceho 50 mM Na₃PO₄ a od 100 mM do 500 mM NaCl alebo použitím pufra ekvivalentnej iónovej sily.
7. 7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že hydrofóbna interaktívna živica z kroku (d) je živica bez náboja, modifikovaná alkylovými skupinami obsahujúcimi 1 až 10 atómov uhlíka alebo aryl-alkylovými skupinami.
8. 8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že živica bez náboja jc zvolená zo súboru, zahrnujúceho častice silikagélu, zosieťovanú agarózu alebo zosieťovaný polymetakrylátový polymér.
9. 9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, žc živica bez náboja je tvorená semirigidnými sférickými granulami syntetizovanými kopolymerizáciou etylénglykolu a polymérov metakrylátového typu, modifikované butylovými skupinami.
10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že aplikačné podmienky v kroku (d) zahrnujú aplikáciu látky, eluovanej v kroku (c), pri pH v rozmedzí od 3 do 5.
11. 11. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že aplikačné podmienky v kroku (d) zahrnujú aplikáciu látky, eluovanej v kroku (c), v 50 mM Na₃PO₄, 500 ml NaCl a pH upravenom na hodnotu 4 kyselinou fosforečnou alebo s použitím pufra ekvivalentnej iónovej sily.
12. 12. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že eluovanie v kroku (f) sa uskutočňuje za použitia pufru, ktorý obsahuje 20 mM HCI a ktorý má koncentráciu etanolu vyššiu ako 25 %.
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia etanolu je medzi 28,5 % a 30 %.
14. 14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia etanolu je 29 %.
15. 15. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že afinitná chromatografickú živica v kroku (g) je predstavovaná zosieťovaným kopolymérom alyldextránu a Ν,Ν’-metylénbisakrylamidu vo forme granúl s priemerom, ktorý je v rozmedzí od 25 do 75 pm.
16. 16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že granuly sú schopné fŕakcionovať globuláme proteíny s veľkosťou od 20 000 do 8 000 000 kDa.
17. 17. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že aplikačné podmienky v kroku (g) zahr

    SK 284179 Β6 nujú aplikáciu eluentu v kroku (f) pri pH s hodnotou medzi 1 a 4.
18. 18. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že eluovanie v kroku (i) sa uskutočňuje s použitím pufra, obsahujúceho 200 mM glycínu a pri hodnote pH v rozmedzí od 3 do 6 alebo s použitím pufru ekvivalentnej iónovej sily.
19. 19. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje koncentrovanie vodného roztoku rDSPA al.
20. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje lyofilizáciu koncentrovaného roztoku rDSPA al.
21. 21. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje koncentrovanie vodného roztoku rDSPA al a lyofilizáciu koncentrovaného roztoku rDSPA al.
22. 22. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z nasledujúcich krokov:

    a) Aplikovanie média, ktoré má pH v rozmedzí od 4 do 7, na katiónovú ionexovú živicu, zvolenú zo súboru, zahrnujúceho častice silikagélu, zosieťovanú agarózu alebo zosieťované polymetakrylátové polyméry, modifikované karboxylovými alebo karboxyalkylovými skupinami, čo vedie k selektívnej väzbe rDSPA al na katiónovú ionexovú živicu,

    b) prípadne premývanie tejto katiónovej ionexovej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty,

    c) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z katiónovej ionexovej živice pufrom, ktorý obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a od 100 mM do 500 mM chloridu sodného alebo pufrom ekvivalentnej iónovej sily;

    d) privedenie eluentu z kroku (c), ktorý obsahuje rDSPA al, pri pH v rozmedzí od 3 do 5 na hydrofóbnu interaktívnu živicu, zvolenú zo súboru, zahrnujúceho Častice silikagélu, zosieťovanú agarózu alebo zosieťovaná metakrylátové polyméry, vedúce k selektívnej väzbe rDSPA al na túto hydrofóbnu interaktívnu živicu;

    e) premývanie tejto hydrofóbnej interaktívnej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty;

    f) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z hydrofóbnej interaktívnej živice pufrom, ktorý obsahuje 20 mM HC1 a ktorý má koncentráciu etanolu väčšiu ako 25 %.

    g) aplikovanie eluentu, ktorý obsahuje rDSPA al, z kroku (f) pri pH v rozmedzí od 1 do 4 na afinitnú chromatografickú živicu, predstavovanú zosieťovaným polymérom alyldextránu a Ν,Ν’-metylénbisakrylamidu v tvare granúl s priemerom v rozmedzí od 25 do 75 pm, vedúce k selektívnej väzbe rDSPA al na túto afinitnú chromatografickú živicu,

    h) prípadné premývanie tejto afinitnej chromatografickej živice s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty;

    i) selektívne eluovanie viazaného rDSPA al z afinitnej chromatografickej živice s použitím pufra, ktorý obsahuje 200 mM glycínu, pri hodnote pH v rozmedzí od 3 do 6 alebo pufra ekvivalentnej iónovej sily, za vzniku čistého rDSPA al vo vodnom roztoku.
23. 23. Spôsob izolácie a čistenia rDSPA al z biologického média, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z nasledujúcich krokov:

    a) aplikovanie tohto média, ktoré má pH 5, na katiónovú ionexovú živicu, ktorá pozostáva z matrice častíc oxidu kremičitého kovalentne viazaných na polyetylénimínsilán, v ktorom boli amino skupiny modifikované karboxylovými skupinami, čo vedie k selektívnej väzbe rSDPA al na túto katiónovú ionexovú živicu;

    b) premývanie tejto katiónovej ionexovej živice pri pH 5 použitím lOOmM acetátu sodného a 50 mM Na₃PO₄ pri pH 7,5, s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty;

    c) eluovanie viazaného rDSPA al z katiónovej ionexovej živice pufrom, ktorý obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného pri pH 7,5;

    d) aplikovanie eluentov z kroku (c), ktorý obsahuje rDSPA al, pri hodnote pH 4 na hydrofóbnu interaktívnu živicu pozostávajúcu zo semirigidných sférických granúl syntetizovaných kopolymerizáciou etylénglykolu a polymérov typu metakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami, čo vedie k selektívnej väzbe rDSPA al na hydrofóbnu interaktívnu živicu;

    e) premývanie tejto hydrofóbnej interaktívnej živice s použitím 20 mM HCI a potom s použitím 20 mM HCI, ktorá obsahuje 19 % etanolu s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty;

    f) eluovanie viazaného rDSPA al z hydrofóbnej interaktívnej živice pufrom, ktorý obsahuje 29 % etanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkovej pri pH 2,5;

    g) aplikovanie eluentu, ktorá obsahuje rDSPA al, z kroku (f) pri hodnote pH 2,5 na afinitnú chromatografickú živicu pozostávajúcu zo zosieťovaného kopolyméru alyldextránu a Ν,Ν’-metylénbisakrylamidu, ktorá frakcionuje globuláme proteíny s hmotnosťou medzi 20 000 a 8 000 000 kDa, čo spôsobí selektívnu väzbu rDSPA al na túto afinitnú chromatografickú živicu;

    h) premývanie tejto afinitnej chromatografickej živice s použitím 20mM HCI s cieľom odstrániť proteíny, ktoré nie sú rDSPA al a neproteínové nečistoty;

    i) eluovanie viazaného rDSPA al z afinitnej chromatografickej živice s použitím pufra, ktorý obsahuje 200 mM glycínu, pri pH medzi 4 a 5, za vzniku čistého rDSPA al vo vodnom roztoku.